抗微生物肽(AMP)是整個自然中生物體防御系統(tǒng)的必需組分并且提供抵抗侵入的病原體的保護。它們表現出針對革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌、真菌、寄生蟲和病毒的強效抗微生物活性。較小的AMP(通常約15-40個氨基酸)主要通過破壞微生物細胞膜的結構或功能來作用，其不靶向單一限定的分子結構。因此，與常規(guī)抗生素相反，無論細菌的代謝活性如何，它們都是有效的。人AMP例如防御素和導管素(LL-37)存在于白細胞中，通過皮膚和粘膜表面中的各種上皮細胞分泌。除了其抗微生物活性之外，AMP還是炎癥、免疫活化和傷口愈合中的重要效應分子。AMP在序列和二級結構上是特別多樣性的，但是它們有一些共同的性質。它們通常為陽離子、兩性離子，通過損害細菌膜完整性來發(fā)揮其殺微生物效果。AMP與靶微生物的陰離子膜表面的相互作用導致膜透化、細胞裂解和死亡。公認胞質膜是大多數AMP的主要靶標，而膜中肽的積累導致增加的透過性和屏障功能的喪失，造成胞質組分泄漏和細胞死亡。

常規(guī)抗生素通過結合靶標來殺傷細菌，所述靶標例如細胞壁上的表位、或細菌蛋白和DNA或RNA合成中的靶標。通過改變抗生素靶標以致抗生素無法繼續(xù)結合這些靶標，致病細菌能快速發(fā)展出抗性。AMP相對常規(guī)抗生素的主要優(yōu)勢是無法快速發(fā)展出抗性。一個原因是其不像常規(guī)抗生素一樣靶向單一限定分子結構(表位)，而是作用在細胞膜上殺傷微生物。AMP尤其適用于對抗所謂生物膜相關感染(BAI)，其為微生物的表面結合的細胞團聚體，大多數為細菌但也可為真菌。生物膜顯著有助于細菌對常規(guī)抗生素的抗性。生物膜與人的各種病理癥狀例如囊性纖維化、內置醫(yī)療裝置的定殖和牙科斑塊形成和損傷相關。使用常規(guī)抗生素對抗生物膜相關感染還由于許多原因而不足，所述原因包括對促炎微生物化合物釋放的刺激、生物膜穿透不充分、以及必需的全身給藥導致的血液中的失活或降解。AMP針對常規(guī)細菌的其他優(yōu)勢包括快速啟動殺傷、生物可降解性從而減輕了當前對環(huán)境殘留抗生素的擔憂、以及具有伴隨的抗炎活性。

在成百上千的潛在天然和合成肽的庫中，進行到臨床試驗的相當之少。示例為爪蟾抗菌肽、奧米加南、OP-145、諾瓦克汀(novexatin)和立體可(lytixar)。僅兩種AMP，達托霉素和DPK-060正處于臨床研發(fā)中。例如已經進行了2期臨床試驗的OP-145，又稱P60.4Ac(Peptides,2006；27:649-60)。OP-145是衍生自內源性人導管素抗微生物肽LL-37的24個氨基酸的肽。OP-145已經發(fā)展為用于局部治療慢性中耳炎的內毒素中和抗微生物肽。除了作為抗微生物肽，OP-145還中和LPS。

當前已知的AMP(包括OP-145)，仍存在一些缺陷。例如多種細菌，如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)、糞腸球菌(E.faecalis)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)全部分泌降解幾種抗微生物肽(如導管素LL-37)的蛋白酶。因此，從治療的角度來看，耐蛋白酶的抗微生物肽有優(yōu)勢。此外，由于AMP針對細菌以及哺乳動物膜的潛在裂解效果和其它性質，設計新肽的挑戰(zhàn)之一取決于開發(fā)與受感染患者的細胞膜相比，具有高的針對微生物如細菌或真菌細胞的特異性的AMP，即高治療指數(最小溶血濃度/最小抗微生物活性；MHC/MEC)。已知AMP(包括OP-145)的另一重要缺點是其活性受到血漿組分存在的嚴重影響。例如，對于OP-145來說，PBS中的LC99.9(殺死≥99.9％的最低肽濃度)是1.6μM，而PBS/血漿(1:1)中的LC99.9約為200μM。這對系統(tǒng)給予AMP來說尤其不利。

有多種機制導致AMP在血漿存在下的顯著較低的活性，例如血漿組分對肽的失活例如酶降解、或由于非特異性結合血漿組分導致的肽不可用。抵抗血漿組分的AMP非常重要，不僅由于其是潛在的全身治療劑，而且由于其用于治療(例如)感染的傷口和醫(yī)學移植相關感染和炎癥。尤其是深層組織感染中可能存在的高蛋白水解酶活性，其可導致沒有蛋白水解酶抗性的AMP失活。慢性傷口的傷口流體具有過量的蛋白酶，并且移植的材料被來自宿主流體的血漿組分快速覆蓋。慢性傷口和醫(yī)學移植物均常與微生物生物膜關聯(lián)。尤其是在治療生物膜相關感染中，抗生素大多全身給予，因此易于在血液和周圍組織中被酶促降解。因此，由于對血漿組分敏感，許多AMP(包括OP-145)的應用受限于例如局部應用。因此明顯需要對血漿組分有抗性的替代的AMP，尤其是潛在的全身治療劑和/或有效對抗與例如慢性傷口和醫(yī)學移植物相關的生物膜感染的治療劑。

本發(fā)明目的在于提供新型強效抗微生物肽，其克服了常規(guī)抗生素的劣勢并具有優(yōu)于已知的抗微生物肽改善的性質，尤其由于其抵抗血漿組分。本文另一目的是提供在導入哺乳動物如人時為非變應原性的抗微生物肽，其對致病性微生物具有高特異性，并且對生物膜相關感染中的病原性微生物具有特別高的抗微生物活性。本發(fā)明的肽或多肽針對生物膜中的微生物以及未組織在生物膜中的微生物發(fā)揮強效、廣譜的抗微生物活性，具有快速的抗微生物活性，并且可用作治療劑、預防劑或診斷劑。本發(fā)明的肽或多肽設計為克服有效性持續(xù)時間受限和應用性受限的問題，這是由于其在血液、血漿和血清中以及存在來自它們的組分時能保留其抗微生物活性。

發(fā)明人發(fā)現基于序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR的肽P139-P163對(耐藥性)革蘭氏陽性菌(例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))和革蘭氏陰性菌(例如，綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))以及真菌(例如白色念珠菌(Candida albicans)和黑曲霉(Aspergillus niger))高度有效，參見表2-4和11，圖1和2。因此所述肽發(fā)揮廣譜抗生物素活性。所有肽均非常強效，如其低IC99.9值所示，其在PBS中與OP-145相當。重要的是，發(fā)現存在血漿時，所有的肽均比OP-145有效。存在血漿時的大多數肽甚至比OP-145明顯更強效，具有多至16倍高的活性(表2-4)。如表2所證實，存在50％血漿時OP-145的IC99.9為204.8μM。存在血漿時P148和P159的IC99.9為12.8μM(16倍增加)。存在血漿時P140、P141、P144、P145、P150、P151、P152、P153、P158、P160、P161、P162和P163的IC99.9為25.6μM(8倍增加)。存在血漿時，P139、P142、P143、P146、P147、P154、P156和P157的IC99.9為51.2μM(4倍增加)，P149和P155的IC99.9為102.4μM(2倍增加)。

已證實P145、P148和P159對中對數生長期和穩(wěn)定期細菌培養(yǎng)物均有效(參見表2-4)。此外，P145、P148和P159能抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成(參見圖3)。此外，P145、P148和P159具有可證明的免疫調節(jié)活性，因其中和內毒素脂磷壁酸(LTA)和脂多糖(LPS)，因此降低促炎反應(表12)。

還發(fā)現具有至少16個氨基酸的短P148變體在PBS中的抗微生物活性與P148相當(參見表5)。重要的是，存在血漿時的抗微生物活性在該短變體中依然保留。具有14個氨基酸的P148短變體具有比P148低的抗微生物活性，但其仍比存在血漿的OP-145的效果強5倍。

因此，本發(fā)明的多肽在存在或不存在血漿時均具有針對殘留或不殘留在生物膜中的微生物的高抗微生物活性，具有LPS和LTA中和活性表明的最佳的抗炎(微生物化合物-中和)活性。

本發(fā)明的抗微生物肽對生物膜感染的效果在以下三點：它們防止生物膜形成并打散已有的生物膜，殺死釋放位點處及周圍的細菌、真菌或其它微生物，和通過中和促炎微生物內毒素如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)和脂多糖(LPS)并激活巨噬細胞以促進它們的吞噬作用和殺微生物活性來協(xié)調免疫反應。這種免疫控制對于防止植入物周圍的組織變?yōu)椴≡w的新環(huán)境而言是必要的。

因此，本發(fā)明提供了一種分離或重組多肽，包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR，或所述氨基酸序列的變體，所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性，并且在存在50％血漿的情況下針對至少一種微生物種具有體外抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲的活性，在相同條件下測定時，該活性比OP-145的活性至少高1.3倍，

所述變體序列具有至少14個氨基酸并且任選具有：

-一個或多個下述的氨基酸取代：

·選自L、V、F、A、I、W、Y或Q的組的一個或多個氨基酸被選自該組的另一氨基酸取代；

·R和/或K被帶正電氨基酸取代；

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸；

-由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或

-來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列。

本發(fā)明還提供了一種分離或重組多肽，包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR，或所述氨基酸序列的變體，所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性，并且在存在50％血漿的情況下針對至少一種微生物種具有體外抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲的活性，在相同條件下測定時，該活性比OP-145的活性至少高1.3倍，

所述變體序列具有至少14個氨基酸并且任選具有：

-一個或多個下述的氨基酸取代：

·選自L、V、F、A、I、W、Y或Q的組的一個或多個氨基酸被選自該組的另一氨基酸取代；

·R和/或K被A或帶正電氨基酸取代；

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸；

-由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或

-來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列。

在本文限定的氨基酸序列或其變體中，用單字母符號表示氨基酸。這些單字母符號和三字母符號是本領域技術人員所熟知的，并具有以下含義：A(Ala)是丙氨酸、C(Cys)是半胱氨酸、D(Asp)是天冬氨酸、E(Glu)是谷氨酸、F(Phe)是苯丙氨酸、G(Gly)是甘氨酸、H(His)是組氨酸、I(Ile)是異亮氨酸、K(Lys)是賴氨酸、L(Leu)是亮氨酸、M(Met)是甲硫氨酸、N(Asn)天冬酰胺、P(Pro)是脯氨酸、Q(Gln)是谷氨酰胺、R(Arg)是精氨酸、S(Ser)是絲氨酸、T(Thr)是蘇氨酸、V(Val)是纈氨酸、W(Trp)是色氨酸、Y(Tyr)是酪氨酸。如本文所用，“帶正電氨基酸”指生理pH下(即pH 7.3-7.4)具有正電荷的氨基酸。

本發(fā)明的多肽具有抗微生物活性，優(yōu)選抗細菌、抗病毒和/或抗真菌活性，更優(yōu)選抗細菌和/或抗真菌活性。此外，本發(fā)明的多肽優(yōu)選同時具有抗微生物和抗炎活性。本文所述的術語多肽的“抗微生物活性”是指抵抗至少一種微生物，例如細菌、病毒和/或真菌的生長或增殖，并包括抑制、降低或防止生長或增殖以及殺死微生物。微生物是微觀的生物體，即，通常太小難以被人的肉眼看到。微生物是非常多種多樣的，它們包括細菌、病毒、真菌、古細菌、原生動物和細藻。類似地，本文所用術語“抗細菌活性”、“抗病毒活性”、“抗真菌活性”和“抗寄生蟲活性”是指分別抵抗一般細菌、病毒、真菌和寄生蟲的生長或增殖，并包括抑制、降低或防止生長或增殖以及殺死它們。例如，抗微生物活性表示為抑制濃度(IC)或致死濃度(LC)。本文所用ICx或LCx指2小時后殺傷至少x％微生物的最低肽濃度。例如IC99.9和LC99.9指殺傷≥99.9％微生物的最低肽濃度。可通過本領域已知的方法來測量抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和抗寄生蟲活性。

這類方法之一詳述于本申請的實施例并涉及測定抗微生物活性的體外試驗。在該方法中，在微生物-多肽混合物在合適的培養(yǎng)基之中或之上孵育之后，用不同濃度的本發(fā)明多肽孵育微生物，例如細菌或真菌孵育持續(xù)例如約1-2小時，以確立與未用多肽孵育的微生物樣品(以相同方式進一步處理)相比的存活和/殺傷的微生物的數量。

可以使用病毒空斑試驗來評估本發(fā)明的多肽的抗病毒活性。簡言之，病毒接種物在任意單層細胞感染之前暴露于多肽。在標準間隔之后，使用這些提取物的多個稀釋物通過感染新鮮的單層細胞并定量它們對單層細胞的作用來確定細胞提取物中的病毒效價。

為了評價抗寄生蟲活性，本發(fā)明的多肽與寄生蟲孵育標準時間間隔。此后，可直接分析寄生蟲的代謝活性，例如通過MTT試驗，或者可將寄生蟲移植到哺乳動物細胞中并在孵育之后通過顯微鏡來評價這些細胞中的寄生蟲繁殖。

本文所用術語多肽的“抗炎活性”是指在已感染微生物，例如細菌、病毒、真菌和/或寄生蟲的對象中抑制、減少或防止炎癥反應。本發(fā)明的多肽的抗炎活性通過抑制、減少或防止促炎微生物化合物，如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)和/或脂多糖(LPS)的釋放來實現?？赏ㄟ^本領域已知的方法來測量抗炎活性。此類方法的示例為LPS中和試驗和LTA中和試驗，如本申請實施例所述。該方法中，本發(fā)明的多肽與固定濃度的LPS或LTA(例如500ng/ml LPS或2mg/ml LTA)混合并孵育30分鐘。此后，將這些混合物加入稀釋的新鮮人全血中并在20小時后，通過ELISA測量血液樣品中細胞因子(例如，LTA為1L-8，LPS為1L-12p40)的水平。

本發(fā)明的多肽抵抗血漿，還稱為血液血漿，優(yōu)選人血漿。本文所用“血漿”或“血液血漿”具有本領域常規(guī)含義。其指血液中移除了紅細胞、白細胞和血小板的流體部分，該部分包括蛋白質、激素和其他有機化合物和無機化合物例如電解質。本文所用“抵抗血漿”定義為在存在50％血漿，優(yōu)選人血漿的情況下針對至少一種微生物種具有體外抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲的活性，在相同條件下測定時，該活性比OP-145的活性至少高1.3倍。優(yōu)選針對至少一種微生物物種的所述活性比OP-145的活性高至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選比OP-145的活性高至少5倍。在存在50％血漿的情況下，特別優(yōu)選的多肽針對至少一種微生物物種的抗微生物活性比OP-145的抗微生物活性至少高16倍。

“存在50％血漿”表示當多肽或OP-145與添加血漿的液體(例如PBS)中的微生物孵育時測量的抗微生物活性，所述血漿優(yōu)選人血漿，終濃度為50％?！跋嗤磻獥l件”表示對本發(fā)明多肽的抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性的測定所用的條件與對OP-145的抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性的測定所用的條件相同。此類條件包括但不限于：孵育多肽和微生物的緩沖液、微生物物種的同一性、微生物濃度、孵育時間和溫度以及所用血漿的來源。

OP-145具有序列JIGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLRB，其中J是乙酰基且B是酰氨基。本領域技術人員能使用常用固相合成法或本文詳述的重組技術來合成OP-145從而能比較OP-145與其他肽的抗微生物活性。此外，乙?；王０坊潜绢I域常用技術，因此本領域技術人員能對OP-145的肽鏈的N末端進行乙酰化并對C末端進行酰胺化。

如本文所述，體外抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性優(yōu)選表示為IC99.9或IC 50。本文所用“IC99.9”和“IC50”分別指在給定時間內(例如2小時)殺傷至少99.9％或50％微生物的最低肽濃度。本發(fā)明的多肽優(yōu)選在存在50％血漿的情況下針對至少一種微生物種的體外IC99.9至多為相同條件下測定的OP-145的IC99.9的75％。本發(fā)明的多肽在存在50％血漿的情況下針對至少一種微生物種的體外IC99.9優(yōu)選至多為相同條件下測定的OP-145的IC99.9的70％，更優(yōu)選至多為60％、更優(yōu)選至多為50％、更優(yōu)選至多為40％、更優(yōu)選至多為30％、更優(yōu)選至多為20％、最優(yōu)選至多為10％。特別優(yōu)選的多肽在存在50％血漿的情況下針對至少一種微生物種的體外IC99.9至多為相同條件下測定的OP-145的IC99.9的10％。

本發(fā)明多肽在存在50％血漿的情況下在2小時后于37℃下針對至少一種微生物物種的體外IC99.9優(yōu)選為150μM。該IC99.9優(yōu)選按照實施例中所述的測定抗微生物活性的方法測定。實施例中所述用于測定針對與生物膜不關聯(lián)的微生物的抗微生物活性的方法涉及將添加人血漿(終濃度50％)的PBS中的50μL多肽溶液與5x10⁶CFU/mL PBS的20μL細菌懸液在孔中混合。該混合物37℃震蕩孵育2小時后，樣品用于評估細菌計數。殺傷99.9％細菌的最低肽濃度稱為抑制濃度(IC)99.9。細菌計數可通過手工CFU計數來測定。為了測定抗細菌活性，使用例如1x10⁶CFU/ml細菌，為了測定抗真菌活性，使用例如1x10⁵細胞/ml。

為了測定抗生物膜活性，實施例所述方法涉及在96‐孔聚丙烯板中的生物膜調整的BM2中用1x10⁸CFU/ml的金黃色葡萄球菌JAR060131于37℃孵育所述多肽24小時后測定IC50，所述板通過用20％血漿于4℃孵育過夜而包被有血漿，通過PBS洗滌四次移除浮游細菌并用結晶紫染色生物膜。用乙醇增溶之后，測定590nm的光密度作為生物膜質量的量度。

本發(fā)明多肽在存在50％血漿的情況下的體外IC99.9優(yōu)選至多為100μM、更優(yōu)選至多為80μM、更優(yōu)選至多為51.2μM、更優(yōu)選至多為30μM。本發(fā)明的優(yōu)選多肽的本文所定義的IC99.9為至多25.6μM。特別優(yōu)選所述多肽在存在50％血漿的情況下針對至少一種微生物物種的體外IC99.9至多為12.8μM。

所述至少一種微生物物種為例如細菌物種例如金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，真菌物種例如白色念珠菌(C.albicans)和黑曲霉菌(A.niger)，寄生蟲物種例如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和弓形蟲(Toxoplasma gondii)，或病毒物種例如甲肝病毒、丙肝病毒、甲型流感病毒等。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽在存在50％血漿的情況下針對至少一種細菌或真菌物種的體外IC99.9為至多105μM，優(yōu)選針對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉菌，最優(yōu)選本發(fā)明多肽在存在50％血漿的情況下針對至少金黃色葡萄球菌(最優(yōu)選Campoccia等(Int J Artif Organs.2008 9月；31(9):841-7)所述的金黃色葡萄球菌JAR)的體外IC99.9為至多105μM。本發(fā)明的優(yōu)選多肽針對金黃色葡萄球菌的本文所定義的IC99.9至多25.6μM、更優(yōu)選至多12.8μM。

優(yōu)選的變體序列具有至多一個氨基酸被A取代。這可為任何氨基酸，例如氨基酸1-24位中的任一。如表6-8所證實，其中一個氨基酸被丙氨酸取代的多肽保持至少部分抗微生物活性，而對于一些丙氨酸取代的多肽來說活性甚至增加。

還提供一種包含氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR，或所述氨基酸序列的變體的分離或重組多肽，

所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性，并且在存在50％血漿的情況下具有體外抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲的活性，在相同條件下測定時，該活性比OP-145的活性至少高1.3倍，

所述變體具有至少14個氨基酸并且任選具有：

-一個或多個下述的氨基酸取代：

·K被帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被R、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代；

·R被帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被K、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代；

·L被V、I或W取代；

·Y被W或Q取代；

·V被F或A取代；

·I被L取代；

·W被F、Y、L或I取代

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸；

-由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或

-來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列。

還提供一種包含氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR，或所述氨基酸序列的變體的分離或重組多肽，

所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性，并且在存在50％血漿的情況下具有體外抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲的活性，在相同條件下測定時，該活性比OP-145的活性至少高1.3倍，

所述變體具有至少14個氨基酸并且任選具有：

-一個或多個下述的氨基酸取代：

·K被A或帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被A、R、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代；

·R被A或帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被A、K、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代；

·L被A、V、I或W取代；

·Y被A、W或Q取代；

·V被F或A取代；

·I被A或L取代；

·W被A、F、Y、L或I取代

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸；

-由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或

-來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列。

該優(yōu)選的變體序列還優(yōu)選具有至多一個氨基酸被A取代。這可為任何氨基酸，因此氨基酸1-24位中的任一氨基酸可被A取代。

本文所用的氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR的變體的長度為至少14個氨基酸并且優(yōu)選具有一個或多個下述氨基酸取代：

-K被帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被R、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代，更優(yōu)選被R取代；

-R被帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被K、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代，更優(yōu)選被K取代；

-L被V、I或W取代；

-Y被W或Q取代；

-V被F或A取代；

-I被L取代；

-W被F、Y、L或I取代

由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸

由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸。優(yōu)選地，所述變體序列具有多至14個所述取代，更優(yōu)選多至10個所述取代，例如多至9、多至8、多至7、多至6、多至5、多至4、多至3、多至2或1個所述取代。

優(yōu)選所述變體序列任選具有一個或多個下述氨基酸取代：

-在氨基酸位置2處用R取代K

-在氨基酸位置3處用R取代K

-在氨基酸位置4處用V取代L

-在氨基酸位置5處用W取代Y

-在氨基酸位置8處用V取代L

-在氨基酸位置9處用F或A取代V

-在氨基酸位置10處用R取代K

-在氨基酸位置11處用L取代I

-在氨基酸位置12處用I或W取代L

-在氨基酸位置15處用F、Y、L或I取代W

-在氨基酸位置16處用F、Y、L或I取代W

-在氨基酸位置18處用Q取代Y

-在氨基酸位置20處用R取代K

-在氨基酸位置21處用K取代R

由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸

在此，氨基酸位置的編號如下：L₁K₂K₃L₄Y₅K₆R₇L₈V₉K₁₀I₁₁L₁₂K₁₃R₁₄W₁₅W₁₆R₁₇Y₁₈L₁₉K₂₀R₂₁P₂₂V₂₃R₂₄。所述變體還任選具有一個或多個、更優(yōu)選至多一個氨基酸被A取代。這可為任何氨基酸，因此氨基酸1-24位中的任一氨基酸可被A取代。

優(yōu)選地，本文限定的變體序列具有至多15個所述氨基酸取代，更優(yōu)選至多10個所述氨基酸取代，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個所述取代。此外，本文所述變體序列優(yōu)選至少包含氨基酸序列KRLVKILKRWWRYL，即氨基酸6-19，任選具有一個或多個所述氨基酸取代。因此提供一種包含氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR，或包含所述氨基酸序列的變體的分離或重組多肽，

所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲活性，并且在存在50％血漿的情況下針對至少一種微生物種具有體外抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌和/或抗寄生蟲的活性，在相同條件下測定時，該活性比OP-145的活性至少高1.3倍，

所述變體序列至少具有氨基酸序列KRLVKILKRWWRYL，任選具有：

-多至10個下述氨基酸取代：

·選自L、V、F、A、I、W、Y或Q的組的一個或多個氨基酸被選自該組的另一氨基酸取代；

·R和/或K被A或帶正電氨基酸取代；

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸；

-由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或

-來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列。

還優(yōu)選具有至少一個所述氨基酸取代的變體序列。

本發(fā)明優(yōu)選的多肽包括表1所示的肽P139、P140、P141、P142、P143、P144、P145、P146、P147、P148、P149、P150、P151、P152、P153、P154、P155、P156、P157、P158、P159、P160、P161、P162或P163的氨基酸序列，因為這些肽具有PBS中的高度抗微生物活性，并且在存在血漿時相比肽OP-145具有更高的抗微生物活性。優(yōu)選地，所述多肽包括表1所示的肽P139、P140、P141、P142、P145、P146、P147、P148、P150、P151、P152、P153、P154、P156、P157、P158、P159、P160、P161、P162或P163的氨基酸序列，因為這些肽在存在血漿時相比肽OP-145具有至少高4倍的抗微生物活性。更優(yōu)選地，所述多肽包括表1所示的肽P140、P141、P145、P148、P150、P151、P152、P153、P158、P159、P160、P161、P162或P163的氨基酸序列，因為這些肽在存在血漿時相比肽OP-145具有至少高8倍的抗微生物活性。

本發(fā)明特別優(yōu)選的多肽包括氨基酸序列LKRLYKRLAKLIKRLYRYLKKPVR(其為肽P145的氨基酸序列)，或所述氨基酸序列的變體，所述變體具有至少14個氨基酸并任選具有由相應的D-氨基酸和/或由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或任選具有來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列，更優(yōu)選所述多肽至少包括氨基酸序列LKRLYKRLAKLIKRLYRYLKKPVR的氨基酸14-19，最優(yōu)選所述多肽包括氨基酸序列LKRLYKRLAKLIKRLYRYLKKPVR。該多肽特別優(yōu)選是由于肽P145具有強效廣譜抗微生物活性(存在或不存在血清)，以及抗炎性。

本發(fā)明另一特別優(yōu)選的多肽包括氨基酸序列LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR(其為肽P148的氨基酸序列)，或所述氨基酸序列的變體，所述變體具有至少14個氨基酸并任選具有由相應的D-氨基酸和/或由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或任選具有來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列，更優(yōu)選所述多肽至少包括氨基酸序列LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR的氨基酸14-19，最優(yōu)選所述多肽包括氨基酸序列LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR、RVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR、LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKP、RVWKRVFKLLKRYWRQLKK、WKRVFKLLKRYWRQLKKPVR、LKRVWKRVFKLLKRYWRQLK、VWKRVFKLLKRYWRQLKK、WKRVFKLLKRYWRQLK、KRVFKLLKRYWRQL。這些是肽P148、P325、P326、P327、P328、P329、P330、P331和P332的氨基酸序列。該多肽特別優(yōu)選是由于肽P148具有強效廣譜抗微生物活性(存在或不存在血清)，以及抗炎性，并且肽P325、P326、P327、P328、P329、P330、P331和P332保留肽P148的活性。

本發(fā)明另一個特別優(yōu)選的多肽包括氨基酸序列LKRLYKRVFRLLKRYYRQLRRPVR(其為肽P159的氨基酸序列)，或所述氨基酸序列的變體，所述變體具有至少14個氨基酸并任選具有由相應的D-氨基酸和/或由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸，和/或任選具有來自所述氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反序列，更優(yōu)選所述多肽至少包括氨基酸序列LKRLYKRVFRLLKRYYRQLRRPVR的氨基酸14-19，最優(yōu)選所述多肽包括氨基酸序列LKRLYKRVFRLLKRYYRQLRRPVR。該多肽特別優(yōu)選是由于肽P159具有強效廣譜抗微生物活性(存在或不存在血清)，以及抗炎性。

本發(fā)明另一優(yōu)選的多肽包含表6、7和8所示的肽P246、P247、P248、P249、P250、P251、P252、P253、P254、P255、P256、P257、P258、P259、P260、P261、P262、P263、P264、P265、P266、P267、P268、P269、P270、P271、P272、P273、P274、P275、P276、P277、P278、P279、P280、P281、P282、P283、P284、P285、P286、P287、P288、P289、P290、P291、P292、P293、P294、P295、P296、P297、P298、P299、P300、P301、P302、P303、P304、P305、P306、P307、P308、P309、P310、P311、P312、P313、P314、P315、P316或P317的氨基酸序列，因為這些肽具有PBS中的高度抗微生物活性，并且在存在血漿時相比肽OP-145具有更高的抗微生物活性。具有該氨基酸序列的多肽為其中一個氨基酸被A取代的多肽P145、P148或P159的變體。本發(fā)明特別優(yōu)選的多肽具有肽P276的氨基酸序列，其為在位置7處的R被A取代的P148的變體。

本發(fā)明優(yōu)選的多肽具有選自表1、2、5、6、7、8、9和/或10的多肽的氨基酸序列。本發(fā)明多肽更優(yōu)選包括氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或其變體，其選自表2或5-10并且在50％血漿中的致死濃度(LC)99.9為至多102.4μM。在一個實施方式中，提供選自表2或5-10的50％血漿中LC 99.9為至多51.2μM(更優(yōu)選至多51.2μM)的多肽。

或者或除了上述氨基酸被另一氨基酸取代之外，本文所述的氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR的變體可在上述一個或多個氨基酸取代之后包含一個或多個由其相應的D-氨基酸或由對應于所述氨基酸序列中已存在的L-氨基酸的D-氨基酸所取代的L-氨基酸。本文中用大寫的單字母符號表示的氨基酸，如A代表丙氨酸，是天然蛋白質中通常發(fā)現的那些L-氨基酸。本文所用的“相應D-氨基酸”是L-氨基酸的D-氨基酸相對物。例如，丙氨酸(A)的相應D-氨基酸是D-丙氨酸(a)，精氨酸(R)的相應D-氨基酸是D-精氨酸(r)，天冬酰胺(N)的相應D-氨基酸是D-天冬酰胺(n)等。本文限定的變體序列的所有L-氨基酸可被它們相應的D-氨基酸取代。本發(fā)明因此提供了包含氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或所述氨基酸序列的變體的多肽，所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲和/或抗炎活性，

所述變體序列具有至少14個氨基酸并且任選具有：

-一個或多個下述的氨基酸取代：

·選自L、V、F、A、I、W、Y或Q的組的一個或多個氨基酸被選自該組的另一氨基酸取代，或被氨基酸L、V、F、A、I、W、Y或Q的對應D-氨基酸取代；

·R被帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被K、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代，或被K或R的對應D-氨基酸取代；

·K被帶正電氨基酸取代，優(yōu)選被R、高賴氨酸、高精氨酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸取代，或被R或K的對應D-氨基酸取代；

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸。該變體序列還可具有選自K和R的一個或多個氨基酸(優(yōu)選至少一個氨基酸)被A取代，或被對應D-氨基酸取代。優(yōu)選所述變體序列任選具有一個或多個下述氨基酸取代：

·K被R或R的對應D-氨基酸取代；

·R被K或K的對應D-氨基酸取代；

·L被V、I或W或被氨基酸V、I或W的對應D-氨基酸取代；

·Y被W或Q或被氨基酸W或Q的對應D-氨基酸取代；

·V被F或A或被氨基酸F或A的對應D-氨基酸取代；

·I被L或L的對應D-氨基酸取代；

·W被F、Y、L或I或氨基酸L F、Y、L或I的對應D-氨基酸取代；

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸；

更優(yōu)選所述變體序列任選具有一個或多個下述氨基酸取代

-位置2的氨基酸K被R或被R的對應D-氨基酸取代；

-位置3的氨基酸K被R或被R的對應D-氨基酸取代；

-位置4的氨基酸L被V或被V的對應D-氨基酸取代；

-位置5的氨基酸Y被W或被W的對應D-氨基酸取代；

-位置8的氨基酸L被V或被V的對應D-氨基酸取代；

-位置9的氨基酸V被F或A或被氨基酸F或A的對應D-氨基酸取代；

-位置10的氨基酸K被R或被R的對應D-氨基酸取代；

-位置11的氨基酸I被L或被L的對應D-氨基酸取代；

-位置12的氨基酸L被I或W或被氨基酸I或W的對應D-氨基酸取代；

-位置15的氨基酸W被F、Y、L或I或被氨基酸F、Y、L或I的對應D-氨基酸取代；

-位置16的氨基酸W被F、Y、L或I或被氨基酸F、Y、L或I的對應D-氨基酸取代；

-位置18的氨基酸Y被Q或被Q的對應D-氨基酸取代；

-位置20的氨基酸K被R或被R的對應D-氨基酸取代；

-位置21的氨基酸R被K或被K的對應D-氨基酸取代；

-氨基酸被對應D氨基酸取代。

本文限定的氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR的變體可含有至多24個由其相應D-氨基酸取代的L-氨基酸。因此，變體序列可完全由D-氨基酸組成。例如，該變體序列可含有24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個由其相應的D-氨基酸取代L-氨基酸。優(yōu)選地，一個或多個L-氨基酸被其對應D-氨基酸取代的所述變體序列包含表1所示的肽P139、P140、P141、P142、P143、P144、P145、P146、P147、P148、P149、P150、P151、P152、P153、P154、P155、P156、P157、P158、P159、P160、P161、P162或P163的氨基酸序列的至少14個氨基酸。更優(yōu)選地，一個或多個L-氨基酸被其對應D-氨基酸取代的本發(fā)明的多肽任選地包含肽P1454、P148或P159的氨基酸序列。在一個實施方式中，本文所述變體序列包含氨基酸被其對應D-氨基酸的一個取代。氨基酸序列中D-氨基酸的位置是無關的。在另一個實施方式中，變體序列含有的所有L-氨基酸被其相應的D-氨基酸取代。本文所述變體序列還可為氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR的至少14個連續(xù)氨基酸或肽P139-163(優(yōu)選P145、P148或P159)之一的氨基酸序列的至少14個連續(xù)氨基酸的逆反肽。優(yōu)選所述變體序列是所述氨基酸序列的全長的逆反肽，優(yōu)選肽P139-163(更優(yōu)選P145、P148或P159)之一的氨基酸序列的全長的逆反肽。逆反肽是以參考氨基酸序列的反向序列由D-氨基酸組成的肽。例如，本發(fā)明的優(yōu)選變體序列是P145、P148或P159的氨基酸序列的逆反肽，即分別具有序列rvpkklyrylrkilkalrkylrkl、rvpkklqrwyrkllkfvrkwvrkl或rvprrlqryyrkllrfvrkylrkl，或所述序列之一的至少14個氨基酸。

本文所述的氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR的變體可包括多至5個取代，所述取代為氨基酸被非天然氨基酸取代，或在上述一個或多個氨基酸取代之后所述氨基酸序列中存在的氨基酸被非天然氨基酸取代。本文所用的“非天然氨基酸”是指非遺傳編碼的氨基酸，不考慮它們是否在自然中出現?？纱嬖谟诒疚乃薅ǖ陌被嵝蛄械淖凅w中的非天然氨基酸包括：β-氨基酸、對-?；?L-苯丙氨酸、N-乙酰基賴氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氫2-疊氮琥珀酸4-叔丁酯、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2,4-二氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、對氨基苯丙氨酸、2,3-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、2,2'-二氨基庚二酸、對氨基-L-苯丙氨酸、對-疊氮基-L-苯丙氨酸、D-烯丙基甘氨酸、對-苯甲?；?L-苯丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸對-溴苯丙氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、磺基丙氨酸、D-瓜氨酸、硫代-L-瓜氨酸、鎖鏈素、ε-氨基己酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、高精氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、羥基賴氨酸、異-羥基賴氨酸、3-(3-甲基-4-硝基芐基)-L-組氨酸甲酯、異鎖鏈素、異-異亮氨酸、異丙基-L-苯并丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-甲基賴氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、N-甲基纈氨酸、甲硫氨酸亞砜、2-萘基丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、異絲氨酸、3-苯基絲氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、5,5,5-三氟-DL-亮氨酸、鳥氨酸、3-氯-酪氨酸、N5-氨基甲酰基鳥氨酸、青霉胺、苯基甘氨酸、γ-氨基丁酸、吡啶基丙氨酸、1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、γ-羧基-DL-谷氨酸、4-氟-DL-谷氨酸、D-甲狀腺素、異-蘇氨酸、5-羥基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸、5-氟-色氨酸、3-氟-纈氨酸。

優(yōu)選地，所述序列的天然氨基酸由相應的非天然氨基酸取代。本文所用的“相應非天然氨基酸”是指是參考天然氨基酸的衍生物的非天然氨基酸。例如，天然氨基酸被相應的β-氨基酸取代。β-氨基酸的氨基與β碳結合，而不是與天然氨基酸中的α碳結合。例如，α-丙氨酸被β-丙氨酸取代等。天然氨基酸被所述天然氨基酸的衍生物的非天然氨基酸取代的其它示例如下。丙氨酸被例如β-丙氨酸、叔丁基丙氨酸、2-萘基丙氨酸；L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基異丁酸取代。精氨酸被例如高精氨酸、鳥氨酸、N5-氨基甲?；B氨酸、3-氨基-丙酸取代。天冬酰胺被例如N-乙基天冬酰胺取代。天冬氨酸被例如4-叔丁基氫2-疊氮琥珀酸取代。半胱氨酸被例如磺基丙氨酸、高半胱氨酸取代。谷氨酸被例如γ-羧基-DL-谷氨酸、4-氟-DL-谷氨酸取代。谷氨酰胺被例如D-瓜氨酸、硫代-L-瓜氨酸取代。甘氨酸被例如N-甲基甘氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、D-烯丙基甘氨酸取代。組氨酸被例如3-(3-甲基-4-硝基芐基)-L-組氨酸甲酯取代。異亮氨酸被例如異鎖鏈素、N-甲基異亮氨酸、異-異亮氨酸取代。亮氨酸被例如正亮氨酸、鎖鏈素、5,5,5-三氟-亮氨酸取代。賴氨酸被例如6-N-甲基賴氨酸、2-氨基庚酸、N-乙酰基賴氨酸、羥基賴氨酸、異-羥基賴氨酸取代。甲硫氨酸被例如甲硫氨酸亞砜取代。苯丙氨酸被例如對-氨基-L-苯丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、對-溴苯丙氨酸、對-酰基-L-苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸取代。脯氨酸被例如3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、1-乙?；?4-羥基-L-脯氨酸取代。絲氨酸被例如高絲氨酸、異絲氨酸、3-苯基絲氨酸取代。蘇氨酸被例如D-甲狀腺素、異-蘇氨酸取代。色氨酸被例如5-羥基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸、5-氟-色氨酸取代。酪氨酸被例如O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、3-氯-酪氨酸取代。纈氨酸被例如正纈氨酸、N-甲基纈氨酸、3-氟-纈氨酸取代。

本發(fā)明因此提供了包含氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或所述氨基酸序列的變體的多肽，所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲和/或抗炎活性，

所述變體序列具有至少14個氨基酸并且任選具有：

-一個或多個下述的氨基酸取代：

·選自L、V、F、A、I、W、Y或Q的組的一個或多個氨基酸被選自該組的另一氨基酸取代，或被氨基酸L、V、F、A、I、W、Y或Q的對應非天然氨基酸取代；

·R被K或K的對應非天然氨基酸取代；

·K被R或K的對應非天然氨基酸取代；

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸。該變體序列還可具有選自K和R的一個或多個氨基酸(優(yōu)選至少一個氨基酸)被對應非天然氨基酸A取代。

優(yōu)選所述變體序列任選具有一個或多個下述氨基酸取代：

·K被R或R的對應非天然氨基酸取代；

·R被K或K的對應非天然氨基酸取代；

·L被V、I或W或被氨基酸V、I或W的對應非天然氨基酸取代；

·Y被W或Q或被氨基酸W或Q的對應非天然氨基酸取代；

·V被F或A或被氨基酸F或A的對應非天然氨基酸取代；

·I被L或L的對應非天然氨基酸取代；

·W被F、Y、L或I或氨基酸L F、Y、L或I的對應非天然氨基酸取代；

-由相應的非天然氨基酸取代一個或多個氨基酸；

更優(yōu)選所述變體序列任選具有一個或多個下述氨基酸取代

-位置2的氨基酸K被R或被R的對應非天然氨基酸取代；

-位置3的氨基酸K被R或被R的對應非天然氨基酸取代；

-位置4的氨基酸L被V或被V的對應非天然氨基酸取代；

-位置5的氨基酸Y被W或被W的對應非天然氨基酸取代；

-位置8的氨基酸L被V或被V的對應非天然氨基酸取代；

-位置9的氨基酸V被F或A或被氨基酸F或A的對應非天然氨基酸取代；

-位置10的氨基酸K被R或被R的對應非天然氨基酸取代；

-位置11的氨基酸I被L或被L的對應非天然氨基酸取代；

-位置12的氨基酸L被I或W或被氨基酸I或W的對應非天然氨基酸取代；

-位置15的氨基酸W被F、Y、L或I或被氨基酸F、Y、L或I的對應非天然氨基酸取代；

-位置16的氨基酸W被F、Y、L或I或被氨基酸F、Y、L或I的對應非天然氨基酸取代；

-位置18的氨基酸Y被Q或被Q的對應非天然氨基酸取代；

-位置20的氨基酸K被R或被R的對應非天然氨基酸取代；

-位置21的氨基酸R被K或被K的對應非天然氨基酸取代；

-氨基酸被對應D氨基酸取代。

本發(fā)明的多肽可由氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或本文限定的該序列的變體組成。本文所用的“多肽”是指包含多個氨基酸的肽、多肽和擬肽。術語“多肽”和“肽”可互換使用。證明具有抗微生物活性的最小的本發(fā)明的多肽的長度為14個氨基酸。然而，氨基酸序列或其變體可以是更大的多肽的部分，即N端和/或C端被一個或多個其它氨基酸延伸的多肽的部分。本發(fā)明的多肽的氨基酸序列或其變體可在N端和/或C端經修飾，優(yōu)選通過包含N端和/或C端延伸基團?；蛘撸霭被嵝蛄谢蚱渥凅w是N端和/或C端延伸的。本發(fā)明的多肽因此包含至少14個氨基酸，并且可包含多達1000個氨基酸。然而，優(yōu)選較小的多肽以保持盡可能低的生產成本。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽的長度是14-200個氨基酸，更優(yōu)選14-100個氨基酸，更優(yōu)選14-50個氨基酸。例如，本發(fā)明的多肽包含14-24個氨基酸，即16、17、18、19、20、21、22、23或24個氨基酸。優(yōu)選所述多肽包含至少16個氨基酸，例如16-200、16-100或16-50個氨基酸。所述多肽優(yōu)選具有14-24個氨基酸。這類具有14-24個氨基酸的多肽任選地還具有N-端和/或C-端修飾，如選自乙?；?、己?；?、癸酰基-、肉豆蔻?；?、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-和丙酰基-殘基的N-端修飾和/或如選自酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1個或2個氨基-己酰基基團的C-端修飾。在一個實施方式中，本發(fā)明的多肽由本文所述氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或其變體組成，優(yōu)選由表1所述的P145、P148或P159的氨基酸序列或其至少14個氨基酸組成，任選具有N端和/或C端修飾，優(yōu)選包含N和/或C末端延長基團。

本文所用的“擬肽”是指含有非肽結構元件的化合物，該化合物模擬本發(fā)明的多肽的抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲和/或抗炎性質。因此，本發(fā)明的多肽可包含非肽結構元件。這類非肽結構元件可存在于本發(fā)明多肽的氨基酸序列中，作為所述序列的一個或多個氨基酸的取代或修飾的結果。或者，本發(fā)明的多肽可包含氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或其本文限定的變體外側，即在任選的N端和/或C端延伸基團中的非肽結構元件。擬肽中的非肽結構元件一般是對一個或多個現有氨基酸的修飾。通過對本發(fā)明的多肽進行結構性修飾來得到優(yōu)選的擬肽，例如，使用非天然氨基酸如本文上述限定的那些、構象約束物、多肽的環(huán)化、等排替代或其它修飾。本發(fā)明的多肽的氨基酸序列因此任選包含一個或多個修飾?？赏ㄟ^天然方法對該多肽進行修飾，如翻譯后加工，或通過化學修飾技術?？稍谒龆嚯牡娜我馕恢锰幉迦胄揎?，包括多肽主鏈、氨基酸側鏈和N端或C端處。單個多肽可含有多種類型的修飾，或單一類型的幾個修飾。修飾可包括乙?；?、酰胺化、?；?、磷酸化、甲基化、去甲基化、ADP-核糖基化、二硫鍵形成、泛素化、γ羧化、糖基化、羥基化、碘化、氧化、PEG化和硫化。另外，可向本發(fā)明的多肽提供標記物，如生物素、熒光素或黃素、脂質或脂質衍生物、糖基團。還可向本發(fā)明的多肽提供靶向部分。

在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的多肽經N末端和/或C末端修飾。本發(fā)明的多肽因此優(yōu)選包含N端和/或C端延伸基團?？捎糜诒景l(fā)明的多肽的N端和C端延伸基團是本領域熟知的。N端修飾的優(yōu)選示例是乙?；?、己酰基-、癸?；?、肉豆蔻?；?、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-和丙?；?殘基。C端修飾的優(yōu)選示例是酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1個或2個氨基-己?；鶊F。然而，其它N端或C端延伸基團也會產生本領域技術人員已知的活性化合物。在一個實施方式中，所述多肽包含N端乙?；?、己?；?、癸?；?、肉豆蔻?；?、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-或丙?；?殘基，以及C端酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1個或2個氨基-己?；鶊F。在一個實施方式中，提供了本發(fā)明的多肽，其中N端是乙?；亩鳦端是酰胺化的。

本發(fā)明因此提供了包含氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或所述氨基酸序列的變體的分離或重組多肽，所述多肽具有抗微生物、抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲和/或抗炎活性，所述變體序列具有至少14個氨基酸并任選地具有以下氨基酸取代中的一個或多個、優(yōu)選多至10個：

-在氨基酸位置2處用R取代K；

-在氨基酸位置3處用R取代K；

-在氨基酸位置4處用V取代L；

-在氨基酸位置5處用W取代Y；

-在氨基酸位置8處用V取代L；

-在氨基酸位置9處用F或A取代V；

-在氨基酸位置10處用R取代K；

-在氨基酸位置11處用L取代I；

-在氨基酸位置12處用I或W取代L；

-在氨基酸位置15處用F、Y、L或I取代W；

-在氨基酸位置16處用F、Y、L或I取代W；

-在氨基酸位置18處用Q取代Y；

-在氨基酸位置20處用R取代K；

-在氨基酸位置21處用K取代R；和/或

-由相應的D-氨基酸取代一個或多個氨基酸，

其中，所述氨基酸序列或其所述變體包含N端和/或C端延伸基團，優(yōu)選包含N端乙?；?、己?；?、癸?；?、肉豆蔻酰基-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-或丙?；?殘基，以及C端酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1個或2個氨基-己?；鶊F。本領域技術人員會清楚其它N端或C端延伸基團也會產生活性化合物。在此，氨基酸的編號如下：L₁K₂K₃L₄Y₅K₆R₇L₈V₉K₁₀I₁₁L₁₂K₁₃R₁₄W₁₅W₁₆R₁₇Y₁₈L₁₉K₂₀R₂₁P₂₂V₂₃R₂₄。所述多肽優(yōu)選包含表1所述的P145、P148或P159的氨基酸序列或其至少14個氨基酸。所述多肽還優(yōu)選具有14-24個氨基酸。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽包含疏水性部分。向陽離子(多)肽加入疏水性基團改善了它們中和微生物內毒素并與微生物膜相互作用的能力，并因此改善了它們消除微生物，例如病原體的能力。

如上文所述，可通過本領域已知的化學修飾技術來修飾本發(fā)明的多肽?？稍诙嚯暮铣善陂g或結束時導入對本發(fā)明的多肽的修飾。例如，當使用固相合成技術合成多肽時，可通過將仍然與樹脂結合的氨基酸序列與乙酸反應來進行N端乙?；?。作為另一個示例，在固相肽合成中使用特定類型的樹脂來進行C端酰胺化，如市售的Tentagel SAM(德國蒂賓根的ex Rapp(ex Rapp，Tübingen))。這些樹脂包含化學柄(chemical handle)，在切割期間從這些化學柄釋放酰胺化的(多)肽。修飾多肽的這些和其它方法是本領域任何技術人員已知的。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽包含細胞穿透肽。該細胞穿透肽是這樣一種肽序列，當其與本發(fā)明的抗微生物肽連接時，有助于有效轉移所述多肽穿過細胞膜。本領域任何已知的穿透肽均可用于本發(fā)明多肽中。細胞穿透肽的示例包括但不限于多聚精氨酸、TAT、HIV-Tat、R9-TAT、Pep-1、Pep-7、穿膜肽(penetratin)、轉運子、Antp、Rev、FHV包被蛋白、buforin II、MAP、K-FGF、Ku70、SynBl、HN-1、TP10、pVEC、BGSC和BGTC。

本發(fā)明多肽優(yōu)選是天然不存在的多肽，即本發(fā)明多肽優(yōu)選為非天然產生的多肽。本文所用“非天然產生”表示天然中不存在該形式的所述多肽，優(yōu)選天然中不存在所述多肽的氨基酸序列。

還提供本發(fā)明多肽的多聚體，其包含多至6個多肽，包括本文所述氨基酸序列LKKLYKRLVKILKRWWRYLKRPVR或其變體，優(yōu)選包含P145、P148或P159的氨基酸序列或其至少14個氨基酸。所述多聚體可包含至多6個具有相同氨基酸序列的多肽單體，或至多6個多肽單體，其中2個或更多個多肽單體具有不同的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多聚體包含至多6個具有相同氨基酸序列的本發(fā)明的多肽。

也提供了本發(fā)明的多肽的鹽。這類鹽包括，但不限于酸加成鹽和堿加成鹽。本文所用的多肽的“藥學上可接受的鹽”是指保留多肽的所需抗微生物、抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲和/或抗炎活性并適于給予人或動物的鹽。制備多肽的鹽的方法是本領域已知的，并且一般包括將多肽與藥學上可接受的酸或堿混合，例如，通過將產物的游離酸或游離堿形式與一個或多個當量的合適的酸或堿在溶劑或介質(鹽在該溶劑或介質中不溶)或溶劑(如水，其然后被真空或凍干去除)中混合，或通過在合適的離子交換樹脂上將現有鹽的陽離子交換成另一種陽離子。藥學上可接受的酸和堿的示例包括有機和無機酸，如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、馬來酸、丙二酸、三氟乙酸、肉桂酸、硫酸、鹽酸、氫溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸和硫氰酸，其與多肽的游離氨基形成銨鹽，和堿，其與多肽的游離羧基形成羧酸鹽，如乙胺、甲胺、二甲胺、三乙胺、異丙胺、二異丙胺和其它單烷基、二烷基和三烷基胺，以及芳基胺。

可通過多種方法制備本發(fā)明的多肽。例如，可通過本領域熟知的常用的固相合成方法，例如，涉及α氨基的t-BOC或FMOC保護的方法來合成多肽。在此，隨后向加長的氨基酸鏈加入氨基酸。這類方法例如描述于Merrifield(1963),J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156；和Atherton等，"Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)"倫敦的IRL出版社,(1989)。固相肽合成方法特別適于大規(guī)模生產中較短長度的多肽，如長度達到約70個氨基酸的多肽的合成。

或者，可使用本領域熟知的重組技術來制備本發(fā)明的多肽，其中在宿主細胞中表達編碼多肽的核苷酸序列。本發(fā)明因此提供了制備本發(fā)明的多肽的方法，包括：

-提供包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的核酸分子；

-用所述核酸分子轉化宿主細胞；

-在允許所述多肽表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；

-從所述細胞收獲所述多肽；

-任選地N端或C端修飾所述多肽，例如通過加入N端和/或C端延伸基團。

本發(fā)明還提供了包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的核酸分子，其在本文中也稱為本發(fā)明的核酸分子。本文所用的本發(fā)明的核酸分子或核酸序列包含核苷酸，優(yōu)選DNA和/或RNA鏈。

還提供了包含本發(fā)明的核酸序列分子的載體。本文所用術語“載體”是指能夠向宿主細胞導入異源核酸序列的核酸分子，如質粒、噬菌體或動物病毒。本發(fā)明的載體允許在宿主細胞中表達或產生由異源核酸序列編碼的本發(fā)明的多肽。本發(fā)明所用的載體例如衍生自動物病毒，其示例包括，但不限于痘苗病毒(包括減毒衍生物，如改良的安卡拉痘苗病毒，MVA)、新城疫病毒(NDV)、腺病毒或逆轉錄病毒。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含含有啟動子的表達盒，該啟動子適于在所選的宿主細胞中引發(fā)本發(fā)明的多肽的轉錄。真核宿主細胞中表達本發(fā)明的多肽的合適啟動子的示例包括，但不限于β-肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、5S RNA啟動子或病毒衍生的啟動子，如巨細胞病毒(CMV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)和猴病毒40(SV40)啟動子，用于哺乳動物宿主。

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核酸分子和/或載體的重組宿主細胞。宿主細胞是已經或能夠被核酸分子如本發(fā)明的載體轉化的細胞?！稗D化”是指外來核酸向受體細胞的導入。宿主細胞的轉化可導致重組蛋白質被所述細胞瞬時表達，表示該重組蛋白質僅表達持續(xù)限定的時間段。替代地，受體細胞的轉化可導致穩(wěn)定表達，表明核酸導入細胞的基因組中并由此傳到下一代細胞中。另外，可以實現重組蛋白質的誘導型表達。誘導型表達系統(tǒng)需要存在或缺少允許編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的表達的分子。誘導型表達系統(tǒng)的示例包括，但不限于Tet-On和Tet-Off表達系統(tǒng)、激素誘導型基因表達系統(tǒng)(例如蛻皮激素誘導型基因表達系統(tǒng))、阿拉伯糖誘導型基因表達系統(tǒng)、和使用pMT/BiP載體(英杰公司(Invitrogen))的果蠅誘導型表達系統(tǒng)，該載體包含誘導型金屬硫蛋白啟動子。在制備本發(fā)明的多肽的方法中使用的宿主細胞是例如革蘭氏陽性原核生物、革蘭氏陰性原核生物或真核生物。優(yōu)選地，所述宿主細胞是真核細胞，如植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞或昆蟲細胞，最優(yōu)選昆蟲細胞或哺乳動物細胞。合適的宿主細胞的示例包括植物細胞，如玉米細胞、水稻細胞、浮萍細胞、煙草細胞(如BY-2或NT-1細胞)和馬鈴薯細胞。酵母細胞的示例是釀酒酵母(Saccharomyces)和畢赤酵母(Pichia)。昆蟲細胞的示例是草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞，如Tn5、SF-9和SF-21細胞，以及果蠅細胞，如果蠅施耐德2(S2)細胞。適于表達本發(fā)明的多肽的哺乳動物的示例包括，但不限于，非洲綠猴腎細胞(Vero)、幼倉鼠腎細胞(如BHK-21)、人視網膜細胞(例如PerC6細胞)、人胚胎腎細胞(如HEK293細胞)、馬-達二氏犬腎(MDCK)細胞、雞胚成纖維細胞(CEF)、雞胚腎細胞(CEK細胞)、胚盤衍生的胚胎干細胞(例如EB14)、小鼠胚成纖維細胞(如3T3細胞)、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、和這些細胞類型的衍生物。

本發(fā)明的方法優(yōu)選還包括收獲、純化和/或分離本發(fā)明的多肽的步驟。所得的本發(fā)明的多肽優(yōu)選用于人類治療，任選地在額外純化、分離或加工步驟之后，例如使用凝膠電泳或色譜方法純化。

本發(fā)明的多肽顯示出可優(yōu)選同時用于治療或非治療應用的多種活性。具體地，本發(fā)明的多肽可用于對抗多種微生物感染，如細菌感染、真菌感染、病毒感染，以及對抗寄生蟲感染。提供了包含本發(fā)明的多肽或其藥學上可接受的鹽，以及至少一種藥學上可接受的運載體、稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物。還提供了包含本發(fā)明的核酸分子或載體以及至少一種藥學上可接受的運載體、稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物。

本發(fā)明還提供了用作藥物的本發(fā)明的多肽。還提供用作藥物的包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的核酸分子。所述藥物可以是治療劑或預防劑。

在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種治療患有或有風險患有細菌、真菌、病毒和/或寄生蟲感染的對象的方法，該方法包括給予所述對象治療有效量的本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的藥物組合物或本發(fā)明的核酸分子。還提供了一種制備用于治療感染微生物的對象或用于預防微生物感染的藥物的方法。在優(yōu)選的實施方式中，所述微生物是細菌、真菌、病毒或寄生蟲。還提供了用于防止或治療微生物、細菌、真菌、病毒和/或寄生蟲感染或微生物、細菌、真菌、病毒和/或寄生蟲感染導致的病癥的本發(fā)明用途的多肽和/或核酸分子。

本文所用的“對象”是人或動物。對象包括但不限于哺乳動物，如人、豬、雪貂、海豹、兔、貓、狗、牛和馬，以及鳥類如雞、鴨、鵝和火雞。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，對象是哺乳動物。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，對象是人。

本發(fā)明還提供了抑制微生物，例如細菌、病毒、真菌或寄生蟲生長的方法，該方法包括將所述微生物或寄生蟲與本發(fā)明的多肽或藥物組合物接觸?？稍隗w內或體外進行所述接觸。

本發(fā)明的多肽和藥物組合物有效治療多種微生物感染，如各種病毒、細菌和真菌感染。例如，多肽和藥物組合物有效治療革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌。可在人或動物中造成可用本發(fā)明的多肽和組合物治療的感染的致病性細菌的示例包括，但不限于利斯特氏菌屬、埃希氏菌屬、衣原體屬、立克次氏體屬、分枝桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、肺炎球菌屬、腦膜炎球菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、軍團菌屬、白喉、沙門氏菌屬、桿菌屬、霍亂弧菌、破傷風、梭菌屬、芽孢桿菌屬、耶爾森氏菌屬、和鉤端螺旋體屬。

可在人或動物中造成可用本發(fā)明的多肽和組合物治療的感染的致病性病毒的示例包括，但不限于甲肝、乙肝或丙肝、皰疹病毒(例如，VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II、CMV、EB病毒(EpsteinBarr))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒和人免疫缺陷病毒(HIV病毒；例如，I型和II型)。

可在人或動物中造成可用本發(fā)明的多肽和組合物治療的感染的致病性真菌的示例包括，但不限于念珠菌(例如，白色念珠菌、克魯斯念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌)、曲霉(例如，煙曲霉、黑曲霉)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、夾膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、毛霉屬、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子(Paracoccidioides brasiliensis)、和粗球孢子菌(Coccidioides immitis)。

可在人或動物中造成可用本發(fā)明的多肽和組合物治療的感染的致病性寄生蟲的示例包括，但不限于痢疾內變形蟲(Entamoeba histolytica)、瘧原蟲(例如，惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲)、阿米巴蟲、鞭毛蟲、結腸小袋絳蟲(Balantidium coli)、棘阿米巴屬、隱孢子蟲屬、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、果氏巴貝蟲(Babesia microti)、錐蟲(例如，布氏錐蟲、克氏錐蟲)、利什曼原蟲(例如，杜氏利什曼原蟲)、和弓形蟲(Toxoplasma gondii)。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的多肽和藥物組合物有效治療由甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和(非耐藥性)金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、革蘭氏陰性菌綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和真菌物種白色念珠菌(Candida albicans)和黑曲霉(Aspergillus niger)引起的感染。

可給予含多肽的組合物用于預防性和/或治療性處理。在治療性應用中，向已患有疾病的對象(優(yōu)選人)給予足夠對抗感染的癥狀或由感染及其障礙導致的病癥的量的多肽或組合物。在預防性應用中，向處于患有微生物或寄生蟲感染風險的對象，例如人或動物給予足夠防止感染或至少抑制感染發(fā)展的量的多肽或組合物。多肽一般以治療性的量存在于本發(fā)明的藥物組合物中，該量是足夠治療病癥或疾病，尤其是與微生物或寄生蟲感染相關的癥狀的量。給予本發(fā)明的多肽或其至少2種的組合的一般劑量是0.01至10mg多肽/kg體重，取決于多肽的大小。

本發(fā)明的多肽和藥物組合物適用于廣泛的應用。例如，其可用于局部應用，例如在治療或預防皮膚感染、傷口感染和泌尿道感染中。如本文之前詳述，本發(fā)明的多肽能夠防止生物膜形成并且打散已有的生物膜，殺死在生物膜形成部位處或其周圍的細菌、真菌或其它微生物，并通過中和促炎微生物內毒素來調節(jié)免疫反應。細菌生物膜可延遲皮膚傷口愈合并降低常規(guī)抗生素在愈合或處理受感染的皮膚傷口、皮膚感染或泌尿道感染中的局部抗菌功效。本發(fā)明因此提供用于治療或預防皮膚感染、傷口感染和/或泌尿道感染的本發(fā)明的多肽、藥物組合物和/或核酸分子。還提供本發(fā)明的多肽、藥物組合物和/或核酸分子用于傷口愈合。還提供了本發(fā)明的多肽、藥物組合物和/或核酸分子在制備用于治療或預防皮膚感染、傷口感染、泌尿道感染和/或傷口愈合的藥物組合物中的用途。本發(fā)明還提供了一種治療患有皮膚感染、傷口感染和/或泌尿道感染的對象的方法，該方法包括給予所述對象治療有效量的本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的藥物組合物或本發(fā)明的核酸分子。

本發(fā)明的多肽還優(yōu)選用作易受微生物，例如細菌、病毒、真菌、寄生蟲感染的物質的防腐劑。這類物質可浸漬、包被或覆蓋本發(fā)明的多肽。如前詳述，本發(fā)明多肽在血液、血漿和血清中以及存在組分例如血漿組分時保留抗微生物活性。因此，本發(fā)明的多肽和藥物組合物特別適用于全身應用和用于治療和/或防止移植物和醫(yī)療裝置相關的感染。本文所用術語“醫(yī)療裝置”是指可用于人或動物身體的任何類型的裝置，并且包括但不限于醫(yī)療裝置，醫(yī)療器械，假體如人工關節(jié)(包括臀部和膝蓋)，和牙科假體，胸植入體，可植入裝置如起搏器，心臟瓣膜，支架，導管，耳管，夾板，醫(yī)療裝置螺桿，和傷口或組織敷料。移植物和醫(yī)療裝置常與微生物感染相關，特別是生物膜感染，而這被本發(fā)明多肽成功抑制，如實施例所示。此外，移植物和醫(yī)療裝置在植入后通常被宿主流體的血漿組分快速覆蓋。如實施例所示，由于本發(fā)明的多肽在存在血漿時發(fā)揮抗微生物活性，移植物和/或醫(yī)療裝置的微生物感染被本發(fā)明多肽有效治療和/或阻止。因此提供本發(fā)明多肽作為移植物和/或醫(yī)療裝置的防腐劑的用途。還提供本發(fā)明多肽用于防止和/或治療移植物和/或醫(yī)療裝置的微生物感染、優(yōu)選細菌感染。

本發(fā)明的多肽優(yōu)選整合到控釋和/或靶向遞送運載體中。本文所用的術語“控釋”是指以時間依賴性方式釋放本發(fā)明的多肽。在一個實施方式中，控釋是指緩釋。本文所用的術語“靶向遞送”是指以位點導向的方式釋放本發(fā)明的多肽?？蒯屳d劑的使用具有以下優(yōu)勢，即可避免諸如通過注射本發(fā)明的多肽的頻繁給藥。使用靶向遞送載劑具有以下優(yōu)勢，即本發(fā)明的多肽有效遞送到和/或保留在對象身體的感興趣部位處，如炎癥部位或感染部位。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽靶向受到微生物包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲感染的部位。控釋和/或靶向遞送運載體是本領域所熟知的?？蒯尯?或靶向遞送載劑的非限制性示例是納米顆粒、微粒、納米膠囊、微膠囊、脂質體、微球、水凝膠、聚合物、脂質復合物、血清白蛋白、抗體、環(huán)糊精和葡聚糖。例如，通過將本發(fā)明的多肽整合到這種運載體的表面中或表面上來提供控釋。運載體由形成捕獲本發(fā)明的多肽的顆粒并在合適的環(huán)境(如水性、酸性或堿性環(huán)境或體液)中緩慢降解或溶解，從而釋放該多肽的材料組成。例如，通過提供表面上帶靶向基團的運載體來實現靶向遞送。這類包含靶向基團的運載體的示例是抗體官能化的運載體、具有位點特異性配體的運載體和帶正或負表面電荷的運載體。用于控釋和/或靶向遞送的優(yōu)選顆粒是納米顆粒，即，直徑范圍為約1至500nm，優(yōu)選至多約200nm的顆粒，和脂質體，任選地提供靶向基團。因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的控釋運載體和包含這種控釋運載體的藥物組合物。還提供了包含本發(fā)明的多肽的靶向遞送運載體，和包含這種靶向遞送運載體的藥物組合物。所述運載體優(yōu)選自納米顆粒、微粒、納米膠囊、微膠囊、脂質體、微球、水凝膠、聚合物、脂質復合物、血清白蛋白、抗體、環(huán)糊精和葡聚糖。

優(yōu)選的靶向遞送和/或控釋運載體由生物可降解材料組成。本文所用的“生物可降解”是指在生理條件下降解的分子。這包括可水解降解的分子和需要酶促降解的分子。合適的生物可降解材料包括，但不限于生物可降解的聚合物和天然的生物可降解的材料，如PLA(聚乳酸)，PGA(聚乙醇酸)，聚己酸內酯(PCA)，聚環(huán)氧乙烷(PEO)，聚二噁烷酮(PDS)，聚己酸內酯(PCL)，聚富馬酸丙二醇酯，衍生自內酯的聚合物，如交酯、乙交酯和己內酯，碳酸酯如碳酸亞丙酯和碳酸亞丁酯，二噁烷酮，乙二醇，聚酯酰胺(PEA)環(huán)氧乙烷，酯酰胺，γ-羥基戊酸酯，β-羥基丙酸酯，α-羥基酸，羥基丁酸酯，羥基烷酸酯，聚酰亞胺碳酸酯，聚氨酯，聚酐，及其組合，多糖如透明質酸，殼聚糖和纖維素，以及蛋白質如明膠和膠原。

還提供了一種涂層，優(yōu)選用于移植物和/或醫(yī)療裝置，該涂層包含本發(fā)明的多肽。在一個實施方式中，這類涂層提供了本發(fā)明的多肽的控釋。這類醫(yī)療裝置的控釋涂層優(yōu)選包含生物可降解材料，使得通過降解涂層材料來實現本發(fā)明的多肽的釋放。因此，還提供了包含本發(fā)明的多肽的控釋涂層。還提供了包含這類涂層的醫(yī)療裝置，該涂層包含本發(fā)明的多肽和生物可降解材料。還提供了包含這類涂層的移植物，該涂層包含本發(fā)明的多肽和生物可降解材料。本發(fā)明的生物可降解涂層包括上述定義的生物可降解材料。具體地，這類生物可降解涂層包含選自下組的材料：PLA(聚乳酸)，PGA(聚乙醇酸)，聚己酸內酯(PCA)，聚環(huán)氧乙烷(PEO)，聚二噁烷酮(PDS)，聚己酸內酯(PCL)，聚富馬酸丙二醇酯，衍生自內酯的聚合物，如交酯、乙交酯和己內酯，碳酸酯如碳酸亞丙酯和碳酸亞丁酯，二噁烷酮，乙二醇，聚酯酰胺(PEA)環(huán)氧乙烷，酯酰胺，γ-羥基戊酸酯，β-羥基丙酸酯，α-羥基酸，羥基丁酸酯，羥基烷酸酯，聚酰亞胺碳酸酯，聚氨酯，聚酐，及其組合，多糖如透明質酸，殼聚糖和纖維素，以及蛋白質如明膠和膠原。此外，提供防止和/或處理移植物和/或醫(yī)療裝置的微生物感染，優(yōu)選細菌感染的方法，包括提供具有含本發(fā)明多肽的涂層的所述移植物和/或醫(yī)療裝置并將所述移植物或醫(yī)療裝置植入對象中。

多肽和藥物組合物也可用作抗炎劑，由于它們中和促炎微生物內毒素如脂磷壁酸、肽聚糖和脂多糖，從而抑制、降低或防止嗜中性粒細胞、巨噬細胞/單核細胞和淋巴細胞的流入以及受感染的對象釋放促炎微生物化合物。因此，還提供了一種抑制促炎化合物釋放的方法，該方法包括將能夠釋放促炎化合物的細胞與本發(fā)明的多肽接觸?？稍隗w內或體外進行所述接觸。還提供了用作抗炎劑的本發(fā)明的多肽。

雖然本發(fā)明的多肽是強效抗微生物劑，但是它們可與其它已知的抗微生物劑組合，所述抗微生物劑如常規(guī)抗感染藥，如抗生素、抗病毒藥和抗真菌藥或其它抗微生物肽，以及抗體和化學物，例如，敏化劑、納米顆粒。這種組合可產生增加的抗微生物活性或拓寬活性譜。本發(fā)明的多肽例如可與青霉素類、頭孢菌素類、大環(huán)內酯類、氟喹諾酮類、磺酰胺類、四環(huán)素類和/或氨基糖苷類組合用于治療細菌感染。為了治療病毒感染，多肽可與抗病毒核苷類似物，如阿昔洛韋、更昔洛韋、齊多夫定(AZT)或地達諾新或者神經氨酸酶抑制劑，如奧塞米韋、帕拉米韋或扎那米韋組合。為了治療真菌感染，本發(fā)明的多肽和組合物可與多烯抗真菌劑、咪唑類、三唑類、丙烯胺類、棘球白素類、環(huán)吡酮胺、氟胞嘧啶和/或灰黃霉素組合。因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽和另外的抗微生物劑的藥物組合物，該抗微生物劑是如抗生素或抗微生物肽，優(yōu)選選自下組：青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、和莫匹羅星。

本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種藥學上可接受的運載體、稀釋劑或賦形劑。例如，合適的運載體的例子包括鑰孔血藍素(KLH)、血清白蛋白(如BSA或RSA)和卵清蛋白。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述合適的運載體是溶液，如鹽水。可整合到片劑、膠囊等中的賦形劑的示例如下：粘結劑如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如微晶纖維素；崩解劑如玉米淀粉、預膠化淀粉、海藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；調味劑如薄荷，冬青油，或櫻桃。當劑量單位形式是膠囊時，除了上述類型的材料以外，它可包含液體運載體(如脂肪油)?？梢源嬖诟鞣N各樣的其它材料作為包衣或者來改變所述劑型的外形。例如，可用紫膠、糖或兩者同時包被片劑。糖漿劑或酏劑可含有活性化合物，糖如甜味劑，用作防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯，染料和調味劑如櫻桃或橙風味。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選適合人使用。

可以多種不同的方式給予本文所述的藥物組合物。示例包括通過口服、鼻內、直腸、局部、腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、真皮下、皮內、鞘內和顱內方法給予包含本發(fā)明的多肽并含有藥學上可接受的運載體的藥物組合物。對于口服給藥，活性成份可以固體劑型給予，如膠囊、片劑和粉末，或以液體劑型，如酏劑、糖漿劑和懸液。

可按照常規(guī)藥學實踐通過在用于注射的載劑，如水或天然產生的植物油，如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等，或合成脂肪載劑如油酸乙酯等中溶解或懸浮本發(fā)明的多肽來配制用于注射的無菌組合物。也可納入緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑等。

還可可按照常規(guī)藥學實踐來配制用于局部給藥的組合物。本文所用的“局部給藥”是指施用于身體表面，如皮膚或粘膜以局部治療由微生物或寄生蟲感染導致的病癥。適用于局部給藥的制劑的示例包括，但不限于乳膏、凝膠、軟膏、洗液、泡沫、懸液、噴霧劑、氣溶膠、粉末氣溶膠。局部藥物可以是經表皮的，表明它們可直接施涂于皮膚上。局部藥物也可以是吸入的，例如，用于施用于呼吸道的粘膜上皮，或施用于除皮膚以外的組織的表面，如施用于結膜表面的滴眼液或置于耳中的滴耳液。所述配制用于局部給藥的藥物組合物包含至少一種適于局部施用的藥物賦形劑，如利泄劑、稀釋劑、潤濕劑、防腐劑、pH調節(jié)劑和/或水。

本發(fā)明的多肽也特別適于診斷用途。多肽可用于檢測微生物感染，例如，通過檢測生理樣品如血液、血漿、粘液、傷口滲出物和尿液中的微生物毒素，例如，細菌毒素包括LPS、LTA和PG。此外，多肽可用于測定這類樣品中微生物毒素的量。因此，本文提供了用作診斷劑的本發(fā)明的多肽核酸分子。還提供了本發(fā)明的多肽在檢測生理樣品如血液、血漿、傷口滲出物和尿液樣品中微生物毒素，優(yōu)選細菌或真菌毒素中的用途。如上所述，本發(fā)明的多肽可偶聯(lián)到合適的部分，如生物素、熒光素標記物、近紅外染料或放射性同位素上。這類標記的多肽可用于檢測微生物感染如細菌感染的方法中，因為它們會遷移到微生物感染的部位。使用適于所用的與多肽接合的標記物的檢測器，可能檢測感染部位。因此，本發(fā)明還提供了用于檢測微生物感染，如細菌感染的方法。該方法一般包括向已感染或懷疑正感染微生物生物體的對象給予標記的多肽。因為標記的多肽能夠與感染性生物體相互作用，其在感染部位處積累。為了檢測生理樣品中的微生物毒素，該方法包括向已感染或懷疑正感染微生物生物體的對象的生理樣品給予標記的多肽?？赡苁褂脤雍隙嚯牡臉擞浳锩舾械母鞣N檢測器來檢測多肽在感染部位處或樣品中的積累。

本發(fā)明的多肽的另一個有用的應用在于食品防腐。因此，還提供了本發(fā)明的多肽作為食品防腐劑的用途。一般而言，通過將食品經過60至100℃的溫度的熱處理來破壞致病性或腐壞微生物。這種處理可能對食品有不希望的影響，如不希望的感官作用。本發(fā)明的多肽作為食品防腐劑的用途可能導致延長的保質期和/或增強的食品安全性。

食品中的致病性微生物可引起對象感染或中毒，并且包括細菌如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi)和非鼠傷寒沙門氏菌(non-typhi Salmonella species)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、志賀氏菌(Shigella)和肉毒梭菌(Clostridium Botulinum)，病毒如輪狀病毒和諾瓦克病毒，寄生蟲如豬肉絳蟲(Taenia solium)、牛肉絳蟲(Taenia saginata)和旋毛蟲(Trichinella spiralis)和霉菌。食品腐壞是指食品的外觀、稠度、風味和/或氣味的變化，并且可能是由細菌如乳桿菌、明串珠菌、假單胞菌、微球菌、黃桿菌、沙雷氏菌、腸桿菌和鏈球菌，真菌如曲霉、鐮刀菌和枝孢以及酵母造成的。

下面借助以下非限制性實施例更具體地解釋本發(fā)明。

附圖說明

圖1：存在5μM卡泊芬凈(Cancidas)或0.8‐6.4μM所述肽的情況下培養(yǎng)在PBS中的黑曲霉菌的生長曲線。值表示為相對于0小時處光密度的600nm處光密度。16小時孵育后PBS中的真菌生長的光學顯微圖。三次重復的代表性光學顯微圖。

圖2：用PBS、卡泊芬凈、OP‐145或所述肽孵育16小時后25％血漿中黑曲霉菌生長的光學顯微圖。三次重復的代表性光學顯微圖。

圖3：不同濃度(μM)對金黃色葡萄球菌JAR060131生物膜形成的抑制。結果表示為三次獨立實驗的相對于未處理樣品(0)±標準偏差的平均生物膜質量百分比。A，未包被孔中的生物膜形成。B，血漿包被孔中的生物膜形成。

實施例

材料和方法

抗微生物肽的合成

通過正常Fmoc-化學法來制備合成肽，其使用預加載Tentagel樹脂，PyBop/NMM用于原位激活和NMP中20％哌啶用于去除Fmoc(Hiemstra HS等，Proc Natl Acad Sci USA,94,10313-10318(1997))。用6倍?；镔|進行偶聯(lián)，持續(xù)60分鐘。在最后去除Fmoc之后，當肽序列中存在C(三乙基硅烷)或W(乙硫醇)時，用含其他清除劑的TFA/H₂O 19/1(v/v)來切割肽。通過用醚/戊烷1/1(v/v)沉淀和離心分離產物來分離肽。在約40℃下空氣干燥之后，肽溶解在乙酸/水1/10(v/v)中并凍干。使用UPLC-MS(沃特斯公司(Waters)的Acquity)檢驗肽的純度并且使用Maldi-Tof質譜(布魯克公司(Bruker)的Microflex)檢驗完整性，顯示預期的分子質量。

縮寫：

Fmoc：9H-芴基甲氧羰基

NMM：N-甲基嗎啉

PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-六氟磷酸鏻

TFA：三氟乙酸

細菌菌株

由荷蘭馬斯特里赫特的馬斯特里赫特大學醫(yī)學中心的S.Croes博士友情提供甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，MRSA)的臨床分離株LUH14616(參見Croes S BMC Microbiol.2009；9:229.doi:10.1186/1471-2180-9-229)。

金黃色葡萄球菌JAR描述于Campoccia等(Int J Artif Organs.2008年9月；31(9):841-7)。

表皮葡萄球菌RP62a如Infect.Immun.2008；75:1129-1136中所述。

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1如Nucl.Acids Res 2011；39,增刊1:D596-D60所述。

細菌在-80℃下儲存直至使用。通過將從血液瓊脂板分離的細菌菌落在胰蛋白酶大豆湯(TSB)培養(yǎng)基(法國Le Pont de Clax的BD公司(Becton Dickinson))中孵育2.5小時，然后稀釋至所需的濃度來制備對數中期細菌接種物。穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌JAR060131獲自18‐20小時培養(yǎng)物。

測定抗細菌活性

用PBS中下述菌種的1x10⁶CFU/ml的中對數生長期培養(yǎng)物孵育肽：金黃色葡萄球菌JAR060131、甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)LUH14616、表皮葡萄球菌RP62a和銅綠假單胞菌PAO1，添加或不添加匯集的人血漿(傘奎公司(Sanquin)，阿姆斯特丹，荷蘭)至終濃度50％。抗微生物活性表達為99.9％致死濃度(LC99.9)，即37℃震蕩孵育2小時后殺傷≥99.9％細菌的最低肽濃度。

為了評估肽對穩(wěn)定期細菌的抗微生物活性，在上述條件下用1x10⁶CFU/ml獲自18-20小時培養(yǎng)物的穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌JAR060131孵育肽。

測定抗真菌活性

用白色念珠菌Y‐O1的1x10⁵細胞/ml的中對數生長期培養(yǎng)物孵育肽，添加或不添加匯集的人血漿至終濃度50％。抗微生物活性表達為99％致死濃度(LC99)，即37℃震蕩孵育2小時后殺傷≥99％細胞的最低肽濃度。

肽對真菌生長的效果用黑曲霉評估。用PBS中的7.5x10⁴孢子/ml黑曲霉PagsA‐lux孵育肽，添加或不添加匯集的人血漿至終濃度25％。

作為陽性對照，孢子用抗真菌卡泊芬凈(Cancidas)處理。測定隨時間的吸光度，并在16小時用光學顯微鏡觀察真菌生長。

測定抗生物膜活性

如Antimicrob Agents Chemother 2012；56:2696-2704所述，在96孔聚丙烯板中的生物膜調整的BM2中用1x10⁸CFU/ml金黃色葡萄球菌JAR060131孵育肽。37℃孵育24小時后，用PBS經四次沖洗移除浮游生物細菌，并用結晶紫染色生物膜。用乙醇增溶之后，測定590nm的光密度作為生物膜質量的量度。抗生物膜活性表達為50％抑制濃度(IC50)，即導致≥50％生物膜質量降低的最低肽濃度。

為了評估存在血漿時肽的抗生物膜活性，用20％血漿通過4℃孵育過夜對96孔聚丙烯板進行血漿包被。用無菌水沖洗孔一次，并用上述金黃色葡萄球菌和肽進行接種。

免疫調節(jié)活性：LPS和LTA中和

用500ng/ml LPS(大腸桿菌O54)或2mg/ml LTA(無內毒素的金黃色葡萄球菌)或1x10⁹CFU/ml的UV‐殺傷的金黃色葡萄球菌JAR060131于37℃預孵育肽30分鐘。37℃用肽-LPS/LTA/金黃色葡萄球菌混合物刺激稀釋的人全血進行20小時。用ELISA測定上清中的IL‐12p40和IL‐8水平。LPS和LTA中和活性表示為50％或90％抑制濃度(IC50和IC90)，即導致LPS/LTA/金黃色葡萄球菌‐誘導的IL‐12p40或IL‐8生產下降≥50或≥90％的最低肽濃度。

結果

鑒定源自OP-145的25個肽

抗微生物并且相對OP-145而言對血漿組分易感性下降的新型肽基于計算機預測進行鑒定。

預測OP-145采取兩親性螺旋結構。在該結構中，所述肽折疊為α-螺旋，其在螺旋一側含有帶電荷基團，在另一側含有疏水基團。從應用具有氨基酸取代的肽的前述研究可知，引入在螺旋的疏水側結束的帶電荷基團，或引入在螺旋的帶電荷側結束的疏水基團，產生具有降低的抗細菌活性的化合物。

因此我們決定新設計的肽需要預測為以兩親性螺旋折疊。基于OP-145的序列，我們針對氨基酸取代設計了如下基序。我們關注的取代所產生的肽與OP-145具有重要區(qū)別，使得OP-145的結構相似性最小，并且使最小化結合血漿組分(影響抗微生物活性)的機會最大。

計算機預測顯示下述基序會得到具有兩親性螺旋的肽。

下述25個肽基于所述基序進行選擇(J＝乙酰基,B＝酰胺)。

表1.肽P139-163的序列。J＝乙酰基，B＝酰胺

存在或不存在血漿的情況下測試這些肽的抗細菌活性(表2)。

基于所獲結果，P145、P148和P159選擇作為比OP-145顯著改善的肽。

表2.源自OP-145的肽的抗微生物活性。¹抗微生物活性表示為IC99.9(μM)，即2小時內殺傷99.9％細菌接種物(約1x10⁶CFU/ml的金黃色葡萄球菌JAR)的最低肽濃度。

P145,P148和P159針對不同細菌的抗微生物活性

在PBS中，P145、P148和P159與OP‐145一樣針對中對數期培養(yǎng)物的所有細菌物種具有相似的抗微生物活性(表3)。存在50％血漿時，P145、P148和P159相對OP‐145顯示出針對下述菌種的更高的殺菌活性：金黃色葡萄球菌JAR060131(11‐16‐倍)、MRSA LUH14616(21‐26‐倍)、表皮葡萄球菌RP62a(43‐倍)和銅綠假單胞菌PAO1(>11‐21‐倍)。

表3.中對數期培養(yǎng)物在PBS和50％血漿中的OP‐145、P145、P148和P159的抗微生物活性。結果表示為LC99.9，即導致≥99.9％細菌殺傷的最低肽濃度(μM)。結果是至少兩次獨立實驗的中值。

OP‐145、P145、P148和P159顯示針對穩(wěn)定期金黃色葡萄球菌JAR060131的相比對數期細菌的相似的抗微生物活性(表4)。因此，存在50％血漿時，P145、P148和P159顯示出針對金黃色葡萄球菌JAR060131而言比OP‐145更高的殺菌活性。

表4.PBS和50％血漿中的OP‐145、P145、P148和P159針對金黃色葡萄球菌JAR060131的穩(wěn)定期上清的抗微生物活性。結果是三次獨立實驗的均值。

P148的長度變體的抗微生物活性

P148的C末端和N末端缺失4個氨基酸對針對金黃色葡萄球菌JAR060131的抗微生物活性沒有影響(表5)。C末端和N末端缺失5個氨基酸相比P148降低了抗微生物活性，但是相對OP-145仍增加了5倍活性。

表5.PBS和50％血漿中P148的長度變體的抗微生物活性。結果表示為LC99.9，即導致≥99.9％金黃色葡萄球菌殺傷的最低肽濃度(μM)。結果是兩次獨立實驗的均值。J＝乙?；?，B＝酰胺

具有多丙氨酸取代的P145、P148和P159的抗微生物活性

P145、P148和P159的一個氨基酸和P148的兩個氨基酸取代為丙氨酸對其針對金黃色葡萄球菌JAR060131的抗微生物活性沒有影響(表6-9)。

表6.在不同位置具有丙氨酸取代的P145在PBS和50％血漿中的抗微生物活性。兩次獨立實驗的結果。J＝乙?；?，B＝酰胺

表7.在不同位置具有丙氨酸取代的P148在PBS和50％血漿中的抗微生物活性。兩次獨立實驗的結果。J＝乙酰基，B＝酰胺

表8.在不同位置具有丙氨酸取代的P159在PBS和50％血漿中的抗微生物活性。兩次獨立實驗的結果。J＝乙?；?，B＝酰胺

表9.具有多丙氨酸取代的P148在PBS和50％血漿中的抗微生物活性。結果是兩次獨立實驗的均值。J＝乙?；?，B＝酰胺

具有帶正電氨基酸取代的P148變體的抗微生物活性

其中賴氨酸或精氨酸已被帶正電氨基酸取代的P148變體在PBS中和50％血漿中都保留針對金黃色葡萄球菌的抗微生物活性(表10)。

表10.具有帶正電氨基酸取代的P148在PBS和50％血漿中的抗微生物活性。J＝乙?；?O＝鳥氨酸；X＝二氨基丁酸(DABA)；U＝二氨基丙酸(DAPA),B＝酰胺。

P145、P148和P159的抗真菌活性

PBS中51.2μM的OP‐145對白色念珠菌Y‐O1沒有抗真菌活性(表11)。P145、P148和P159殺傷99％白色念珠菌的濃度范圍為12.8μM(對于P159)-38.4μM(對于P148)。在50％血漿中，P145、P148和P159的抗真菌活性為204.8μM。該濃度下，未觀察到OP‐145的抗真菌活性。

表11.OP-145、P145、P148和P159在PBS和50％血漿中的抗真菌活性。結果是兩次獨立實驗的均值。

OP‐145在3.2μM濃度時抑制>99.9％的黑曲霉生長(圖1)。P145顯示與OP‐145相似的抗真菌活性，而P148具有高4倍的抗真菌活性，0.8μM時已抑制真菌生長。相比OP‐145，P159的抗真菌活性低2倍。由于血漿影響光密度值，僅基于光學顯微鏡評估存在血漿時肽的抗真菌活性。存在25％血漿時，204.8μM的OP‐145抑制真菌生長(圖2)。P145、P148和P159在102.4μM時抑制生長。

P145、P148和P159的抗生物膜活性

3.2μM的OP‐145顯示對生物膜形成≥50％的抑制(圖3A)。P145的IC50值為6.4μM，對P148和P159來說為12.8μM。最大生物膜抑制為約75％。值得注意的是，在生物膜調整的BM2培養(yǎng)基中，這些肽在多至51.2μM仍不顯示抗微生物活性。在血漿包被的孔中，3.2μM的OP‐145和P159抑制50％的生物膜形成，而對P145和P148來說，抑制50％的生物膜形成需要2倍高的濃度(圖3B)。存在血漿時的最大生物膜抑制范圍為61％(對于P148)-82％(對于P159)。

免疫調節(jié)活性：P145、P148和P159的LPS和LTA中和

OP‐145的IC50和IC90分別為0.15nM和1.25nM。0.03nM時P148已經抑制>50％的LPS-誘導的IL‐12p40生產，P159為0.05nM時。P148和P159在0.25nM時達到對LPS-誘導的IL‐12p40的90％抑制，P145在0.75nM時達到(表11)。肽中和LTA的能力通過測量血細胞對LTA‐誘導的IL‐8生產的抑制來評估。在終濃度為0.781μM時，OP‐145抑制>50％的IL‐8生產(5μg/ml LTA誘導)(表11)。P145、P148和P159的LTA‐中和能力增加4倍。肽還用UV‐殺傷的金黃色葡萄球菌JAR060131進行預孵育。用0.195μM OP‐145孵育使得由金黃色葡萄球菌JAR誘導的IL‐8的產生下降>50％(表12)。P159與OP-145具有相似的中和活性，而使金黃色葡萄球菌誘導的IL‐8的產生抑制>50％則需要8倍高的P145和P148濃度。

表12.OP‐145、P145、P148和P159的LPS、LTA和金黃色葡萄球菌中和活性。對于LPS中和來說，用來自兩個供體的血液進行實驗。對于LTA和金黃色葡萄球菌中和而言，用來自一個供體的血液進行實驗。