專利名稱：殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料及其制備方法
殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于水凝膠技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
細胞作為生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，可以感受來自外界的物理、化學和生物等因子的刺激，并對刺激做出響應(yīng)。細胞生長的基底硬度是一個重要的力學研究參數(shù)，也是當前細胞力學領(lǐng)域研究的熱點。Engler等研究顯示干細胞對組織彈性非常敏感，可隨組織中的彈性指數(shù)變化而向某一譜系分化(專化)并產(chǎn)生相應(yīng)的表型。類似于腦組織的軟基質(zhì)有“神經(jīng)向”誘導功能，肌肉組織稍硬基質(zhì)有“肌向”誘導功能，軟骨的硬度有“骨向”誘導功能。
研究者用聚丙烯酰胺水凝膠為硬度可變基底材料來進行細胞培養(yǎng)研究不同軟硬基底對細胞彈性以及細胞生理的影響，然而細胞在聚丙烯酰胺水凝膠基底生長需要表襯利于細胞貼附的物質(zhì)如膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、明膠、多聚賴氨酸和多肽等。Tony Yeung等研究了成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和中性粒細胞在表襯纖連蛋白或膠原的不同軟硬度的聚丙烯酰胺水凝膠上細胞形態(tài)學、細胞骨架和整合素表達等變化和細胞的運動趨向。上述研究通常根據(jù)不同的研究目的和內(nèi)容而采用不同表襯物質(zhì)對細胞生長的基底進行表襯。目前細胞力學研究領(lǐng)域主要熱點是力學參數(shù)的改變對細胞的影響，而用這些胞外基質(zhì)蛋白對基底表面進行表襯后，就要考慮表襯的物質(zhì)對細胞的影響，但是這樣卻增加了研究的復雜性而不能單獨去研究基底硬度這個力學因素對細胞的影響，如Denitsa Docheva等研究膠原蛋白和纖連蛋白對前列腺 癌細胞的彈性和細胞骨架影響，發(fā)現(xiàn)生長在表襯膠原蛋白和纖連蛋白基底的細胞彈性會發(fā)生變化，因為這些胞外基質(zhì)蛋白與細胞膜蛋白整合素分子相互作用，從而引起細胞內(nèi)微絲蛋白的重組和解聚動態(tài)平衡發(fā)生變化，而細胞內(nèi)微絲蛋白是維持細胞彈性的重要蛋白。所以當用聚丙烯酰胺水凝膠基底研究不同軟硬度對細胞彈性影響時，表襯的蛋白分子和基底的軟硬都會影響細胞彈性。
而殼聚糖以其生物官能性、血液相容性、安全性和抑菌性等優(yōu)良性質(zhì)在醫(yī)藥、生物醫(yī)學工程等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。如將不同材料與殼聚糖制成膜，讓這兩種材料原有功能得到協(xié)調(diào)；用殼聚糖制備各種微載體；制備組織工程支架材料。殼聚糖帶正電荷有利于細胞的貼壁，我們將殼聚糖制成薄膜并在其上接種細胞，發(fā)現(xiàn)在殼聚糖膜上細胞貼壁時間變短，具有明顯的發(fā)展?jié)摿Α?br> 現(xiàn)有技術(shù)的缺點:用聚丙烯酰胺水凝膠為硬度可變基底材料來進行細胞培養(yǎng)研究不同軟硬基底對細胞彈性以及細胞生理的影響，然而細胞在聚丙烯酰胺水凝膠基底生長需要表襯利于細胞貼附的物質(zhì)如膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、明膠、多聚賴氨酸和多肽等，影響因素過多，研究復雜，不能單一的研究基底硬度對細胞的影響。發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能得到不同硬度的、加入的殼聚糖有利于細胞貼壁生長、不增加研究的復雜性和難度且成本低廉的、能單獨研究基底硬度對細胞影響的殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料及其制備方法。
本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的:一種殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料，其關(guān)鍵在于由以下體積份數(shù)的組分組成:
丙烯酰胺溶液:1.25份；
甲叉雙丙烯酰胺溶液:0.5 3份；
H2O:0.75 3.25 份；
過硫酸銨溶液0.03份；
四甲基乙二胺0.02份；
殼聚糖溶液0.5 I份。
上述殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度為1%，其配制方法為:將0.5g殼聚糖加入到50mLl%醋酸溶液中，37°C攪拌至溶解，靜置24h后，得到質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖溶液。
上述甲叉雙丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為1%;所述丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為30%。
上述甲叉雙丙烯酰胺溶液與H2O的體積份數(shù)之和為3.75份。
一種所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料的制備方法，其關(guān)鍵在于由以下步驟組成:
(I)混合攪拌:按權(quán)利要求1所述體積份數(shù)加入丙烯酰胺溶液、甲叉雙丙烯酰胺溶液、過硫酸銨溶液、四甲基乙二胺、殼聚糖溶液混合均勻后，加入到離心管中，于旋渦混合機上攬拌5 IOmin ；
(2)移入玻璃夾板反應(yīng):用移液槍將混合攪拌后的溶液灌入10cm*6cm的玻璃夾板內(nèi)，夾穩(wěn)夾板涂上防漏液，在室溫下充分反應(yīng)；
(3)浸泡:然后將制成的凝膠放入醫(yī)用生理鹽水和雙抗的混合溶液中，所述醫(yī)用生理鹽水和雙抗體積份數(shù)比為100:1，浸泡48h，每12h換一次浸泡液，最后得到殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料。·
上述殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度為1%，其配制方法為:將0.5g殼聚糖加入到50mLl%醋酸溶液中，37°C攪拌至溶解，靜置24h后，得到質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖溶液。
上述甲叉雙丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為1%;所述丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為30%。
上述甲叉雙丙烯酰胺溶液與H2O的體積份數(shù)之和為3.75份。
1、測量殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠溶脹性
將殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠取小片放到35mm培養(yǎng)皿內(nèi)置于37°C烘箱中烘干，稱重記錄。向培養(yǎng)皿內(nèi)加入PBS溶液，室溫下，每20min吸凈培養(yǎng)皿內(nèi)多余PBS溶液，稱重記錄，如此反復直至重量不再變化，則視水凝膠達到飽和，結(jié)果如

圖1和圖2所示。
結(jié)果顯示:不同配方制備的殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠在120min后，凝膠吸水達到飽和，吸水量不再有明顯變化，這可以說明，將凝膠經(jīng)過24h孵育后，完全達到飽和，由此可以排除基底吸水膨脹帶來的牽張拉力對細胞的影響，從而易于細胞的生長。
2、測定聚丙烯酰胺水凝膠和殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠彈性模量
流變儀是流變學實驗中常用儀器之一，旋轉(zhuǎn)流變儀(AR200eX0)屬于應(yīng)力控制類流變儀，其工作原理:用在旋轉(zhuǎn)運動過程中產(chǎn)生的剪切流動來快速測定材料的粘彈性等多種流變學性質(zhì)。測量前按表I分別配制不同配方的聚丙烯酰胺水凝膠和殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠，然后將其放入PBS溶液中浸泡過夜，切成直徑約為2cm圓片，上機進行測定，參數(shù)設(shè)置:溫度25°C、切應(yīng)力為1%、振蕩頻率0.2Hz。所得數(shù)據(jù)用Spss軟件進行顯著性檢驗，結(jié)果如圖3和圖4所示。
表I不同配方的聚丙烯酰胺水凝膠和殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料，其特征在于由以下體積份數(shù)的組分組成: 丙烯酰胺溶液:1.25份； 甲叉雙丙烯酰胺溶液:0.5 3份；H2O:0.75 3.25 份； 過硫酸銨溶液0.03份； 四甲基乙二胺0.02份； 殼聚糖溶液0.5 I份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料，其特征在于:所述殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度為1%，其配制方法為:將0.5g殼聚糖加入到50mL體積濃度為1%的醋酸溶液中，37°C攪拌至溶解，靜置24h后，得到質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料，其特征在于:所述甲叉雙丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為1% ;所述丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為30%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料，其特征在于:所述甲叉雙丙烯酰胺溶液與H2O的體積份數(shù)之和為3.75份。
5.一種權(quán)利要求1所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料的制備方法，其特征在于由以下步驟組成: (1)混合攪拌:按權(quán)利要求1所述體積份數(shù)加入丙烯酰胺溶液、甲叉雙丙烯酰胺溶液、過硫酸銨溶液、四甲基乙二胺、殼聚糖溶液混合均勻后，加入到離心管中，于旋渦混合機上攬祥5 IOmin ； (2)移入玻璃夾板反應(yīng):用移液槍將混合攪拌后的溶液灌入10cm*6cm的玻璃夾板內(nèi)，夾穩(wěn)夾板涂上防漏液，在室溫下充分反應(yīng)； (3)浸泡:然后將制成的凝膠放入醫(yī)用生理鹽水和雙抗的混合溶液中，所述醫(yī)用生理鹽水和雙抗體積份數(shù)比為100:1，浸泡48h，每12h換一次浸泡液，最后得到殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料的制備方法，其特征在于:所述殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度為1%，其配制方法為:將0.5g殼聚糖加入到50mLl%醋酸溶液中，37°C攪拌至溶解，靜置24h后，得到質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料的制備方法，其特征在于:所述甲叉雙丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為1% ;所述丙烯酰胺溶液的質(zhì)量濃度為30%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料的制備方法，其特征在于:所述甲叉雙丙烯酰胺溶液與H2O的體積份數(shù)之和為3.75份。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料及其制備方法，其中一種殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料，由丙烯酰胺溶液；甲叉雙丙烯酰胺溶液；H2O；過硫酸銨溶液；四甲基乙二胺；殼聚糖溶液組成。而一種殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料的制備方法，其關(guān)鍵在于由(1)混合攪拌；(2)移入玻璃夾板反應(yīng)；(3)浸泡三個步驟組成。本發(fā)明為一種殼聚糖聚丙烯酰胺水凝膠基底材料及其制備方法，具有工藝簡單，能得到不同硬度的水凝膠，且得到的水凝膠具有無毒性作用、易于細胞貼壁生長，降低了研究細胞力學的復雜性，有利于對細胞力學性質(zhì)進行研究，且降低了研究的成本。
文檔編號C08F220/56GK103224679SQ20131016942
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者葉志義, 吳貴生, 劉良臣 申請人:重慶大學