一種3-甲硫基丙酸的制備方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬微生物來源的化合物分離鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種3-甲硫基丙酸的制備方法。

背景技術(shù)：
微生物具有分布廣、種類多、易變異、次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富且結(jié)構(gòu)新穎等特點(diǎn)，因此篩選微生物來源的化合物獲得先導(dǎo)化合物以用于新藥開發(fā)有著不可估量的潛力。利用微生物制備的豐富多樣的化合物資源庫，一些原本只能通過化學(xué)合成方法才能得到的化合物如苯甲酰甲酸甲酯（公開號(hào)：CN102719497A）、（S）-環(huán)氧氯丙烷（公開號(hào)：CN102533921A）、鄰苯二甲酸二丁酯（公開號(hào)：CN102703534A）等均可利用微生物發(fā)酵或轉(zhuǎn)化獲得，并且微生物發(fā)酵及代謝產(chǎn)物分離純化過程與化學(xué)合成的方法相比，具有條件溫和、環(huán)境友好、成本低、可在人工控制的條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。3-甲硫基丙酸的分子式如式1所示：式1據(jù)報(bào)道，3-甲硫基丙酸具有植物毒性作用（PerreauxD,etal.PhysiolPlantPath.1982,20（3）：313-319）。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
因此，本發(fā)明解決的技術(shù)問題是針對(duì)目前3-甲硫基丙酸的微生物制備方法較為缺乏的問題，提供一種利用蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）制備3-甲硫基丙酸的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為：一種3-甲硫基丙酸的制備方法，包括以下步驟：（1）發(fā)酵培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus），將所得發(fā)酵液固液分離后收集菌體，用有機(jī)溶劑浸泡菌體，所述有機(jī)溶劑選自丙酮，甲醇或乙醇中的一種或幾種，破碎菌體，離心取上清液，將上清液濃縮后利用乙酸乙酯萃取，將所得萃取液濃縮至干；（2）將步驟（1）所得產(chǎn)物用無水乙醇溶解，采用反相硅膠柱層析，利用甲醇-水混合液或甲醇-氯仿混合液進(jìn)行梯度洗脫，所述混合液中甲醇的濃度為0～100%，所述百分比為體積百分比，收集甲醇濃度為30～70%的洗脫液濃縮至干；（3）將步驟（2）所得產(chǎn)物利用無水乙醇溶解，加入硅膠攪拌，采用硅膠柱層析，利用石油醚-丙酮混合液洗脫，所述混合液中石油醚:丙酮的體積比為10:1～1:10，收集洗脫液濃縮干燥即得。步驟（1）為：發(fā)酵培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus），將所得發(fā)酵液固液分離后收集菌體，用有機(jī)溶劑浸泡菌體，所述有機(jī)溶劑選自丙酮，甲醇或乙醇中的一種或幾種，破碎菌體，離心取上清液，將上清液濃縮后利用乙酸乙酯萃取，將所得萃取液濃縮至干。其中所述的蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）為常規(guī)蠟狀芽孢桿菌，所述菌株較佳地為蠟狀芽孢桿菌（BacillusCereus）CGMCCNO.1.126。其中所述發(fā)酵為常規(guī)發(fā)酵技術(shù)。所述發(fā)酵的培養(yǎng)基配方較佳地為：玉米淀粉3%，花生餅粉1.5%，麥芽糖0.6%，玉米漿0.4%，蛋氨酸0.1%，氯化鈷0.6×10-3%，微量元素溶液0.1×10-3%，實(shí)驗(yàn)用水，pH7.2。其中所述微量元素溶液的配方較佳地為：FeCl3.6H2O0.27g/L、ZnSO4.7H2O0.08g/L、CoCl2.6H2O0.07g/L、Na2MO4.2H2O0.07g/L、CuSO4.5H2O0.08g/L、H3BO30.02g/L、MnSO4.H2O0.05g/L，實(shí)驗(yàn)用水，pH7.4。其中所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為常規(guī)培養(yǎng)條件，較佳地為：培養(yǎng)溫度25～35℃，震蕩速度150～250r/min，培養(yǎng)時(shí)間48～72h。其中所述固液分離為常規(guī)技術(shù)，較佳地為采用離心方法。所述固液分離的離心條件較佳地為：3000～5000rpm，離心1～2小時(shí)。其中所述有機(jī)溶劑為常規(guī)有機(jī)溶劑，較佳地為選自丙酮，甲醇或乙醇中的一種或幾種；優(yōu)選地為丙酮。其中所述破碎菌體的方法為常規(guī)破碎菌體方法，較佳地為超聲處理法或高壓勻漿破壁法，優(yōu)選為超聲處理法。所述超聲處理法的條件較佳地為：50～70kHz超聲處理4～6小時(shí)。其中所述離心技術(shù)為常規(guī)技術(shù)，所述離心的條件較佳地為：3000～5000rpm，離心20～40分鐘。步驟（2）為：將步驟（1）所得產(chǎn)物用無水乙醇溶解，采用反相硅膠柱層析，利用甲醇-水混合液或甲醇-氯仿混合液進(jìn)行梯度洗脫，所述混合液中甲醇的濃度為0～100%，所述百分比為體積百分比，收集甲醇濃度為30～70%的洗脫液濃縮至干。其中所述反相硅膠層析柱為常規(guī)反相硅膠層析柱，較佳地為AQ-C18反相層析柱，所述反向硅膠層析柱的填充量較佳地為50～80g，更佳地為80g。其中所述甲醇-水混合液或甲醇-氯仿混合液為常規(guī)洗脫液，較佳地是甲醇-氯仿混合液，更佳地為甲醇-水混合液，所述混合液中甲醇的濃度較佳地為0～100%，更佳地為0%、30%、50%、70%以及100%甲醇-水混合液，優(yōu)選地為30%甲醇-水混合液，所述百分比為體積百分比。所述甲醇混合液的用量較佳地為1～2L，優(yōu)選地為2L。所述洗脫的流速較佳地為20～40ml/min，更佳地為20ml/min。其中所述濃縮為常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮。步驟（3）將步驟（2）所得產(chǎn)物利用無水乙醇溶解，加入硅膠攪拌，采用硅膠柱層析，利用石油醚-丙酮混合液洗脫，所述混合液中石油醚:丙酮的體積比為10:1～1:10，收集洗脫液濃縮干燥即得。其中所述硅膠為常規(guī)硅膠，較佳地為200～300目硅膠。所述的硅膠層析柱較為常規(guī)硅膠層析柱，較佳地為正相硅膠層析柱或反相硅膠層析柱，更佳地為正相硅膠層析柱，所述正相硅膠層析柱較佳地為200～300目硅膠層析柱，更佳地為300目硅膠層析柱，所述正相硅膠層析柱的裝填量較佳地為5～10g，更佳地為10g。其中所述洗脫所使用的洗脫液較佳地為：石油醚-乙酸乙酯混合液、氯仿-甲醇洗脫液或石油醚-丙酮混合液，更佳地為石油醚-丙酮混合液，所述石油醚-丙酮混合液中石油醚與丙酮的體積比較佳地為10:1～1:10，更佳地為10:1，所述洗脫的速度較佳地為5～15ml/min。其中所述濃縮為常規(guī)濃縮技術(shù)，較佳地為減壓濃縮，所述減壓濃縮的條件較佳地為：40～45℃，真空度700～800mmHg。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明所述3-甲硫基丙酸的制備方法具有材料來源方便、制備周期短、更加綠色環(huán)保和工藝簡單的優(yōu)勢。附圖說明圖1為蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液預(yù)處理流程圖。圖2為3-甲硫基丙酸分離純化的流程圖。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，所述試劑為常規(guī)試劑，或按照商品說明書選擇。實(shí)施例1蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵：將保藏在甘油管（50%的甘油）中的蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）菌種(CGMCCNO.1.126)接種至含30ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，實(shí)驗(yàn)用水，pH7.2。接種1ml的種子液至750ml的三角搖瓶（含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基）中，30℃，200r/min的條件下培養(yǎng)72h。共富集8L菌株蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉3%，花生餅粉1.5%，麥芽糖0.6%，玉米漿0.4%，蛋氨酸0.1%，氯化鈷0.6×10-3%，微量元素溶液0.1×10-3%，水，pH7.2。微量元素溶液的配制如下：FeCl3.6H2O0.27g/L、ZnSO4.7H2O0.08g/L、CoCl2.6H2O0.07g/L、Na2MO4.2H2O0.07g/L、CuSO4.5H2O0.08g/L、H3BO30.02g/L、MnSO4.H2O0.05g/L，水，pH7.4。實(shí)施例2制備3-甲硫基丙酸1.發(fā)酵液預(yù)處理：富集得到8L蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液后，4000r/min離心60min，棄去上清，加入2L丙酮浸泡菌體，輔以超聲(42KHZ)處理6h，4000r/min離心30min，取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40-45℃，真空度758mmHg)至最小體積，用1L乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至干，得到蠟狀芽孢桿菌菌體的乙酸乙酯萃取組分，將其命名為BS02-E，共3g，蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液的預(yù)處理過程如圖1所示。2.產(chǎn)物分離純化：將所得的BS02-E組分用5ml無水乙醇溶解，采用反相硅膠柱層析（80g，AQ-C18)（YMC公司，批號(hào)：9955），依次用水、30%、50%、70%、100%甲醇-水混合液洗脫，流速20ml/min，每個(gè)梯度用2L洗脫液洗脫，將30%甲醇洗脫液減壓濃縮至干，低溫（-4℃）保存，備用，所述分離純化過程如圖2所示。產(chǎn)物的HPLC的色譜分析條件如下：色譜柱：UltimateAQ-C18(5μm)(4.6×150mm)，檢測波長：254nm，流動(dòng)相：A)甲醇B)水，流速：1ml/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣：20μl，洗脫濃度：30%甲醇。所得產(chǎn)物的出峰時(shí)間：6.99min。3.BS02-E30%甲醇洗脫組分的分離純化將所得BS02-E30%洗脫組分用3-5ml無水乙醇溶解，600mg硅膠（200-300目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(體積比)的洗脫液洗脫。試管收集，每管收集5ml，TLC（薄層色譜法）檢測合并，合并液減壓濃縮至干得單一化合物BS02-C-1（200mg），其理化性質(zhì)及核磁共振波譜數(shù)據(jù)如下：淺黃色油狀液體，可溶于二甲基亞砜、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑。ESI-MSm/z:119.02[M-H]-。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:10.40(1H，brs，-COOH)，2.74(2H，m，-CH2-S-)，2.64(2H，m，-CH2-COOH)，2.10(3H，s，-S-CH3)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ:178.0(-COOH)，34.2(-CH2-COOH)，28.7(-CH2-S-)，15.3(-S-CH3)。通過查閱文獻(xiàn)，其質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（NicholasP,etal.Tetrahedron.1997,53(20):6993-7010）中的3-甲硫基丙酸對(duì)比基本一致，故化合物BS02-C-1鑒定為3-甲硫基丙酸。實(shí)施例3取實(shí)施例2制得的BS02-E組分（3g）用5ml無水乙醇溶解，采用反相硅膠柱層析（80g，AQ-C18)（YMC公司，批號(hào)：9955），依次用水、30%、50%、70%、100%甲醇-水混合液洗脫，流速20ml/min，每個(gè)梯度用2L洗脫液洗脫，將30%甲醇洗脫組分（358mg）濃縮至干，用3～5ml無水乙醇溶解，600mg硅膠（200-300目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(體積比)的洗脫液洗脫。試管收集，每管收集5ml，TLC（薄層色譜法）檢測合并，合并液減壓濃縮至干。產(chǎn)物最終純度為90.2%，收率為44%。實(shí)施例4取實(shí)施例2制得的BS02-E組分（3g）用5ml無水乙醇溶解，采用反相硅膠柱層析（80g，AQ-C18)（YMC公司，批號(hào)：9955），依次用水、30%、50%、70%、100%甲醇-水混合液洗脫，流速20ml/min，每個(gè)梯度用2L洗脫液洗脫，將50%洗脫組分（500mg）濃縮至干，用3～5ml無水乙醇溶解，600mg硅膠（200～300目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(體積比)的洗脫液洗脫。試管收集，每管收集5ml，TLC（薄層色譜法）檢測合并，合并液減壓濃縮至干。產(chǎn)物最終純度為93%，收率為5%。實(shí)施例3和4說明，洗脫時(shí)甲醇含量越高，越有利于最終純度的提高，但是甲醇含量過高，則產(chǎn)物收率也相應(yīng)降低。實(shí)施例5取實(shí)施例2制得的BS02-E的30%洗脫組分（358mg）濃縮至干，用3ml無水乙醇溶解，600mg硅膠（200～300目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(體積比)混合液洗脫。試管收集，每管收集5ml，TLC（薄層色譜法）檢測合并，合并液減壓濃縮至干。產(chǎn)物最終純度為90.2%，收率為55%。實(shí)施例6取實(shí)施例2制得的BS02-E的30%洗脫組分(358mg)濃縮至干，用4ml無水乙醇溶解，600mg硅膠（200～300目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:2(體積比)混合液洗脫。試管收集，每管收集5ml，TLC（薄層色譜法）檢測合并，合并液減壓濃縮至干。產(chǎn)物最終純度為86%，收率為59%。實(shí)施例5和6說明，洗脫時(shí)丙酮所占的比例越高，3-甲硫基丙酸洗脫下來的收率也越大，但是純度會(huì)相應(yīng)的下降。應(yīng)選擇純度及收率均適中的洗脫方式洗脫。實(shí)施例7取實(shí)施例2制得的BS02-E的30%洗脫組分(358mg)濃縮至干，用5ml無水乙醇溶解，600mg硅膠（200～300目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）（200～300目，5g），用40ml石油醚：丙酮=10:2(體積比)的混合液洗脫。試管收集，每管收集5ml，TLC（薄層色譜法）檢測合并，合并液減壓濃縮至干。產(chǎn)物最終純度為88%，收率為59%。實(shí)施例8取實(shí)施例2制得的BS02-E的30%洗脫組分(358mg)濃縮至干，用5ml無水乙醇溶解，600mg硅膠（200～300目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）（200～300目，5g），用40ml合適比例的的氯仿-甲醇混合液（48:1，體積比）洗脫。試管收集，每管收集5ml，TLC（薄層色譜法）檢測合并，合并液減壓濃縮至干。產(chǎn)物最終純度為88%，收率為38.9%。應(yīng)選擇純度及收率均適中的洗脫方式洗脫。應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。