本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明涉及用于病毒檢測的方法和系統(tǒng)。

背景技術(shù)：
宮頸癌是全球女性的第二位高發(fā)癌，其發(fā)病主要與人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染有關(guān)。每年全世界約有50萬新發(fā)病例，25萬死亡病例，其中發(fā)展中國家占2/3.已經(jīng)表征超過100種HPV類型會感染皮膚(皮膚類型)或呼吸道和肛門生殖道的粘膜(粘膜類型)，超過40種HPV類型會感染子宮頸。基于誘導(dǎo)的良性的，惡化前的或惡性的病變，將HPV分別分為低危(例如HPV6，11，42，43和44)和高危型(例如類型16，18，31，33和45)。因此，HPV感染的及早發(fā)現(xiàn)和正確分型對宮頸癌的預(yù)防至關(guān)重要。然而，目前HPV檢測分型的方法，仍有待改進(jìn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)問題的至少之一。為此，本發(fā)明的一個方面，提出了一種能夠?qū)Σ《具M(jìn)行有效檢測的方法。其包括以下步驟：針對包含病毒核酸的樣品，制備DNA測序文庫；利用IonTorrent技術(shù)對所述DNA測序文庫進(jìn)行DNA測序，以便獲得所述病毒核酸的序列信息；以及基于所述病毒核酸的序列信息確定所述病毒的類型。利用該方法，能夠借助IonTorrent測序技術(shù)，快速準(zhǔn)確地對待測病毒進(jìn)行檢測，并且成本較低，操作簡單，易于推廣。這里所使用的術(shù)語“檢測”應(yīng)作廣義理解，既可以是診斷檢測，也可以是非診斷檢測。診斷檢測的含義是指，檢測結(jié)果可以直接作為是否罹患疾病的依據(jù)。根據(jù)本發(fā)明又一方面，本發(fā)明還提出了一種用于病毒檢測的系統(tǒng)，其包括：DNA測序文庫制備裝置，所述DNA測序文庫制備裝置用于針對包含病毒核酸的樣品制備DNA測序文庫；測序裝置，所述測序裝置與所述DNA測序文庫制備裝置相連，用于對所述DNA測序文庫進(jìn)行測序，以便獲得所述病毒核酸的序列信息；以及分析裝置，所述分析裝置與所述測序裝置相連，用于基于所述病毒核酸的序列信息，確定所述病毒的類型，其中，所述測序裝置為適于實施IonTorrent測序技術(shù)的裝置。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實施本發(fā)明實施例的病毒檢測方法，從而有效地對樣品中的病毒進(jìn)行檢測，并對所包含的病毒類型進(jìn)行檢測。另外，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還提出了用于構(gòu)建DNA測序文庫的DNA標(biāo)簽(在本文中，有時也簡單地稱為“標(biāo)簽”)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出了一組分離的DNA標(biāo)簽。這些分離的DNA標(biāo)簽分別由SEQIDNO：1-56所示的核苷酸構(gòu)成。在本說明書中，這些DNA標(biāo)簽分別被命名為DNAIndexN，其中N＝1-56的任意整數(shù)，其序列如下表1所示。利用上述根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽，通過將DNA標(biāo)簽與樣本DNA或其等同物相連，可以精確地表征DNA的樣本來源。由此，利用上述DNA標(biāo)簽，可以同時構(gòu)建多種樣本的DNA測序文庫(在本文中，有時也稱為“測序文庫”)，從而可以通過將來源于不同樣本的DNA測序文庫同時進(jìn)行測序，基于DNA標(biāo)簽對DNA測序文庫的DNA序列進(jìn)行分類，從而可以獲得多種樣本的DNA序列信息，由此可以充分利用高通量的測序技術(shù)，例如利用IonTorrent測序技術(shù)，同時對多種DNA測序文庫進(jìn)行測序，從而提高了DNA測序文庫的測序效率和通量。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽構(gòu)建DNA測序文庫，能夠精確地對多種DNA測序文庫進(jìn)行區(qū)分，并且所得到的測序數(shù)據(jù)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性非常好。表1DNA標(biāo)簽(DNAIndexN)序列(5’→3’方向)根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于將上述DNA標(biāo)簽引入樣本DNA或其等同物中的一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物。根據(jù)本發(fā)明的實施例的一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第一核酸序列，所述第一核酸序列為選自SEQIDNO：57-62的一種；和第二核酸序列，所述第二核酸序列為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種，其中，所述第二核酸序列與所述第一核酸序列的5’末端相連。在本說明書中，該組PCR正向標(biāo)簽引物的每一種分別包含如前所述的根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽，通過采用PCR正向標(biāo)簽引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以將PCR正向標(biāo)簽引物引入到樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應(yīng)的DNA標(biāo)簽引入到DNA或其等同物中。其中，構(gòu)成PCR正向標(biāo)簽引物的第一核酸序列如下表2所示。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了用于將上述DNA標(biāo)簽引入樣本DNA或其等同物中的一組分離的PCR反向標(biāo)簽引物。根據(jù)本發(fā)明的實施例的該組分離的PCR反向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第三核酸序列，所述第三核酸序列為選自SEQIDNO：63-67的一種；和第四核酸序列，所述第四核酸序列為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種，其中，所述第四核酸序列與所述第三核酸序列的3’末端相連。在本說明書中，這組PCR反向標(biāo)簽引物的每一種分別具有如前所述的根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽，通過采用PCR反向標(biāo)簽引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以將PCR反向標(biāo)簽引物引入樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應(yīng)的DNA標(biāo)簽引入到DNA或其等同物中。其中，構(gòu)成PCR反向標(biāo)簽引物的第三核酸序列如下表2所示。表2第一核酸序列和第三核酸序列(5’→3’方向)利用上述根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物和一組分離的PCR反向標(biāo)簽引物，均能夠有效地將DNA標(biāo)簽引入到樣品的DNA或其等同物中，由此能夠構(gòu)建具有DNA標(biāo)簽的DNA測序文庫。另外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)針對相同的樣品，采用具有不同標(biāo)簽的PCR正向標(biāo)簽引物分別構(gòu)建含有各種DNA標(biāo)簽的DNA測序文庫時，所得到的測序數(shù)據(jù)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性非常好；同樣，采用具有不同標(biāo)簽的PCR反向標(biāo)簽引物分別構(gòu)建含有各種DNA標(biāo)簽的DNA測序文庫時，所得到的測序數(shù)據(jù)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性也非常好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在通過采用PCR正向標(biāo)簽引物和PCR反向標(biāo)簽引物的至少一種進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便構(gòu)建樣本DNA的DNA測序文庫時，可以通過PCR正向標(biāo)簽引物和PCR反向標(biāo)簽引物向樣本DNA的DNA測序文庫導(dǎo)入DNA標(biāo)簽，從而能夠同時構(gòu)建多種樣本DNA的DNA測序文庫。由此通過采用根據(jù)本發(fā)明實施例的具有DNA標(biāo)簽的PCR正向標(biāo)簽引物和PCR反向標(biāo)簽引物的至少一種進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以構(gòu)建多種樣本的DNA測序文庫，從而可以根據(jù)不同DNA測序文庫中這些標(biāo)簽的不同對DNA測序文庫進(jìn)行區(qū)分，最終實現(xiàn)對大量樣本的混合測序，以滿足高通量測序的需求，從而降低測序成本。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1：顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的構(gòu)建DNA測序文庫的方法的流程示意圖。圖2：顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的構(gòu)建樣本DNA的DNA測序文庫的方法構(gòu)建DNA測序文庫過程中，部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖3：顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的應(yīng)用于IonTorrent測序的模板結(jié)構(gòu)示意圖。圖4：顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的用于對HPV進(jìn)行基因分型的系統(tǒng)的示意圖。具體實施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。病毒檢測方法根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出了一種病毒檢測方法，其包括：首先，針對包含病毒核酸的樣品，制備DNA測序文庫。接著，利用IonTorrent技術(shù)對所構(gòu)建的DNA測序文庫進(jìn)行DNA測序，以便獲得病毒核酸的序列信息。最后，基于病毒核酸的序列信息確定所述病毒的類型。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在獲得病毒核酸的序列信息后，確定病毒類型的方法不受特別限制，可以通過將病毒核酸序列與已知的病毒核酸數(shù)據(jù)庫，例如HPV的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。在本文中所使用的術(shù)語“病毒核酸”，應(yīng)作廣義理解，可以指的是直接從病毒提取的核酸，例如病毒全基因組或其部分，也可以是從受到病毒侵染的宿主細(xì)胞中提取的包含有病毒核酸信息的宿主細(xì)胞的全基因組或其部分。另外，病毒核酸的類型也不受特別限制，可以是DNA，也可以是RNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，將RNA轉(zhuǎn)化為DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述病毒為人類乳頭瘤病毒(HPV)。根據(jù)具體的示例，所述包含病毒核酸的樣品是女性生物樣本的全基因DNA樣品。優(yōu)選，所述女性生物樣本是選自女性宮頸脫落細(xì)胞和宮頸癌組織的至少一種。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效地對宿主細(xì)胞中所包含的HPV核酸信息進(jìn)行檢測。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過任何已知的方法從生物樣本中提取全基因組DNA。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，全基因組DNA樣品是使用KingFisher自動提取儀進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以用于構(gòu)建DNA測序文庫的方法不受特別限制，只要所構(gòu)建的文庫能夠應(yīng)用于IonTorrent測序技術(shù)即可。優(yōu)選地，采用包括下列步驟的方法進(jìn)行制備(參考圖1)：將所述包含病毒核酸的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用正向引物和反向引物，所述正向引物和所述反向引物是所述病毒特異性的；將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，以便獲得經(jīng)過末端修復(fù)的擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述經(jīng)過末端修復(fù)的擴(kuò)增產(chǎn)物與測序接頭相連，以便獲得具有測序接頭的連接產(chǎn)物；以及分離回收所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物，所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物構(gòu)成所述DNA測序文庫。通過使用病毒特異性的PCR正向引物和反向引物，可以獲得病毒的特定區(qū)域的序列，從而可以提高病毒檢測的效率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)病毒核酸的序列，來確定相應(yīng)的引物序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，針對HPV病毒。可以采用的正向引物包括第一核酸序列，所述第一核酸序列為選自SEQIDNO：57-62的一種?？梢圆捎玫姆聪蛞锇ǖ谌怂嵝蛄校龅谌怂嵝蛄袨檫x自SEQIDNO：63-67的一種。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過采用上述引物，能夠顯著有效地對女性生物組織中的HPV病毒核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，從而進(jìn)行檢測和分型。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，還可以通過PCR反應(yīng)，在構(gòu)建測序文庫中引入DNA標(biāo)簽，從而可以同時對多種樣品進(jìn)行病毒檢測。為此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，正向引物可以進(jìn)一步包括第二核酸序列，該第二核酸序列為選自SEQIDNO：1-56的一種，其中，第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連。根據(jù)本發(fā)明的實施例，反向引物也可以進(jìn)一步包括第四核酸序列，該第四核酸序列為選自SEQIDNO：1-56的一種，其中，所述第四核酸序列與所述第三核酸序列的3’末端相連。關(guān)于DNA標(biāo)簽，后面將進(jìn)行詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)之前，進(jìn)一步包括對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟，例如可以采用QiagenDNAPurification試劑盒，根據(jù)制造商所提供的說明書來進(jìn)行純化。由此，可以提高對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)的效率，從而進(jìn)一步提高構(gòu)建測序文庫的效率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇市售可得的試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在將經(jīng)過末端修復(fù)的擴(kuò)增產(chǎn)物與測序接頭相連之前，進(jìn)一步包括對經(jīng)過末端修復(fù)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，具有測序接頭的連接產(chǎn)物的長度為約180-200bp。由此，可以進(jìn)一步提高構(gòu)建測序文庫的效率。另外，本申請的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用長度為約180-220bp的連接產(chǎn)物時，可以顯著提高后續(xù)測序的效率，尤其是提供應(yīng)用IonTorrent進(jìn)行測序的效率。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，通過使用2.0％的瓊脂糖凝膠在100V下電泳2小時，進(jìn)行分離回收所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，測序接頭的類型并不受特別限制，根據(jù)具體的實施例，可以采用具有下列雙鏈核苷酸序列的測序接頭：P5接頭具有雙鏈結(jié)構(gòu)，分別為：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQIDNO：68)3’-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA(SEQIDNO：69)A接頭序列具有雙鏈結(jié)構(gòu)，分別為：5’-TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQIDNO：70)3’-T*T*AAGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC(SEQIDNO：71)。在SEQIDNO：69和71中帶有星號標(biāo)記的T表示，該T堿基不具有磷酸基團(tuán)。因而，根據(jù)本發(fā)明的實施例，在獲得具有測序接頭的連接產(chǎn)物之后，可以將所獲得的具有測序接頭的連接產(chǎn)物進(jìn)行缺口平移反應(yīng)，可以進(jìn)一步提高構(gòu)建文庫的效率，和后續(xù)測序的效率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇任何市售可得的試劑盒來進(jìn)行切口平移處理，例如可以采用PCRSuperMixHighFidelity，來自IonXpressTMFragmentLibraryKit。根據(jù)本發(fā)明的實施例，對所述DNA樣本的DNA測序文庫進(jìn)行測序進(jìn)一步包括通過乳液PCR反應(yīng)制備IonTorrent測序模板的步驟。優(yōu)選在進(jìn)行所述乳液PCR擴(kuò)增之前進(jìn)一步包括將所述DNA測序文庫進(jìn)行稀釋的步驟。更優(yōu)選，所述乳液PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物的濃度為560*106個分子/反應(yīng)體系。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增時，在同一反應(yīng)體系中，不同長度的DNA分子的擴(kuò)增效率有時會有顯著的區(qū)別。為此，發(fā)明人開發(fā)了可以適用于IonTorrent測序技術(shù)的乳液PCR反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，通過乳液PCR反應(yīng)制備IonTorrent測序模板，進(jìn)一步包括下列步驟：首先，形成油包水型乳液，所述油包水乳液中包括多個不連續(xù)的含水區(qū)室，所述多個不連續(xù)的含水區(qū)室的至少一部分中包含：磁性顆粒、所述DNA測序文庫的一部分、用于擴(kuò)增所述DNA測序文庫的寡核苷酸引物，其中，所述寡核苷酸引物的至少一部分與所述磁性顆粒相連。形成油包水型乳液的方法，可以是將含有磁性顆粒、測序文庫、寡核苷酸引物以及用于進(jìn)行PCR反應(yīng)所需要的試劑的水溶液與油相通過高速震蕩形成油包水型的乳液，每個油包水型乳液的含水區(qū)室可以作為一個PCR的反應(yīng)容器，由此，多個不連續(xù)的含水區(qū)室內(nèi)獨立地發(fā)生PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以有效地對測序文庫的每一個DNA分子進(jìn)行有效地擴(kuò)增，并且由于磁性顆粒上連接有引物，因而可以在磁性顆粒上形成DNA分子的多個克隆，在回收磁性顆粒之后，通過裂解雙鏈DNA為單鏈DNA可以獲得攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，進(jìn)而可以有效地應(yīng)用于IonTorrent測序技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，多個不連續(xù)的含水區(qū)室的每一個中至多含有所述DNA測序文庫的一個DNA分子。由此，可以實現(xiàn)，在同一個磁性顆粒上所攜帶的多個DNA分子的克隆均來自于相同的DNA分子，由此，可以進(jìn)一步提高測序的效率和精確性。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所采用的磁性顆粒的類型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，可以采用IonSphereTM顆粒。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以根據(jù)DNA測序文庫的序列來確定，例如可以通過DNA測序文庫的DNA分子兩端的測序接頭的序列來確定用于擴(kuò)增DNA測序文庫的寡核苷酸引物的序列。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，用于擴(kuò)增所述DNA測序文庫的寡核苷酸引物包括第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，其中，所述第一寡核苷酸引物的序列為TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQIDNO:72)，并且所述第一寡核苷酸引物與所述磁性顆粒相連；所述第二寡核苷酸引物的序列為CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQIDNO:73)，并且所述第二寡核苷酸引物在所述含水區(qū)室中呈游離狀態(tài)。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，針對HPV，可以有效地制備用于IonTorrent測序的其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，作為IonTorrent測序模板，從而進(jìn)一步提高檢測HPV病毒的效率。接下來，將所述油包水型乳液置于適于擴(kuò)增所述DNA測序文庫的熱循環(huán)條件下，以便形成其上攜帶DNA測序文庫的磁性顆粒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，進(jìn)行乳液PCR以擴(kuò)增所述DNA測序文庫的PCR條件，即熱循環(huán)條件不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，其包括下列：步驟1：94℃6min步驟2：94℃30sec步驟3：58℃30sec步驟4：72℃90sec重復(fù)步驟2-4，40個循環(huán)；以及步驟5：94℃30sec步驟6：68℃6min重復(fù)步驟5和6，5個循環(huán)。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該熱循環(huán)條件特別適用于對HPV的檢測。然后，將其上攜帶DNA測序文庫的磁性顆粒置于適于雙鏈DNA裂解的條件下，例如，可以將所述油包水型乳液與裂解液接觸，其中，所述裂解液含有NaOH和Tween-20的水溶液，所述NaOH和Tween-20的終濃度分別為125mM和0.1重量％以便獲得其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒，所述其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒構(gòu)成IonTorrent測序模板。在獲得其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒后，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以進(jìn)一步包括這些其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒的步驟，從而可以進(jìn)一步提高后續(xù)利用IonTorrent測序技術(shù)進(jìn)行測序的效率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所選用的磁性顆粒的性質(zhì)，采用任何方法進(jìn)行對磁性顆粒的富集。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以采用MyOneTM珠富集其上攜帶單鏈DNA的磁性顆粒。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用MyOneTM珠能夠有效地富集攜帶單鏈DNA的IonSphereTM顆粒，并且可以有效地提高HPV檢測的效率。DNA標(biāo)簽根據(jù)本申請的一個方面，本發(fā)明提出了一些分離的DNA標(biāo)簽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，這些分離的DNA標(biāo)簽分別由SEQIDNO：1-56所示的核苷酸序列構(gòu)成。在本說明書中，這些DNA標(biāo)簽分別被命名為DNAIndexN，其中N＝1-56的任意整數(shù)，其序列如前面表1所示，在此不再贅述。在本發(fā)明中所使用術(shù)語“DNA”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA。利用根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽，通過將DNA標(biāo)簽與樣本的DNA或其等同物相連，得到具有標(biāo)簽的DNA測序文庫，通過對DNA測序文庫進(jìn)行測序，可以獲得樣本DNA的DNA序列以及標(biāo)簽的序列，進(jìn)而基于標(biāo)簽的序列可以精確地表征DNA的樣本來源。由此，利用上述DNA標(biāo)簽，可以同時構(gòu)建多種樣本DNA的DNA測序文庫，從而可以通過將來源于不同樣本DNA的DNA測序文庫進(jìn)行混合，同時進(jìn)行測序，基于DNA標(biāo)簽對樣本DNA的DNA序列進(jìn)行分類，獲得多種樣本DNA的DNA的序列信息。從而可以充分利用高通量的測序技術(shù)，例如利用IonTorrent測序技術(shù)，同時對多種樣本DNA進(jìn)行測序，從而提高了通過高通量測序技術(shù)的效率和通量，降低了確定樣本DNA的序列信息的成本。這里所使用的表述方式“DNA標(biāo)簽與樣本的DNA或其等同物相連”應(yīng)做廣義理解，其包括DNA標(biāo)簽可以與樣本的DNA直接相連，以構(gòu)建DNA測序文庫，也可以與和樣本的DNA具有相同序列的核酸(例如可以是相應(yīng)的RNA序列或cDNA序列，其與DNA具有相同的序列)相連。本申請的發(fā)明人進(jìn)行了大量的篩選工作，并且選定了根據(jù)本發(fā)明實施例的適用于IonTorrent測序技術(shù)的一組分離的DNA標(biāo)簽，其分別由SEQIDNO：1-56所示的核苷酸序列構(gòu)成。其序列如前面表1所示，不再贅述。通常而言，針對不同的測序技術(shù)，需要開發(fā)不同的標(biāo)簽以能夠適用于同時對多種樣本進(jìn)行測序。目前尚未有關(guān)于這些標(biāo)簽應(yīng)用于樣本DNA的DNA測序文庫構(gòu)建并通過IonTorrent測序的報道。因此，本發(fā)明還提出了上述DNA標(biāo)簽在構(gòu)建IonTorrent測序文庫中的應(yīng)用。PCR正向標(biāo)簽引物、PCR反向標(biāo)簽引物以及構(gòu)建DNA測序文庫根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明提供了一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物，其用于將上述DNA標(biāo)簽引入樣本DNA或其等同物中。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該組分離的PCR正向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第一核酸序列和第二核酸序列，且第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連，其中，第一核酸序列為選自SEQIDNO：57-62的一種，第二核酸序列為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種。在本文中，表達(dá)方式“第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連”是指選自根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽與第一核酸序列相連，具體地，DNA標(biāo)簽可以連接在第一核酸序列的5’末端，也可以通過媒介例如連接子間接地與所述第一核酸序列的5’末端連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)成PCR正向標(biāo)簽引物的第一核酸序列具有HPV特異性，其序列如下表2所示，在此不再贅述。在本說明書中，該組PCR正向標(biāo)簽引物的每一種分別具有如前所述的根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽，通過采用PCR正向標(biāo)簽引物的PCR反應(yīng)，可以將PCR正向標(biāo)簽引物引入樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應(yīng)的DNA標(biāo)簽引入到DNA或其等同物中。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明還提供了一組分離的PCR反向標(biāo)簽引物，其同樣是用于將上述DNA標(biāo)簽引入樣本DNA或其等同物中。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該組分離的PCR反向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第三核酸序列和第四核酸序列，且第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連，其中，第三核酸序列為選自SEQIDNO：63-67的一種，第四核酸序列為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種。這里，表達(dá)方式“第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連”是指選自根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽與第三核酸序列相連，具體地，DNA標(biāo)簽可以直接連接在第三核酸序列的3’末端，也可以通過媒介例如連接子間接地與第三核酸序列的3’末端連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)成PCR反向標(biāo)簽引物的第三核酸序列具有HPV特異性，其序列如下表2所示，在此不再贅述。在本說明書中，這組PCR反向標(biāo)簽引物分別具有如前所述的根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽，通過采用PCR反向標(biāo)簽引物的PCR反應(yīng)，可以將PCR反向標(biāo)簽引物引入樣品的DNA或其等同物中，從而就將相應(yīng)的DNA標(biāo)簽引入到DNA或其等同物中。根據(jù)本發(fā)明的實施例，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)向樣本DNA的DNA測序文庫中導(dǎo)入DNA標(biāo)簽，具體地，PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用正向引物和反向引物，其中正向引物和反向引物的至少一種包含選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種，因此可以通過PCR正向標(biāo)簽引物和PCR反向標(biāo)簽引物向樣本DNA的DNA測序文庫導(dǎo)入DNA標(biāo)簽，從而能夠同時構(gòu)建多種樣本DNA的DNA測序文庫。由此通過采用根據(jù)本發(fā)明實施例的具有DNA標(biāo)簽的PCR正向標(biāo)簽引物和PCR反向標(biāo)簽引物的至少一種的PCR反應(yīng)，可以同時構(gòu)建多種樣本的DNA測序文庫，從而可以根據(jù)不同DNA測序文庫中這些標(biāo)簽的不同對DNA測序文庫進(jìn)行區(qū)分，最終實現(xiàn)對大量樣本的混合測序，以滿足高通量測序的需求，從而簡化操作流程，降低測序成本。另外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)針對相同的樣本，基于上述方法，采用具有不同標(biāo)簽PCR正向標(biāo)簽引物或PCR反向標(biāo)簽引物構(gòu)建含有各種DNA標(biāo)簽的DNA測序文庫時，所得到的測序數(shù)據(jù)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性非常好。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種用于構(gòu)建DNA測序文庫的試劑盒，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括：一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物，所述一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第一核酸序列，其為選自SEQIDNO：57-62的一種；和第二核酸序列，其為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種，其中，第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連，一組分離的PCR反向標(biāo)簽引物，一組分離的PCR反向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第三核酸序列，其為選自SEQIDNO：63-67的一種；和第四核酸序列，其為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種，其中，第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連，其中，一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物的每一種和一組分離的PCR反向標(biāo)簽引物的每一種分別設(shè)置在不同的容器中。由此，利用該試劑盒，能夠方便地將根據(jù)本發(fā)明實施例的DNA標(biāo)簽引入到構(gòu)建的DNA測序文庫中。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，試劑盒中還可以包含其他用于構(gòu)建DNA測序文庫的常規(guī)組件，在此不再贅述。對多種樣品進(jìn)行病毒檢測的方法進(jìn)一步，借助DNA標(biāo)簽，可以將上面檢測病毒的方法應(yīng)用于多種樣品。例如，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種對多種包含病毒核酸的樣品進(jìn)行病毒檢測的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，其包括以下步驟：首先，針對所述多種包含病毒核酸的樣品，制備DNA測序文庫混合物，其中，所述DNA樣本測序文庫混合物由所述多種包含病毒核酸的樣品中每一種的DNA測序文庫構(gòu)成，并且所述多種DNA樣本的每一種采用相互不同并且已知序列的DNA標(biāo)簽，所述DNA標(biāo)簽為選自SEQIDNO：1-56的一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，制備DNA測序文庫混合物的方法不受特別限制，可以分別制備各種DNA測序文庫，然后，將其混合，也可以先分別進(jìn)行部分步驟引入各自的標(biāo)簽，然后進(jìn)行混合，最后共同完成構(gòu)建測序文庫的通用步驟。因而針對所述多種包含病毒核酸的樣品，制備DNA測序文庫混合物進(jìn)一步包括以下步驟：將所述多種包含病毒核酸的樣品的每一種分別獨立地進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得多種擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物是所述病毒特異性的，并且所述正向引物和反向引物的至少一種包含已知序列的DNA標(biāo)簽，所述DNA標(biāo)簽為選自SEQIDNO：1-56的一種，并且所述多種包含病毒核酸的樣品的每一種采用相互不同并且已知序列的DNA標(biāo)簽；將所述多種擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行混合，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物混合物；將所述擴(kuò)增產(chǎn)物混合物與測序接頭相連，以便獲得具有測序接頭的連接產(chǎn)物混合物；以及分離回收所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物混合物，所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物混合物構(gòu)成所述DNA測序文庫?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，制備所述多種DNA樣本的DNA測序文庫混合物進(jìn)一步包括以下步驟：針對所述多種包含病毒核酸的樣品的每一種，分別獨立地制備DNA測序文庫，其中，不同的DNA樣本采用相互不同并且已知序列的DNA標(biāo)簽；以及將所述多種樣本的DNA測序文庫進(jìn)行組合，以便獲得所述DNA測序文庫混合物，其中，所述DNA文庫是通過下列步驟制備的：將所述包含病毒核酸的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用正向引物和反向引物，所述正向引物和所述反向引物是所述病毒特異性的；將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)，以便獲得經(jīng)過末端修復(fù)的擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述經(jīng)過末端修復(fù)的擴(kuò)增產(chǎn)物與測序接頭相連，以便獲得具有測序接頭的連接產(chǎn)物；以及分離回收所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物，所述具有測序接頭的連接產(chǎn)物構(gòu)成所述DNA測序文庫。這里，所使用的術(shù)語“多種”為至少2種。其中，表達(dá)方式“相互不同并且已知序列的DNA標(biāo)簽”是指針對一種樣本DNA構(gòu)建的DNA測序文庫中，其包含的DNA標(biāo)簽與其它樣本DNA的DNA測序文庫的標(biāo)簽不同，且各標(biāo)簽序列是已知的，其中，一個DNA測序文庫中可以包含1個DNA標(biāo)簽，也可以包含2個DNA標(biāo)簽。當(dāng)其包含1個DNA標(biāo)簽時，術(shù)語“相互不同”容易理解；當(dāng)其包含2個DNA標(biāo)簽時，這兩個DNA標(biāo)簽可以看做是一個組合，這里我們就稱之為“標(biāo)簽組合”，這時術(shù)語“相互不同”就是指不同的DNA樣本中所含的標(biāo)簽組合不同。根據(jù)本發(fā)明的實施例，一個DNA測序文庫中的構(gòu)成標(biāo)簽組合的這2種標(biāo)簽可以相同，也可以不同。其次，利用IonTorrent測序技術(shù)，對所述DNA測序文庫混合物進(jìn)行測序，以獲得所述多種樣品的病毒核酸序列信息以及所述DNA標(biāo)簽的序列信息。然后，基于所述DNA標(biāo)簽的序列信息，對所述病毒核酸序列信息進(jìn)行分類，以便確定所述多種樣品中病毒的類型。根據(jù)本發(fā)明實施例的上述方法，可以充分利用高通量的測序技術(shù)，例如利用IonTorrent測序技術(shù)，同時對多種樣本DNA的DNA測序文庫進(jìn)行測序，從而提高DNA測序文庫的測序效率和通量，同時可以提高確定多種樣本DNA的DNA序列信息的效率。關(guān)于測序的方法和采用的測序引物，前面已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，此處不再贅述。用于病毒檢測的系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于對病毒進(jìn)行檢測的系統(tǒng)。參考圖4，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該用于對病毒進(jìn)行檢測的系統(tǒng)1000包括：DNA測序文庫制備裝置100、測序裝置200以及分析裝置300。根據(jù)本發(fā)明的實施例，DNA測序文庫制備裝置100用于制備待測樣本的DNA測序文庫，例如可以采用適于前面所述的DNA測序文庫構(gòu)建方法的任意裝置作為DNA測序文庫制備裝置100。測序裝置200與DNA測序文庫制備裝置100相連，可以從DNA測序文庫制備裝置100接收所制備的DNA測序文庫，并對所接收的DNA測序文庫進(jìn)行測序，從而可以獲得待測樣本的DNA序列信息，其中，測序裝置為適于實施IonTorrent測序技術(shù)的裝置。分析裝置300與測序裝置200相連，可以從測序裝置200接收所獲得的待測樣本的DNA序列信息，從而基于DNA序列信息對待測樣本中的病毒進(jìn)行檢測和分型，具體地，是將DNA序列信息與病毒數(shù)據(jù)庫例如HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而基于比對結(jié)果實現(xiàn)對待測樣本的病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的病毒檢測和分型。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述DNA測序文庫制備裝置中可以設(shè)置有一組分離的PCR正向標(biāo)簽引物，該組分離的PCR正向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第一核酸序列，其為選自SEQIDNO：57-62的一種；和第二核酸序列，其為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種，其中，第二核酸序列與第一核酸序列的5’末端相連，一組分離的PCR反向標(biāo)簽引物，該組分離的PCR反向標(biāo)簽引物的每一種獨立地包括：第三核酸序列，其為選自SEQIDNO：63-67的一種；和第四核酸序列，其為選自根據(jù)本發(fā)明實施例的一組分離的DNA標(biāo)簽的一種，其中，第四核酸序列與第三核酸序列的3’末端相連。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，可以采用本領(lǐng)域中已知的任何適于進(jìn)行上述操作的裝置作為上述各個裝置的組成部件。另外，這里所使用的術(shù)語“相連”應(yīng)作廣義理解，可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語的具體含義。利用根據(jù)本發(fā)明實施例的用于對病毒進(jìn)行檢測分型的系統(tǒng)，能夠方便準(zhǔn)確地同時對多個待測樣本的病毒進(jìn)行檢測分型，該系統(tǒng)制作成本較低，操作簡單、快速，有利于普遍推廣，從而可以應(yīng)用于更多女性的HPV檢測，以便實現(xiàn)更多的女性真正得到定期科學(xué)規(guī)范的篩查。需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明實施例的對待病毒進(jìn)行檢測的方法，以及對病毒進(jìn)行檢測的系統(tǒng)，是本申請的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動和優(yōu)化工作才完成的。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自LifeTechnology公司。實施例11.樣本提取使用KingFisher自動提取儀，按照制造商所提供的說明書，從56份已知測序分型結(jié)果的宮頸脫落細(xì)胞中提取DNA。2.PCR擴(kuò)增將樣本提取步驟中所得的56份DNA依次編號，以56組分別帶有標(biāo)簽的正向引物和反向引物分別擴(kuò)增所得到的56份DNA樣本。需要說明的是，針對不同的DNA樣本采用不同的標(biāo)簽序列，這里所使用的標(biāo)簽序列均選自表1所示的56種標(biāo)簽。另外，在這56組帶有標(biāo)簽的引物中的每一組中，均包含6條帶有標(biāo)簽的正向引物和5條帶有標(biāo)簽的反向引物，其中帶有標(biāo)簽的正向引物和帶有標(biāo)簽的反向引物分別由表2中所列出的第一核酸序列與標(biāo)簽和第三核酸與標(biāo)簽構(gòu)成，在相同組中使用相同的選自表1所示的標(biāo)簽。PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，每板設(shè)置一個不添加模板的陰性對照，陰性對照所用引物與樣品1的引物相同。反應(yīng)體系25微升，其組成是：試劑體積/反應(yīng)水(HPLC級)14.375微升10xExTaqBuffer(添加鎂離子)2.5微升dNTPmix(均為2.5mM)2微升正向引物(各7.5pmol)0.5微升反向引物(各7.5pmol)0.5微升ExTaqHS(5U/μl)0.125微升模板DNA5微升總體積25微升PCR反應(yīng)在Bio-Rad公司的PTC-200PCR儀上運行。PCR程序如下：95℃30s→48℃30s→72℃30s→(40個循環(huán))72℃10min→12℃∞PCR完成后，取3微升PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，根據(jù)圖2，PCR產(chǎn)物條帶大小為約170bp。3.PCR產(chǎn)物混合和純化將剩余的PCR產(chǎn)物混合在一個3ml的EP管中，震蕩混勻，從中取500微升DNA混合物，使用QiagenDNA純化試劑盒，根據(jù)制造商提供的說明書進(jìn)行純化，純化所得的200微升DNA，標(biāo)記為HPV-L。經(jīng)Nanodrop8000(ThermoFisherScientific公司)測定HPV-L的DNA濃度是59.6納克/微升。4.末端修復(fù)反應(yīng)將所得到的測序文庫HPV-L進(jìn)行DNA末端修復(fù)反應(yīng)，末端修復(fù)的反應(yīng)體系如下，在本實施例中使用IonXpressTMFragmentLibraryKit的緩沖液和酶，通過參照將IonXpressTMFragmentLibraryKit的全部說明書并入本文：反應(yīng)體系200微升，其組成是：試劑體積/反應(yīng)DNA片段39微升無核酸酶的水119微升5X末端修復(fù)緩沖液40微升末端修復(fù)酶2微升總體積200微升反應(yīng)條件為：利用Thermomixer(Eppendorf公司)，在20℃下溫浴20min。反應(yīng)結(jié)束后，使用QIAquickPCR純化試劑盒回收純化反應(yīng)產(chǎn)物，將反應(yīng)產(chǎn)物溶于50微升的EB(QIAGENElutionBuffer)中。5、3’連接接頭(adapter)反應(yīng)使用IonXpressTMFragmentLibraryKit，通過下述反應(yīng)體系為文庫DNA的連接接頭(adapter)：反應(yīng)體系200微升，其組成是：試劑體積/反應(yīng)上一步的反應(yīng)產(chǎn)物50微升10X連接酶緩沖液20微升無核酸酶的水77微升接頭50微升DNA連接酶3微升總體積200微升反應(yīng)條件為：利用Thermomixer(Eppendorf公司)，在37℃下溫浴30min。所采用的接頭DNA序列為：P5接頭序列：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3’-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTAA接頭序列：5’-TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG3’-T*T*AAGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC反應(yīng)結(jié)束后，使用1.8倍體積AmpureBeads(BeckmanCoulterGenomics)純化回收反應(yīng)產(chǎn)物，并將純化后的反應(yīng)產(chǎn)物溶于40微升的EB中。將所得到的純化后的反應(yīng)產(chǎn)物，在2.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。條件為100V，2h。選擇180-200bp的片段進(jìn)行切膠回收。重新溶解于43微升EB中，得到連接有接頭的DNA片段。6、缺口平移(Nick-translate)及擴(kuò)增文庫因為上一步反應(yīng)中接頭一端沒有磷酸基團(tuán)，因而連接有接頭的DNA片段需要進(jìn)行缺口平移反應(yīng)，同時可以對DNA文庫進(jìn)行擴(kuò)增。在本實施例中使用IonFragmentLibraryKit，其體系如下：反應(yīng)體系為：反應(yīng)條件是：反應(yīng)結(jié)束后，使用1.5倍體積AmpureBeads(BeckmanCoulterGenomics)純化反應(yīng)產(chǎn)物，并將純化產(chǎn)物溶于30微升去離子水中，得到DNA測序文庫。使用Agilent2100BioanalyserDNA1000chip(AglientTechnologies,PaloAlto,CA)和熒光定量PCR(QPCR)對所得到的DNA測序文庫進(jìn)行檢測，DNA測序文庫的濃度結(jié)果分別是40.6納摩和38.4納摩。通常而言，Agilent2100BioanalyserDNA1000chip(AglientTechnologies,PaloAlto,CA)的結(jié)果更可信。7、制備IonTorrent測序模板7.1確定合適的文庫濃度以Agilent2100BioanalyserDNA1000chip(AglientTechnologies,PaloAlto,CA)。檢測結(jié)果為準(zhǔn)，將上一步制備好的DNA測序文庫進(jìn)行稀釋，最終濃度達(dá)到每18微升中含有560*106個分子，即滿足560*106個分子/反應(yīng)體系(280*106ISP/反應(yīng)體系)7.2制備油包水型乳液參照IonXpressTMTemplateKit說明書，分別制備IKADT-20油相(9ml)、IonSphereTM顆粒、DNA測序文庫以及PCR水相MIX。PCR水相MIX組成是：試劑體積(微升)去核酸水33610XPCR緩沖液105MgCl2溶液105dNTPs105引物混合物105富集引物5熱穩(wěn)定焦磷酸酶5聚合酶126總體積892最后將稀釋合格的DNA測序文庫(18微升/反應(yīng))與PCR水相MIX混勻，進(jìn)行乳液PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序如下：通過上述乳液PCR反應(yīng)，實現(xiàn)了將DNA測序文庫中DNA分子與IonSphereTM顆粒連接并復(fù)制，其連接后的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示。如圖3所示，DNA片段的5’端和3’端分別連接有接頭1和接頭2，并且通過接頭2與離子磁性顆粒相連。接頭1和接頭2的序列分別如下：名稱序列接頭1(A接頭)TTCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG接頭2(磁珠-P5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-CCTCTCTATGGGCA接頭)GTCGGTGAT7.3制備攜帶單鏈DNA的IonSphereTM顆粒在完成乳液PCR后，分離回收IonSphereTM顆粒，并通過與裂解液(含有NaOH和Tween-20的水溶液，所述NaOH和Tween-20的終濃度分別為125mM和0.1重量％)，將IonSphereTM顆粒上的DNA模板由雙鏈變?yōu)閱捂?。然后利用帶有生物素的MyOneTM珠，借助MyOneTM珠與擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性結(jié)合，富集其上攜帶單鏈DNA的IonSphereTM顆粒，由此獲得用于IonTorrent測序技術(shù)的測序模板。經(jīng)Qubit2.0(Invitrogen公司)檢測合格滿足上機(jī)測序要求。6.IonTorrent測序測序操作流程詳見IonTorrent操作說明書。安裝對應(yīng)的測序芯片，本是實施例中采用314芯片，在芯片上加入酶和制備好的攜帶單鏈DNA的IonSphereTM顆粒進(jìn)行測序，測序過程約2.5小時即可完成，得到可靠的基因序列信息。7.結(jié)果分析通過對測序結(jié)果中標(biāo)簽序列以及引物的序列信息篩選，可獲得每個樣本的DNA序列信息，將所得DNA序列信息與HPV數(shù)據(jù)庫比對，最終可實現(xiàn)對每一份樣本的HPV檢測以及分型，得到的結(jié)果與原已知結(jié)果完全一致，具體結(jié)果如下：如上表所示，采用本發(fā)明的技術(shù)路線，對56份已知測序分型結(jié)果的樣本進(jìn)行HPV基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用本發(fā)明的技術(shù)方案，對病毒即HPV進(jìn)行分析，所得的結(jié)果與已知的分型結(jié)果一致，從而證明了本發(fā)明的技術(shù)方案能夠有效地應(yīng)用于對病毒尤其是HPV的檢測，同時相對于現(xiàn)有的測序分型方法，本發(fā)明的技術(shù)方法要快速地多。另外，如上表所示，本發(fā)明的技術(shù)方案可以有效地適用于病毒的多種型別，即可以有效地對多種HPV型別進(jìn)行檢測。工業(yè)實用性本發(fā)明的用于構(gòu)建DNA測序文庫的DNA標(biāo)簽、PCR正向標(biāo)簽引物、PCR反向標(biāo)簽引物、DNA測序文庫及其制備方法、用于構(gòu)建DNA測序文庫的試劑盒、確定DNA樣本的DNA序列信息的方法、確定多種DNA樣本的DNA序列信息的方法、對樣本的HPV進(jìn)行分型的方法、對多種樣本的HPV進(jìn)行分型的方法以及用于對HPV進(jìn)行檢測分型的系統(tǒng)，能夠應(yīng)用于HPV檢測分型，可有效地提高對多個待測樣本進(jìn)行HPV檢測分型的效率，并且結(jié)果準(zhǔn)確，成本較低，操作簡單、快速。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示意性實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。