一種羊口瘡病毒elisa檢測(cè)試劑盒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方 法。 二、
【背景技術(shù)】：
[0002] 羊口瘡病毒感染羊口唇部上皮組織后，被感染羊只口唇部先出現(xiàn)丘疹、水皰，隨后 形成膿皰、潰瘍，最后結(jié)成桑椹狀的厚痂塊，聚集大量病毒，且羊口瘡病毒存在免疫逃逸機(jī) 制，常會(huì)造成羊只反復(fù)感染羊口瘡，增加了羊口瘡疫病防控難度。本病一旦發(fā)生，患羊口唇 部會(huì)引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致羊只營(yíng)養(yǎng)攝入減少，生產(chǎn)性能降低。尤其新生羔羊發(fā)生羊口 瘡后，因口唇部嚴(yán)重病變而難以采食母乳，最后饑餓死亡，給羊場(chǎng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0003] 本發(fā)明為了解決上述【背景技術(shù)】中的不足之處，提供一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試 劑盒的制備方法。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒 的制備方法，其特征在于：所述的制備方法為：用兩株識(shí)別羊口瘡病毒不同表位的單克隆 抗體D4和G9,建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，并組裝成檢測(cè)試劑盒。
[0005] 所述的一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的ELISA 檢測(cè)方法為：
[0006] 1)用包被稀釋液稀釋純化凍干的單克隆抗體D4,配制成濃度為3ug/ml的抗體溶 液，IOOul/孔，置于4°C過夜，包被結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔， 輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上 拍干孔中殘留PBST;
[0007] 2)將封閉液加入酶標(biāo)板，IOOul/孔，37°C封閉30~60min，封閉結(jié)束后棄去孔內(nèi) 液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3 次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ;
[0008] 3)加入待檢羊口瘡病毒，IOOul/孔，37°C孵育30~60min。孵育結(jié)束后重復(fù)棄去 孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗 滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ;
[0009] 4)用試劑稀釋液稀釋純化凍干的單克隆抗體G9,配置成濃度為3ug/ml的抗體 溶液，IOOul/孔，37°C孵育30~60min。孵育結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板， 200 μ L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后， 在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ;
[0010] 5)用試劑稀釋液1:5000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體，IOOul/孔，37°C孵 育30~60min。孵育結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔，輕微震蕩IOs 后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘 留 PBST ;
[0011] 6)加入TMB顯色液，IOOul/孔，避光，37°C孵育15~20min ;
[0012] 7)加入 2mol/L 的終止液 H2SO4, IOOul/ 孔，15min 內(nèi)檢測(cè)各孔 OD45。值，以 Ρ/Ν>2· 1 為陽性孔。
[0013] 所述的ELISA檢測(cè)方法能夠特異性識(shí)別羊口瘡病毒，不與羊痘病毒存在交叉反 應(yīng)。
[0014] 所述的ELISA檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限度為0. 625ng/ml。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下：本發(fā)明針利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有兩株 雜交瘤細(xì)胞D4和G9,分別制備并純化小鼠腹水，建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，并組裝成試 劑盒。該試劑盒能夠特異性檢測(cè)羊口瘡病毒，最低檢測(cè)限度為〇. 625ng/ml，且不與羊痘病毒 存在交叉反應(yīng)，為羊口瘡疫病防控，流行病學(xué)調(diào)查等提供有力工具。 四、
【附圖說明】：
[0016] 圖1為按照本發(fā)明中ELISA操作方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 五、
【具體實(shí)施方式】：
[0017] -種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法為用兩株識(shí)別羊口瘡病毒不同表 位的單克隆抗體D4和G9,建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，并組裝成檢測(cè)試劑盒。
[0018] 1、羊口瘡病毒的制備
[0019] 羊口瘡病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，3000rpm離心15~20min，取上清，置于 4°C離心機(jī)，15000rpm離心20~30min，棄上清，用PBS重懸下層沉淀，即為純化的羊口瘡病 毒，凍干保存，用于免疫BALB/c小鼠及組裝ELISA試劑盒。
[0020] 2、羊口瘡病毒單克隆抗體的制備
[0021] 用羊口瘡病毒多次免疫BALB/c小鼠，待小鼠血清效價(jià)達(dá)到1:50000,取小鼠脾臟， 分離脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，制備雜交瘤細(xì)胞，最終篩選到兩株能夠分泌特 異性識(shí)別羊口瘡病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞D4和G9,且兩株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆 抗體能夠識(shí)別羊口瘡病毒的不同表位。
[0022] 將D4和G9分別擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取腹腔已注射液體石蠟一周的BALB/ c小鼠，每只小鼠腹腔注射1種雜交瘤細(xì)胞，IO5個(gè)/只，常規(guī)飼養(yǎng)10天左右，至小鼠腹部膨 大、活動(dòng)受限時(shí)，抽取小鼠腹水約2-3ml，1500rpm-2000rpm離心10min，去除下層沉淀及上 層液體石蠟，取中層澄清液體。用蛋白G親和層析柱純化收集到的澄清液體，即得到大量的 單克隆抗體D4和G9,將所得單克隆抗體置于4°C透析過夜，凍干保存。
[0023] 3、羊口瘡病毒雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
[0024] 1)用包被稀釋液稀釋純化凍干的單克隆抗體D4,配制成濃度為3ug/ml的抗體溶 液，IOOul/孔，置于4°C過夜，包被結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔， 輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上 拍干孔中殘留PBST;
[0025] 2)將封閉液加入酶標(biāo)板，IOOul/孔，37°C封閉30~60min，封閉結(jié)束后棄去孔內(nèi) 液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3 次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ;
[0026] 3)加入待檢羊口瘡病毒，IOOul/孔，37°C孵育30~60min。孵育結(jié)束后重復(fù)棄去 孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗 滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ;
[0027] 4)用試劑稀釋液稀釋純化凍干的單克隆抗體G9,配置成濃度為3ug/ml的抗體 溶液，IOOul/孔，37°C孵育30~60min。孵育結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板， 200 μ L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后， 在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ;
[0028] 5)用試劑稀釋液1:5000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體，IOOul/孔，37°C孵 育30~60min。孵育結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體，添加 PBST至酶標(biāo)板，200 μ L/孔，輕微震蕩IOs 后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘 留 PBST