;
[0029] 6)加入TMB顯色液，IOOul/孔，避光，37°C孵育15~20min ;
[0030] 7)加入終止液（2mol/L H2SO4)，IOOul/ 孔，15min 內(nèi)檢測(cè)各孔 OD45。值，以 Ρ/Ν>2· 1 為陽(yáng)性孔。
[0031] 4、ELISA檢測(cè)方法靈敏度的測(cè)定
[0032] 將純化的羊口瘡病毒凍干粉溶于PBST中，配制成濃度為10ng/ml，5ng/ml，2. 5ng/ ml，I. 25ng/ml，0. 625ng/ml，0. 312ng/ml，0. 156ng/ml 和 0· 078ng/ml 的溶液，按照 2 中 ELISA操作步驟，檢測(cè)不同濃度所對(duì)應(yīng)的OD45。值，與陰性對(duì)照OD 45。值相比，得到不同濃度羊 口瘡病毒液對(duì)應(yīng)的P/N值，以P/N>2. 1對(duì)應(yīng)的最低羊口瘡病毒液濃度為ELISA檢測(cè)方法的 最低檢測(cè)限度。ELISA檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限度為0. 625ng/ml，具體測(cè)定結(jié)果如表1 :
[0033] 表1.靈敏度檢測(cè)結(jié)果
[0035] 5. ELISA檢測(cè)方法特異性鑒定
[0036] 將羊痘病毒，羊口瘡病毒分別作為檢測(cè)抗原，設(shè)陰性對(duì)照，按照2中ELISA操作步 驟，檢測(cè)該ELISA方法是否與羊痘病毒存在交叉反應(yīng)。以P/N>2. 1為陽(yáng)性，確定該ELISA 檢測(cè)方法僅與羊口瘡病毒進(jìn)行特異性反應(yīng)，與羊痘病毒不存在交叉反應(yīng)。具體檢測(cè)結(jié)果如 下：
[0037] 表2 ·特異性鑒定結(jié)果
[0038]
[0039] 6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0040] 將純化的羊口瘡病毒凍干粉溶于PBST中，配制成濃度為10ng/ml，9ng/ml，8ng/ ml，7ng/ml，6ng/ml，5ng/ml，4ng/ml，3ng/ml，2ng/ml 和 lng/ml 的溶液，按照 2 中 ELISA 操作 步驟，檢測(cè)不同濃度所對(duì)應(yīng)的OD45。值。以羊口瘡病毒液濃度為橫坐標(biāo)（y)，以0D450值為縱 坐標(biāo)（X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1)。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y = 〇. 2033x+0. 0103
[0041] 表3 ·標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)結(jié)果
[0043] 7. ELISA試劑盒的組裝
[0044] 羊口瘡病毒雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒具體組成如下：
[0045] (1)空白96孔酶標(biāo)板一塊；
[0046] (2)純化羊口瘡病毒凍干粉一支，使用時(shí)，用試劑稀釋液稀釋，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲 線；
[0047] (3)純化單克隆抗體D4凍干粉一支，使用時(shí)，用包被緩沖液稀釋成3ug/ml ;
[0048] (4)純化單克隆抗體G9凍干粉一支，使用時(shí)，用試劑稀釋液稀釋成3ug/ml ;
[0049] (5)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體一只，使用時(shí)，用試劑稀釋液1:5000稀釋； [0050] (6) TMB顯色液，終止液（2mol/L H2SO4)，包被緩沖液（50mmol/L碳酸鹽緩沖液）， 封閉液（5 %脫脂奶粉溶液），試劑稀釋液（PBST)，洗滌液（PBST)各一支。
[0051] 試劑盒中除辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體置于_20°C保存，其與置于4°C保存。
[0052] 實(shí)施例：從羊場(chǎng)采集山羊口腔棉拭子共17份：11份樣品具有明顯羊口瘡臨床癥 狀，其中患羊口唇部4份臨床表現(xiàn)水皰，4份出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，3份出現(xiàn)結(jié)痂，經(jīng)PCR方法檢測(cè)， 結(jié)果顯示11份樣品均呈羊口瘡病毒陽(yáng)性；剩余6份樣品臨床表現(xiàn)正常，經(jīng)PCR方法檢測(cè)，結(jié) 果顯示4份樣品呈羊口瘡病毒陽(yáng)性，2份樣品呈羊口瘡病毒陰性。將上述棉拭子浸泡于試劑 稀釋液，置于4°C過(guò)夜，按照2中ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)棉拭子浸出液的OD 45。值。羊口瘡陽(yáng)性 樣品P/N>2. 1，羊口瘡陰性樣品P/N〈2. 1，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際患病情況一致，具體結(jié)果如表3 :
[0053] 表3·羊場(chǎng)樣品檢測(cè)結(jié)果
[0054]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的制備方法為：用 兩株識(shí)別羊口瘡病毒不同表位的單克隆抗體D4和G9,建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，并組 裝成檢測(cè)試劑盒。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于： 所述的ELISA檢測(cè)方法為： 1) 用包被稀釋液稀釋純化凍干的單克隆抗體D4,配制成濃度為3ug/ml的抗體溶液， IOOul/孔，置于4°C過(guò)夜，包被結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，添加PBST至酶標(biāo)板，200 y L/孔，輕微 震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干 孔中殘留PBST ; 2) 將封閉液加入酶標(biāo)板，IOOul/孔，37°C封閉30~60min，封閉結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體， 添加PBST至酶標(biāo)板，200 y L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最 后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ; 3) 加入待檢羊口瘡病毒，IOOul/孔，37°C孵育30~60min。孵育結(jié)束后重復(fù)棄去孔內(nèi) 液體，添加PBST至酶標(biāo)板，200 y L/孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3 次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘留PBST ; 4) 用試劑稀釋液稀釋純化凍干的單克隆抗體G9,配置成濃度為3ug/ml的抗體溶液， IOOul/孔，37°C孵育30~60min。孵育結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體，添加PBST至酶標(biāo)板，200 y L/ 孔，輕微震蕩IOs后，棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗 布上拍干孔中殘留PBST ; 5) 用試劑稀釋液1:5000稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體，IOOul/孔，37°C孵育 30~60min。孵育結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體，添加PBST至酶標(biāo)板，200 y L/孔，輕微震蕩IOs后， 棄掉酶標(biāo)板中的PBST，重復(fù)洗滌3次，最后一次洗滌結(jié)束后，在干凈紗布上拍干孔中殘留 PBST ； 6) 加入TMB顯色液，IOOul/孔，避光，37°C孵育15~20min ; 7) 加入2mol/L的終止液H2SO4, IOOul/孔，15min內(nèi)檢測(cè)各孔OD45。值，以P/N>2. 1為陽(yáng) 性孔。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于： 所述的ELISA檢測(cè)方法能夠特異性識(shí)別羊口瘡病毒，不與羊痘病毒存在交叉反應(yīng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于： 所述的ELISA檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限度為0. 625ng/ml。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法。本發(fā)明針利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有兩株雜交瘤細(xì)胞D4和G9，分別制備并純化小鼠腹水，建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，并組裝成試劑盒。該試劑盒能夠特異性檢測(cè)羊口瘡病毒，最低檢測(cè)限度為0.625ng/ml，且不與羊痘病毒存在交叉反應(yīng)，為羊口瘡疫病防控，流行病學(xué)調(diào)查等提供有力工具。一種羊口瘡病毒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法為：用兩株識(shí)別羊口瘡病毒不同表位的單克隆抗體D4和G9，建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，并組裝成檢測(cè)試劑盒。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號(hào)】CN105044345
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510489772
【發(fā)明人】陳德坤, 劉鶴媛, 周銘
【申請(qǐng)人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年8月11日