通過持續(xù)性酶以一個核苷酸的精度控制DNA在納米孔中的移動本專利申請要求獲得如下專利申請的優(yōu)先權(quán)和利益：美國臨時專利申請系列號61/402,903，題目為“通過持續(xù)性酶以核苷酸的精度控制DNA在納米孔中的移動”（ControlofDNAMovementinaNanoporeatOneNucleotidePrecisionbyaProcessiveEnzyme），其于2010年9月7日提出申請；美國臨時專利申請系列號61/574,237，題目為“用于在納米孔上對單鏈多核苷酸測序的方法”（MethodsforSequencingSingle-StrandedPolynucleotidesonANanopore），其于2011年7月30日提出申請；美國臨時專利申請系列號61/574,238，題目為“保護(hù)DNA模板3′端免于核酸外切酶消化的DNA引物”（DNAPrimerthatProtectsDNATemplate3′TerminusfromExonucleaseDigestion），其于2011年7月30日提出申請；美國臨時專利申請系列號61/574,236，題目為“用堿性DNA和C3(CPG)間隔物保護(hù)DNA3′端免于核酸外切酶消化”（ProtectionofDNA3′TerminiFromExonucleolyticDigestionUsingAbasicDNAandaC3(CPG)Spacer），其于2011年9月7日提出申請；美國臨時專利申請系列號61/574,240，題目為“使用封閉寡聚體和蛋白納米孔通過Phi29DNAP激活單個DNA分子用于DNA復(fù)制”（ActivationofIndividualDNAMoleculesForDNAReplicationByPhi29DNAPUsingaBlockingOligomerandaProteinNanopore），其于2011年7月30日提出申請；美國臨時專利申請系列號61/574,239，題目為“使用登錄寡聚體控制Phi29DNAP在ss-DNA底物上的結(jié)合位置”（ControlofPhi29DNAPBindingLocationAlongass-DNASubstrateUsingaRegistryOligomer），其于2011年7月30日提出申請；美國臨時專利申請系列號61/574,235，題目為“使用電壓控制的DNA二聚體解鏈和重合鏈對DNA序列進(jìn)行再閱讀”（Re-ReadingDNASequenceinaNanoporeUsingVoltage-ControlledUnzippingandRe-ZippingoftheDNADuplex），其于2011年7月30日提出申請；和美國臨時專利申請系列號61/574,235，題目為“使用DNA聚合酶允許更快激活DNA以漸次通過納米孔的較短封閉寡聚體”（ShorterBlockingOligomersAllowingFasterActivationofDNAforRatchetingThroughaNanoporeUsingaDNAPolymeraseEnzyme），其于2011年7月30日提出申請，本文通過引證并入它們的全部內(nèi)容用于各種目的。本發(fā)明部分地使用美國國立人類基因組研究所的基金，基金號為5RC2NG00553-02。美國聯(lián)邦政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本文公開的發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)混合物中的單個聚合物受到另一種化合物(例如酶)的作用的時機的裝置和方法。本發(fā)明特別用于分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子開關(guān)、分子電路和分子計算器，及其制造等領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及使用組合物診斷受試者是否易患癌癥、自身免疫性疾病、細(xì)胞周期病癥或其它病癥的方法。背景本發(fā)明涉及用于表征多核苷酸和其它聚合物的組合物、方法和裝置?？焖俅_定DNA和RNA的核苷酸序列是生物技術(shù)研究人員，特別是尋求獲得生物體整個基因組序列的課題，的主要目標(biāo)。此外，快速確定多核苷酸的序列，對于鑒定個體和群體中的遺傳突變和多態(tài)性是重要的。納米孔測序是一種快速確定多核苷酸分子序列的方法。納米孔測序是基于物理感知單個多核苷酸（例如DNA和RNA）中的單個核苷酸在穿過納米孔時的性質(zhì)（或核苷酸環(huán)境中的物理變化（即例如電流））。原則上，多核苷酸的序列可以從單個分子確定。然而，在實踐中，優(yōu)選地，多核苷酸序列由從相同分子的多次通過或者由具有相同多核苷酸序列的多個分子的通過獲得的統(tǒng)計平均數(shù)據(jù)加以確定。Kasianowicz等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:13770-13773,1996,本文引用其作為參考)通過使用電場強迫單鏈RNA和DNA分子通過脂雙層膜中的1.5納米直徑的納米孔開孔（例如離子通道），研究了使用膜通道將多核苷酸作為通過小離子通道的分子加以表征。納米孔開孔的直徑在任何給定時間內(nèi)僅允許單鏈多核苷酸穿過納米孔。當(dāng)多核苷酸穿過納米孔時，多核苷酸部分地阻塞納米孔開孔，導(dǎo)致離子電流瞬時降低。因為電流降低的幅度直接與多核苷酸的長度成比例，所以Kasianowicz等(1996)能夠通過測量離子電流的改變實驗性地確定多核苷酸的長度。Baldarelli等(U.S.Pat.No.6,015,714)和Church等(美國專利No.5,795,782)介紹了使用納米孔開孔在單體的基礎(chǔ)上以單體表征多核苷酸，包括DNA和RNA分子。特別地，Baldarelli等通過使多核苷酸通過納米孔開孔對多核苷酸進(jìn)行了表征和測序。該納米孔開孔置于隔離兩種介質(zhì)的結(jié)構(gòu)或界面中。當(dāng)多核苷酸通過納米孔時，每個堿基/核苷以一定的方式改變離子電流，使得鑒定瞬時阻塞納米孔開孔的核苷酸的方式成為可能，藉此可以表征多核苷酸的核苷酸組成，并可能確定多核苷酸的核苷酸序列。先前納米孔分析技術(shù)的缺點是控制被分析靶多核苷酸的速度。如Kasianowicz等(1996)所述，納米孔分析是一種用于確定多核苷酸長度的有用方法。然而，移位速度依賴于核苷酸組成，在Kasianowicz等(1996)列出的測量條件下，可以在105-107個核苷酸/秒的范圍變化。因此，任何給定多核苷酸的長度與其移位時間之間的關(guān)系并不直觀。還預(yù)期如果充分降低移位速度，可以獲得關(guān)于多核苷酸內(nèi)核苷酸單位的組成及它們之間的空間關(guān)系的更高分辨率。最近，在納米孔開孔上分析了與核酸加工酶結(jié)合的DNA或RNA分子的性質(zhì)。所研究的復(fù)合體包括單鏈DNA與大腸桿菌核酸外切酶I的復(fù)合體(Hornblower,B.;Coombs,A.;Whitaker,R.D.;Kolomeisky,A.;Picone,S.J.;Meller,A.;Akeson,M.Nat.Methods.2007,4,315-317)，RNA與噬菌體phi8ATP酶的復(fù)合體(Astier,Y.;Kainov,D.E.;Bayley,H.;Tuma,R.;Howorka,S.Chemphyschem.2007,8,2189-2194)，和與兩種A族DNA聚合酶的3′-5′-核酸外切酶缺陷體，大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段(KF(外切-))和噬菌體DNA聚合酶(T7DNAP(外切-))，結(jié)合的引物/模板DNA底物(Benner,S.;Chen,R.J.;Wilson,N.A.;Abu-Shumays,R.;Hurt,N.;Lieberman,K.R.;Deamer,D.W.;Dunbar,W.B.;Akeson,M.Nat.Nanotechnol.2007,2,718-724;Cockroft,S.L.;Chu,J.;Amorin,M.;Ghadiri,M.R.J.Am.Chem.Soc.2008,130,818-820;Gyarfas,B.;Olasagasti,F.;Benner,S.;Garalde,D.;Lieberman,K.R.;Akeson,M.ACS.Nano.2009,3,1457-1466;Hurt,N.;Wang,H.;Akeson,M.;Lieberman,K.R.J.Am.Chem.Soc.2009,131,3772-3778;Wilson,N.A.;Abu-Shumays,R.;Gyarfas,B.;Wang,H.;Lieberman,K.R.;Akeson,M.;Dunbar,W.B.ACS.Nano.2009,3,995-1003)。我們已經(jīng)證明，T7DNAP(外切-)能夠復(fù)制并使保留在α-溶血素(α-HL)納米孔內(nèi)的DNA模板逆著所施加的80mV電壓前進(jìn)(Olasagasti,F.;Lieberman,K.R.;Benner,S.;Cherf,G.M.;Dahl,J.M.;Deamer,D.W.;Akeson,M.,Nat.Nanotechnol.2010,advanceonlinepublication,doi:10.1038/nnano.2010.2177)。然而，由于T7DNAP(外切-)-DNA復(fù)合體在負(fù)載條件下(underload)穩(wěn)定性低、在80mV電壓下信噪比減小、聚合酶的周轉(zhuǎn)率(turnoverrate)高，所以在報道中，難以檢測在復(fù)制期間超過3個連續(xù)核苷酸添加的離子電流階躍(ioniccurrentstep)。HERE國際專利申請No.PCT/US2008/004467和相關(guān)的美國專利申請Nos.12/080,684和12/459,059公開了多種技術(shù)，其包括與數(shù)種示例性DNA聚合酶偶聯(lián)的α-溶血素納米孔，其可以在這里公開的技術(shù)一起使用。目前需要提供能夠用于表征聚合物，包括多核苷酸和多肽，以及診斷和預(yù)后疾病和病癥的組合物和方法。在本領(lǐng)域也需要提供這樣的系統(tǒng)和方法，它們能夠在這樣的時間范圍內(nèi)檢測單核苷酸，利用該時間范圍不僅能夠區(qū)分多核苷酸的各個核苷酸，還能夠?qū)蝹€核苷酸進(jìn)行化學(xué)表征。特別地，還需要提供能夠耐受體外更高鹽濃度的組合物。發(fā)明簡述本發(fā)明人令人驚訝地證明，Phi29DNA聚合酶類似分子剎車發(fā)揮作用，控制多核苷酸沿著由所施加電壓產(chǎn)生的電場移動通過孔。令人驚訝地，該聚合酶能夠以三種模式控制多核苷酸移動通過孔，即聚合酶模式、核酸外切酶模式和解鏈(unzipping)模式。聚合酶模式和核酸外切酶模式是基于酶的正常活性。當(dāng)聚合酶和核酸外切酶活性均被抑制時，在通過施加的強場拉動dsDNA通過納米孔時，Phi29DNA聚合酶令人驚訝地會解開dsDNA鏈。這已經(jīng)被命名為解鏈模式。解鏈模式暗示它是對酶上面的或者穿過酶的dsDNA的解鏈，重要的是，它是破壞兩條鏈與酶的相互作用，并克服雜交狀態(tài)之間的氫鍵所需要的必需力量。這里，我們將描述Phi29DNA聚合酶如何作為多核苷酸的分子剎車發(fā)揮作用，使其能夠充分地、受控地移動通過納米孔用于測序。因此，本發(fā)明提供了用于測序靶多核苷酸的方法，包括：a.使靶多核苷酸與跨膜孔和Phi29DNA聚合酶接觸，使得該聚合酶控制該靶多核苷酸移動通過該孔，且該靶多核苷酸中的一部分核苷酸與該孔相互作用；和b.測量每次相互作用期間通過孔的電流，藉此確定該靶多核苷酸的序列，其中步驟(a)和(b)使用施加的跨越該孔的電壓來實施。該方法優(yōu)選地以如下三種模式之一實施：(1)步驟(a)和(b)優(yōu)選地在存在游離核苷酸和酶輔因子的條件下實施，使得所述聚合酶逆著施加的電壓產(chǎn)生的場移動所述靶多核苷酸通過所述孔；(2)步驟(a)和(b)在不存在游離核苷酸但存在酶輔因子的條件下實施，使得所述聚合酶順著施加的電壓產(chǎn)生的場移動所述靶多核苷酸通過所述孔；或(3)步驟(a)和(b)在不存在游離核苷酸也不存在酶輔因子的條件下實施，使得所述聚合酶順著施加的電壓產(chǎn)生的場移動所述靶多核苷酸通過所述孔。本發(fā)明還提供了形成用于測序靶多核苷酸的傳感器的方法，包括：(a)在靶多核苷酸的存在下，使孔與Phi29DNA聚合酶接觸；和(b)施加跨越該孔的電壓，從而在該孔和該聚合酶之間形成復(fù)合體；藉此形成用于測序靶多核苷酸的傳感器。本發(fā)明還提供了提高Phi29DNA聚合酶活性的速率的方法，包括(a)在多核苷酸存在下，使Phi29DNA聚合酶與孔接觸；和(b)施加跨越該孔的電壓，從而在該孔和該聚合酶之間形成復(fù)合體；藉此提高Phi29DNA聚合酶的活性的速率。本發(fā)明還提供了Phi29DNA聚合酶用于控制靶多核苷酸移動通過孔的用途。本發(fā)明還提供了用于測序靶多核苷酸的試劑盒，包括(a)孔和(b)Phi29DNA聚合酶。本發(fā)明還提供了用于測序樣品中靶多核苷酸的分析裝置，包括多個孔和多個Phi29DNA聚合酶。本發(fā)明還提供了用于確定樣品中多核苷酸的核苷酸序列的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括電源、陽極、陰極、順室(cischamber)、反室(transchamber)，其中所述順室和反室被薄膜分開，該薄膜具有多個開孔（孔），其中每個開孔（孔）的直徑為大約0.25nm-大約4nm，導(dǎo)電溶劑、持續(xù)性DNA修飾酶(processiveDNAmodifyingenzyme)、多種dNTP分子、和金屬離子輔因子。在一個實施方案中，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括至少一種ddNTP分子。在另一個實施方案中，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括電流表。在優(yōu)選實施方案中，該開孔直徑為大約2nm。在另一個實施方案中，該導(dǎo)電溶劑是水性溶劑。在可選擇的實施方案中，該導(dǎo)電溶劑是非水性溶劑。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是一種DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶可耐受至少0.6M的單價鹽。在另一個實施方案中，該單價鹽的濃度是飽和的。在另一個實施方案中，該單價鹽的濃度為0.6M至飽和。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從中溫菌或自然感染中溫菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從嗜鹽菌或自然感染嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從極端嗜鹽菌(extremehalophile)或自然感染極端嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶選自下組中的細(xì)菌：富鹽菌屬（Haloferax）、鹽幾何菌屬（Halogeometricum）、鹽球菌屬（Halococcus）、鹽陸生菌屬（Haloterrigena）、鹽紅菌屬（Halorubrum）、鹽盒菌屬（Haloarcula）、鹽桿菌屬（Halobacterium）、肋生鹽弧菌（Salinivibriocosticola）、伸長鹽單胞菌（Halomonaselongata）、以色列鹽單胞菌（Halomonasisraelensis）、Salinibacterrube、杜氏鹽藻（Dunaliellasalina）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、嗜鹽放線多孢菌（Actinopolysporahalophila）、嗜鹽海球菌（Marinococcushalophilus）和S.costicola。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶從下組中選出：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢桿菌噬菌體M2DNA聚合酶、鏈球菌噬菌體CP1DNA聚合酶、腸桿菌噬菌體DNA聚合酶，及其變體。在優(yōu)選實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是phi29DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶來自中度嗜鹽菌，其中該中度嗜鹽菌從下組中選出：假單胞菌屬、黃桿菌屬、螺旋體屬、鹽弧菌屬、非紅單胞菌屬和雙歧微菌屬。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于確定樣品中多核苷酸的核苷酸序列的設(shè)備，該設(shè)備包括電源、陽極、陰極、順室、反室，其中順室和反室被薄膜分開，該薄膜具有多個開孔（孔），其中每個開孔（孔）的直徑為大約0.25nm-大約4nm，導(dǎo)電溶劑、持續(xù)性DNA修飾酶、多種dNTP分子、和金屬離子輔因子。在一個實施方案中，該設(shè)備進(jìn)一步包括至少一種ddNTP分子。在另一個實施方案中，該裝置進(jìn)一步包括電流表。在優(yōu)選實施方案中，該開孔直徑為大約2nm。在另一個實施方案中，該導(dǎo)電溶劑是水性溶劑。在可選擇的實施方案中，該導(dǎo)電溶劑是非水性溶劑。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶可耐受至少0.6M的單價鹽。在另一個實施方案中，該單價鹽的濃度是飽和的。在另一個實施方案中，該單價鹽的濃度為0.6M至飽和。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從中溫菌或自然感染中溫菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從嗜鹽菌或自然感染嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從極端嗜鹽菌或自然感染極端嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶選自下組中的細(xì)菌：富鹽菌（Haloferax）、鹽幾何菌（Halogeometricum）、鹽球菌（Halococcus）、鹽陸生菌（Haloterrigena）、鹽紅菌（Halorubrum）、鹽盒菌（Haloarcula）、鹽桿菌（Halobacterium）、肋生鹽弧菌（Salinivibriocosticola）、伸長鹽單胞菌（Halomonaselongata）、以色列鹽單胞菌（Halomonasisraelensis）、鄉(xiāng)土鹽水桿菌（Salinibacterrube）、杜氏鹽藻（Dunaliellasalina）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、嗜鹽放線多孢菌（Actinopolysporahalophila）、嗜鹽海球菌（Marinococcushalophilus）和S.costicola。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶從下組中選出：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢桿菌噬菌體M2DNA聚合酶、鏈球菌噬菌體CP1DNA聚合酶、腸桿菌噬菌體DNA聚合酶，及其變體。在優(yōu)選實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是phi29DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶來自中度嗜鹽菌，其中該中度嗜鹽菌從下組中選出：假單胞菌屬、黃桿菌屬、螺旋體屬、鹽弧菌屬、非紅單胞菌屬和雙歧微菌屬。在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于確定樣品中多核苷酸的核苷酸序列的裝置，該裝置包括電源、陽極、陰極、順室、反室，其中順室和反室被薄膜分開，該薄膜具有多個開孔（孔），其中每個開孔（孔）的直徑為大約0.25nm-大約4nm，導(dǎo)電溶劑、持續(xù)性DNA修飾酶、多種dNTP分子、和金屬離子輔因子。在一個實施方案中，該裝置進(jìn)一步包括至少一種ddNTP分子。在另一個實施方案中，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括電流表。在優(yōu)選實施方案中，該開孔直徑為大約2nm。在另一個實施方案中，該導(dǎo)電溶劑是水性溶劑。在可選擇的實施方案中，該導(dǎo)電溶劑是非水性溶劑。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶可耐受至少0.6M的單價鹽。在另一個實施方案中，該單價鹽的濃度是飽和的。在另一個實施方案中，該單價鹽的濃度為0.6M至飽和。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從中溫菌或自然感染中溫菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從嗜鹽菌或自然感染嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從極端嗜鹽菌或自然感染極端嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶選自下組中的細(xì)菌：富鹽菌（Haloferax）、鹽幾何菌（Halogeometricum）、鹽球菌（Halococcus）、鹽陸生菌（Haloterrigena）、鹽紅菌（Halorubrum）、鹽盒菌（Haloarcula）、鹽桿菌（Halobacterium）、肋生鹽弧菌（Salinivibriocosticola）、伸長鹽單胞菌（Halomonaselongata）、以色列鹽單胞菌（Halomonasisraelensis）、鄉(xiāng)土鹽水桿菌（Salinibacterrube）、杜氏鹽藻（Dunaliellasalina）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、嗜鹽放線多孢菌（Actinopolysporahalophila）、嗜鹽海球菌（Marinococcushalophilus）和S.costicola。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶從下組中選出：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢桿菌噬菌體M2DNA聚合酶、鏈球菌噬菌體CP1DNA聚合酶、腸桿菌噬菌體DNA聚合酶，及其變體。在優(yōu)選實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是phi29DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶來自中度嗜鹽菌，其中該中度嗜鹽菌從下組中選出：假單胞菌屬、黃桿菌屬、螺旋體屬、鹽弧菌屬、非紅單胞菌屬和雙歧微菌屬。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于確定樣品中多核苷酸的核苷酸序列的方法，該方法包括如下步驟：提供兩個分開的相鄰的包含液體介質(zhì)的室，位于所述兩個室之間的界面，該界面具有開孔(孔)，其具有這樣的尺寸，使得一次僅允許一條多核苷酸鏈以逐個單體的次序從通道的順側(cè)(cis-side)向反側(cè)(trans-side)通過；提供具有對多核苷酸的結(jié)合活性的持續(xù)性DNA修飾酶；在樣品中提供多核苷酸，其中該多核苷酸的一部分是雙鏈一部分是單鏈；將該多核苷酸引入到所述兩個室的之一中；向同一室內(nèi)引入酶；讓該持續(xù)性DNA修飾酶與該多核苷酸結(jié)合；提供兩個室之間的電勢差，藉此產(chǎn)生第一極性，該第一極性導(dǎo)致該多核苷酸的單鏈部分換位穿過該開孔(孔(transposethrough)到反式側(cè)；向同一室內(nèi)引入酶；讓該酶與該多核苷酸結(jié)合；測量通過通道的電流，藉此檢測多核苷酸中的核苷酸堿基；第一次降低電勢差；使該多核苷酸的單鏈部分換位穿過所述開孔；測量電流變化；增加所述電勢差；測量通過通道的電流，藉此檢測位于所述開孔(孔)的特定核苷酸堿基；重復(fù)上述任一步驟，藉此確定多核苷酸的核苷酸序列。在一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括添加至少一種ddNTP分子的步驟。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括其中開孔直徑為大約2nm。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括其中該液體介質(zhì)是水性溶劑。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括其中該持續(xù)性DNA修飾酶是DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括其中該持續(xù)性DNA聚合酶耐受至少0.6M鹽。在另一個實施方案中，該單價鹽是飽和的。在另一個實施方案中，該單價鹽的濃度為0.6M至飽和。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括其中該持續(xù)性DNA修飾酶是從中溫菌或自然感染中溫菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是從嗜鹽菌或自然感染嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括其中該持續(xù)性DNA修飾酶是從中溫菌、嗜鹽菌或極端嗜鹽菌或自然感染中溫菌、嗜鹽菌或極端嗜鹽菌的病毒中分離的。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶選自下組中的細(xì)菌：富鹽菌（Haloferax）、鹽幾何菌（Halogeometricum）、鹽球菌（Halococcus）、鹽陸生菌（Haloterrigena）、鹽紅菌（Halorubrum）、鹽盒菌（Haloarcula）、鹽桿菌（Halobacterium）、肋生鹽弧菌（Salinivibriocosticola）、伸長鹽單胞菌（Halomonaselongata）、以色列鹽單胞菌（Halomonasisraelensis）、鄉(xiāng)土鹽水桿菌（Salinibacterrube）、杜氏鹽藻（Dunaliellasalina）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、嗜鹽放線多孢菌（Actinopolysporahalophila）、嗜鹽海球菌（Marinococcushalophilus）和肋生鹽弧菌（S.costicola）。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶從下組中選出：phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、His1DNA聚合酶和His2DNA聚合酶、芽孢桿菌噬菌體M2DNA聚合酶、鏈球菌噬菌體CP1DNA聚合酶、腸桿菌噬菌體PRD1DNA聚合酶，及其變體。在一個優(yōu)選實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶是phi29DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該持續(xù)性DNA修飾酶來自中度嗜鹽菌，其中該中度嗜鹽菌從下組中選出：假單胞菌屬、黃桿菌屬、螺旋體屬、鹽弧菌屬、非紅單胞菌屬和雙歧微菌屬。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了測序多核苷酸的方法，該方法包括納入寡聚體的步驟，該寡聚體包括至少一個無堿基核苷酸(abasicnucleotide)種類。在一個優(yōu)選實施方案中，該寡聚體包括超過一個無堿基核苷酸。在一個更優(yōu)選的實施方案中，該寡聚體包括至少5個無堿基核苷酸。在可選擇的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括納入含有C3(CPG)間隔物的寡聚體的步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于測序多核苷酸的方法，該方法進(jìn)一步包括包含一種登記寡聚體(registryoligomer)的步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于測序多核苷酸的方法，該方法進(jìn)一步包括納入封閉寡聚體(blockingoligomer)的步驟。在優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少15個核苷酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少20個核苷酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少25個核苷酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少30個核苷酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少35個核苷酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少40個核苷酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少45個核苷酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，該封閉寡聚體包含至少50個核苷酸。在可選擇的實施方案中，該封閉寡聚體從下組選出：10聚體、15聚體、20聚體、25聚體、30聚體、31聚體、32聚體、33聚體、34聚體、35聚體、36聚體、37聚體、38聚體、39聚體、40聚體、50聚體，或其間任意數(shù)目的核苷酸。還期望提供具有超過50個核苷酸的封閉寡聚體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種測序多核苷酸的方法，其中該多核苷酸的長度為10個核苷酸-5萬個核苷酸。多核苷酸中的核苷酸數(shù)目可以是10,15,20,25,30,35,40,45,50,75,100,150,200,250,300,350,400,450,500,750,1,000,1,500,2,000,2,500,3,000,3,500,4,000,4,500,5,000,10,000,15,000,20,000,30,000,40,000,50,000個或其間的任意數(shù)目。還可期望測序超過50,000個核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明提供了薄膜裝置、系統(tǒng)、以及使用它們的方法。主題裝置或系統(tǒng)包括通過電氣通信手段連接的順室和反室。該順室和反室被包含至少一個孔或通道的薄膜分開。在一個優(yōu)選實施方案中，該薄膜包含具有疏水域和親水域的化合物。在一個更優(yōu)選的實施方案中，該薄膜包含磷脂。該裝置或系統(tǒng)進(jìn)一步包括用于在順室和反室之間施加電場的裝置。該孔或通道的形狀和大小適于使聚合物通過。在一個優(yōu)選實施方案中，該孔或通道容納該聚合物的一部分而非全部。在另一個優(yōu)選實施方案中，該聚合物是多核苷酸。在可選擇的優(yōu)選實施方案中，該聚合物是多肽。本發(fā)明提供的其它聚合物包括多肽、多磷脂、多糖和聚酮。在一個實施方案中，該薄膜進(jìn)一步包括與所述聚合物具有結(jié)合親和力的化合物。在一個優(yōu)選實施方案中，該結(jié)合親和力(Ka)至少為106l/摩爾。在更優(yōu)選的實施方案中，Ka至少為108l/摩爾。在另一優(yōu)選的實施方案中，該化合物與至少一個孔相鄰。在更優(yōu)選的實施方案中，該化合物是通道。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該通道具有生物活性。在最優(yōu)選的實施方案中，該化合物包含所述孔。在另一個實施方案中，所述孔的大小和形狀允許激活物通過，其中該激活物從下組中選出：ATP、NAD+、NADP+、二?；视汀⒘字＝z氨酸、類花生酸（eicosinoids）、視黃酸、維生素D2、抗壞血酸、神經(jīng)肽、腦啡肽、內(nèi)啡肽、4-氨基丁酸（GABA）、5-羥基色胺（5-HT）、兒茶酚胺、乙酰CoA、S-腺苷甲硫氨酸，和任何其它生物激活物。在另外一個實施方案中，孔的大小和形狀允許輔因子通過，其中輔因子從下組中選出：Mg2+,Mn2+,Ca2+,ATP,NAD+,NADP+，和任何其它生物輔因子。在優(yōu)選實施方案中，孔或通道是孔分子或通道分子，并且包括生物分子，或合成修飾分子，或經(jīng)過改變的生物分子，或其組合。這些生物分子是例如，但不限于，離子通道、核苷通道、肽通道、糖轉(zhuǎn)運體、突觸通道、跨膜受體如GPCR等、核孔、合成變體、嵌合變體、或類似物。在一個優(yōu)選實施方案中，生物分子是α-溶血素。作為備選，化合物包含非酶生物活性。具有非酶生物活性的化合物可以是例如，但不限于，蛋白質(zhì)、肽、抗體、抗原、核酸、肽核酸(PNAs)、鎖核酸(LNAs)、嗎啉(morpholinos)、糖、脂質(zhì)、糖磷酸肌醇、脂多糖等。化合物可以具有抗原活性?；衔锟梢跃哂羞x擇性結(jié)合性質(zhì)，藉此聚合物在特殊的受控環(huán)境條件下與化合物結(jié)合，但當(dāng)環(huán)境條件改變時，則不結(jié)合。這些條件可以是例如，但不限于，[H+]改變、環(huán)境溫度改變、嚴(yán)緊度改變、疏水性改變、親水性改變等。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種化合物，其中該化合物進(jìn)一步包括接頭分子，該接頭分子從下組中選出：巰基、硫醚基、磷酸基、硫酸基、氰基、哌啶基、芴甲氧羰基(Fmoc)、和叔丁氧羰基(Boc)。在一個實施方案中，該薄膜包含多個孔。在一個實施方案中，該裝置包括多個電極。多核苷酸在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于控制酶與部分雙鏈性的多核苷酸的復(fù)合體結(jié)合的方法，該方法包括：提供兩個分開的相鄰的介質(zhì)池和位于該兩個池之間的界面，該界面具有通道，該通道的尺寸僅允許一次讓一個多核苷酸順次逐個單體地從一個池移向另一個池；提供具有與該部分雙鏈性的多核苷酸復(fù)合體的結(jié)合活性的酶；提供包括第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸復(fù)合體，其中該多核苷酸復(fù)合體的一部分是雙鏈性的，并且其中該第一多核苷酸進(jìn)一步包括與第二多核苷酸不相容的模塊；將所述多核苷酸復(fù)合體引入到兩個池之一中；將所述酶引入到兩個池之一中；在兩個池之間施加電勢差，藉此產(chǎn)生第一極性；第一次翻轉(zhuǎn)該電勢差，藉此產(chǎn)生第二極性；第二次翻轉(zhuǎn)電勢差以生成第一極性，藉此控制所述酶與所述部分雙鏈性的多核苷酸復(fù)合體的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，該介質(zhì)是導(dǎo)電的。在更優(yōu)選的實施方案中，該介質(zhì)是水溶液。在優(yōu)選實施方案中，所述模塊選自下組：肽核酸、2'-O-甲基、熒光化合物、衍生化核酸、和核酸異構(gòu)體。在另一個優(yōu)選實施方案中，該方法進(jìn)一步包括如下步驟：測量所述兩個池之間的電流；將第一次誘導(dǎo)第一極性時獲得的電流與第二次誘導(dǎo)第一極性時獲得的電流進(jìn)行比較。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步包括如下步驟：測量所述兩個池之間的電流；將第一次誘導(dǎo)第一極性時獲得的電流值與后來獲得的電流值進(jìn)行比較。在更優(yōu)選的實施方案中，酶選自下組：DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、DNA連接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙?；?。在另一個備選的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括如下步驟：提供至少一種可觸發(fā)酶活性的試劑；將該試劑引入含有多核苷酸復(fù)合體的池中；和在合適的溫度下溫育該池。在更優(yōu)選的實施方案中，該試劑選自下組：脫氧核糖核苷酸和輔因子。在更優(yōu)選的實施方案中，該脫氧核糖核苷酸在引入該輔因子之前被引入到池中。在另一個還更優(yōu)選的實施方案中，該輔因子選自下組：Mg2+,Mn2+,Ca2+,ATP,NAD+,和NADP+。在一個實施方案中，將酶引入到與多核苷酸相同的池中。在備選的實施方案中，將酶引入到相對的池中。本文公開的發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)混合物中單個多聚體被另一種化合物(例如酶)作用的速率的裝置和方法。該裝置和方法還用于確定多核苷酸的核苷酸堿基序列。本發(fā)明特別用于分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子開關(guān)、分子電路和分子計算器，及其制造等領(lǐng)域。在一個實施方案中，該納米孔系統(tǒng)能夠以大約5Hz-2000Hz的速度控制分子與聚合物的結(jié)合。納米孔系統(tǒng)能夠以例如大約5Hz、大約10Hz、大約15Hz、大約20Hz、大約25Hz、大約30Hz、大約35Hz、大約40Hz、大約45Hz、大約50Hz、大約55Hz、大約60Hz、大約65Hz、大約70Hz、大約75Hz、大約80Hz、大約85Hz、大約90Hz、大約95Hz、大約100Hz、大約100Hz、大約100Hz、大約100Hz、大約110Hz、大約120Hz、大約125Hz、大約130Hz、大約140Hz、大約150Hz、大約160Hz、大約170Hz、大約175Hz、大約180Hz、大約190Hz、大約200Hz、大約250Hz、大約300Hz、大約350Hz、大約400Hz、大約450Hz、大約500Hz、大約550Hz、大約600Hz、大約700Hz、大約750Hz、大約800Hz、大約850Hz、大約900Hz、大約950Hz、大約1000Hz、大約1125Hz、大約1150Hz、大約1175Hz、大約1200Hz、大約1250Hz、大約1300Hz、大約1350Hz、大約1400Hz、大約1450Hz、大約1500Hz、大約1550Hz、大約1600Hz、大約1700Hz、大約1750Hz、大約1800Hz、大約1850Hz、大約1900Hz、大約1950Hz和大約2000Hz控制分子與聚合物的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，該納米孔系統(tǒng)能夠以大約25Hz-大約250Hz的速度控制分子與聚合物的結(jié)合。在更優(yōu)選的實施方案中，該納米孔系統(tǒng)能夠以大約45Hz-大約120Hz的速度控制分子與聚合物的結(jié)合。在最優(yōu)選的實施方案中，該納米孔系統(tǒng)能夠以大約50Hz的速度控制分子與聚合物的結(jié)合。本發(fā)明還提供了薄膜裝置及其使用方法。主題裝置包括通過電氣通信手段連接的順室和反室。該順室和反室被包含至少一個孔或通道的薄膜分開。在一個優(yōu)選實施方案中，該薄膜包含具有疏水結(jié)構(gòu)域和親水結(jié)構(gòu)域的第一種化合物。在更優(yōu)選的實施方案中，該薄膜包含磷脂。該裝置進(jìn)一步包括用于在所述順室和反室之間施加電場的裝置。該孔或通道的形狀和尺寸適合于聚合物通過。在一個優(yōu)選實施方案中，該孔或通道容納聚合物的一部分而非全部。在另一個優(yōu)選實施方案中，該孔或通道容納聚合物的單體部分而非聚合物的二聚體部分。在另外一個優(yōu)選實施方案中，該聚合物是多核苷酸。在可選擇的優(yōu)選實施方案中，該聚合物是多肽。本發(fā)明提供的其它聚合物包括多肽、磷脂、多糖和聚酮。在一個實施方案中，該薄膜進(jìn)一步包括對聚合物具有結(jié)合親和力的第二種化合物。在一個優(yōu)選實施方案中，該結(jié)合親和力(Ka)至少為106l/摩爾。在更優(yōu)選的實施方案中，Ka至少為108l/摩爾。在另一優(yōu)選的實施方案中，該化合物與至少一個孔相鄰。在更優(yōu)選的實施方案中，該化合物是通道。在另外更優(yōu)選的實施方案中，該通道具有生物活性。在最優(yōu)選的實施方案中，該化合物包含所述孔。在一個實施方案中，所述第二種化合物包含酶活性。該酶活性可以是例如，但不限于，蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化還原酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、甲基化酶、乙?；?、連接酶、裂合酶等的酶活性。在更優(yōu)選的實施方案中，該酶活性可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、DNA連接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶、乙?；傅鹊拿富钚?。在一個優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是從嗜鹽微生物中分離的。在備選的優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是從嗜鹽微生物中分離的DNA聚合酶的天然存在變體。在備選的優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是從嗜鹽微生物中分離的DNA聚合酶的合成變體。在備選的優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是合成組合物，其具有從嗜鹽微生物分離的DNA聚合酶的酶學(xué)性質(zhì)，或者具有從嗜鹽微生物分離的DNA聚合酶的天然發(fā)生變體的酶學(xué)性質(zhì)。在更優(yōu)選的實施方案中，該嗜鹽微生物是極端嗜鹽微生物。在另一更優(yōu)選的實施方案中，該嗜鹽微生物是中度嗜鹽微生物。在另一優(yōu)選的實施方案中，該嗜鹽微生物在選自下組的環(huán)境條件中生長旺盛：溫度等于或大于50°C，壓力等于或大于200kPa，pH等于或小于6.5，pH等于或大于7.5，鹽度等于或大于0.5M。例如，溫度可以是50°C,55°C,60°C,65°C,70°C,75°C,80°C,85°C,90°C,95°C,和99°C。在另一實例中，pH可以是2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.5,8.0,8.5,9.0,和9.5。在備選的優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是從能夠感染嗜鹽微生物的病毒中分離的。在備選的優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是從能夠感染嗜鹽微生物的病毒分離出的DNA聚合酶的天然發(fā)生變體。在備選的優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是從能夠感染嗜鹽微生物分離的病毒中分離的DNA聚合酶的合成變體。在另外備選的優(yōu)選實施方案中，DNA聚合酶是合成組合物，其具有從能夠感染嗜鹽微生物分離的病毒中分離的DNA聚合酶的酶學(xué)性質(zhì)，或者具有從能夠感染嗜鹽微生物分離的病毒中分離的DNA聚合酶的天然發(fā)生變體的酶學(xué)性質(zhì)。在更優(yōu)選的實施方案中，該嗜鹽微生物是極端嗜鹽微生物。在備選的實施方案中，該能夠感染嗜鹽微生物的病毒在從下組選出的環(huán)境條件下具有感染性：溫度等于或大于50°C，壓力等于或大于200kPa，pH等于或小于6.5，pH等于或大于7.5，鹽度等于或大于0.5M。例如，溫度可以是50°C,55°C,60°C,65°C,70°C,75°C,80°C,85°C,90°C,95°C,和99°C。在另一實例中，pH可以是2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.5,8.0,8.5,9.0,和9.5。第二種化合物可具有選擇性結(jié)合性質(zhì)，藉此聚合物在特定的受控環(huán)境條件下與第二種化合物結(jié)合，而當(dāng)環(huán)境條件改變時則不結(jié)合。這樣的條件可以是例如，但不限于，[H+]改變、環(huán)境溫度改變、嚴(yán)緊度改變、疏水性改變、親水性改變等。在另一個實施方案中，孔的尺寸和形狀允許激活物通過，其中激活物選自下組：ATP、NAD+、NADP+、二酰基甘油、磷脂酰絲氨酸、類花生酸、視黃酸、維生素D2、抗壞血酸、神經(jīng)肽、腦啡肽、內(nèi)啡肽、4-氨基丁酸（GABA）、5-羥基色胺（5-HT）、兒茶酚胺、乙酰CoA、S-腺苷甲硫氨酸，和任何其它生物激活物。在另外一個實施方案中，孔的尺寸和形狀允許允許輔因子通過，其中輔因子從下組中選出：Mg2+,Mn2+,Ca2+,ATP,NAD+,NADP+，和任何其它生物輔因子。在優(yōu)選實施方案中，孔或通道包括生物分子，或合成修飾的或經(jīng)過改變的生物分子。這些生物分子是例如，但不限于，離子通道、核苷通道、肽通道、糖轉(zhuǎn)運體、突觸通道、跨膜受體如GPCR等、核孔、等等。在備選的實施方案中，第二種化合物包含非酶生物活性。具有非酶生物活性的第二種化合物可以是例如，但不限于，蛋白質(zhì)、肽、抗體、抗原、核酸、肽核酸(PNAs)、鎖核酸(LNAs)、嗎啉(morpholinos)、糖、脂質(zhì)、糖磷酸肌醇、脂多糖等等。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了第三種化合物，其中該第三種化合物進(jìn)一步包括接頭分子，該接頭分子選自下組：巰基、硫醚基、磷酸基、硫酸基、氰基、哌啶基、芴甲氧羰基、和叔丁氧羰基。在一個實施方案中，該薄膜包括多個孔。在一個實施方案中，該裝置包括多個電極。本發(fā)明還構(gòu)想了使phi29DNA聚合酶(DNAP)與單鏈DNA(ss-DNA)結(jié)合，藉此降低該ss-DNA在施加的180mV電壓下穿過α-溶血素納米孔的速度的方法。在優(yōu)選實施方案中，單鏈DNA以接近1個核苷酸/1-100ms的速度穿過phi29DNAP和α-溶血素納米孔。在另一個實施方案中，該速度為1個核苷酸/100-1000ms。本發(fā)明還構(gòu)想了使用引物DNA5′端來保護(hù)模板3′端免于DNA聚合酶(DNAP)消化的方法。本發(fā)明還構(gòu)想了在3′端上共價連接C3(CPG)間隔物，后隨無堿基殘基，來防止DNA的核酸外切消化的方法。本發(fā)明還構(gòu)想了通過將修飾的DNA寡聚體結(jié)合到引物模板結(jié)合點附近，來保護(hù)引物DNA免于phi29DNAP功能的方法。在優(yōu)選實施方案中，phi29結(jié)合于寡聚體5′端，并且施加180mV電勢將該復(fù)合體捕獲在α-溶血素納米孔上從而除去該寡聚體并將phi29置于引物末端，然后DMA復(fù)制可得以進(jìn)行。本發(fā)明還構(gòu)想了使用登記寡聚體(registryoligomer)，優(yōu)選地經(jīng)過修飾的DNA寡聚體，來控制phi29DNAP在ss-DNA上何處結(jié)合并坐落的方法。施加180mV電勢將這些DNAP-DNA復(fù)合體捕獲在α-溶血素納米孔上從而除去該寡聚體并容許s-DNA移位通過phi29DNAP和α-溶血素。本發(fā)明還構(gòu)想了一種方法，其中通過施加的電壓(180mV)使phi29DNAP結(jié)合的dsDNA解鏈(unzip)。在優(yōu)選實施方案中，電壓降低允許DNA重新合鏈(re-zipping)。恢復(fù)電壓再次使DNA解鏈，這允許DNA通過所述納米孔來回移動。本發(fā)明還構(gòu)想使用結(jié)合在DNA引物/轉(zhuǎn)錄本連接點處的封閉寡聚體，由此當(dāng)寡聚體被捕獲在納米孔上時，寡聚體被剝離，隨后DNA被活化，以便步進(jìn)地通過(ratchetingthrough)納米孔。本發(fā)明還構(gòu)想了使用更短的封閉寡聚體并降低封閉從DNA解離寡聚體所需的時間。在優(yōu)選實施方案中，這允許供復(fù)制的DNA分子在納米孔上的更快激活，并提高納米孔用于測序應(yīng)用的通量。本發(fā)明還構(gòu)想了一種多核苷酸測序(sewquencing)方法，該方法包括確定信號中的噪音水平的步驟，噪音水平代表了誘發(fā)信號的核苷酸與之前誘發(fā)信號的核苷酸和之后的誘發(fā)信號的核苷酸相比的同一性。在優(yōu)選實施方案中個，該信號是兩個相鄰池之間測得的電流的變化。在更優(yōu)選的實施方案中，對于某一核苷酸而言，當(dāng)之前的核苷酸和/或之后的核苷酸是不同的核苷酸時，測得的噪音水平更高。本發(fā)明還構(gòu)想了一種多核苷酸測序方法，該方法包括以較其他其它dNTP更低的濃度納入某種dNTP的步驟，藉此降低DNAP反應(yīng)的速度。在一個實施方案中，該dNTP的濃度比其它dNTP低約一個數(shù)量級。在更優(yōu)選的實施方案中，該dNTP的濃度比其它dNTP低約兩個數(shù)量級。附圖簡述圖1圖示了本發(fā)明的一個實施方案，通過該方案phi29DNA聚合酶(phi29DNAP)和DNA之間的二元聚合物能夠被幾乎無限地保留在納米孔上。圖1還圖示了本發(fā)明的一個實施方案，藉此DNA雙鏈體可以被施加的跨納米孔電壓系統(tǒng)地解鏈。圖2圖示了本發(fā)明的一個實施方案，通過該方案與phi29DNAP結(jié)合的DNA雙鏈體可以被施加的跨納米孔電壓系統(tǒng)地解鏈，然后在更低的電勢差下重新合鏈。圖2還圖示了本發(fā)明的一個實施方案，其顯示了野生型phi29DNAP的持續(xù)性核酸外切酶如何能夠系統(tǒng)地使DNA步進(jìn)通過納米孔；該過程可通過dNTP濃度和所施加的跨納米孔電壓加以控制。單個DNA模板可以通過單個結(jié)合的phi29DNAP的聚合酶結(jié)構(gòu)域和核酸外切酶結(jié)構(gòu)域來回通過納米孔；這些競爭性運動可以通過電壓和dNTP濃度加以控制。圖3圖示了本發(fā)明的一個實施方案，通過該方案，phi29DNAP的聚合酶催化位點中正確dNTP的結(jié)合和解離可以通過跨納米孔的離子電流來衡量；活性可能依賴于浸浴納米孔的緩沖液中的正確dNTP的濃度。此外，這些圖顯示，離子閃爍(ionicflicker)能夠預(yù)測由DNA鏈上與給定單體直接相鄰的單體產(chǎn)生的離子電流；該過程可能依賴于與phi29DNAP聚合酶位點中的模板核苷酸互補的dNTP的濃度。圖3還圖示了使用以ddNMP(3′–H)為末端的引物鏈以及與phi29DNAP催化位點的模板堿基互補的dNTP如何可以在體相（bulkphase）中在固定的ssDNA/dsDNA結(jié)合點處維持DNA模板/引物對；通過包含與ddNMP(3′–H)末端類似的ddNMP(3′–H)，可以增強對ssDNA/dsDNA結(jié)合點的保護(hù)。圖4圖示了導(dǎo)致ddNMP(3′–H)末端切離的納米孔電壓是如何增強供復(fù)制的DNA激活的（如圖3所示）。圖5圖示了本發(fā)明的一個實施方案，其顯示了溶液中的dNTP是如何影響DNA復(fù)制的持續(xù)進(jìn)行，其中取決于它們的存在或濃度，dNTP導(dǎo)致暫停(pauses)和獨特的標(biāo)記電流(signaturecurrents)。圖6圖示了本發(fā)明的一個實施方案，其顯示phi29DNAP可以在所施加的至少300mV的跨納米孔電壓下復(fù)制DNA模板；DNA復(fù)制速度可以通過所施加的電壓加以調(diào)節(jié)。圖7圖示了本發(fā)明的一個實施方案，其顯示可以被phi29DNAP轉(zhuǎn)位通過納米孔的DNA模板的長度(堿基數(shù))依賴于被納米孔捕獲的DNA的長度。該圖還顯示，phi29DNAP能夠在0.6MKCl下在納米孔上復(fù)制DNA。圖8圖示了與圖7b相同的數(shù)據(jù)，顯示了在多核苷酸通過納米孔期間的不同階段的多核苷酸和DNAP的狀態(tài)。無堿基殘基用紅色顯示。圖9圖示了本發(fā)明的示例性實施方案，顯示噪音（作為所測量的電流）能夠指示之前和之后核苷酸單體同一性；當(dāng)?shù)谝绘溕系木又邪被岬脑谙群驮诤蠛塑账崤c第二直系同源鏈上(其中居中核苷酸與第一鏈相同)觀察到的在先和在后核苷酸不同時，觀察到的來自第一鏈上的居中氨基酸的噪音幅度不同。圖10圖示了使phi29DNA聚合酶(DNAP)與單鏈DNA(ss-DNA)結(jié)合顯著降低ss-DNA在180mV的施加電勢下穿過α-溶血素納米孔的速度。圖11圖示了通過在引物模板結(jié)合點附近結(jié)合經(jīng)過修飾的DNA寡聚體，可以保護(hù)引物DNA鏈免于phi29DNAP的功能；phi29結(jié)合寡聚體5′-端，并通過施加的180mV電勢將該復(fù)合體捕獲在α-溶血素納米孔上而除去該寡聚體并將phi29置于引物末端，然后可以發(fā)生DNA復(fù)制。圖12圖示了phi29DNAP能夠結(jié)合并沿著ss-DNA移動；使用登記寡聚體(一種經(jīng)過修飾的寡聚體)來控制phi29DNAP在ss-DNA上何處結(jié)合并坐落。圖13圖示了具有3′–5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶能夠消化模板DNA的3′端；該方法使用引物DNA5′端保護(hù)模板3′端免于被DNA聚合酶(DNAP)消化。圖14圖示了如何能夠通過稀釋dNTPs控制DNA模板的合成速度。圖15-19圖示了實驗結(jié)果，顯示電壓激活的DNA在納米孔中向前和向后步進(jìn)。圖15.納米孔裝置的組件。a)納米孔裝置。將單α-HL納米孔插入在分隔兩個池的脂雙層中，每池含有100μl緩沖KCl溶液。向順室添加帶負(fù)電荷的單鏈DNA(ssDNA)。施加跨池的電壓（反式側(cè)+），驅(qū)動離子電流通過孔（例如在0.3MKCL,180mV下60pA），并導(dǎo)致ssDNA進(jìn)入和轉(zhuǎn)位通過納米孔。b)P/tDNA被保護(hù)免于phi29DNAP引導(dǎo)的消化和延長的示意圖。引物DNA鏈需要在體相(bulkphase)中被保護(hù)免于合成和消化，但是在納米孔中被激活用于合成。這可以通過將經(jīng)過修飾的封閉寡聚體在p/t結(jié)合點處退火實現(xiàn)。(i)顯示了p/t(23nt/79nt)底物和25nt封閉寡聚體結(jié)合位點彎曲紅線）。封閉寡聚體含有3′-C3間隔物，隨后是6個無堿基殘基(Xs)，以防護(hù)降解并方便在納米孔上除去。版本iii含有2個5′-吖啶殘基(Zs)。c)使用封閉寡聚體保護(hù)體相中p/tDNA。將不存在或存在寡聚體ii或iii的b.i)中的DNAp/t底物與指示的phi29DNAP,dNTPs,和Mg2+一起溫育。在沒有封閉寡聚體的條件下，Phi29DNAP消化(-dNTPs,泳道3)并延長(+dNTPs,泳道4)了引物。在存在封閉寡聚體(i)或(ii)的條件下，引物鏈被保護(hù)免于消化(-dNTPs,泳道6,9)和延長(+dNTPs,泳道7,10)。圖16。DNA向前或向后步進(jìn)通過納米孔。(a)用于步進(jìn)通過納米孔的P/tDNA。圖16b（紅線）的封閉寡聚體iii保護(hù)引物免于體相中的催化。模板25-29位的5個無堿基殘基(Xs)在通過納米孔時會在電流中產(chǎn)生峰(引用)。(b,c)DNA向前或向后步進(jìn)通過納米孔。(a)通過施加的電壓將預(yù)負(fù)載phi29DNAP的p/tDNA捕獲在納米孔上(i)。捕獲開始時將無堿基插入物置于納米孔上方(紅圈)。所施加的電壓強迫封閉寡聚體/模板雙鏈體發(fā)生非催化解鏈，導(dǎo)致當(dāng)無堿基插入物向前步進(jìn)通過納米孔時在電流中產(chǎn)生一個35pA峰(ii)。(iii)進(jìn)一步的解鏈除去封閉寡聚體，并將phi29DNAP置于引物/模板結(jié)合點處。在dNTPs和Mg2+存在下，phi29DNAP隨后持續(xù)復(fù)制25個DNA堿基，導(dǎo)致無堿基插入物反向步進(jìn)通過納米孔，并再次出現(xiàn)35pA電流峰(iv)。當(dāng)無堿基插入物到達(dá)聚合酶活性位點時，復(fù)制停止(v)。(d)反向DNA步進(jìn)是復(fù)制依賴性的。用2’,3’-雙脫氧胞嘧啶代替引物3’-脫氧胞嘧啶會導(dǎo)致第二個峰的出現(xiàn)延遲（紅色箭頭）。Phi29DNAP最終切除末端雙脫氧胞嘧啶，起始DNA合成，并導(dǎo)致第二個35pA峰的穿越(traversal)。圖17.報告正向和反向DNA步進(jìn)的離子電流信號分析。(a)顯示檢測到的來自單個分子正向/反向步進(jìn)通過納米孔的離散振幅的離子電流軌跡。總共檢測到33個離散振幅，它們相對一個共同的25pA振幅（位置0）對稱。在分子與分子之間，振幅被隨機跳過（例如位置-4和-3）或重復(fù)（例如位置14和15）。(b)(a)中所示電流振幅的參考圖譜(Referencemap)。(c)在單次5hr實驗處理的200個分子中，(b)中每個振幅位置被跳過（黑色向上條棒）或重復(fù)（灰色向下條棒）的次數(shù)百分比。(d)對于(c)中分析的分子，兩個相應(yīng)振幅（例如位置-15和15）均被跳過（黑色向上條棒）或重復(fù)（灰色向下條棒）的次數(shù)百分比。圖18.DNA復(fù)制對關(guān)鍵dNTP底物的依賴性。(a)用于步進(jìn)通過納米孔的P/tDNA。單個脫氧鳥嘌呤（紅色箭頭）位于p/t結(jié)合點與無堿基插入物之間的+16位。在無dCTP的條件下，DNA合成將在dGTP處終止，并將無堿基殘基放置在納米孔+8-+12位之間，這會使產(chǎn)生離子電流在25pA–31pA之間的分叉(JACS)。(b)在無dCTP的條件下，(a)中的DNA構(gòu)建體正向/反向步進(jìn)通過納米孔。在第一個35pA被穿過后，離子電流停止在第二個峰，并在25pA-31pA之間分叉。(b)在存在dCTP的條件下，(a)中的DNA構(gòu)建體正向/反向步進(jìn)通過納米孔。在第一個35pA被穿過后，離子電流繼續(xù)通過第二個35pA峰而無停止。這些數(shù)據(jù)支持我們的主張，即第二個35pA峰依賴于酶介導(dǎo)的DNA復(fù)制。圖19.為提高納米孔上通量(throughput)而優(yōu)化的封閉寡聚體。(a)與p/tDNA底物結(jié)合的優(yōu)化封閉寡聚體(紅線)。將模板鏈的互補序列從25nt縮短到15nt，以便于封閉寡聚體倍更快地從納米孔上除去。(b)使用(a)中的優(yōu)化封閉寡聚體在體相中保護(hù)p/tDNA。在不存在或存在封閉寡聚體的條件下，將p/tDNA底物phi29DNAP、dNTPs、和Mg2+(如標(biāo)明的)一起溫育。在沒有封閉寡聚體時，Phi29DNAP消化(-dNTPs,泳道3)并延長(+dNTPs,泳道4)引物。在存在封閉寡聚體時，引物鏈被保護(hù)免于消化(-dNTPs,泳道6)和延長(+dNTPs,泳道7)。反應(yīng)在23°C納米孔緩沖液中運行5小時。序列表說明SEQIDNO:1顯示了編碼α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN;Stoddartetal.,PNAS,2009;106(19):7702-7707)的一個亞基的多核苷酸序列。SEQIDNO:2顯示了α-HL-NN的一個亞基的氨基酸序列。SEQIDNO:3顯示了經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼Phi29DNA聚合酶的多核苷酸序列。SEQIDNO:4顯示了Phi29DNA聚合酶的氨基酸序列。SEQIDNOs.:5-28是實施例中使用的合成多核苷酸序列（模板、寡聚體和封閉寡聚體）。發(fā)明詳細(xì)說明本文中公開的實施方案是例證和解釋性的，不意味著對本發(fā)明有限制。在不背離本發(fā)明權(quán)利要求范圍的情況下，可以利用其它的實施方案和結(jié)構(gòu)改變。本文通過提述并入這里引用的所有公開出版物、專利和專利申請(無論是在上文還是在下文中)的全部內(nèi)容。如這里和附加權(quán)利要求中所使用的，除非明確指出，否則單數(shù)形式“一個/種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如，“納米孔”包括多個這樣的納米孔，“信號”表示或一個多個信號或其等價物，等等?！岸嗪塑账帷笔侵窪NA或RNA，包括任何天然出現(xiàn)的、合成的或經(jīng)過修飾的核苷酸。核苷酸包括，但不限于，ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、dUTP、5-甲基-CTP、5-甲基-dCTP、ITP、dITP、2-氨基-腺嘌呤-TP、2-氨基-脫氧腺嘌呤-TP、2-硫代胸腺嘧啶三磷酸、吡咯并嘧啶三磷酸、2-硫代胞苷、以及上述全部的α-硫代三磷酸化物、和上述全部堿基的2'-O-甲基-核糖核苷三磷酸化物。修飾的堿基包括，但不限于，5-Br-UTP,5-Br-dUTP,5-F-UTP,5-F-dUTP,5-丙炔基dCTP,和5-丙炔基-dUTP?！稗D(zhuǎn)運性質(zhì)”的意思是在多聚體相對于納米孔移動期間可以測量的性質(zhì)。轉(zhuǎn)運性質(zhì)可以是，例如，溶劑、聚合物、聚合物上的標(biāo)簽、其它溶質(zhì)（例如離子）的功能、或者納米孔與溶劑或聚合物之間的相互作用?！鞍l(fā)夾結(jié)構(gòu)”的定義是如下的寡核苷酸，其具有長度為大約6-大約10,000個核苷酸的核苷酸序列，該核苷酸序列的第一部分與其第二部分至少部分地互補，藉此造成自身多核苷酸折疊，形成二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)?！巴恍浴被颉跋嗨贫取笔侵竷蓷l多核苷酸序列之間或兩條多肽序列之間的序列相似度，同一性是更嚴(yán)格的比較。詞語“百分比同一性”和“%同一性”是指，在比較兩條或多條多核苷酸序列或兩條或多條多肽序列時發(fā)現(xiàn)的序列相似度的百分比?！靶蛄邢嗨贫取笔侵竷蓷l或多條多核苷酸序列之間堿基對序列的百分比相似度（通過任何合適的方法確定）。兩條或多條序列可以為0-100%相似，或者它們之間的任意整數(shù)值。同一性或相似度可以通過比較每條序列內(nèi)的某個位置加以確定，該位置可以出于比較目的而進(jìn)行比對。當(dāng)被比較序列的某個位置被相同的核苷酸堿基或氨基酸占據(jù)時，則各分子在該位置是相同的。多核苷酸序列之間的相似度或同一性的程度是各多核苷酸序列共有的位置上的相同或匹配核苷酸的數(shù)目的函數(shù)。多肽序列的同一性的程度是各多肽序列共有的位置上的相同氨基酸的數(shù)目的函數(shù)。多肽序列的同源性或相似度的程度是各多肽序列共有的位置上的氨基酸的數(shù)目的函數(shù)。術(shù)語“不相容”是指分子的化學(xué)性質(zhì)使得兩個分子或其部分不能彼此物理地和/或化學(xué)地相互作用。例如，包含核苷酸的聚合物的一部分可能與包含核苷酸及另一種化學(xué)模塊(例如肽核酸、2'-O-甲基、熒光化合物、衍生化核苷酸、核苷酸異構(gòu)體等)的聚合物的一部分不相容。在另一個實例中，包含氨基酸殘基的聚合物的一部分可能與包含氨基酸殘基及另一種化學(xué)模塊(例如硫酸基、磷酸基、乙?；⑶杌?、哌啶基、熒光基團(tuán)、唾液酸基團(tuán)、甘露糖基團(tuán)等)的聚合物的一部分不相容?！氨葘?對準(zhǔn)”是指多個DNA或氨基酸序列通過沿長度方向比較而對準(zhǔn)，從而使共同的組分（例如核堿基或氨基酸殘基）可以通過目測容易地鑒定出來。共同組分的分?jǐn)?shù)或百分比與序列間同源性或同一性有關(guān)。比對可用于鑒定保守的結(jié)構(gòu)域和這些結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相關(guān)性。比對可以通過本領(lǐng)域已知的計算機程序合適地加以確定，例如MACVECTOR軟件(1999)(Accelrys,Inc.,SanDiego,CA)。術(shù)語“高度嚴(yán)格”或者“高度嚴(yán)格條件”是指允許序列高度互補的DNA鏈相互雜交的條件，其中相同的這些條件排除顯著不匹配的DNA雜交。能夠在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明多核苷酸雜交的多核苷酸序列可以是，例如，所公開多核苷酸序列的變體，包括等位基因或剪接變體，或者編碼本公開多肽直系同源物或旁系同源物的序列。多核苷酸雜交方法在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)的公開：Kashima等(1985)Nature313:402-404,和Sambrook等(1989)分子克隆:實驗室手冊,第二版,冷泉港實驗室,冷泉港,紐約("Sambrook");和Haymes等"NucleicAcidHybridization:APracticalApproach",IRL出版社,華盛頓特區(qū)(1985)，本文引用其內(nèi)容作為參考。一般地，嚴(yán)緊度由雜交和清洗程序中使用的溫育溫度、溶液的離子強度、和變性劑（例如甲酰胺）的濃度決定（建立和確定嚴(yán)緊度的更詳細(xì)的描述，見下文）。兩條核酸在各種嚴(yán)緊度條件下雜交的程度與它們的相似性程度相關(guān)。因此，來自各種來源的相似多核苷酸序列，例如處于某一生物體的基因組內(nèi)（如直系同源物的情況）和來自另一生物體并可能實施相似功能的序列（如旁系同源物的情況），可以根據(jù)其與未知肽編碼序列雜交的能力加以分離。用于進(jìn)行多核苷酸雜交以分離與本領(lǐng)域已知序列具有相似性的序列的條件和方法可以有大量的變化形式，并不僅限于本文明確公開的示例。這樣的方法可用于分離與所公開序列具有各種程度的相似性的多核苷酸序列，例如與公開的序列具有60%同一性的序列，或者更優(yōu)選地，具有大于大約70%同一性的序列，最優(yōu)選地，與所公開序列具有72%或更大同一性的序列，其中所得的序列具有生物活性。發(fā)明方法本發(fā)明提供了測序靶多核苷酸的方法。該方法包括使靶多核苷酸與孔和Phi29DNA聚合酶接觸，從而使聚合酶控制靶多核苷酸通過孔的移動，并使靶多核苷酸的一部分與孔相互作用。測量每次相互作用期間通過孔的電流，這確定靶多核苷酸的序列。步驟(a)和(b)在所施加的跨越所述孔的電壓下實施。這樣，使用鏈測序(strandsequencing)對靶多核苷酸測序。如上面所討論的，Phi29DNA聚合酶發(fā)揮類似分子剎車的作用，控制多核苷酸沿著所施加電壓產(chǎn)生的場移動通過孔。該方法具有多種優(yōu)點。例如，靶多核苷酸以商業(yè)上可行并且能夠高效測序的速度移動通過孔。該方法還可以按照根據(jù)Phi29DNA聚合酶的三種模式產(chǎn)生的三種優(yōu)選途徑的其中之一加以實施。這在下文有更詳細(xì)的討論。每種途徑均包括校讀(proofreading)序列的方法。本發(fā)明的方法用于多核苷酸測序。多核苷酸，例如核酸，是包含兩個或多個核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可包含任何核苷酸的任何組合。多核苷酸或核酸可以是天然存在型或者是人工的。核苷酸可以被氧化或甲基化。核苷酸典型地含有核堿基、糖和至少一個磷酸基團(tuán)。核堿基典型地是雜環(huán)的。核堿基包括，但不限于，嘌呤和嘧啶，更具體地，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。糖典型地是五糖。核苷酸糖包括，但不限于，核糖和脫氧核糖。核苷酸典型地是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。核苷酸典型地含有單磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸可以附著在核苷酸的5’或3’側(cè)。核苷酸包括，但不限于，腺苷單磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、鳥苷單磷酸(GMP)、鳥苷二磷酸(GDP)、鳥苷三磷酸(GTP)、胸苷單磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、尿苷單磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷單磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、環(huán)腺苷單磷酸(cAMP)、環(huán)鳥苷單磷酸(cGMP)、脫氧腺苷單磷酸(dAMP)、脫氧腺苷二磷酸(dADP)、脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧鳥苷單磷酸(dGMP)、脫氧鳥苷二磷酸(dGDP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧胸苷單磷酸(dTMP)、脫氧胸苷二磷酸(dTDP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)、脫氧尿苷單磷酸(dUMP)、脫氧尿苷二磷酸(dUDP)、脫氧尿苷三磷酸(dUTP)、脫氧胞苷單磷酸(dCMP)、脫氧胞苷二磷酸(dCDP)和脫氧胞苷三磷酸(dCTP)。核苷酸優(yōu)選地選自下組：AMP,TMP,GMP,CMP,UMP,dAMP,dTMP,dGMP或dCMP。核苷酸可以含有糖和至少一個磷酸基團(tuán)（即缺少核堿基）。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。多核苷酸的至少一部分優(yōu)選是雙鏈的。多核苷酸可以是核酸，例如脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）。靶多核苷酸可以包括雜交在一起的一條DNA和一條RNA。多核苷酸可以是本領(lǐng)域已知的任何合成核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)、鎖核酸(LNA)、或其它具有核苷酸側(cè)鏈的合成聚合物?？梢杂帽痉椒▽Π泻怂嵝蛄械娜炕騼H一部分測序。靶多核苷酸可以是任何長度。例如多核苷酸的長度可以是至少10個、至少50個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少400個或至少500個核苷酸對。多核苷酸的長度可以是1000或更多個核苷酸對，5000或更多個核苷酸對，或者10000或更多個核苷酸對。靶多核苷酸存在于任何合適的樣品中。本發(fā)明典型地在已知含有或懷疑含有靶多核苷酸的樣品上實施?？蛇x擇地，可以在樣品上實施本發(fā)明以確認(rèn)已知存在或預(yù)期存在于該樣品中的一個或多個靶多核苷酸的身份。樣品可以是生物樣品。本發(fā)明可以在體外對從任何生物體或微生物獲得的或分離的樣品實施。生物體或微生物典型地是原核或真核的，并且典型地屬于下列五界之一：植物界、動物界、菌物界、原核生物界和原生生物界。本發(fā)明可以在體外對從任何病毒獲得的或者分離的樣品實施。樣品優(yōu)選地是液體樣品。樣品典型地包括患者的體液。樣品可以是尿液、淋巴、唾液、粘液或羊水，但優(yōu)選地是血液、血漿或血清。典型地，樣品是人類來源的，但另外也可以來自其它哺乳動物，例如來自商業(yè)豢養(yǎng)動物如馬、牛、羊或豬，或者另外也可以來自寵物，如貓和狗?；蛘撸参飦碓吹臉悠房梢缘湫偷貜娜缦芦@得：商業(yè)作物，如谷物、豆科植物、水果或蔬菜，例如小麥、大麥、燕麥、蕓苔、玉米、大豆、水稻、香蕉、蘋果、番茄、土豆、葡萄、煙草、豆類、小扁豆、甜菜、可可、棉花。樣品可以是非生物樣品。非生物樣品優(yōu)選地是液體樣品。非生物樣品的實例包括手術(shù)液(surgicalfluid)，水如飲用水、海水或河水，和實驗室檢測用試劑。樣品典型地在被測定之前經(jīng)過處理，例如通過離心或流過膜以過濾掉不想要的分子或細(xì)胞，例如紅細(xì)胞。樣品可以在取樣后立即進(jìn)行測量。樣品也可以典型地在測試之前保存，優(yōu)選地在低于-70°C下保存?？缒た资且环N如下的結(jié)構(gòu)，其允許水合離子在施加電勢的驅(qū)動下從膜的一側(cè)流到膜的另一側(cè)。任何膜均可根據(jù)本發(fā)明使用。合適的膜是本領(lǐng)域眾所周知的。膜優(yōu)選地是兩親性層。兩親性層是由兩親性分子例如磷脂形成的層，兩親性分子同時具有親水和親脂性質(zhì)。膜優(yōu)選地是脂雙層。脂雙層是細(xì)胞膜的模型，是多種多樣的實驗研究的優(yōu)良平臺。例如，脂雙層可以用于通過單通道記錄對膜蛋白進(jìn)行體外研究。可選擇地，脂雙層可以用作生物傳感器，探測多種物質(zhì)的存在。脂雙層可以是任何脂雙層。合適的脂雙層包括，但不限于，平面脂雙層、支撐雙層(supportedbilayer)或脂質(zhì)體。脂雙層優(yōu)選地是平面脂雙層。在下列文獻(xiàn)中公開了合適的脂雙層：國際專利申請No.PCT/GB08/000563(公開為WO2008/102121)、國際專利申請No.PCT/GB08/004127(公開為WO2009/077734)和國際專利申請No.PCT/GB2006/001057(公開為WO2006/100484)。用于形成脂雙層的方法是本領(lǐng)域已知的。合適的方法在實施例中有公開。脂雙層通常通過Montal和Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1972;69:3561-3566)的方法形成，其中脂單層被攜載在水溶液/空氣界面上，并通過與該界面垂直的孔的某一側(cè)。Montal和Mueller的方法之所以流行是因為，它是形成適合于蛋白孔插入的高品質(zhì)的脂雙層的一種成本高效并且相對直觀的方法。其它常用的形成雙層的方法包括頭部浸漬(tip-dipping)、涂布雙層(paintingbilayer)和膜片鉗(patch-clamping)脂質(zhì)體雙層。在一個優(yōu)選實施方案中，按照國際專利申請No.PCT/GB08/004127(公開為WO2009/077734)所述形成脂雙層。該方法中優(yōu)選的是，從干燥脂質(zhì)形成脂雙層。在一個最為優(yōu)選的實施方案中，按照WO2009/077734(PCT/GB08/004127)所述形成跨越開孔的脂雙層。在另一個優(yōu)選實施方案中，膜是固態(tài)層。固態(tài)層不是生物來源的。換言之，固態(tài)層不是來自于或者分離自生物環(huán)境，例如生物體或細(xì)胞，或者生物可得結(jié)構(gòu)的合成制造版本。固態(tài)層可以用有機或無機材料形成，包括但不限于，微電子材料、隔熱材料如Si3N4,A1203,和SiO，有機和無機聚合物如聚酰胺、塑料如特氟綸或彈性體如二組分加成硫化型硅橡膠（two-componentaddition-curesiliconerubber）和玻璃。固態(tài)層可以用石墨烯形成。合適的石墨烯層在國際專利申請No.PCT/US2008/010637(公開為WO2009/035647)中有公開。固態(tài)層可以用硅、氮化硅或石墨烯形成。固態(tài)層可以進(jìn)一步包括固態(tài)孔或多個這樣的孔。固態(tài)層或孔可以進(jìn)一步包括通過共價鍵連接的接頭基團(tuán)化合物。DNA聚合酶可以用合適的接頭基團(tuán)附著到固態(tài)層或固態(tài)孔上。方法的實施典型地使用(i)包含孔的人工雙層，(ii)包含孔的分離的天然存在型脂雙層，或(iii)其中插入有孔的細(xì)胞。方法優(yōu)選地用人工脂雙層實施。除了孔之外，雙層可以包括其它跨膜和/或膜內(nèi)蛋白質(zhì)以及其它分子。下文參考本發(fā)明的測序?qū)嵤┓桨赣懻摿撕线m的裝置和條件。本發(fā)明的方法通常在體外實施。跨膜孔優(yōu)選的是跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是一種多肽或多肽的集合，其允許水合離子，如分析物，從膜的一側(cè)流到膜的另一側(cè)。在本發(fā)明中，跨膜蛋白孔能夠形成在施加的電勢的驅(qū)動下允許水合離子從膜的一側(cè)流向另一側(cè)?？缒さ鞍卓變?yōu)選地允許分析物，例如核苷酸，從膜，例如脂雙層，的一側(cè)流向另一側(cè)。跨膜蛋白孔允許多核苷酸，例如DNA或RNA，移動通過孔?？缒さ鞍卓卓梢允菃误w或寡聚體。孔優(yōu)選地由數(shù)個重復(fù)亞單位，例如6、7或8個亞單位構(gòu)成。孔更優(yōu)選地是七聚體或八聚體孔?？缒さ鞍卓椎湫偷匕x子可以流過的桶或通道。孔的亞單位典型地圍繞中心軸，并為跨膜桶或通道或跨膜α-螺旋束或通道的貢獻(xiàn)鏈(strand)?？缒さ鞍卓椎耐盎蛲ǖ赖湫偷匕ǚ奖闩c分析物，如核苷酸、多核苷酸或核酸，相互作用的氨基酸。這些氨基酸優(yōu)選地位于桶或通道的縊痕(constriction)位置附近。跨膜蛋白孔典型地包括一個或多個帶正電的氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸或組氨酸，或芳香族氨基酸，例如酪氨酸或色氨酸。這些氨基酸典型地有利于孔與核苷酸、多核苷酸或核酸之間的相互作用。根據(jù)本發(fā)明使用的跨膜蛋白孔可以來自β-桶孔或α-螺旋束孔。β-桶孔包括由β-鏈形成的桶或通道。合適的β-桶孔包括，但不限于，β-毒素，例如α-溶血素、炭疽毒素和殺白細(xì)胞素(leukocidins)，和細(xì)菌的外膜蛋白/孔蛋白，例如恥垢分支桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)如MspA，外膜孔蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌屬自主轉(zhuǎn)運體脂蛋白(autotransporterlipoprotein)(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶或通道。合適的α-螺旋束孔包括，但不限于，內(nèi)膜蛋白和α外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素?？缒た卓梢詠碜訫sp或α-溶血素(α-HL)。Phi29DNA聚合酶為了克服上面公開的限制（T7DNAP(外切-)-DNA復(fù)合體在負(fù)載下(underload)穩(wěn)定性低、在80mV電壓下信噪比減小、以及聚合酶的周轉(zhuǎn)率(turnoverrate)高），我們檢查了其它的DNA修飾酶，當(dāng)它們被定位在納米孔洞口處時，它們的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)可能有利于持續(xù)性催化。一個引人注意的候選者是細(xì)菌噬菌體phi29DNA聚合酶(phi29DNAP)(Blanco,L.;Salas,M.J.Biol.Chem.1996,271,8509-8512;(19)Salas,M.;Blanco,L.;Lázaro,J.M.;deVega,M.IUBMB.Life2008,60,82-85)。這種來自B族DNA聚合酶的DNA依賴的DNA復(fù)制酶在單獨一條～66.5kDa蛋白鏈內(nèi)同時包含5′-3′聚合酶和3′-5′核酸外切酶功能。在保證細(xì)菌噬菌體phi29線性染色體末端完整性的初始蛋白引發(fā)階段(protein-primedstage)之后，phi29DNAP過渡到DNA引發(fā)階段，并復(fù)制整個19.2千堿基細(xì)菌噬菌體基因組，而無需輔助蛋白如滑動鉗(slidingclamp)或解旋酶(Salas,M.Annu.Rev.Biochem.1991,60,39-71)。在與DNA引發(fā)底物的一次結(jié)合事件后，這種高持續(xù)性聚合酶能夠在體外催化至少70千堿基的DNA的復(fù)制(Blanco,L.;Bernad,A.;Lázaro,J.M.;Martín,G.;Garmendia,C.;Salas,M.J.Biol.Chem.1989,264,8935-940)。phi29DNAP的晶體結(jié)構(gòu)顯示了這種顯著持續(xù)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。phi29DNAP的聚合酶結(jié)構(gòu)域享有保守的掌狀(palm)、指狀(finger)和拇指狀(thumb)亞結(jié)構(gòu)域的構(gòu)造，近似一只部分打開的右手。此外，一個蛋白引發(fā)DNA聚合酶特有的32氨基酸β-發(fā)夾插入物與掌狀和拇指狀亞結(jié)構(gòu)域一起包圍引物-模板DNA，提示這種結(jié)構(gòu)可以按照與滑動鉗蛋白所實現(xiàn)的相似的方式提高持續(xù)性(Johnson,A.;O'Donnell,M.Annu.Rev.Biochem.2005,74,283-315)。相同的β-發(fā)夾還形成圍繞下游模板DNA的通道的一部分。這些特征表明，β-發(fā)夾插入物可同時促進(jìn)強DNA結(jié)合和phi29DNAP的持續(xù)性。與這個預(yù)測一致的是，缺失β-發(fā)夾產(chǎn)生的突變體phi29DNAP顯示分散的DNA合成活性，而不是野生型酶的持續(xù)合成活性，并且對引物-模板二聚體DNA的結(jié)合親和力顯著降低(Rodríguez,I.;Lázaro,J.M.;Blanco,L.;Kamtekar,S.;Berman,A.J.;Wang,J.;Steitz,T.A.;Salas,M.;deVega,M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,6407-6412)。使用光鑷的實驗顯示，phi29DNAP能夠逆著所施加的最高達(dá)～37pN的負(fù)載沿著模板前行數(shù)百個核苷酸，提示這種酶能夠復(fù)制被滯留在納米孔上的DNA。這里，我們顯示，當(dāng)被捕獲在跨α-HL納米孔的電場內(nèi)時，phi29DNAP-DNA復(fù)合體的穩(wěn)定性比KF(外切-)-DNA復(fù)合體大3-4個數(shù)量級。通過利用野生型phi29DNAP的3′-5′核酸外切酶活性切割3′-H末端殘基，產(chǎn)生引物鏈3′-OH，激活被捕獲復(fù)合體中的DNA底物以供復(fù)制。在脫氧核苷三磷酸(dNTPs)的存在下，DNA合成被啟動，使得實時檢測大量核苷酸順次添加成為可能，而僅受到DNA模板長度的限制。我們觀察了在電場中納米孔上的持續(xù)性DNA合成：phi29DNAP-DNA復(fù)合體在施加的180mV電勢下保持與納米孔洞締合，并容易地催化核苷酸順次添加。這與T7DNAP(外切-)形成鮮明對比，后者甚至在較低的電壓下也難以保持在孔的頂上以進(jìn)行順次添加（見Olasagasti等，2010，上文）。phi29DNAP與DNA持久結(jié)合的一個突出之處在于本聚合酶和KF(外切-)在不允許DNA被phi29DNAP核酸外切降解的條件下與納米孔頂上的DNA解離的不同途徑。盡管在180mV下可以在數(shù)毫秒內(nèi)將KF與DNA之間的結(jié)合拉開(圖1c)，同時保持發(fā)夾雙鏈體堿基配對完整，但是使phi29DNAP的緊密結(jié)合解離則需要平均～20秒，并且牽拉懸垂模板鏈通過孔的力量必須在雙鏈體與酶保持締合的同時促使堿基對解鏈（圖1d和2b,c）。然后，被解開的鏈離開酶；鏈可以移動到酶以外的位置，移動到不與酶締合的位置，和/或移動通過開孔或者離開酶的通路區(qū)域，如圖所示。被解開的鏈也可以不穿插(threaded)通過酶或者進(jìn)入酶的折疊中，并且甚至可以不和酶有物理或化學(xué)的接觸。被解開的鏈可以在酶的上方或周圍穿插。我們在本研究中運用了phi29DNAP3′-5′核酸外切酶的三個特征。首先，我們發(fā)現(xiàn)，末端為3′-H的DNA底物在體相中的降解速度比末端為3′-OH的底物更慢（圖2a）。據(jù)我們所知，這是第一次證明phi29DNAP的3′-5′核酸外切酶活性對末端為3′-H的DNA底物有偏惡。這個特征在體相中為DNA底物分子提供了保護(hù)，使其同時免于降解和ddNMP切除依賴性引發(fā)的引物延長。這種保護(hù)還在向納米孔室添加Mg2+后提供了一個窗口，在此窗口內(nèi)我們能夠系列地捕獲大量phi29DNAP-DNA復(fù)合體，這些復(fù)合體中引物末端是完整的。第二，當(dāng)復(fù)合體在電場中被保持在孔頂時，我們使用phi29DNAP核酸外切酶活性切離復(fù)合物中DNA底物的ddNMP末端。dNTPs的存在有利于聚合反應(yīng)遠(yuǎn)勝過持續(xù)降解。因此，切離ddCMP殘基產(chǎn)生引物鏈3′-OH，允許隨后引發(fā)從限定的DNA模板位置開始合成。通過孔頂?shù)碾妶鲵?qū)動力可以加速復(fù)合體中ddNMP末端的切離，因為我們觀察到，當(dāng)電壓增高時，從復(fù)合體捕獲到合成開始的時間減少（未顯示）。但是，這種電壓促進(jìn)的切除與光鑷實驗中在高模板張力條件下誘發(fā)的持續(xù)性核酸外切不同，后者中持續(xù)性的核酸外切甚至在dNTPs存在下也占主導(dǎo)地位。相比之下，盡管引發(fā)合成需要切離ddCMP殘基，但是在納米孔實驗中，聚合反應(yīng)占主導(dǎo)地位（圖4、5、6和7），甚至在220mV的施加電勢下也是如此（圖6）。由于ddNMP引物末端的核酸外切去除緩慢，在體相中維持一個可觀的完整未延長DNA底物的池，這使得我們能夠在相對簡單的條件下對納米孔中的phi29DNA催化的合成進(jìn)行檢查。然而，由于存在隨著時間推移體相中DNA分子狀態(tài)的緩慢變化和潛在的dNTP底物耗竭的擔(dān)憂，這種策略對可以進(jìn)行實驗的時間框架造成了限制。在體相中使用更強力的保護(hù)DNA底物的手段，例如封閉新近被KF(外切-)和T7DNAP(外切-)使用的寡聚體，可以拓展這種酶在利用納米孔進(jìn)行DNA測序和聚合酶機制研究中的用處。第三，我們利用核酸外切酶結(jié)構(gòu)域通過切除引發(fā)鏈3’端的核苷酸，系統(tǒng)地移動DNA鏈通過納米孔（圖2c）。這種生化反應(yīng)的安排和設(shè)置特別適用于多核苷酸測序領(lǐng)域，因為單個核苷酸的序列讀取可以重復(fù)進(jìn)行以確認(rèn)堿基讀出(base-call)，并能夠在可以產(chǎn)生有用數(shù)據(jù)的時間框內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。本研究的結(jié)果證明，phi29DNAP的性質(zhì)理想地適合于以和可靠堿基檢測和鑒定相容的速度移動長鏈DNA通過納米級孔。在本研究中，我們僅使用化學(xué)合成的DNA模板，而能夠觀察到的由單個酶分子催化添加的序列核苷酸的數(shù)目僅受到DNA模板長度的限制。電流軌跡內(nèi)的特征，例如能夠預(yù)測三元復(fù)合體振幅的二元復(fù)合體內(nèi)離子電流閃爍（圖3），和在復(fù)制反應(yīng)發(fā)生前，當(dāng)復(fù)合體捕獲時兩個振幅之間的振蕩（圖4、5和7），提示生物化學(xué)過程，例如指開放-關(guān)閉躍遷和dNTP結(jié)合，可能具有可區(qū)分的標(biāo)記(signature)。在限定底物條件下觀察復(fù)合體中的動態(tài)變化和以高帶寬實時解析單個催化周期（圖4、5、6和7）的能力，為將生物化學(xué)變化定量作為所施加電壓和dNTP濃度的函數(shù)提供了機會。這里，我們描述了使用這里所述的封閉寡聚體策略的修正方法，對以單列次序排列的高達(dá)500個DNA模板進(jìn)行了納米孔分析。這些優(yōu)化的封閉寡聚體促使phi29DNAP預(yù)負(fù)載到靶DNA上，同時保護(hù)DNA底物在體相中不被復(fù)制和核酸外切達(dá)至少5個小時。這些DNA分子只有在被捕獲到納米孔上時才會被激活以供復(fù)制。我們已經(jīng)使用過封閉寡聚體調(diào)節(jié)ssDNA在phi29DNAP催化下通過納米孔的運動。改進(jìn)點有：1）在體相中提高對p/tDNA復(fù)制和消化的保護(hù)，2）在納米孔上加快p/tDNA的激活以供復(fù)制；和3）DNA向前和向后步進(jìn)通過納米孔?？傊?，這些改進(jìn)將納米孔在測序應(yīng)用中的通量提高到在單個納米孔上每小時可分析～130個DNA分子，并將可允許的納米孔實驗時間提高到至少5小時。此外，每個分子通過向前和向后步進(jìn)通過納米孔而被分析兩次。將這種鏈控制方法與能夠解析單個核苷酸的納米孔偶聯(lián)，有可能在納米孔中對同一DNA鏈進(jìn)行測序和重測序。提供了單通道薄膜裝置及其使用方法。主題裝置包括由電氣通信手段連接的順室和反室。在電氣通信手段的順室端有水平圓錐形孔，孔被薄膜密封，薄膜包含單一納米孔或通道。該裝置進(jìn)一步包括用于施加在順室和反室之間的電場的裝置。目標(biāo)裝置可用于其中監(jiān)視通過納米孔或通道的離子電流的用途，這些應(yīng)用包括對天然存在的離子通道的表征，聚合化合物的表征，等。特別地，本發(fā)明提供了一種新型系統(tǒng)，其包括位于順室和反室之間的納米孔和從中溫菌、嗜鹽菌或極端嗜鹽菌微生物中分離的DNA聚合酶。在一個優(yōu)選實施方案中，從中溫菌原核生物分離的DNA聚合酶是phi29DNAP蛋白。在另一個優(yōu)選實施方案中，該DNA聚合酶包括5′–3′聚合酶和3′–5′核酸外切酶。在更優(yōu)選的實施方案中，嗜鹽菌微生物是極端嗜鹽菌微生物。或者，DNA聚合酶從能夠感染中溫菌、嗜鹽菌或極端嗜鹽菌微生物的病毒中分離出來。DNA聚合酶可以在低鹽濃度下有活性，例如小于0.5M鹽，或者在高鹽濃度下有活性，例如至少大約0.5M、至少大約0.6M、至少大約1M、至少大約1.5M、至少大約2M、至少大約2.5M、至少大約3M、至少大約3.5M、至少大約4M、至少大約4.5M、至少大約5M、至少大約5.5M，和飽和。本發(fā)明還提供了一種DNA聚合酶，其也可在相似條件下保持活性的時間顯著長于Klenow(外切-)片段。在一個實例中，本發(fā)明的DNA聚合酶可以保持活性達(dá)40秒，而使用Klenow(外切-)片段為數(shù)毫秒。這種～10,000倍的活性提高明顯是出人意料的優(yōu)異結(jié)果，是現(xiàn)有技術(shù)以任意組合(包括T7DNA聚合酶，其已知在與硫氧還蛋白結(jié)合后在體相中具有高度的持續(xù)性，但是當(dāng)它被捕獲在納米孔上時會迅速解離(Olasagasti,F.;Lieberman,K.R.;Benner,S.;Cherf,G.M.;Dahl,J.M.;Deamer,D.W.;Akeson,M.,Nat.Nanotechnol.2010,提前在線出版,doi:10.1038/nnano.2010.177))均不能預(yù)期到的。本發(fā)明提供了一種DNA聚合酶，其可以保持活性達(dá)40秒、60秒、120秒、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、1.5小時、2小時、4小時、8小時、12小時、16小時、20小時、24小時、數(shù)天、或數(shù)周，包括超過1個月，或者甚至無限期。本發(fā)明的額外的優(yōu)點是，在一些情況或環(huán)境下，不必提供等待反應(yīng)發(fā)生的步驟。在一個實施方案中，DNA聚合酶活性導(dǎo)致終端級聯(lián)（terminalcascade）,即一系列離散的離子電流階躍。本發(fā)明的使用實例(1)納米孔裝置可用于監(jiān)視酶，例如核酸外切酶和聚合酶，的周轉(zhuǎn)，其在DNA測序中具有重要用途。(2)納米孔裝置可以發(fā)揮生物傳感器功能，監(jiān)視可溶性物質(zhì)(例如酶底物和信號分子)之間的相互作用。實例包括血液成分，例如葡萄糖，尿酸和尿素，激素例如類固醇和細(xì)胞因子，和通過與受體分子結(jié)合發(fā)揮功能的藥劑。(3)納米孔裝置能夠?qū)崟r監(jiān)視重要生物結(jié)構(gòu)例如核糖體的功能，并用單一功能單元實施此操作。(4)有各種科學(xué)和工業(yè)應(yīng)用中使用在高鹽濃度下可以高效發(fā)揮功能的DNA聚合酶是有利的。在測序中，GC壓縮(GCcompression)可以通過使用高鹽濃度加以解決。在納米孔測序中，高鹽濃度會提高基于離子電流的納米孔測量的信噪比。鹽耐受的DNA聚合酶可以在各種極端嗜鹽菌成員中找到，這些極端嗜鹽菌中耐鹽性不是通過從胞漿排出單價離子實現(xiàn)，而是通過使細(xì)胞內(nèi)機構(gòu)功能適應(yīng)高鹽而實現(xiàn)的。作為極端嗜鹽菌成員耐鹽的實例，來自古菌嗜鹽盒菌的蘋果酸脫氫酶采用一種鹽適應(yīng)策略，其中環(huán)境中的高離子濃度不僅被耐受，而且被整合到蛋白質(zhì)中。鈉（或鉀）和氯離子被發(fā)現(xiàn)整合在分子自身之中。當(dāng)考慮感染極端嗜鹽菌的病毒時，不僅病毒衣殼的蛋白直接暴露于環(huán)境，而且其復(fù)制機構(gòu)的蛋白，也必須在其古細(xì)菌宿主的高鹽環(huán)境下有效工作。在高鹽濃度有利的各種應(yīng)用中，這些DNA聚合酶的高鹽耐受力非常有用。例如，該聚合酶可用于測序，其中它們可以為高GC壓縮提供更好的分辨率。此外，聚合酶可用于納米孔測序，其中高鹽濃度可提高基于離子電流的納米孔測量的信噪比。其他實施方案(A)我們還發(fā)現(xiàn)，具有3′–5′核酸外切酶的DNA聚合酶能夠從3′–>5′端消化DNA。我們發(fā)現(xiàn)，共價鍵合C3(CPG)間隔物，后隨3′端的無堿基殘基，可以阻止DNA的核酸外切消化。(B)Phi29DNAP結(jié)合的dsDNA在納米孔中被施加的電壓(180mV)解鏈。電壓降低允許DNA重新合鏈(re-zipping)?；謴?fù)電壓再次使DNA解鏈，這使DNA往復(fù)移動通過納米孔。(C)我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)封閉寡聚體結(jié)合在DNAp/t連接點處時，該寡聚體在被捕獲在納米孔上時會被剝離，隨后DNA被活化以步進(jìn)通過納米孔。使用更短的封閉寡聚體可以減少將封閉寡聚體從DNA剝離所需的時間。這允許我們更快地激活DNA分子在納米孔上復(fù)制，并提高納米孔在測序應(yīng)用中的通量。(D)電流軌跡中的噪音能夠幫助鑒定聚合物鏈上的鄰近單體。圖9顯示，當(dāng)聚合物穿過納米孔時，聚合物中的一個或多個單體決定傳感器讀出的平均離子電流。此外，聚合物在孔中運動會在平均電流上疊加電流波動（噪音）。該噪音部分地是由相鄰單體（或多個單體）的身份，以及與這些單體相關(guān)的離子電流決定的。這是不可能預(yù)期到的，因此是一種出人意料的優(yōu)異結(jié)果。(E)DNA通過納米孔的受控輸送：這在實施例XVI和圖14中有舉例，在那里我們顯示了，我們?nèi)绾卫胐NTP濃度對通過納米孔的DNA合成的速度的影響。這是不可能預(yù)期到的，因此是一種出人意料的優(yōu)異結(jié)果。單通道薄膜裝置的制造提供了單通道薄膜裝置及其使用方法。主題裝置包括混合信號半導(dǎo)體晶片，至少一個電化學(xué)層，其中該電化學(xué)層包括半導(dǎo)體材料，例如二氧化硅等，其中該半導(dǎo)體材料進(jìn)一步包括一種表面修飾劑，例如碳?xì)浠衔?，其中該電化學(xué)層限定多個孔洞，這些孔洞包括室和頸部，并且其中孔洞的室與混合信號半導(dǎo)體晶片的第一金屬組分共定位，其中孔洞的一部分塞入有第二種金屬，例如銀，其中該第二金屬與第一金屬電連接，并且其中孔洞進(jìn)一步包括薄膜，例如磷脂雙層，該薄膜在孔洞的頸部形成溶劑可透過的密封，該薄膜進(jìn)一步包括孔，并且其中該孔洞包圍水相和氣相。在優(yōu)選實施方案中，金屬化層包括金屬或金屬合金，例如但不限于，鎳、金、銅和鋁。根據(jù)本發(fā)明使用的孔可以是β-桶孔或α-螺旋束孔。β-桶孔包括由β-折疊片形成的桶或通道。合適的β-桶孔包括，但不限于，β-毒素，例如α-溶血素和殺白細(xì)胞素，和細(xì)菌的外膜蛋白/孔蛋白，例如恥垢分枝桿菌孔蛋白A(MspA)、MspB、MspC、MspD、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌自主轉(zhuǎn)運體脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶或通道。合適的α-螺旋束孔包括，但不限于，內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白，例如大腸桿菌Wza和ClyA毒素。其它有用的孔蛋白可以包括MspA單體的NNN-RRK突變體，包括如下的突變體：D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。用于將亞單位插入膜(例如脂雙層)中的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以以純化的形式將亞單位懸浮在含有脂雙層的溶液中，從而使它擴散到脂雙層內(nèi)，并通過與脂雙層結(jié)合而被插入和組裝成功能狀態(tài)?？蛇x擇地，可以用M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和國際專利申請No.PCT/GB2006/001057(公開為WO2006/100484)中介紹的“拾取和放置”方法(“pickandplace”method)將亞單位直接插入到膜中?？追肿踊蛲ǖ婪肿拥臐舛茸阋栽诶绱蠹s15分鐘內(nèi)在任何薄膜或雙層中形成單通道。形成這種通道的時間可以是例如半分鐘-1小時，例如大約半分鐘、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、7分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、60分鐘、或其間的任何時間。形成的時間可以由操作者通過數(shù)個因素或參數(shù)加以改變，例如提高或降低環(huán)境或溫育溫度，提高或降低第二溶液或第一溶液中鹽的濃度，在第一溶液和第二溶液之間設(shè)置電勢差吸引孔或通道分子向薄膜或雙層移動，或者其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。該有限狀態(tài)機(finitestatemachine)能夠通過對流過電路的（離子）電流起反應(yīng)檢測和/或感知其相應(yīng)雙層內(nèi)單通道的形成，該電路包括宏觀電極、第二溶液、單納米孔或通道分子、第一溶液、和用于給定陣列單元的金屬電極。生物通道的形成是隨機過程。一旦在給定陣列單元雙層內(nèi)形成了單通道，優(yōu)選地減少或者優(yōu)選地消除在其中再這樣形成第二個通道的機會。第二通道插入的概率可以用施加的跨雙層的(即電勢差)電勢加以調(diào)節(jié)。當(dāng)感知到單通道時，該有限狀態(tài)機調(diào)節(jié)金屬電極上的電勢，降低在同一雙層內(nèi)插入第二個通道的可能性。在一個備選的實施方案中，每個陣列單元可以包括圍繞孔洞的金電極。該金電極可通過還原和氧化反應(yīng)激活化學(xué)劑，并且能夠特異在特定孔洞的位置處發(fā)揮作用。納米孔系統(tǒng)可以用現(xiàn)有技術(shù)的商業(yè)可得的65nm處理技術(shù)來產(chǎn)生，例如來自臺灣半導(dǎo)體制造公司（臺灣）的技術(shù)。600x600的納米孔陣列可以1000Hz的速度實施360,000個生物化學(xué)反應(yīng)和檢測/感知步驟。這能夠例如使該半導(dǎo)體晶片的每個1cmx1cm切割片(diecut)以每秒3億6000萬個堿基的速度進(jìn)行多核苷酸測序。在順室和反室之間施加電場的示例手段是，例如，包含埋置陽極和埋置陰極的電極，它們與電壓源連接。這種電極能夠用例如氯化銀，或任何其它具有相似物理和/或化學(xué)性質(zhì)的化合物制成。檢測納米開孔的時間依賴性轉(zhuǎn)運性質(zhì)可以通過合適的技術(shù)加以測量。轉(zhuǎn)運性質(zhì)可以因用于轉(zhuǎn)運多核苷酸的介質(zhì)、液體中的溶質(zhì)（例如離子）、多核苷酸（例如單體化學(xué)結(jié)構(gòu)）、或多核苷酸上的標(biāo)簽而定。轉(zhuǎn)運性質(zhì)實例包括電流、電導(dǎo)、電阻、電容、電荷、濃度、光學(xué)性質(zhì)（例如熒光和拉曼散射）、和化學(xué)結(jié)構(gòu)。理想地，轉(zhuǎn)運性質(zhì)是電流。用于檢測順室和反室之間的電流的裝置實例已經(jīng)在下列文獻(xiàn)中有介紹：WO00/79257，美國專利Nos.6,46,594,6,6736,673,615,6,627,067,6,464,842,6,362,002,6,267,872,6,015,714,和5,795,782和美國公開Nos.2004/0121525,2003/0104428,和2003/0104428，并且可以包括，但不限于，在孔開孔處或其附近與通道或孔直接關(guān)聯(lián)的電極，被置于順室和反室內(nèi)的電極，和絕緣玻璃微電極。電極能夠，但不限于，檢測跨兩個室的離子電流差異，或跨孔開孔或通道開孔的電子隧穿電流。在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)運性質(zhì)是跨開孔直徑的電子流，其可以通過置于納米孔周緣附近或與之相鄰的電極加以監(jiān)視。這些電極能夠與Axopatch200B放大器連接，用于放大信號。這里公開的本發(fā)明的應(yīng)用和/或使用可以包括但不限于如下：1.用mRNA,rRNA,和tRNA指示的相對或絕對基因表達(dá)水平的測定。這包括天然、突變和致病核酸和多核苷酸。2.等位基因表達(dá)的測定。3.單倍型測定和染色體內(nèi)多個SNP的定相(phasing)。4.DNA甲基化狀態(tài)測定。5.mRNA可變剪接和剪接變體水平的測定。6.RNA轉(zhuǎn)運測定。7.mRNA,rRNA和DNA中蛋白-核酸復(fù)合體的測定。8.通過DNA,rRNA或mRNA測定食品和環(huán)境樣品中微生物或病毒的存在。9.通過DNA,rRNA或mRNA鑒定食品和環(huán)境樣品中微生物或病毒的含量。10.在植物、人、微生物和動物中，通過DNA,rRNA或mRNA鑒定病狀。11.醫(yī)學(xué)診斷中的核酸測定。12.定量核轉(zhuǎn)錄終止分析(nuclearrunoffassays)。13.DNA和RNA水平的基因重排測定，包括，但不限于，在免疫響應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的基因重排。14.微生物、病毒和線粒體中基因轉(zhuǎn)移測定。15.遺傳進(jìn)化分析。16.法醫(yī)檢驗。17.親子鑒定。18.系譜分析(Geneologicalassays)。與其它多核苷酸同源的多核苷酸可以通過在嚴(yán)格或在高度嚴(yán)格條件下彼此雜交加以鑒定。當(dāng)它們基于各種良好表征的物理化學(xué)力，例如氫鍵、溶劑排斥（solventexclusion）、堿基堆疊等而締合時，單鏈的多核苷酸發(fā)生雜交。雜交的嚴(yán)緊度反映了所涉及核酸的序列相同程度，因此嚴(yán)緊度越高，兩條多核苷酸鏈越相似。嚴(yán)緊度受到多種因素的影響，包括雜交溶液和洗脫溶液的溫度、鹽濃度和組成、有機和無機添加劑、溶劑等，在上文引用的參考文獻(xiàn)中有更詳細(xì)的介紹。本發(fā)明包括能夠在各種嚴(yán)緊度條件下(例如WahlandBerger(1987)MethodsEnzymol.152:399-407,andKimmel(1987)MethodsEnzymol.152:507-511)與多核苷酸或其片段雜交的多核苷酸序列。同源性的評估由多種嚴(yán)緊度條件下的DNA-DNA或DNA-RNA雜交給出，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的(HamesandHiggins,Editors(1985)NucleicAcidHybridisation:APracticalApproach,IRLPress,Oxford,U.K.)。可以調(diào)節(jié)嚴(yán)緊度條件以篩選中等相似的片段，例如來自遠(yuǎn)相關(guān)生物體的同源序列，到高度相似的片段，例如來自近親生物體的復(fù)制功能酶的基因。雜交后清洗決定嚴(yán)緊度條件。本發(fā)明的表征和使用測序在一個實施方案中，本發(fā)明可用于進(jìn)行多核苷酸的序列分析。該分析與先前和當(dāng)前技術(shù)相比具有優(yōu)勢，即單次分析可以在單個位置實施，從而顯著節(jié)省試劑、底物、報告分子等的成本。另外重要的是測序反應(yīng)和信號產(chǎn)生的迅捷性，從而比先前技術(shù)更加改進(jìn)。其它用于核酸測序的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并可以用于實踐本發(fā)明的任何實施方案。這些方法采用酶，例如DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASE、TaqDNA聚合酶和熱穩(wěn)定T7DNA聚合酶(AmershamPharmaciaBiotech,PiscatawayNJ)或這些聚合酶的組合，和校讀核酸外切酶，例如在ELONGASE擴增系統(tǒng)(LifeTechnologies,GaithersburgMD)中發(fā)現(xiàn)的。優(yōu)選地，序列制備物用機器自動化，例如HYDRA微分配器(microdispenser)(RobbinsScientific,SunnyvaleCA)、MICROLAB2200系統(tǒng)(Hamilton,RenoNV)和DNAENGINE熱循環(huán)儀(PTC200;MJResearch,WatertownMA)。用于測序的機器包括ABIPRISM3700,377或373DNA測序系統(tǒng)(PEBiosystems)、MEGABACE1000DNA測序系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)等。序列可以用本領(lǐng)域眾所周知的多種算法加以分析，它們在下列文獻(xiàn)中有介紹：Ausubeletal.(1997;ShortProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYorkN.Y.,unit7.7)和Meyers(1995;MolecularBiologyandBiotechnology,WileyVCH,NewYorkN.Y.,pp.856-853)。鳥槍法測序用于從來自多個來源的克隆插入物產(chǎn)生更多序列。鳥槍測序法是本領(lǐng)域眾所周知的，并使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、不耐熱的DNA聚合酶和從感興趣的多核苷酸分子兩側(cè)各自區(qū)域選出的引物。使用本領(lǐng)域眾所周知的各種算法和程序，例如CONSED(Gordon(1998)GenomeRes.8:195-202)，檢查不完全組裝序列的身份。污染序列包括載體或嵌合序列或缺失序列可以分別得以去除或恢復(fù)，將不完全組裝的序列組織成最終序列。多核苷酸序列的延伸本發(fā)明的序列可以用各種本領(lǐng)域已知的基于PCR的方法加以延長。例如，可以使用XL-PCR試劑盒(PEBiosystems)、巢式引物、和商業(yè)可得的cDNA或基因組DNA文庫延長多核苷酸序列。對于所有基于PCR的方法，引物可以用商業(yè)可得的軟件，例如OLIGO4.06引物分析軟件(NationalBiosciences,PlymouthMN)加以設(shè)計，長度為大約22-30個核苷酸，GC含量為大約50%或更多，靶分子在大約55°C-大約68°C的溫度下退火。當(dāng)延伸序列以恢復(fù)調(diào)節(jié)元件時，優(yōu)選地使用基因組文庫而非cDNA文庫。本發(fā)明多核苷酸的使用用于測定的分子標(biāo)記多種的標(biāo)簽和偶聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可用在各種核酸、氨基酸和抗體測定中。標(biāo)記分子的合成可以用Promega(MadisonWI)或AmershamPharmaciaBiotech試劑盒實現(xiàn)，并入標(biāo)記的核苷酸例如32P-dCTP,Cy3-dCTP或Cy5-dCTP或氨基酸例如35S-甲硫氨酸。核苷酸和氨基酸可以用各種物質(zhì)直接標(biāo)記，包括熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)色劑等，或者用試劑例如BIODIPY或FITC(MolecularProbes,EugeneOR)通過與分子中存在的氨基、巰基和其它基團(tuán)化學(xué)偶聯(lián)進(jìn)行標(biāo)記。診斷劑多核苷酸、片段、寡核苷酸、互補RNA和DNA分子和PNA可用于檢測和定量基因表達(dá)變化、mRNA的存在/不存或者過量表達(dá)，或者在治療干預(yù)期間監(jiān)視mRNA的水平。與表達(dá)變化相關(guān)的癥狀、疾病或異常包括特發(fā)性肺動脈高壓、繼發(fā)性肺高壓、細(xì)胞增生性疾病，特別是退行性寡樹突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、眼眶腦膜瘤、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤、神經(jīng)元瘤、多發(fā)性硬化、亨廷頓病、乳腺腺癌、前列腺腺癌、胃腺癌、轉(zhuǎn)移性神經(jīng)內(nèi)分泌癌、非增生性纖維囊腫和增生性纖維囊腫乳腺疾病、膽囊炎和膽石癥、骨關(guān)節(jié)炎、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、艾迪生氏病、成人呼吸窘迫綜合征、過敏、強直性脊柱炎、淀粉樣變性、貧血、哮喘、動脈粥樣硬化、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性甲狀腺炎、良性前列腺增生、支氣管炎、Chediak-Higashi綜合征、膽囊炎、克羅恩病、過敏性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺氣腫、胎兒有核紅細(xì)胞增多癥、結(jié)節(jié)性紅斑、萎縮性胃炎、腎小球腎炎、Goodpasture綜合征、痛風(fēng)、慢性肉芽腫性疾病、格雷夫斯病、橋本氏甲狀腺炎、嗜酸性粒細(xì)胞增多、腸易激綜合征、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、心肌或心包炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、胰腺炎、多囊卵巢綜合征、多發(fā)性肌炎、銀屑病、賴特爾綜合癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、硬皮病、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）、干燥綜合征、全身過敏反應(yīng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、血小板減少性紫癜、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、沃納綜合征，血液透析、體外循環(huán)、病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物、和蠕蟲感染；催乳素產(chǎn)生紊亂、不孕癥，包括輸卵管疾病、排卵缺陷及子宮內(nèi)膜異位癥，發(fā)情周期失調(diào)、月經(jīng)周期失調(diào)、多囊卵巢綜合征、卵巢過度刺激綜合征、子宮內(nèi)膜或卵巢腫瘤、子宮肌瘤、自身免疫性疾病、宮外孕和致畸作用；乳房的癌癥、乳房纖維囊性病、和溢乳；精子發(fā)生紊亂、精子生理異常、良性前列腺增生癥、前列腺炎、陰莖硬結(jié)癥、陽痿、男性乳腺發(fā)育；光化性角化病、動脈硬化、滑囊炎、肝硬化、肝炎、混合性結(jié)締組織?。∕CTD）、骨髓纖維化、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥、癌癥并發(fā)癥，癌癥包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤、畸胎瘤，以及，特別是，腎上腺、膀胱、骨、骨髓、腦、乳腺、宮頸、膽囊、神經(jīng)節(jié)、胃腸道、心、腎、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、陰莖、前列腺、唾液腺、皮膚、脾、睪丸、胸腺、甲狀腺、和子宮的癌癥。在另方面中，本發(fā)明的多核苷酸。多核苷酸、片段、寡核苷酸、互補RNA和DNA分子和PNA，或其片段，可用于檢測和定量基因表達(dá)變化、mRNA的存在/不存在或者過量表達(dá)，或者在治療干預(yù)期間監(jiān)視mRNA的水平。與表達(dá)變化相關(guān)的癥狀、疾病或異常包括靜坐不能(akathesia)、阿爾茨海默氏病、健忘、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、共濟(jì)失調(diào)、雙相情感障礙、木僵、腦癱、腦血管病、克雅氏病、癡呆癥、抑郁癥、唐氏綜合征、遲發(fā)性運動障礙、肌張力障礙、癲癇癥、亨廷頓氏病、多發(fā)性硬化癥、肌營養(yǎng)不良癥、神經(jīng)痛、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)病變、帕金森氏病、皮克氏病、視網(wǎng)膜色素變性、精神分裂癥、季節(jié)性情感障礙、老年性癡呆、中風(fēng)、抽動穢語綜合征和癌癥，包括腺癌、黑色素瘤和畸胎癌，特別是腦的癌癥。這些cDNA還可用作在數(shù)天到數(shù)月的周期范圍內(nèi)對上述疾病和其它大腦異常、癥狀和疾病的治療效力的標(biāo)志。診斷測定可以使用雜交或擴增技術(shù)比較來自患者的生物樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的基因表達(dá)，以便檢測基因表達(dá)變化。這種比較的定性和定量方法是本領(lǐng)域眾所周知的。診斷測定可以使用雜交或擴增技術(shù)比較來自患者的生物樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的基因表達(dá)，以便檢測基因表達(dá)變化。這種比較的定性和定量方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，多核苷酸或探針可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行標(biāo)記，并在有助于形成雜交復(fù)合體的條件下添加到來自患者的生物樣品中。在溫育期之后，對樣品進(jìn)行清洗，并定量與雜交復(fù)合體締合的標(biāo)記物（或信號）的量，并與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。如果患者樣品中標(biāo)志物的量與標(biāo)準(zhǔn)值相比有顯著改變，則表明存在相關(guān)的病癥、疾病或異常。為了為與基因表達(dá)相關(guān)的病癥、疾病或異常的診斷提供基礎(chǔ)，建立了正?；驑?biāo)準(zhǔn)表達(dá)譜。這可以通過在雜交或擴增條件下組合從正常對象(動物或人)獲得的生物樣品與探針來實現(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)雜交可以通過比較用正常對象獲得的數(shù)值與使用已知量的基本上純化的靶序列的實驗獲得的數(shù)值來定量。以這種方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)值可以和從具有特定病癥、疾病或異常的癥狀的患者獲得的樣品的數(shù)值進(jìn)行比較。從標(biāo)準(zhǔn)值向與特定病癥相關(guān)聯(lián)的數(shù)值的偏離用于診斷該病癥。這些測定還可以用于在動物研究和臨床試驗中評估特定治療方法的效力，或者監(jiān)視單個患者的治療。一旦確定存在某種病癥并開始某種治療方案，便可以規(guī)律地重復(fù)診斷測定，確定患者體內(nèi)的表達(dá)水平是否開始近似于正常對象體內(nèi)觀察到的水平。從連續(xù)測定中獲得的結(jié)果可用于顯示在數(shù)天到數(shù)月期間的治療效力。配體的純化多核苷酸或其片段可以用于從樣品中純化配體。使用多核苷酸或其片段純化配體的方法可能涉及在允許特異結(jié)合的條件下將多核苷酸或其片段與樣品合并，檢測特異性結(jié)合，回收結(jié)合的蛋白質(zhì)，和使用合適的試劑將多核苷酸與純化的配體分離。在另外的實施方案中，多核苷酸可以在任何尚未被開發(fā)的分子生物學(xué)技術(shù)中使用，只要該新技術(shù)依賴于目前已知的多核苷酸的性質(zhì)即可，包括，但不限于，三聯(lián)體遺傳編碼和特異堿基對互作等性質(zhì)。DNA聚合酶的組成本發(fā)明還構(gòu)想了持續(xù)性DNA聚合酶的變體。這些變體與DNA具有更強或減弱的結(jié)合親和性。這些變體還可以具有增高或降低的反應(yīng)速度。例如，在KF中，反應(yīng)性酪氨酸殘基可以被例如色氨酸取代。對肽序列進(jìn)行的氨基酸取代可以高達(dá)1、2、3、4、5、10、20或30個取代。保守取代用具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)、相似化學(xué)性質(zhì)或相似側(cè)鏈體積的其它氨基酸代替氨基酸。被引入的氨基酸可以與其所取代的氨基酸具有相似的極性、親水性、疏水性、堿性、酸性、中性或電荷?；蛘?，保守取代可以引入另一種芳香族或脂肪族氨基酸代替先前存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸改變是本領(lǐng)域眾所周知的，并可以根據(jù)下面表1中定義的20種主要氨基酸的性質(zhì)加以選擇。當(dāng)氨基酸具有相似性質(zhì)時，這可以參考表2中氨基酸側(cè)鏈的親水性程度(hydropathyscale)加以確定。表1-氨基酸的化學(xué)性質(zhì)Ala脂肪族，疏水，中性Met疏水，中性Cys極性，疏水，中性Asn極性，親水，中性Asp極性，親水，帶電(-)Pro疏水，中性Glu極性，親水，帶電(-)Gln極性，親水，中性Phe芳香族，疏水，中性Arg極性，親水，帶電(+)Gly脂肪族，中性Ser極性，親水，中性His芳香族，極性，親水，帶電(+)Thr極性，親水，中性Ile脂肪族，疏水，中性Val脂肪族，疏水，中性Lys極性，親水，帶電(+)Trp芳香族，疏水，中性Leu脂肪族，疏水，中性Tyr芳香族，極性，疏水表2-親水性程度保守取代是指除去了氨基酸序列中的至少一個殘基，并插入不同的殘基來代替之。當(dāng)期望保持蛋白質(zhì)的活性時，這種取代一般是根據(jù)表3進(jìn)行的。表2顯示了能夠取代蛋白質(zhì)中的氨基酸并且通常被看作是保守取代的氨基酸。表3殘基保守取代AlaSerArgLysAsnGln;HisAspGluGlnAsnCysSerGluAspGlyProHisAsn;GlnIleLeu;ValLeuIle;ValLysArg;GlnMetLeu;IlePheMet;Leu;TyrSerThr;GlyThrSer;ValTrpTyrTyrTrp;PheValIle;Leu相似取代是指，除去氨基酸序列中的至少一個殘基并插入不同的殘基來代替之。當(dāng)期望保持蛋白質(zhì)的活性時，這種取代一般是根據(jù)表3進(jìn)行的。表4顯示了能夠取代蛋白質(zhì)中的氨基酸并且通常被看作是結(jié)構(gòu)性和功能性取代的氨基酸。例如，表4第1列中的殘基可以被第1列中的殘基取代；此外，表4第1列中的殘基可以用第1列中的殘基取代。表4殘基相似取代AlaSer;Thr;Gly;Val;Leu;IleArgLys;His;GlyAsnGln;His;Gly;Ser;ThrAspGlu,Ser;ThrGlnAsn;AlaCycSer;GlyGluAspGlyPro;ArgHisAsn;Gln;Tyr;Phe;Lys;ArgIleAla;Leu;Val;Gly;MetLeuAla;Ile;Val;Gly;MetLysArg;His;Gln;Gly;ProMetLeu;Ile;PhePheMet;Leu;Tyr;Trp;His;Val;AlaSerThr;Gly;Asp;Ala;Val;Ile;HisThrSer;Val;Ala;GlyTrpTyr;Phe;HisTyrTrp;Phe;HisValAla;Ile;Leu;Gly;Thr;Ser;Glu保守性小于表2中的取代可以通過挑選對保持如下性質(zhì)具有更顯著不同影響的殘基加以選擇：(a)取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。一般會預(yù)期對蛋白性質(zhì)產(chǎn)生最大改變的取代是，(a)用親水殘基，例如絲氨?；蛱K氨酰，取代疏水殘基(或反之)，例如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨酰、丙氨酰；(b)用半胱氨酸或脯氨酸取代其它殘基(或反之)；(c)用具有正電側(cè)鏈的殘基，例如賴氨酰、精氨酰或組氨酰，取代負(fù)電殘基(或反之)，例如谷氨酰或天冬氨酰；或(d)用具有大側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸，取代不具有側(cè)鏈的殘基(或反之)，例如甘氨酸。跨膜蛋白孔也優(yōu)選地來自α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由7個相同的單體或亞基形成（即，其為七聚體）。α-溶血素-NN的單體或亞基的序列如SEQIDNO:2所示?？缒さ鞍卓變?yōu)選地包括7個單體，每一個均包含SEQIDNO:2所示的序列或其變體。SEQIDNO:2的氨基酸1，7-21，31-34，45-51，63-66，72，92-97，104-111，124-136，149-153，160-164，173-206，210-213，217，218，223-228，236-242，262-265，272-274，287-290，和294形成環(huán)區(qū)。SEQIDNO:2的殘基113和147形成α-HL桶或通道縊痕的一部分。在這些實施方案中，本發(fā)明的方法中優(yōu)選地使用如下的孔，其包含7個蛋白或單體，其中每一個均包含SEQIDNO:2所示的序列或其變體。7個蛋白可以是相同的（同七聚體）或不同的（異七聚體）。SEQIDNO:2的變體是如下的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQIDNO:2的不同，但保持孔形成能力。變體形成孔的能力可以用任何本領(lǐng)域已知的方法加以測定。例如，可以將變體和其它合適的亞基一起插入到脂雙層中，并可以確定其寡聚體化從而形成孔的能力。將亞基插入分子內(nèi)，例如脂雙層中，的方法是本領(lǐng)域已知的。合適的方法在上文已有討論。變體可以包括方便共價結(jié)合或者與Phi29DNA聚合酶的相互作用的修飾。變體優(yōu)選地包括一個或多個反應(yīng)性半胱氨酸殘基，其方便附著到核酸結(jié)合蛋白質(zhì)上。例如，變體可以在SEQIDNO:2的一個或多個如下位置處包含半胱氨酸：8,9,17,18,19,44,45,50,51,237,239和287，和/或在其氨基末端或羧基末端。優(yōu)選的變體在SEQIDNO:2的8,9,17,237,239和287位包含半胱氨酸取代(A8C,T9C,N17C,K237C,S239C或E287C)。變體優(yōu)選地是國際專利申請No.PCT/GB09/001690(公開為WO2010/004273),PCT/GB09/001679(公開為WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公開為WO2010/086603)中描述的任何一種變體。變體還可以包含便于任何與核苷酸的相互作用的修飾。變體可是天然發(fā)生的變體，其被生物體例如葡萄球菌屬細(xì)菌自然表達(dá)。或者，變體可以被細(xì)菌例如大腸桿菌體外或重組表達(dá)。變體還包括通過重組技術(shù)產(chǎn)生的非天然發(fā)生變體。在SEQIDNO:2的整個氨基酸序列長度上，變體基于氨基酸同一性優(yōu)選地與該序列具有至少50%的同源性。更優(yōu)選地，變體多肽基于氨基酸同一性與SEQIDNO:2的氨基酸序列在整個序列上可以為至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，更優(yōu)選地至少95%，97%或99%同源。在200個或更個連續(xù)氨基酸的序列段上，例如230、250、280或280或更多的連續(xù)氨基酸序列上可以有至少80%，例如至少85%，90%或95%的氨基酸同一性（“硬同源性”）。同源性可以如上面所討論地加以確定。除了上面討論的之外，在SEQIDNO:2的氨基酸序列上可以制造例如高達(dá)1,2,3,4,5,10,20或30個氨基酸取代。保守取代可以如上所述地加以制造?？梢詮纳厦嬗懻摰亩嚯纳项~外地缺失一個或多個SEQIDNO:2氨基酸序列的氨基酸殘基。可以缺失多達(dá)1,2,3,4,5,10,20或30個殘基，或者更多。變體可以是SEQIDNO:2的片段。這些片段保留孔形成能力。片段的長度可以是至少50、100、200或250個氨基酸。片段優(yōu)選地包括SEQIDNO:2的孔形成結(jié)構(gòu)域。片段通常包含SEQIDNO:2的殘基119、121、135、114和139。上述的多肽可以可選擇地或額外地添加一個或多個氨基酸。SEQIDNO:2氨基酸序列或其變體或其片段的氨基端或羧基端可以具有延伸。延伸的長度可以非常短，例如1-10個氨基酸?；蛘?，延伸可以比較長，例如長達(dá)50或100個氨基酸。擔(dān)載體蛋白可以被融合到孔或變體上。如上面所討論的，SEQIDNO:2的變體是亞基，其氨基酸序列與SEQIDNO:2的不同，但保留形成孔的能力。變體典型地包含SEQIDNO:2負(fù)責(zé)孔形成的區(qū)域。含有β-桶的α-HL的孔形成能力由每個亞基中的β-鏈提供。SEQIDNO:2的變體典型地包含SEQIDNO:2形成β-鏈的區(qū)域。SEQIDNO:2中形成β-鏈的氨基酸在上面有討論?？梢詫EQIDNO:2形成β-鏈的區(qū)域進(jìn)行一個或多個修飾，只要最終的變體保留其形成孔的能力即可。可以對SEQIDNO:2的β-鏈區(qū)域進(jìn)行的特定修飾在上文有討論。SEQIDNO:2的變體優(yōu)選地在其α-螺旋和/或環(huán)區(qū)域中包括一個或多個修飾，例如取代、添加或刪除。形成α-螺旋或環(huán)的氨基酸在上文有討論。變體可以被修飾，以便于其如上文所討論的鑒定或純化。在一些實施方案中，跨膜蛋白孔被化學(xué)修飾?？卓梢杂萌魏畏绞皆谌魏挝稽c被化學(xué)修飾?？缒た變?yōu)選通過下列方式化學(xué)修飾：附著分子到一個或多個半胱氨酸上（半胱氨酸連接），附著分子到一個或多個賴氨酸上，附著分子到一個或多個非天然氨基酸上，表位的酶修飾，或末端修飾。實施這些修飾的合適方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？缒さ鞍卓卓梢酝ㄟ^附著任何分子進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，孔可以通過附著染料或熒光團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾?？梢詫字腥魏螖?shù)目的單體進(jìn)行化學(xué)修飾。一個或多個，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個單體，優(yōu)選地被如上面所討論地被化學(xué)修飾。半胱氨酸殘基的反應(yīng)性可以通過相鄰殘基的修飾而被提高。例如，側(cè)翼精氨酸、組氨酸或賴氨酸殘基的堿性基團(tuán)會改變半胱氨酸巰基的pKa，變成更具反應(yīng)性的S-基團(tuán)的pKa。半胱氨酸殘基的反應(yīng)性可以被巰基保護(hù)基團(tuán)，例如dTNB保護(hù)。這些可以在附著接頭之前與孔的一個或多個半胱氨酸殘基反應(yīng)。（用于化學(xué)修飾孔的）分子可以被直接附著在孔上，或者通過接頭附著，如在下列文獻(xiàn)中公開的：國際專利申請Nos.PCT/GB09/001690(公開為WO2010/004273),PCT/GB09/001679(公開為WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公開為WO2010/086603)。任何Phi29DNA聚合酶均可以根據(jù)本發(fā)明加以使用。Phi29DNA聚合酶優(yōu)選地包含SEQIDNO:4所示的序列或其變體。野生型Phi29DNA聚合酶具有聚合酶和核酸外切酶活性。在正確條件下，它還可以解開雙鏈多核苷酸。因此，酶可以在三種模式下工作。這在下文有更詳細(xì)的討論。SEQIDNO:4的一種變體是如下的酶，其氨基酸序列與SEQIDNO:4的不同，并保持多核苷酸結(jié)合活性。該變體必須以下面討論的三種模式中的至少一種模式工作。優(yōu)選地，變體以全部三種模式工作。變體可以包含修飾，其便于處理多核苷酸和/或便于在高鹽濃度和/或室溫下發(fā)揮活性。變體可以包含F(xiàn)idelitySystems的TOPO修飾，其可以提高酶對鹽的耐受。在SEQIDNO:4氨基酸序列的全長上，變體優(yōu)選地基于氨基酸同一性與該序列具有至少40%同源性。更優(yōu)選地，變體多肽基于氨基酸同一性與SEQIDNO:4的氨基酸序列在整個序列上可為至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，更優(yōu)選地至少95%，97%或99%同源。在200個或更多連續(xù)氨基酸的序列段上，例如230、250、280或280或更長的連續(xù)氨基酸序列段上可以有至少80%，例如至少85%，90%或95%的氨基酸同一性（“硬同源性”）。同源性如下面所描述地加以確定。變體可以在任何在下文中參考SEQIDNO:2討論的方式上與野生型序列不同。聚合酶可以共價連接在孔上。這些方法是有可能的，因為跨膜蛋白孔可用于根據(jù)它們對通過孔的電流的不同影響，區(qū)分具有相似結(jié)構(gòu)的核苷酸。當(dāng)它們與孔相互作用時，可以從它們的電流幅度在單分子水平上鑒定單個核苷酸。如果電流以某種核苷酸特異的方式流過孔（即檢測到與某種核苷酸相關(guān)的獨特電流流過孔），則孔中存在該核苷酸。連續(xù)鑒定靶多核苷酸中的核苷酸可以確定多核苷酸的序列。如上面所討論的，這就是鏈測序。在單鏈多核苷酸中的核苷酸與孔相互作用期間，該核苷酸以該核苷酸特異的方式影響流過孔的電流。例如，某個特殊的核苷酸會以某個特定的平均時長和特定的程度降低流過孔的電流。換言之，流過孔的電流對特定核苷酸是獨特的?？梢詫嵤φ諏嶒?，確定特定核苷酸對流過孔的電流的影響。然后，可以將在測試樣品上實施本發(fā)明方法獲得的結(jié)果與對照實驗中獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，以便確定靶多核苷酸的序列。該測序方法可以用任何適于研究其中孔插入在膜之中的膜/孔系統(tǒng)的設(shè)備來實施。該方法可以用任何適合于跨膜孔感知的設(shè)備加以實施。例如，所述設(shè)備包括室，其含有水溶液和將室分隔成兩個部分的屏障。該屏障具有開孔，在其中形成含有孔的膜。測序方法可以用國際專利申請No.PCT/GB08/000562中描述的設(shè)備加以實施。本發(fā)明的方法涉及測量在與核苷酸相互作用期間通過孔的電流。因此，該設(shè)備還包括能夠施加電壓并測量跨越膜和孔的電信號的電路。該方法可以用膜片鉗或電壓鉗來實施。該方法優(yōu)選地涉及使用電壓鉗。本發(fā)明的測序方法涉及測量在與核苷酸相互作用期間通過孔的電流。適合用于測量通過跨膜蛋白孔的離子電流的條件是本領(lǐng)域已知的，并且在實施例中有公開。該方法典型地用施加跨越膜和孔的電壓實施。所用的電壓典型地為–400mV到+400mV。所用電壓的范圍優(yōu)選地具有從下組選出的下限：-400mV,-300mV,-200mV,-150mV,-100mV,-50mV,-20mV和0mV，和獨立從下組選出的上限：+10mV,+20mV,+50mV,+100mV,+150mV,+200mV,+300mV和+400mV。所用電壓的范圍更優(yōu)選地是100mV-240mV，最優(yōu)選的范圍是160mV-240mV。通過使用更高的施加電勢，有可能增加孔對不同核苷酸的區(qū)分。測序方法典型地在任何堿金屬鹽酸鹽的存在下實施。在上面討論的設(shè)備示例中，鹽存在于室內(nèi)的水溶液中。典型地使用氯化鉀(KCl)、氯化鈉(NaCl)或氯化銫(CsCl)。KCl是優(yōu)選的。鹽濃度通常為0.1-2.5M,0.3-1.9M,0.5-1.8M,0.7-1.7M,0.9-1.6M或1M-1.4M。鹽濃度優(yōu)選地為150mM-1M。在一些可選擇的實施方案中，理想地包含處于飽和濃度的鹽。Phi29DNA聚合酶令人驚訝地在高鹽濃度下工作。鹽濃度優(yōu)選地至少為0.3M，例如至少0.4M或0.5M。高鹽濃度提供高信噪比，并可以相對于正常電流波動的背景鑒定出指示核苷酸存在的電流。如果在酶的存在下進(jìn)行核苷酸檢測，可以使用較低的鹽濃度。該方法典型地在緩沖液存在下實施。在上面討論的設(shè)備實例中，緩沖液存在于室內(nèi)的水溶液中。本發(fā)明方法可以使用任何緩沖液。典型地，緩沖液是HEPES。另一種合適的緩沖液是Tris-HCl緩沖液。方法典型地在如下的pH下實施：4.0-12.0,4.5-10.0,5.0-9.0,5.5-8.8,6.0-8.7或7.0-8.8或7.5-8.5。所用pH優(yōu)選地為大約7.5。方法可以在如下的溫度下實施：0°C-100°C,15°C-95°C,16°C-90°C,17°C-85°C,18°C-80°C,19°C-70°C,或20°C-60°C。方法典型地在室溫下實施。方法可以任選地在支持酶功能的溫度下，例如大約37°C下實施。如上面所提到的，如果溫度提高，可以在低鹽濃度下實現(xiàn)良好的核苷酸區(qū)分。除了提高溶液溫度之外，可以采用許多其它的策略提高溶液的導(dǎo)電率，同時保持適合于酶活性的條件。一種這樣的策略是使用脂雙層劃分兩個不同濃度的鹽溶液，在酶的一側(cè)是低鹽濃度的鹽，在相反側(cè)是更高的濃度。這種方法的一個實例是，在膜的順側(cè)使用200mMKCl，在反室中使用500mMKCl。在這些條件下，通過孔的導(dǎo)電率在正常條件下預(yù)期與400mMKCl大致相當(dāng)，而如果酶被置于順式側(cè)，則其僅經(jīng)受200mM。使用不對稱鹽濃度的另一個可能的好處是誘發(fā)出的跨孔的滲透壓梯度?？衫眠@種凈水流將核苷酸拉到孔內(nèi)用于檢測。使用中性滲透物，例如蔗糖、甘油或PEG，可以實現(xiàn)相似的效果。另一種可能是使用具有相對低水平KCl的溶液，并依賴一種對酶活性干擾較小的額外電荷攜載物質(zhì)。被分析的靶多核苷酸可以和已知的保護(hù)性化學(xué)物組合，以保護(hù)多核苷酸在體相溶液中免于結(jié)合蛋白的作用。然后，可以利用孔除去保護(hù)性化學(xué)物。這可以通過使用在施加電勢下可以被孔、結(jié)合蛋白或酶解雜交(unhybridised)的保護(hù)性基團(tuán)(WO2008/124107)，或者通過使用當(dāng)被保持在孔極近時被結(jié)合蛋白或酶除去的保護(hù)性化學(xué)物(JAmChemSoc.2010Dec22;132(50):17961-72)來實現(xiàn)。當(dāng)靶多核苷酸與Phi29DNA聚合酶及孔接觸時，靶多核苷酸首先與Phi29DNA聚合酶形成復(fù)合體。當(dāng)跨孔施加電壓時，靶多核苷酸/Phi29DNA聚合酶復(fù)合體與孔形成復(fù)合體，并控制多核苷酸移動通過孔。如上面所討論的，野生型Phi29DNA聚合酶具有聚合酶和核酸外切酶活性。在正確的條件下它還可解開雙鏈多核苷酸。因此，該酶可以按照三種模式工作。本方法可以根據(jù)Phi29DNA聚合酶的三種模式以三種優(yōu)選方式中的一種實施。每種方式均包括序列校讀的方法。第一，該方法優(yōu)選地使用Phi29DNA聚合酶作為聚合酶來實施。在這種實施方案中，步驟(a)和(b)在游離核苷酸和酶輔因子的存在下實施，從而聚合酶使靶序列逆著所施加電壓形成的電場移動通過孔。靶序列沿著5’至3’方向移動。游離核苷酸可以是一個或多個上面討論的各種核苷酸中的任意一種核苷酸。酶輔因子是允許Phi29DNA聚合酶作為聚合酶或核酸外切酶發(fā)揮功能的因子。酶輔因子優(yōu)選地是二價金屬陽離子。所述二價金屬陽離子優(yōu)選地是Mg2+,Mn2+,Ca2+或Co2+。酶輔因子最優(yōu)選地是Mg2+。所述方法優(yōu)選地進(jìn)一步包括(c)除去游離核苷酸，從而使聚合酶將靶序列沿著所施加電壓產(chǎn)生的電場移動通過孔(即沿著3’和5’方向)，并且靶序列的一部分核苷酸與孔相互作用，和(d)測量每次相互作用期間流過孔的電流，藉此校讀在步驟(b)中獲得的靶序列的序列，其中步驟(c)和(d)也在施加的跨膜電壓下實施。第二，方法優(yōu)選地將Phi29DNA聚合酶作為核酸外切酶使用實施。在這種實施方案中，其中步驟(a)和(b)在不存在游離核苷酸但存在酶輔因子的條件下實施，從而使聚合酶將靶序列沿著所施加電壓產(chǎn)生的電場移動通過孔。靶序列沿著3’至5’方向移動。該方法優(yōu)選地進(jìn)一步包括(c)添加游離核苷酸，從而使聚合酶將靶序列逆著所施加電壓產(chǎn)生的電場移動通過孔(即沿著5’-3’方向)，并且靶序列的一部分核苷酸與孔相互作用，和(d)測量每次相互作用期間流過孔的電流，藉此校讀在步驟(b)中獲得的靶序列的序列，其中步驟(c)和(d)也在施加的跨膜電壓下實施。第三，方法優(yōu)選地將Phi29DNA聚合酶以解鏈模式使用來實施。在這種實施方案中，其中步驟(a)和(b)在不存在游離核苷酸和酶輔因子的條件下實施，從而使聚合酶控制靶序列沿著所施加電壓產(chǎn)生的電場移動通過孔（在它被解鏈的同時）。在這種實施方案中，聚合酶發(fā)揮類似剎車的功能，阻止靶序列在施加電壓的影響下太快地移動通過孔。該方法優(yōu)選地進(jìn)一步包括(c)降低所施加的跨孔電壓，從而使靶序列沿著與步驟(a)和(b)中相反的方向移動通過孔（即在它重新退火的同時），并且靶序列中的一部分核苷酸與孔相互作用，和(d)測量每次相互作用期間流過孔的電流，藉此校讀在步驟(b)中獲得的靶序列的序列，其中步驟(c)和(d)也在施加的跨膜電壓下實施。本發(fā)明的方法優(yōu)選地涉及一種來自MspA的孔和Phi29DNA聚合酶。Phi29DNA聚合酶優(yōu)選地分開雙鏈靶多核苷酸，并控制所得的單鏈多核苷酸移動通過孔。這個實施方案具有三個預(yù)料不到的優(yōu)點。第一，靶多核苷酸以商業(yè)上可行的并且允許有效測序的速度移動通過孔。靶多核苷酸移動通過Msp孔的速度比其通過溶血素孔的速度更快。第二，在多核苷酸移動通過孔時觀察到的電流范圍增加，這允許更容易地確定序列。第三，當(dāng)特定孔和聚合酶一起使用時觀察更小的電流差異，藉此提高信噪比。其它方法本發(fā)明還提供了形成用于測序靶多核苷酸的傳感器的方法。該方法包括在靶多核苷酸的存在下使孔與Phi29DNA聚合酶接觸。然后施加跨孔電壓，以形成孔與聚合酶之間的復(fù)合體。該復(fù)合體就是用于測序靶多核苷酸的傳感器。該方法優(yōu)選地包括在靶核酸序列的存在下使源自Msp的孔與Phi29DNA聚合酶接觸，并施加跨越孔的電壓，以在孔與聚合酶之間形成復(fù)合體。上面參考本發(fā)明測序方法討論的任何實施方案均同等地適用于本方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了提高Phi29DNA聚合酶活性速率的方法。該方法包括在多核苷酸的存在下使Phi29DNA聚合酶與孔接觸?？缭娇资┘与妷阂栽诳着c聚合酶之間形成復(fù)合體，這提高Phi29DNA聚合酶的活性速率。該方法優(yōu)選地包括在核酸序列的存在下使Phi29DNA聚合酶與源自Msp的孔接觸，并跨越孔施加電壓，以在孔與聚合酶之間形成復(fù)合體。上面參考本發(fā)明測序方法討論的任何實施方案均同等地適用于本方法。試劑盒本發(fā)明還提供了用于測序靶多核苷酸的試劑盒。該試劑盒包括(a)孔，和(b)Phi29DNA聚合酶。上面參考本發(fā)明測序方法討論的任何實施方案均同等地適用于所述試劑盒。該試劑盒可以進(jìn)一步包括膜的組分，例如形成脂雙層需要的磷脂。本發(fā)明的試劑盒可以額外地包括一種或多種其它能夠使上述任一實施方案得以實施的試劑或器材。這些試劑或器材包括如下的一個或多個：合適的緩沖液（水溶液），從受試者獲取樣品的手段（例如包含針頭的容器或器材)，擴增和/或表達(dá)多核苷酸的手段，如上定義的膜或電壓鉗或膜片鉗設(shè)備。試劑可以在試劑盒中以干燥狀態(tài)存在，使得液體樣品重懸浮該試劑。試劑盒還可以任意地包括能夠使試劑盒用在本發(fā)明方法中的使用說明，或者有關(guān)適用本方法的患者的細(xì)節(jié)。試劑盒可以任意地包括核苷酸。設(shè)備本發(fā)明還提供了用于測序靶多核苷酸的設(shè)備。該設(shè)備包括多個孔和多個Phi29DNA聚合酶。該設(shè)備優(yōu)選地進(jìn)一步包括用于實施本發(fā)明測序方法的使用說明。該設(shè)備可以是任何用于多核苷酸分析的常規(guī)設(shè)備，例如陣列或芯片。上面參考本發(fā)明測序方法討論的任何實施方案均同等地適用于本發(fā)明的設(shè)備。該設(shè)備優(yōu)選地被設(shè)置以實施本發(fā)明的測序方法。該設(shè)備優(yōu)選地包括：a.傳感裝置，其能夠支持膜和多個孔，并可操作以使用孔和蛋白質(zhì)實施多核苷酸測序；b.至少一個用于容納用于實施測序的材料的儲庫；流體系統(tǒng)，其被配置成可控地從所述至少一個儲庫向所述傳感裝置供應(yīng)材料；和c.多個用于接收各自樣品的容器，該流體系統(tǒng)被配置成選擇性地從所述容器向所述傳感裝置供應(yīng)樣品。該裝置可以是下列任一文獻(xiàn)中描述的裝置：國際專利申請No.No.PCT/GB08/004127(公開為WO2009/077734),PCT/GB10/000789(公開為WO2010/122293)，國際專利申請No.PCT/GB10/002206(尚未公開)或國際專利申請No.PCT/US99/25679(公開為WO00/28312)。通過參考下面的實施例將更容易理解本發(fā)明，這些實施例僅是出于舉例本發(fā)明某些方面和實施方案的目的，并無限制意義。實施例這里描述了多個實施例，用于展示測量大分子和聚陰離子或聚陽離子的能力。實施例I：用封閉(blocking)引物防止酶與DNA寡核苷酸酶結(jié)合D355A、E357A核酸外切酶缺陷型KF(100,000Uml-1;比活性20,000Umg-1)得自于紐英倫生物技術(shù)有限公司（NewEnglandBiolabs）。野生型phi29DNAP(833,000Uml-1;比活性83,000Umg-1)得自于Enzymatics。DNA寡核苷酸在斯坦福大學(xué)蛋白與核酸工廠(StanfordUniversityProteinandNucleicAcidFacility)合成并通過變性PAGE加以純化。實施例II：引物延伸和切離測定一個用6-FAM標(biāo)記5′端的67聚體、含14個堿基對的發(fā)夾DNA底物通過90°C溫育4分鐘，隨后在冰水中快速冷卻來自退火。在10mMK-Hepes,pH8.0,0.3MKCl,1mMEDTA,1mMDTT中(在標(biāo)明時添加MgCl2至10mM)，添加dNTPs至指示濃度，用1μM退火發(fā)夾和0.75μMphi29DNAP(外切+)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)在室溫下溫育標(biāo)明的時間，并通過添加緩沖液飽和的苯酚終止反應(yīng)。在抽提和乙醇沉淀后，將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在7M尿素、0.1XTBE中，并在含有18%丙烯酰胺:雙丙烯酰胺(19:1)、7M尿素、1XTBE的凝膠上變性電泳來分離。延伸產(chǎn)物在UVP凝膠記錄系統(tǒng)(UVPGelDocumentationsystem)上使用Sybr金濾鏡(SybrGoldfilter)可視化。條帶強度用ImageJ軟件(NIH)定量分析。實施例III：納米孔實驗納米孔裝置以及將單個α-HL納米孔插入到脂雙層中已經(jīng)描述過。用集成膜片鉗放大器(Axopatch200B,MolecularDevices)以電壓鉗制模式測量通過α-HL納米孔的離子電流通量。用模數(shù)轉(zhuǎn)化器(Digidata1440A,MolecularDevices)在全細(xì)胞設(shè)置中以100kHz進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣，并用低通Bessel濾波器以5kHz進(jìn)行濾波。對于電壓鉗制實驗，以每個圖片中指定的電壓測量電流阻塞（反式-正極）(trans-positive)。實驗在含有10mMK-HepespH8.0,1mMEDTA,1mMDTT,0.3M或0.6MKCl(如圖所示),和10mMMgCl2(當(dāng)有標(biāo)明時)的緩沖液中，在23±0.2°C下進(jìn)行。在每次實驗之前，通過95°C加熱3分鐘并在冰浴中快速冷卻將DNA發(fā)夾底物退火，以防止分子間雜交。實施例IV：主動電壓控制實驗納米孔上DNAP-DNA復(fù)合體的主動電壓控制用有限狀態(tài)機(FSM)邏輯實現(xiàn)，該有限狀態(tài)機用LabVIEW軟件(Version8,NationalInstruments)編程，并在FPGA系統(tǒng)(PCI-7831R,NationalInstruments)上實現(xiàn)，如前人所述(Benneretal.2000supra;Wilsonetal.2009，上文)。在圖2和S2所示實驗中采用的FSM邏輯的細(xì)節(jié)在圖面說明中給出。實施例V：納米孔數(shù)據(jù)分析KF(外切-)-DNA二元復(fù)合體的駐留時間(dwelltime)和振幅用本實驗室開發(fā)的軟件加以定量，該軟件檢測并定量捕獲事件的EBS和終端電流階躍(terminalcurrentsteps)的駐留時間和振幅。phi29DNAP復(fù)合體的電流阻塞用Clampfit10.2軟件(AxonInstruments)加以定量。使用Clampfit軟件獲得phi29二元和三元復(fù)合體的主IEBS值，以確定在捕獲事件初始階段中1-5秒窗口內(nèi)測得的所有點振幅柱狀圖的峰。實施例VI：phi29DNAP-DNA二元復(fù)合體和KF-DNA二元復(fù)合體的相對穩(wěn)定性為了實施納米孔實驗，將單個α-HL納米孔插入到將含有緩沖液的兩個室（稱作順室和反室）分開的脂雙層中，并且膜片鉗放大器施加電壓并測量離子電流(圖1a)。為了檢查phi29DNAP與DNA之間形成的二元復(fù)合體，我們使用14個堿基對的DNA發(fā)夾底物(圖1b)。如先前已經(jīng)證明的(Benneretal.2000supra;Hurtetal.2009，上文)，當(dāng)用該底物形成的KF-DNA二元復(fù)合體被捕獲在α-HL孔中時，所得的離子電流標(biāo)記以初始酶結(jié)合狀態(tài)(EBS)為特征。這在KF停留于孔頂，將DNA底物的雙鏈/單鏈結(jié)合點保持在聚合酶活性位點范圍內(nèi)時發(fā)生(圖1c,ii)。在該KF-結(jié)合狀態(tài)下，DNA模板鏈懸垂通過納米孔內(nèi)腔(lumen)，其寬度足夠容納單鏈DNA，但不能容納雙鏈體DNA。通過在模板鏈內(nèi)插入無堿基(1′,2′-H)殘基，插入位置使得當(dāng)聚合酶-DNA復(fù)合體位于孔頂端時其位于納米孔的內(nèi)腔中，例如圖1b所示DNA發(fā)夾模板位置+12-+16之間的5個無堿基殘基，可以選擇性放大該狀態(tài)(IEBS)的振幅。對于KF-DNA二元復(fù)合體，EBS典型地在180mV施加電勢下維持?jǐn)?shù)毫秒(圖1c,ii)。其之后是較短的低振幅狀態(tài)(圖1c,iii)，這個狀態(tài)在牽拉模板鏈的力導(dǎo)致KF與DNA解離，并且雙鏈體DNA落入納米孔前庭(vestibule)時出現(xiàn)。當(dāng)其出現(xiàn)時，在EBS期間位于孔內(nèi)腔的無堿基模塊被移位到孔的反側(cè)，在那里，它對該終端電流階躍振幅的影響可以忽略不計(在180mV時～20pA)。DNA發(fā)夾在前庭內(nèi)解鏈，隨后通過電泳將鏈移動到反室，開放通道電流得以恢復(fù)(圖1c,iv)。phi29DNAP與DNA底物之間的二元復(fù)合體能夠在不存在5′-3′聚合酶和3′-5′核酸外切酶活性必需的二價陽離子的條件下形成。當(dāng)phi29DNAP-DNA二元復(fù)合體用圖1b的發(fā)夾底物形成并在180mV下被捕獲在α-HL孔內(nèi)時(圖1d,ii)，～35pAIEBS典型地保持?jǐn)?shù)十秒(中值=17.6s,IQR=25.6,n=62)。這比KF-DNA二元復(fù)合體在相同條件下(中值=1.9ms,IQR=2.4ms,n=199)長大約10,000倍，與KF-DNA復(fù)合體的捕獲事件相反，這些phi29DNAP-DNA事件不以單個終端階躍結(jié)束，而是以在一系列離散的離子電流階躍中結(jié)束(圖1d,iii)，我們稱之為“終端級聯(lián)”(terminalcascade)。野生型phi29DNAP的3′-5′核酸外切酶在實驗條件下(1mMEDTA，不添加Mg2+)被抑制，因此這些電流階躍不是由于引物鏈的消化所致。因此，我們有理由認(rèn)為，DNA二聚體可以在與酶結(jié)合時解鏈(圖11d,iii)。在這種情況下，當(dāng)模板在張力下解鏈離開復(fù)合體時，無堿基模塊被以單個核苷酸遞增的方式拖離內(nèi)腔，導(dǎo)致以終端級聯(lián)的方式產(chǎn)生一系列離散的振幅階躍(圖1d,iii)。圖1圖示了聚合酶-DNA二元復(fù)合體被捕獲在α-HL納米孔內(nèi)。(a)納米孔裝置的示意圖。單個α-HL納米孔被插入在30μm直徑的脂雙層內(nèi)，該脂雙層分隔兩個含有23°C10mMK-Hepes,pH8.0,300mMKCl,1mMDTT和1mMEDTA的100μL小孔(well)。納米孔緩沖液不含添加的MgCl2?？珉p層膜的膜電勢通過與Axon200B放大器串聯(lián)的AgCl電極加以確定。b)本實驗中使用的DNA發(fā)夾底物。DNA鏈被設(shè)計成自身折疊，形成14bp雙鏈體莖，其被一個含有4個dTMP殘基的環(huán)連接。引物鏈的3′殘基是ddCMP。紅色的X指示5個無堿基(1′,22-H)殘基，其位于DNA模板鏈的+12-+16位（用序列上方的數(shù)字箭頭指示）。模板鏈編碼是相對于位置n=0的第一個非配對殘基(dCMP)（以藍(lán)色指示）。無堿基單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)在DNA序列下方顯示。c)在180mV施加電壓下捕獲KF(外切-)-DNA復(fù)合體的相應(yīng)離子電流標(biāo)記。(i)是開放通道電流；(ii)是酶結(jié)合態(tài)電流(IEBS)；(iii)是當(dāng)電壓促進(jìn)的KF(外切-)與DNA解離導(dǎo)致發(fā)夾的雙鏈體區(qū)段落入孔前庭時導(dǎo)致的電流；(iv)是通過使DNA發(fā)夾當(dāng)其在納米孔前庭內(nèi)時解鏈并隨后被電泳到反室時，導(dǎo)致的返回到開放的(returntoopen)通道電流。KF(外切-)二元復(fù)合體中值EBS駐留時間為1.9ms(n=199)，與由相同發(fā)夾底物形成的二元復(fù)合體在5mMMgCl2存在下的駐留時間相同。(d)在180mV電勢下捕獲phi29DNAP-DNA復(fù)合體時的離子電流標(biāo)記。(i)是開放通道電流；(ii)是phi29DNAP-DNA二元復(fù)合體的IEBS；(iii)是DNA雙鏈體在與phi29DNAP結(jié)合的狀態(tài)下假定解鏈并且隨后DNA步進(jìn)通過孔時導(dǎo)致的電流終端級聯(lián)；和(iv)是在解鏈DNA電泳到反室之后開發(fā)通道電流的恢復(fù)。小圖(c)中KF(外切-)和小圖(d)中phi29DNAP的濃度是0.75μM；兩個小圖中DNA的濃度均為1.0μM。注意小圖(c)和(d)之間時間尺度的差異。這個模型提示，phi29DNA與DNA之間的相互作用足夠強，在phi29DNAP與DNA之間的結(jié)合得以被打斷之前DNA二級結(jié)構(gòu)由于牽拉模板鏈的力量而解鏈。這進(jìn)一步預(yù)測，在終端級聯(lián)期間降低施加電壓將允許DNA雙鏈體重新退火，同時與酶保持締合，從而將phi29DNAP-DNA復(fù)合體重置到其在DNA模板鏈上的原始位置，顯示為返回到～35pA狀態(tài)。為了檢驗這個預(yù)測，我們比較了在存在或不存在Mg2+時捕獲的復(fù)合體經(jīng)過人為控制的電壓降后恢復(fù)到原始的180mV處的EBS振幅的能力。這種比較的先決條件是保證在Mg2+存在下被捕獲的DNA分子的完整性的手段，從而使納米孔測定僅比較它們在捕獲后的命運。因此，在實驗期間，體相中引物鏈的核酸外切必須最小化。我們在凝膠測定中檢驗了DNA底物3′-H末端是否抑制phi29DNAP的3′-5′核酸外切速度，該測定比較2個攜帶dCMP(泳道1-6)或ddCMP(泳道7-12)末端的67聚體5′-6-FAM標(biāo)記發(fā)夾底物的降解(圖2a)。與phi29DNAP3′-5′核酸外切酶功能需要二價陽離子一致，在含有1mMEDTA但沒有添加Mg2+的納米孔緩沖液中溫育45分鐘后，均沒有觀察到DNA底物的切割（圖2a，泳道1和7）。在10mMMg2+存在下，3′-H底物的DNA消化程度可辨識地小于3′-OH底物。10分鐘后，僅有24.5%的全長DNA分子保持dCMP末端發(fā)夾，而90.5%的ddCMP末端底物則保持完整(圖2a，泳道4和10)。45分鐘后，4%的dCMP末端底物和45%的ddCMP末端底物保持完整(圖2a，泳道5和11)。由3′-H末端提供的切割保護(hù)進(jìn)一步得到在所有4種dNTP存在下引物延長程度的證實。對3′-H末端底物，DNA合成開始需要首先切離ddCMP殘基。因此，在45分鐘內(nèi)，具有3′-OH末端的發(fā)夾有>80%的分子延長為全長102聚體產(chǎn)物(圖2a，泳道6)，而具有3′-H末端的發(fā)夾，79.8%的分子仍保持完整，而只有20.1%的全長延長產(chǎn)物(圖2a，泳道12).因此，3′-H末端的DNA底物在添加Mg2+后提供了一個窗口，在此期間phi29DNAP-DNA復(fù)合體能夠被捕獲而DNA底物保持完整。因此，我們在設(shè)計用于評估在phi29DNAP末端級聯(lián)開始后用于發(fā)夾重折疊的電勢的納米孔實驗中，使用了圖1b所示的以ddCMP為末端的發(fā)夾。在該實驗中，當(dāng)phi29DNAP-DNA復(fù)合體在180mV下被捕獲時，有限狀態(tài)機(FSM，見實施例IV)實時監(jiān)視離子電流，直到檢測到終端級聯(lián)的向下電流階躍為止(圖2b，ii)。當(dāng)離子電流下降到31pA以下達(dá)至少0.5ms時(圖2b中的紅色箭頭)，F(xiàn)SM將施加電壓降低到70mV(圖2b,iii)。在70mV2秒后，將施加電壓恢復(fù)到180mV，并重新測量phi29DNAP-DNA復(fù)合體的振幅。當(dāng)不存在Mg2+時，在11種測試分子的每一個中的IEBS水平均可重復(fù)地被重置到最初的35pA水平。這種EBS振幅指示這樣一種初始狀態(tài)，其中phi29DNAP與堿基配對雙鏈體在位于聚合酶活性位點中的n=0模板殘基處結(jié)合(圖2b,iv)；并與具有完整引物鏈的DNA模板的重新退火一致。重要的是，在70mV的間隔期間，主要的振幅是～10.2pA，偶爾偏移到～8.5pA，可測量地高于對照實驗中未結(jié)合的DNA在70mV下確定的6.8pA的數(shù)值(圖S2)。這表明，phi29DNAP復(fù)合體在整個較低電壓間隔期間保持在納米孔洞頂上而沒有解離，與如下的模型一致，其中當(dāng)發(fā)夾與phi29DNAP在孔上方締合時，在180mV發(fā)生解鏈并且在70mV發(fā)生重折疊。當(dāng)在10mMMg2+存在下實施重折疊實驗時，在添加Mg2+后的最初12.5分鐘內(nèi)24個被捕獲的復(fù)合體中有16個具有～35pAIEBS水平，表明它們是由完整的DNA底物分子形成的(圖2c,i)。這種35pA狀態(tài)保持?jǐn)?shù)秒(中值=10.2s,IQR=12.7s,n=16)，之后以振幅下降為結(jié)束(圖2c,ii)。35pA狀態(tài)之后出現(xiàn)的階躍特征與不存在Mg2+時終端級聯(lián)的表征不同(比較圖2b,ii與2c,ii)。對于這些復(fù)合體，當(dāng)電壓降低到70mV達(dá)2秒鐘然后恢復(fù)到180mV時，35pAIEBS水平對于所測試的任何復(fù)合體均未重置(圖2c)。這與不存在Mg2+時捕獲的phi29DNAP-DNA復(fù)合體相反，表明以完整狀態(tài)被捕獲的DNA底物在它們被保持在孔頂上時被核酸外切修飾。這種DNA在與phi29DNAP結(jié)合的納米孔上系統(tǒng)性非催化解鏈隨后重退火的過程可以在主動電壓控制下被重復(fù)多次。圖2圖示了，DNA發(fā)夾在180mV施加電勢下從phi29DNAP解離的期間發(fā)生的雙鏈體解鏈在70mV下被逆轉(zhuǎn)。(a)ddNMP(3′-H)末端的引物鏈在體相中保護(hù)14bpDNA發(fā)夾底物免于phi29DNAP催化的3′-5′核酸外切降解。將攜帶3′-OH(泳道1-6)或3′-H(泳道7-12)末端的5′-6-FAM標(biāo)記的發(fā)夾底物(1μM)，在室溫下在含有10mMK-Hepes,pH8.0,300mMKCl,1mMDTT和1mMEDTA的緩沖液中與0.75μMphi29DNAP溫育指示的時間。泳道1和7中的反應(yīng)不含有外加的MgCl2；泳道2-6和8-12中的反應(yīng)含有10mMMgCl2。泳道6和12的反應(yīng)還含有dATP,dCTP,dGTP和dTTP各200μM。反應(yīng)產(chǎn)物在18%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離。相應(yīng)于完整的67聚體起始底物和102聚體全長延伸產(chǎn)物的凝膠位置用凝膠側(cè)面的箭頭指示。5′-6-FAM標(biāo)記的DNA發(fā)夾的序列如圖S1所示。(b)電壓促進(jìn)的phi29DNAP-DNA復(fù)合體解離通路中的階躍是可逆的。在本實驗中，緩沖液含有1mMEDTA但未添加MgCl2，以阻止phi29DNAP3′-5′核酸外切酶活性。(i)與圖1b所示發(fā)夾底物形成的phi29DNAP-DNA二元復(fù)合體的捕獲。這將位于模板鏈的+12至+16位之間的無堿基插入物定位到納米孔內(nèi)腔的限制性開孔內(nèi)，產(chǎn)生一個35pA的IEBS；(ii)在該35pA狀態(tài)保持?jǐn)?shù)秒后，通過納米孔的電流逐步減小，同時180mV施加電勢促進(jìn)DNA雙鏈體解鏈并使5個無堿基模塊持續(xù)地移出該限制性開孔；(iii)當(dāng)電流振幅下降到低于31pA達(dá)至少0.5ms時，有限狀態(tài)機(FSM)將電壓降低到70Mv(電流軌跡中的紅色箭頭)達(dá)2秒鐘，以允許DNA雙鏈體重退火到其原始狀態(tài)(在示意圖中用彎曲的紅色箭頭指示)，同時將phi29DNAP-DNA復(fù)合體保持在α-納米孔上；(iv)在70mV達(dá)2秒后，F(xiàn)SM將施加電壓恢復(fù)到180mV。最初35pA電流水平的恢復(fù)(虛線)表明，phi29DNAP-DNA復(fù)合體已經(jīng)重置到其原始的捕獲狀態(tài)。(c)phi29DNAP-DNA復(fù)合體在允許從DNA引物鏈3’-5’核酸外切切離核苷酸的條件下解離。在該實驗中，向小圖b中所述的緩沖液添加10mMMgCl2。(i)將phi29DNAP-DNA復(fù)合體捕獲在α-HL納米孔中，使得5個無堿基模塊定位到納米孔內(nèi)腔的限制性開孔中，產(chǎn)生35pA的IEBS，這一現(xiàn)象可以診斷復(fù)合體攜帶具有完整ddCMP末端的DNA底物；(ii)5個無堿基模塊移出限制性開孔導(dǎo)致通過納米孔的電流減小，這可以由下導(dǎo)致：1）DNA雙鏈體解鏈，或2）phi29DNAP催化的引物鏈的3′-5′核酸外切降解，同時復(fù)合體被保持在孔頂；(iii)如在小圖b(iii)中一樣，當(dāng)電流振幅降低到31pA之下達(dá)至少0.5ms時，F(xiàn)SM將電壓降低到70mV達(dá)2秒鐘，以使DNA雙鏈體重退火(電流軌跡中的紅色箭頭)，同時將phi29DNAP-DNA復(fù)合體保持在納米孔上；(iv)與小圖b(iv)相反，2秒后通過FSM恢復(fù)施加180mV的電壓不會恢復(fù)最初的35pAIEBS(紅色虛線)，表明在允許催化位于孔頂上的phi29DNAP-DNA復(fù)合體中的3′-5′核酸外切的條件下，不恢復(fù)最初的捕獲狀態(tài)。實施例VII：模板無堿基插入位置對與phi29DNAP結(jié)合的DNA底物的IEBS的影響的作圖我們對由保持在納米孔頂上的聚合酶-DNA復(fù)合體催化的DNA合成的檢測策略采用當(dāng)聚合酶沿著模板前進(jìn)、將模板鏈中的無堿基殘基模塊以單核苷酸遞增的方式拉入和通過納米孔內(nèi)腔時，監(jiān)視離子電流的變化。這種方法能夠識別受酶驅(qū)動的順次埃級(Angstrom-scale)移動。作為使用phi29DNAP的DNA復(fù)制實驗的前奏，我們建立了參考圖，其將IEBS與5個無堿基模塊在DNA發(fā)夾底物模板鏈中的位置相關(guān)聯(lián)(圖3)。為了構(gòu)建該圖，使phi29DNAP結(jié)合于一系列含有5個連續(xù)無堿基殘基的模塊的底物中的每一個，依次偏移一個核苷酸(圖3a)。我們測量了含有0.3MKCl的緩沖液中用于在如下兩個條件下捕獲復(fù)合體的IEBS：i)1mMEDTA，不添加Mg2+，其在沒有支持性的核苷酸切除或添加的同時允許形成二元復(fù)合體(圖3b，泳道1)；和ii)10mMMg2+,400μMddCTP,和100μMdGTP。后面的兩個條件在體相中分別使98.2%和96%的3′-H末端發(fā)夾分子保持完整狀態(tài)達(dá)10和45分鐘(圖3b，泳道6和7)。由ddCTP提供保護(hù)，若ddCTP被核酸外切功能切除時，phi29DNAP可發(fā)揮聚合酶功能從而恢復(fù)分子的ddCMP末端(圖3b，泳道3和4)。dGTP的存在提高了保護(hù)作用，其與n=0處的模板殘基互補，并能夠在3′-H末端DNA底物的存在下形成phi29DNAP-DNA-dGTP三元復(fù)合體，其可以增加引物末端位于聚合酶結(jié)構(gòu)域而非核酸外切酶結(jié)構(gòu)域中的時間的比例(圖3b,泳道6和7；圖S3)。因此，在Mg2+,ddCTP和dGTP存在下形成的復(fù)合體在本研究中被操作性地定義為三元復(fù)合體。圖3c顯示了phi29DNAP二元復(fù)合體(藍(lán)點)和三元復(fù)合體(紅點)的IEBS圖。兩個圖均與使用6個無堿基模板插入物在80mV下對KF(外切-)-DNA-dNTP三元復(fù)合體確定的映射相似。在0.3MKCl、180mV下，IEBS范圍是22.3pA，即用5ab(6,10)底物(無堿基模塊位于模板位置+6-+10，從聚合酶催化位點n=0起測量)形成的三元復(fù)合體的IEBS，到35.4pA，即用5ab(11,15)和5ab(9,13)底物(無堿基模塊分別位于模板位置+11-+15和+9-+13)形成的二元復(fù)合體的IEBS。這給出了至少13pA的動態(tài)振幅范圍，用于檢測聚合或核酸外切反應(yīng)期間酶的移動。在圖中的所有點，二元和三元復(fù)合體的IEBS均相互偏移(offsetfromoneanother)。偏移的方向和程度部分地取決于沿著圖的位置。例如，在位置(i)(圖3c)，二元復(fù)合體變?yōu)槿獜?fù)合體導(dǎo)致IEBS從31.5pA增加到34.5pA。相比之下，在位置(ii)(圖3c)，二元到三元的變化導(dǎo)致相對較小的電流增加，從34.4到35.2pA；在位置(iii)(圖3c)，二元向三元轉(zhuǎn)變導(dǎo)致較大的IEBS電流降低，從31.5pA到25.5pA。有趣的是，二元狀態(tài)下離子電流閃爍(flicker)的方向和大小經(jīng)常預(yù)示從由相同底物形成的三元復(fù)合體觀察到的主要振幅(圖3d)。圖3圖示了phi29DNAP-DNA復(fù)合體在180mV的EBS振幅是DNA模板鏈中無堿基插入位置的函數(shù)。(a)在phi29DNAP作圖實驗中使用的DNA發(fā)夾。在每個序列中，紅色X指示無堿基(1′,2′-H)殘基的位置。無堿基構(gòu)型標(biāo)示為5ab(x,y)，其中5是插入物中無堿基殘基的數(shù)目，x和y指示插入物中第一個與最后一個無堿基殘基的距離(以核苷酸計)，從聚合酶催化位點中n=0的模板鏈dNMP起量度。形成14個堿基對發(fā)夾的自身互補序列模塊加下劃線。每個發(fā)夾的無堿基構(gòu)型標(biāo)示在每個序列的左側(cè)。(b)在繪制phi29DNAP-DNA復(fù)合體振幅的納米孔實驗期間體相中發(fā)夾底物的狀態(tài)。將一種5′-6-FAM,3′-H14bp發(fā)夾(1μM)在室溫下與0.75μMphi29DNAP在含有1mMEDTA、不含(泳道1)或含有(泳道2-7)10mMMgCl2的緩沖液中溫育指示的時間。反應(yīng)包括了400μMddCTP(泳道4和5)或400μMddCTP與100μMdGTP(泳道6和7)。泳道1中的條件是用于繪制phi29DNAP-DNA二元復(fù)合體的振幅的條件。泳道6和7中的條件是用于繪制phi29DNAP-DNA-dGTP三元復(fù)合體的振幅的條件。(c)在含有0.3MKCl的緩沖液中對phi29DNAP-DNA二元(藍(lán)圓)或phi29DNAP-DNA-dGTP(紅圓)復(fù)合體的主要振幅值繪圖。每個點代表從三個獨立實驗確定的平均IEBS+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差。藍(lán)色和紅色虛線分別指示與由正常DNA殘基且不帶無堿基插入構(gòu)成的DNA發(fā)夾底物形成的phi29DNAP二元和三元復(fù)合體的振幅。(d)顯示在二元(標(biāo)記為-Mg2+,-ddCTP/dGTP)或三元(標(biāo)記為+Mg2+,+ddCTP/dGTP)作圖條件下捕獲的與含有無堿基構(gòu)型(i)5ab(13,17),(ii)5ab(12,16),或(iii)5ab(8,12)的DNA發(fā)夾底物形成的復(fù)合體的代表性事件區(qū)段的電流軌跡。圖中用這些底物形成的復(fù)合體的位置在小圖3c中用相應(yīng)的小寫羅馬數(shù)字指示。作圖實驗結(jié)果容許根據(jù)關(guān)于導(dǎo)致終端級聯(lián)的分子事件提出的模型進(jìn)行預(yù)測(圖1和2)：在二元復(fù)合體捕獲事件的終端級聯(lián)中，電流階躍的順序應(yīng)當(dāng)以依賴于復(fù)合體中無堿基模塊的初始位置的方式改變。這已經(jīng)得到證實。例如，當(dāng)5ab(6,10)底物的復(fù)合體片段在終端級聯(lián)期間解鏈時，無堿基模塊被從其位于酶附近的位置向反室拖拽。這導(dǎo)致在無堿基模塊穿過孔內(nèi)腔時產(chǎn)生一系列～36pA峰值的電流階躍(圖S4,a)。相反，對于與5ab(18,22)底物形成的二元復(fù)合體，無堿基模塊的初始位置遠(yuǎn)離酶。當(dāng)該底物在終端級聯(lián)中被解鏈時，觀察不到振幅峰(圖S4,b)。實施例VIII：由phi29DNAP催化的DNA模板在納米孔內(nèi)的受控轉(zhuǎn)位來自我們實驗室的結(jié)果顯示，在T7DNAP(外切-)復(fù)制期間，可以以單個核苷酸的精度檢測到DNA模板在α-HL納米孔中的前進(jìn)。然而，對于大部分與這種酶形成的復(fù)合體，只有一個或兩個核苷酸添加循環(huán)可以被監(jiān)視到。為了確定phi29DNAP是否在納米孔上更高效地催化順序核苷酸添加，我們測量了在其模板鏈中帶有5個無堿基插入的合成DNA底物分子在phi29DNAP驅(qū)動下的位移。利用圖3中的圖來解釋當(dāng)單個核苷酸被酶促添加到或從DNA3′端除去時IEBS的變化。圖2c中的實驗顯示，在體相中ddNMP殘基的緩慢切離可用于在Mg2+存在下捕獲其中引物鏈保持完整的復(fù)合體。重要的是，該實驗還顯示，可以在孔上實現(xiàn)ddNMP殘基的切離，暴露-1殘基的3′-OH，從而產(chǎn)生這樣的底物，其在dNTP的存在下可以在孔頂潛在競爭合成反應(yīng)。與先前的發(fā)現(xiàn)一致，圖2a中的凝膠實驗顯示，在dNTP存在下，體相中聚合反應(yīng)相對于核酸外切反應(yīng)占主導(dǎo)地位。這些發(fā)現(xiàn)對于我們DNA復(fù)制實驗策略是至關(guān)重要的：在dNTP存在下捕獲帶有完整3′-H末端底物的phi29DNAP復(fù)合體允許在孔上發(fā)生切離反應(yīng)，并且在模板鏈中使用無堿基模塊標(biāo)簽來明確確定是否觀察到保持在孔頂?shù)膹?fù)合體的聚合反應(yīng)。使用這種策略，大部分被捕獲在納米孔中的復(fù)合體應(yīng)在相同的模板位置(相對于起始底物最初n=0位置是-1)開始復(fù)制。因為dGTP能夠通過形成三元復(fù)合體減慢ddCMP的切離速度(圖3b,圖S3)，所以我們選擇使用20μM每種dATP,dCTP,dTTP和5μMdGTP進(jìn)行最初的納米孔合成實驗。我們使用5′-6-FAM,3′-H發(fā)夾底物在凝膠測定中確定了這些條件對體相中DNA底物分子狀態(tài)的影響(圖4b)。10分鐘之后，67聚體起始底物中82.5%的保持完整，13.6%被延伸成102聚體產(chǎn)物。20分鐘后，這些比例是69.4%和26.1%延伸產(chǎn)物，到45分鐘為止，大約30%的熒光素標(biāo)記發(fā)夾被延伸。因此，在我們的納米孔實驗中，將測量限定到向順室添加Mg2+和dNTP底物后的最先10分鐘。在這些條件下的初始納米孔復(fù)制實驗中(圖4)，我們使用的DNA底物具有起始無堿基構(gòu)型5ab(15,19)并帶有3′ddCMP末端(圖4a)。圖4c和4d分別顯示了在存在10mMMg2+且具有或沒有dNTP的條件下，使用該底物在180mV下捕獲phi29DNAP-DNA復(fù)合體的典型離子電流軌跡。在兩種條件下，捕獲時的主要初始IEBS為～29pA，并偏移到～26pA，與5ab(15,19)二元和三元復(fù)合體圖譜值之間的波動(圖3c)一致。在兩種條件下，起始IEBS水平都存在滯后，這是由于3′ddCMP末端的緩慢切離導(dǎo)致的，之后產(chǎn)生了一系列電流變化。我們對在不存在dNTP時進(jìn)行的實驗中電流變化(圖4c)的解釋如下：當(dāng)ddCMP切離時，phi29DNAP核酸外切酶持續(xù)地從引物末端順次切割核苷酸，產(chǎn)生持續(xù)縮短的雙鏈體區(qū)段，并且酶與無堿基插入物之間的距離持續(xù)增大。因此，該無堿基片段通過孔并向著反室移動，導(dǎo)致持續(xù)性離子電流降低。最終，離子電流返回到開放通道狀態(tài)，這與DNA與phi29DNAP解離并隨后電泳進(jìn)入反室一致。相反，當(dāng)實驗在存在20μM每種dATP,dCTP,dTTP和5μMdGTP下實施時，產(chǎn)生不同的離子電流模式，特征是出現(xiàn)35.4pA峰(圖4d)。我們推測，發(fā)生這些電流變化是因為，在phi29DNAP切離保護(hù)DNA3′端的ddCMP殘基后，dNTP的存在有利于孔頂上phi29DNAP催化的核苷酸添加。隨著phi29DNAP持續(xù)性移動靠近DNA模板內(nèi)的無堿基插入物，雙鏈體DNA片段被延伸，將其牽引通過納米孔內(nèi)腔，伴隨著在圖3b的圖中主離子電流峰在無堿基構(gòu)型5ab(15,19)和5ab(6,10)之間往返移動。圖4e顯示了在本實驗期間，由一系列被捕獲的phi29DNAP-DNA復(fù)合體催化的多個DNA模板復(fù)制反應(yīng)。在圖4b所示的凝膠實驗中，除了起始67聚體發(fā)夾底物和全長延伸產(chǎn)物之外，相應(yīng)于部分延伸產(chǎn)物的中間條帶隨著時間而積累(圖4b,泳道6和7)。這些產(chǎn)物的出現(xiàn)可能是由于體相中dNTP池的耗盡，因為在凝膠和納米孔實驗中存在的1μMDNA底物分子中有更多部分被復(fù)制。因為這會潛在影響孔頂上的phi29DNAP復(fù)合體所催化的延伸和合成速度，所以我們檢查了通過使用更高濃度的dNTP是否能夠?qū)⑵渥钚』?。我們測量了在100μM每種dGTP,dCTP,dTTP和dATP存在下，5′-6-FAM,3′-H末端發(fā)夾的引物延伸程度作為時間的函數(shù)(圖5a和b)。在這些條件下，全長產(chǎn)物的積累速度慢于圖4b中的實驗(使用dCTP,dTTP,dATP各20μM和5μMdGTP)，可能是由于更高濃度的dGTP會更高效地抑制ddCMP末端的切離。20分鐘后，86.3%的起始DNA底物保持完整，而13.6%的被完全延伸(圖5a，泳道6,和5b)。相比之下，在使用更低濃度的dNTP和相同時間量進(jìn)行的反應(yīng)中，這些物質(zhì)分別為69.4%和26.1%(圖4b，泳道6)。重要的是，即使在30分鐘后，較短延伸產(chǎn)物的積累仍然低于該測定的檢出限。因此，我們在隨后的復(fù)制實驗中使用100μM濃度的每種dNTP底物。為了檢驗為在圖4d和4e的復(fù)制實驗中觀察到的離子電流標(biāo)記提出的模型，我們使用一種DNA發(fā)夾底物，其中第一個模板dTMP殘基位于相對于無堿基插入的限定位置(圖5)。當(dāng)在100μM每種dGTP,dCTP,dTTP和ddATP存在下用該底物進(jìn)行DNA合成反應(yīng)時，可以添加12個核苷酸，期間無堿基模塊將被從5ab(18,22)的起始位置，跨越5ab(11,15)的35.4pA峰，牽引至位置5ab(6,10)。在到達(dá)位于+12的dTMP殘基后，預(yù)期復(fù)制將終止。相反，在存在100μM每種dGTP,dCTP,dTTP和dATP下進(jìn)行的復(fù)制反應(yīng)將可以進(jìn)展通過該+12位置。圖4圖示了納米孔上由phi29DNAP催化的DNA復(fù)制。(a)用于納米孔復(fù)制實驗的DNA發(fā)夾底物。該底物的起始無堿基構(gòu)型是5ab(15,19)。開始引物延伸需要核酸外切離末端ddCMP殘基，在此之后當(dāng)酶到達(dá)無堿基模塊之前可以添加添加15個核苷酸。隨著復(fù)制的進(jìn)行，5個無堿基殘基模塊將被牽引通過孔，并從無堿基構(gòu)型5ab(15,19)變?yōu)?ab(6,10)，其構(gòu)成圖3圖譜中的主峰。(b)在納米孔實驗條件下，Phi29DNAP在體相中催化的DNA發(fā)夾底物的引物延伸。在含有10mMK-Hepes,pH8.0,0.3MKCl,1mMDTT,和1mMEDTA,不存在(泳道1)或存在(泳道2-7)10mMMgCl2,及添加標(biāo)示的dNTP的緩沖液中，將67聚體5′-6-FAM,3′-H14bp發(fā)夾(1μM)與0.75μMphi29DNAP在室溫下溫育指定時間。反應(yīng)產(chǎn)物在18%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離。泳道5-7在小圖d和e中顯示了在納米孔實驗的dNTP底物條件下(5μMdGTP,dATP,dCTP和dTTP各20μM)體相中10、20和45分鐘時的引物延伸程度。(c)在存在1mMEDTA和11mMMgCl2、不存在dNTP的條件下用小圖a所示5ab(15,19)發(fā)夾形成的phi29DNAP-DNA復(fù)合體的代表性捕獲事件。(d)在存在1mMEDTA、11mMMgCl2和5μMdGTP及20μM每種dATP,dCTP和dTTP的條件下用小圖a所示5ab(15,19)發(fā)夾形成的phi29DNAP-DNA復(fù)合體的代表性捕獲事件。(e)由Phi29DNAP催化的被系列捕獲的各個DNA底物分子的復(fù)制。實時顯示電流軌跡；4個系列中的第一個事件是小圖d所示事件的擴大。小圖c-e所示的電流軌跡是在添加MgCl2(c)或MgCl2和dNTPs(d,e)后最初10分鐘內(nèi)收集的，以便使由于體相反應(yīng)導(dǎo)致的dNTP耗竭最小化。當(dāng)與該DNA底物形成的phi29DNAP復(fù)合體在這兩種條件下被捕獲時，出現(xiàn)了一段數(shù)秒的最初時期，其間主要的電流幅度為～31A，伴隨到～27pA的振蕩(圖5d和e)，與該5ab(18,22)構(gòu)型的三元和二元復(fù)合體的圖譜值相似(圖3c)。在該狀態(tài)結(jié)束后，35.4pA離子電流峰被快速通過，指示無堿基模塊被牽引通過內(nèi)腔。如果在順室中存在dGTP,dCTP,dTTP和ddATP，在通過該峰后，聚合酶停止于如下狀態(tài)，其中電流在～25pA-28pA的主要振幅之間振蕩數(shù)秒(圖5d)。相反，在dATP而非ddATP存在下，聚合酶前行通過并超過25pA狀態(tài)而無停止(圖5e)。這證明，在ddATP存在下觀察到的停止?fàn)顟B(tài)（其表明復(fù)制復(fù)合體到達(dá)了dTMP殘基）是在導(dǎo)致振幅峰的模板片段穿過內(nèi)腔之后實現(xiàn)的。因為到達(dá)該dTMP模板殘基需要穿越5ab(17,21)到達(dá)5ab(7,11)無堿基構(gòu)型所必需的核苷酸摻入，所以這些實驗證明，該特征振幅峰是由于ddCMP在孔上切離后發(fā)生的復(fù)制導(dǎo)致的。圖5圖示了phi29DNAP催化的復(fù)制到達(dá)或通過特定模板位置。(a)在phi29DNAP和100μM每種dGTP,dCTP,dTTP和dATP存在下，DNA發(fā)夾底物在體相中引物延伸的時間過程。在含有1mMEDTA、不存在(泳道1)或存在(泳道2-7)10mMMgCl2和所有四種dNTP各100μM(泳道1-10)的緩沖液中，將67聚體5′-6-FAM,3′-H14bp發(fā)夾(1μM)與0.75μMphi29DNAP在室溫下溫育指定時間。引物延伸的開始需要在持續(xù)性添加dNTP之前核酸外切切離末端ddCMP殘基。反應(yīng)產(chǎn)物在18%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離。(b)在小圖的凝膠中相應(yīng)于完整、未延伸發(fā)夾（藍(lán)色菱形）和延伸產(chǎn)物（紅色菱形）的條帶的熒光強度用ImageJ軟件(NIH)定量。對于每個泳道，將這兩個條帶的總熒光的分?jǐn)?shù)作為反應(yīng)時間的函數(shù)進(jìn)行描點作圖。(c)用于納米孔反應(yīng)實驗的DNA發(fā)夾底物。起始無堿基構(gòu)型是5ab(18,22)。在dGTP,dCTP,dTTP和ddATP存在下，可以最多添加12個核苷酸，直至響應(yīng)于第一個模板dTMP殘基（藍(lán)色）的ddATP被添加。該dTMP殘基被如此定位，使得到達(dá)該終點需要復(fù)制一段模板，而在此期間無堿基模塊（紅色X）被牽引進(jìn)入并通過納米孔內(nèi)腔。在摻入ddATP之后，可以形成具有無堿基構(gòu)型5ab(6,10)的phi29DNAP-DNA-dTTP三元復(fù)合體。在dGTP,dCTP,dTTP和dATP存在下，復(fù)制可以進(jìn)行通過+12位置，并到達(dá)無堿基模塊。(d)在含有0.3MKCl和10mMMgCl2的緩沖液中，在100μM每種dGTP,dCTP,dTTP和ddATP存在下，phi29DNAP催化的小圖c所示發(fā)夾底物的復(fù)制。(e)在向小圖(d)所示的實驗中添加200μMdATP之后，phi29DNAP催化的復(fù)制。小圖d和e所示的事件是數(shù)十個被捕獲復(fù)合物的代表。對照實驗(其中添加了100μM每種dGTP,dCTP,dTTP和dATP但沒有ddATP)中的事件與小圖e所示的代表性事件相同。復(fù)合體在向納米孔室添加MgCl2后的最初10分鐘內(nèi)被捕獲。實施例IX：phi29DNAP催化DNA復(fù)制的速度受到所施加的跨納米孔電壓的影響使用光鑷的實驗顯示，由phi29DNAP催化的復(fù)制速度被模板上～20-～37pN的張力所減慢。這個結(jié)果預(yù)示，phi29DNAP復(fù)制的速度會受到跨納米孔施加的電壓的影響。然而，會發(fā)生這個現(xiàn)象的電壓模式(voltageregime)并不知道。圖6顯示了對于如下實驗，當(dāng)phi29DNAP沿著DNA發(fā)夾底物的25nt模板片段進(jìn)行復(fù)制反應(yīng)期間的代表性事件(圖6a)，在這些實驗中，施加電壓在220mV-100mV的范圍內(nèi)以40mV遞增。該底物的起始無堿基構(gòu)型是5ab(25,29)；因此，在DNA合成期間，5個無堿基插入物將被牽引通過納米孔內(nèi)腔的限制性開孔，跨越無堿基構(gòu)型5ab(18,22)到5ab(6,10)，從而跨越圖3c中描繪的振幅。這些峰在每個電壓下均被穿過，且穿過的速度似乎隨著施加電壓的降低而增加(圖6b)。我們測量了在對應(yīng)于主電流峰兩側(cè)位置的兩個容易區(qū)分的電流振幅（圖6b,i中的藍(lán)色箭頭）之間前進(jìn)所需的時間，它們之間間隔大約5個核苷酸。在220mV，復(fù)制整個該距離所需的中值時間為227ms(IQR=174ms,n=45)；在100mV，復(fù)制的中值時間為67ms(IQR=41ms,n=59)。圖6圖示了在不同電壓下phi29DNAP催化的被保持在納米孔上面的復(fù)合體的復(fù)制。(a)用于納米孔復(fù)制實驗的DNA發(fā)夾底物。該底物的起始無堿基構(gòu)型是5ab(25,29)。在引發(fā)DNA合成必需的核酸外切切離末端ddCMP殘基之后，在酶到達(dá)無堿基模塊之前可以添加25個核苷酸。在DNA合成期間，5個無堿基插入物被牽引通過并越過無堿基構(gòu)型5ab(18,22)到達(dá)5ab(6,10)，其跨越圖3中圖繪的位置。(b)顯示在100μM每種dGTP,dCTP,dTTP和dATP存在下，在含有0.3MKCl,10mMMgCl2的緩沖液中，小圖a所示發(fā)夾底物的phi29DNAP復(fù)制的代表性電流軌跡。顯示了在(i)220mV,(ii)180mV,(iii)140mV和(iv)100mV施加電壓下的合成的軌跡。合成在向納米孔室添加MgCl2后的最初10分鐘內(nèi)進(jìn)行檢查。220mV軌跡下方的藍(lán)色箭頭指示用于定量220和100mV下的合成速度的起始和結(jié)束狀態(tài)。實施例X：在納米孔上phi29DNAP對較長DNA模板的復(fù)制預(yù)想到天然DNA模板在納米孔上的復(fù)制，我們測量了合成DNA發(fā)夾底物中較長區(qū)段的phi29DNAP依賴性復(fù)制。該發(fā)夾底物具有5ab(50,54)的起始無堿基構(gòu)型，在酶到達(dá)無堿基模塊之前可以添加最多50個核苷酸(圖7a)。當(dāng)與該底物形成的phi29DNAP-DNA復(fù)合體在180mV下在含有0.3MKCl的緩沖液中被捕獲時，最初存在數(shù)秒鐘的間隔，此期間電流在～23pA的主要振幅到～25pA的躍遷之間振蕩。47個被捕獲的復(fù)合體中有27個以該振蕩開始，當(dāng)這個時期結(jié)束后，聚合酶繼續(xù)通過圖繪的振幅峰(圖7b)。我們推測，該振蕩標(biāo)記相應(yīng)于帶有完整ddCMP末端被捕獲的復(fù)合體，其捕獲發(fā)生于允許后面發(fā)生合成的ddCMP切離反應(yīng)之前，這是因為(i)在圖4、5、6和7所示的實驗中，在每個成功復(fù)制反應(yīng)的捕獲和合成之間總是出現(xiàn)相似的模式，其隨后穿越無堿基35.4pA峰；(ii)振蕩的上下振幅水平在這些實驗間依賴于DNA底物起始無堿基構(gòu)型而不同；(iii)那些水平與針對每個底物無堿基構(gòu)型圖繪的二元和三元復(fù)合體的振幅非常接近；和(iv)在上下振幅狀態(tài)中花費時間的比例可以按照dGTP濃度的函數(shù)加以調(diào)節(jié)（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，我們使用該振蕩狀態(tài)的結(jié)束作為起點，估計phi29DNAP穿越～50nt模板片段所需的時間。我們從在振蕩剛剛結(jié)束時出現(xiàn)的小但是可重復(fù)的電流微降(dip)（圖7b中的左邊藍(lán)色箭頭）開始測量，直到圖上主峰遠(yuǎn)端側(cè)上可識別的振幅狀態(tài)（圖7b中的右邊藍(lán)色箭頭）。在含有0.3MKCl的緩沖液中復(fù)制整個該距離所需的中值時間為1.39s(IQR=0.57s;n=27)。對于這種嗜熱聚合酶，令人驚訝的是，在含有0.6MKCl的緩沖液中也可以檢測到phi29DNAP對5ab(50,54)底物的復(fù)制（圖7c）。與在0.3MKCl中的復(fù)制反應(yīng)相似，這些事件以如下狀態(tài)開始，其中電流在開始復(fù)制前在兩個水平之間振蕩數(shù)秒鐘（圖7c）。在這些更高離子強度的條件下，電流在～32pA的主要水平與～34pA的躍遷之間振蕩。在以該電流振蕩開始的41個事件中，有25個隨后出現(xiàn)了牽引無堿基片段通過納米孔內(nèi)腔、并導(dǎo)致無堿基模塊穿越圖繪的振幅峰的復(fù)制。在0.6MKCl下，穿越從振蕩周期結(jié)束（圖7c中的左藍(lán)色箭頭）到主無堿基振幅峰遠(yuǎn)端側(cè)（圖7c中的右藍(lán)色箭頭）之間的距離所需的中值時間為2.41s(IQR=1.13s;n=25)。圖7圖示了由phi29DNAP在納米孔上催化的持續(xù)性DNA復(fù)制。(a)用于納米孔復(fù)制實驗的DNA發(fā)夾底物。該底物的起始無堿基構(gòu)型是5ab(50,54)。在引發(fā)DNA合成必需的末端ddCMP殘基被核酸外切切離之后，在酶到達(dá)無堿基模塊（由模板鏈序列上方的藍(lán)色箭頭指示）之前可以添加50個核苷酸。在DNA合成期間，隨著最初32個核苷酸被摻入并且到達(dá)無堿基構(gòu)型5ab(18,22)，5個無堿基插入被拉向孔的內(nèi)腔；隨后的核苷酸添加將該模塊拉到并且拉過構(gòu)型5ab(6,10)。因此，圖3中振幅圖中的無堿基構(gòu)型被跨越。(b)180mV施加電勢下的代表性電流軌跡，其顯示了在含有0.3MKCl的緩沖液中小圖a所示發(fā)夾底物的phi29DNAP復(fù)制。(c)180mV施加電壓下的代表性電流軌跡，其顯示了在含有0.6MKCl的緩沖液中小圖a所示發(fā)夾底物的phi29DNAP復(fù)制。小圖b和c中，左右藍(lán)色箭頭分別指示用于估計沿著該模板復(fù)制～50nt所需時間的起始和結(jié)束點。合成反應(yīng)在dGTP,dCTP,dTTP和dATP各100μM存在下實施，并在向納米孔室添加MgCl2后的最初10分鐘內(nèi)檢查合成反應(yīng)。這些結(jié)果出人意料地比考慮現(xiàn)有技術(shù)的預(yù)期更好。實施例XI：電流軌跡中的噪音能夠幫助鑒定沿聚合物鏈的相鄰單體圖9a：這個軌跡顯示了伴隨著帶有無堿基殘基的DNA鏈在phi29DNA聚合酶控制下移動通過α-HL孔的6個平均電流水平(i-vi)。電流水平iv中的峰-峰噪音顯著比所有其它水平的噪音都大。這是由于位置iv左右的模板運動導(dǎo)致的，其可以探測鄰近的位置iii和v。與位置iii和v相關(guān)的電流與位置iv非常不同，因此iv周圍的噪音更能夠預(yù)測其近鄰的身份。圖9b：這個軌跡顯示了由于在帶有無堿基殘基的DNA模板在phi29DNA聚合酶內(nèi)移位時產(chǎn)生的～3-5埃鏈位移導(dǎo)致的電流差異。在沒有底物的小圖(i)中，主要電流是31pA，伴有到大約34pA的電流偏移（噪音），預(yù)測由于鏈相對于傳感器的位移導(dǎo)致的下一個主要狀態(tài)將是34pA。在小圖(ii)中，下一個位置（偏離第一個位置大約3-5埃）被底物穩(wěn)定化于預(yù)測的34pA水平。偶爾向31pA的向下噪音擾動證實了先前占據(jù)傳感器的一個或多個單體的身份。iii)在沿著與phi29DNA聚合酶結(jié)合的模板鏈的不同的位置處，主要電流（沒有底物）是31pA。向～25pA的噪音偏移預(yù)示了當(dāng)鏈被穩(wěn)定化1個核苷酸（～3-5埃）時的主要電流。在底物存在下(小圖iv)，～25pA水平被穩(wěn)定化，證實了(iii)中的預(yù)測。在(iv)中偶發(fā)的從25pA向31pA的噪音擾動證實了傳感器中先前單體一個或多個單體的身份。圖9c：這個軌跡顯示了納米孔中由phi29DNA聚合酶催化的DNA模板的復(fù)制和伴隨的1nt移動。DNA模板中的單個無堿基報告者導(dǎo)致大的電流動態(tài)范圍。這里，催化僅在存在每種dATP,dCTP,dTTP各100μM，但僅有1μMdGTP的條件下發(fā)生。一些狀態(tài)之間截然不同的閃爍(flicker)是由于，當(dāng)模板中的dC單體到達(dá)phi29DNA聚合酶的催化結(jié)構(gòu)域但無法摻入dG核苷酸，因此返回到先前狀態(tài)，從而導(dǎo)致模板鏈發(fā)生3-5埃(1nt)的位移所導(dǎo)致的。如在(b)中一樣，閃爍預(yù)示下一個穩(wěn)定的振幅。這在位置i,ii和iii中被突出顯示。注意在這些位置處，閃爍圍繞電流平均值是不對稱的。圖9c：這個軌跡顯示了我們預(yù)測后隨的離子電流振幅的能力對于所有DNA模板均是有效的。在該實例中，催化在存在dATP,dCTP,dGTP各100μM，但僅有1μMdTTP的條件下發(fā)生。當(dāng)phi29DNA聚合酶試圖在催化結(jié)構(gòu)域中添加相對于模板dA的dT時，在(i)處出現(xiàn)23pA向22pA的閃爍。添加dT失敗導(dǎo)致模板在180mV負(fù)載下返回到其先前狀態(tài)(距離1nt)。最終（ii，紅色箭頭）dT得以添加，使得電流穩(wěn)定在22pA，從而允許模板進(jìn)一步前進(jìn)。實施例XII：DNA通過納米孔的速度的降低我們已發(fā)現(xiàn)phi29DNA聚合酶(DNAP)與單鏈DNA(ss-DNA)結(jié)合會顯著降低ss-DNA在180mV施加電勢下穿過α-溶血素納米孔的速度。單鏈DNA以接近1個核苷酸/1-100ms的速度通過phi29DNAP和α-溶血素納米孔。圖10a顯示了典型的具有跨膜電勢差的納米孔。圖10b顯示了與短寡核苷酸探針雜交的實驗多核苷酸ss-DNA。在該實例中，‘X’代表無堿基核苷酸。圖10c圖示了不存在phi29DNAP時的一個典型循環(huán)，其代表了與ss-DNA部分雜交的寡核苷酸的行為，并顯示了跨膜(film)或膜(membrane)的電流的伴隨變化。在該實例中，兩條鏈均通過α-溶血素。圖10d圖示了，在存在phi29DNAP時，ss-DNA靶序列被順次通過α-溶血素納米孔，但是寡核苷酸反復(fù)地從ss-DNA去雜交，而ss-DNA保持在納米孔的相同位置處，直至所有寡聚體解離，然后ss-DNA可以自由通過。相關(guān)電流圖顯示了相關(guān)步驟（步驟(ii)至步驟(v)）中電流的峰。實施例XIII：保護(hù)引物DNA免于phi29DNAP活性我們發(fā)現(xiàn)，通過在引物模板連接點附近結(jié)合經(jīng)過修飾的DNA寡聚體，可以保護(hù)引物DNA免于phi29DNAP的功能。Phi29結(jié)合于寡聚體5′-端，并且用180mV施加電勢將該復(fù)合體捕獲在α-溶血素納米孔上，可以除去寡聚體，并將phi29置于引物末端，之后可以發(fā)生DNA復(fù)制。圖11a圖示了典型的寡核苷酸與靶DNA的結(jié)合；‘X’代表無堿基核苷酸，‘S’代表C3(CPG)間隔物。圖11b圖示了不存在dNTP和Mg2+(上面部分)或存在dNTP和Mg2+(下面部分)時明顯不同的信號電流。實施例XIV：使用登記寡聚體(RegistryOligomer)控制Phi29DNAP沿著ss-DNA底物的結(jié)合位置我們發(fā)現(xiàn)，phi29DNAP能夠結(jié)合并沿著ss-DNA移動。我們使用登記寡聚體——一種經(jīng)過修飾的DNA寡聚體——控制phi29DNAP在ss-DNA上何處結(jié)合并坐落。使用180mV施加電勢將這些DNAP-DNA復(fù)合體捕獲在α-溶血素納米孔上可以除去寡聚體，并允許s-DNA轉(zhuǎn)位通過phi29DNAP和α-溶血素。圖12a圖示了典型的登記寡核苷酸與靶DNA的結(jié)合；‘X’代表無堿基核苷酸。圖12b圖示了當(dāng)存在phi29DNAP時作用于α-溶血素納米孔上的多核苷酸復(fù)合體的典型循環(huán)。實施例XV：保護(hù)模板3′端免于消化我們發(fā)現(xiàn)，具有3′-5′核酸外切酶的DNA聚合酶能夠消化模板DNA的3′端。該方法使用引物DNA5′端保護(hù)模板3′端免于被DNA聚合酶(DNAP)消化。圖13A顯示了在α-溶血素納米孔處使用phi29DNAP的典型結(jié)果。圖13B顯示，該方法可以用于ss-DNA和封閉寡聚體(i)，ss-DNA和具有第二引物結(jié)合的封閉寡聚體(ii)，和自身形成發(fā)夾環(huán)的ss-DNA(iii)，進(jìn)一步顯示多核苷酸的長度可以長達(dá)48kb，這是本發(fā)明的另一個優(yōu)點。實施例XVI：使用稀的dNTP底物比例在納米孔上進(jìn)行DNA聚合酶指導(dǎo)的DNA測序在本實驗中，我們使用酶指導(dǎo)的DNA合成對經(jīng)過修飾的DNA模板的短(～20聚體)片段通過納米孔進(jìn)行了測序。這里，我們用180mV施加電壓將被phi29DNAP結(jié)合的引物/模板(p/t)DNA捕獲在納米孔上(圖14a,ii)。通過結(jié)合于引物/模板連接點附近的經(jīng)修飾DNA鏈（紅色）保護(hù)引物鏈免于酶指導(dǎo)的DNA合成。模板鏈具有5個無堿基殘基（紅色圓圈），在它們穿過納米孔時發(fā)揮報告鏈移動的報告者的作用，。DNA-酶復(fù)合體的捕獲將通過納米孔的離子電流從60pA減小到～24pA(圖14a-b,ii)。施加電壓使模板緩慢地向前步進(jìn)通過納米孔，去除經(jīng)修飾的鏈并激活p/tDNA以供合成。這被模板中的5個無堿基殘基（紅色圓圈）穿過納米孔時電流中的35pA峰所報告（圖14a-b,ii-iv)。然后DNA合成啟動，其以更快的速度將模板沿著相反的方向步進(jìn)通過納米孔，導(dǎo)致再次出現(xiàn)35pA的離子電流峰(圖14a-b,iv-vi)。在添加25個核苷酸后，當(dāng)5個無堿基殘基進(jìn)入酶活性位點時，DNA合成停止。隨著DNA模板將25個堿基步移向前然后返回通過納米孔，報告了33個離散的離子電流振幅（描點于圖14c中）。這些振幅圍繞指示DNA合成開始的25pA中點（箭頭，位置0）對稱分布。DNA合成速度，在位置0-16報告，可以通過反應(yīng)中dNTP底物的濃度加以條件。例如，當(dāng)[dNTP]=100μM時，大約每20毫秒向引物鏈添加一個dNTP，當(dāng)[dNTP]=1μM時，大約每2秒添加一個dNTP，反應(yīng)時間相差100倍。當(dāng)向納米孔反應(yīng)添加100nM的一種dNTP(例如dTTP)和100μM所有其它dNTP(dATP,dCTP和dGTP)時，添加每個dTTP的時間大約比任何其它dNTP的添加長1,000倍。因此，報告的離子電流信號會停止在圖14c的每個位置0-16處(其指示dTTP向引物鏈的添加)。當(dāng)進(jìn)行一系列4個實驗時，其中在每個實驗中獨特的一種dNTP是稀的，就可以分辨添加到模板鏈上的一系列dNTP，由此可以對未知的模板DNA進(jìn)行測序。圖14d-g總結(jié)了一系列4個實驗的結(jié)果，其中向納米孔反應(yīng)中添加了100nM的dTTP(圖14d),dCTP(圖14e),dGTP(Fig,14f)或dATP(圖14g)以及各100mM的其它三種dNTP。在添加每種稀釋dNTP期間，報告離子電流或者停止在穩(wěn)定的位置，或者在兩個位置之間波動。在電流在兩個位置之間波動的情況下，將第二個位置標(biāo)記為停止位置。使用這個標(biāo)準(zhǔn)，我們能夠通過閱讀停止的序列重建模板DNA序列，0=C.0-1(1)=T,1-2(2)=A,和2=T,2-3(3)=C,和3=A,3-4(4)=C和4=T,4-5(5)=C,5-6(6)=T,6-7(7)=A,7-8(8)=G,8-9(9)=C,10=T,10-11(11)=A,11-12(12)=C,12-13(13)=T,14=A,14-15(15)=C?？傊?，模板序列被重建為CTATCACTCTAGACT*ACT*AC。兩個dT（在這里用星號標(biāo)記）沒有被檢測，因為這些位置的報告振幅與序列中先前dT的振幅相同。這些數(shù)據(jù)顯示，我們能夠精確測序經(jīng)過修飾的模板鏈中的短DNA插入。實施例XVII：納米孔上電壓激活的DNA向前和向后步移圖15b圖示了被設(shè)計來與phi29DNAP一起使用的封閉寡聚體的特征。DNA底物是一種23聚體引物，其與合成的79聚體DNA模板退火。為了保護(hù)體相中DNA引物免于phi29DNAP依賴的延伸和消化，將封閉寡聚體立即退火到DNA引物/模板連接點附近。每個封閉寡聚體包括與模板鏈互補的～25nt(圖15b(i))。在一個實例中(圖15b(ii))，封閉寡聚體的5′核苷酸與引物的3′端鄰接，形成缺口(nick)。在另一個實例中(圖15b(iii))，兩個吖啶殘基附著在封閉寡聚體的5′端。這些吖啶中的一個取代核苷酸，并與引物3′端鄰接；另一個是添加的5′-突出(overhang)，其被認(rèn)為會插入到引物鏈內(nèi)。每個封閉寡聚體均附加有一個3′-C3間隔物(S)，隨后是7個無堿基殘基（顯示為‘Xs’）。該附加的片段具有兩種功能：保護(hù)封閉寡聚體免于被phi29DNAP核酸外切；和當(dāng)DNA/phi29DNAP復(fù)合體被施加電壓拉入納米孔時，方便封閉寡聚體的除去。圖15c圖示了使用這些封閉寡聚體對DNA引物的保護(hù)。DNA底物在23°C的納米孔緩沖液(+10mMMg2+)中溫育5個小時。隨后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行分析。在沒有封閉寡聚體時，phi29DNAP消化DNA引物鏈(-dNTP,泳道3)或延伸它們(+dNTP,泳道4)。相反，當(dāng)通過任一種封閉寡聚體構(gòu)建體進(jìn)行保護(hù)時，引物鏈既沒有被phi29DNAP消化(-dNTP,泳道6和9),也沒有被延伸(+dNTP,泳道7和10)。我們的下一個目標(biāo)是從被捕獲在納米孔上的每DNA模板上除去封閉寡聚體。我們最初考慮了一種已經(jīng)證實的策略，其中使用主動電壓控制將封閉寡聚體從DNA模板解下，隨后通過電壓極性反轉(zhuǎn)驅(qū)動新暴露的DNA引物-模板連接進(jìn)入順室，并“釣取”聚合酶。然而我們發(fā)現(xiàn)，主動控制對于本應(yīng)用而言不是必需的：當(dāng)向納米孔浴中添加phi29DNAP時，它與體相中的DNA底物形成穩(wěn)定的復(fù)合體，但是由于封閉寡聚體的存在，其不能被酶修飾（圖19）。我們利用這個發(fā)現(xiàn)預(yù)先結(jié)合，隨后在納米孔處激活DNA底物，然后測量各個與聚合酶結(jié)合的DNA模板的伴隨復(fù)制（圖16）。我們使用的DNA底物為79聚體模板，在相對于n=0位置的位置+25至+29處帶有5個無堿基殘基（圖16a）。該無堿基插入物在鏈移動通過α–HL孔期間發(fā)揮離子電流報告者的作用。將該DNA模板與一個23聚體引物退火，該引物的3′端被上述的封閉寡聚體之一保護(hù)（圖15b(iii)）。圖16b顯示了來自代表性實驗中200個復(fù)制事件的典型離子電流軌跡。DNA模板的捕獲(圖16b(i))導(dǎo)致一個23-24pA離子電流，其持續(xù)數(shù)秒(圖16b(ii))。隨后，在持續(xù)的180mV負(fù)載下，該離子電流逐步通過一系列離散的離子電流水平，穿越35pA的最大值(圖16b(iii))，之后下降到22pA，并穩(wěn)定在典型的25pA振幅處(圖16b(iv))。當(dāng)?shù)竭_(dá)25pA振幅時，離子電流反轉(zhuǎn)方向并返回35pA峰(圖16b(v))，其速度大約是第一次峰穿越速度的10倍，然后停止于24pA(圖16b(vi))。我們解釋該模式的模型包括圖16c中圖解的5個連續(xù)階段：i)開放通道；ii)納米孔捕獲與封閉寡聚體結(jié)合的聚合酶-DNA復(fù)合體；iii)通過施加電壓使封閉寡聚體機械解鏈，并使DNA模板步進(jìn)通過納米孔。這在無堿基插入通過主孔縊痕(constriction)時產(chǎn)生第一個35pA電流；iv)釋放封閉寡聚體，從而暴露phi29DNAP催化位點內(nèi)的DNA引物的脫氧核糖末端；v)通過phi29DNAP進(jìn)行DNA復(fù)制，其使模板沿著相反方向步進(jìn)通過納米孔，產(chǎn)生第二個35pA電流峰；vi)當(dāng)模板鏈的無堿基殘基到達(dá)phi29DNAP催化位點時，DNA復(fù)制停止。該模型做出了兩個預(yù)測。第一，因為穿越第二個35pA離子電流峰需要DNA復(fù)制，所以該過程在沒有關(guān)鍵dNTP底物時應(yīng)當(dāng)會停止。附件中描述了與這一預(yù)測一致的結(jié)果（圖18）。第二，我們的模型預(yù)測，進(jìn)行通過假定復(fù)制依賴性的峰應(yīng)當(dāng)會受到DNA引物末端組成的影響。尤其是，用2′,3′-二脫氧胞苷單磷酸(ddCMP)引物末端代替2′-脫氧胞苷單磷酸(dCMP)引物末端會延遲第二個35pA電流峰的出現(xiàn)。這個預(yù)測也被證明是正確的（圖16d）。使用ddCMP修飾的引物，與對照中一樣，第35pA峰由于封閉寡聚體的機械解鏈而被穿越，但是離子電流隨后在25pA停止數(shù)秒鐘（箭頭，位置0）。最后，觀察到第二個35pA峰的穿越。該延遲和恢復(fù)是由于末端ddCMP被phi29DNAP核酸外切酶除去，隨后在dGMP核苷酸相鄰的新暴露的3′-OH處開始鏈延伸。從這些實驗，我們推斷，phi29DNAP能夠用于控制單個DNA模板以單個核苷酸的精度向前和向后步進(jìn)通過α-HL孔。然而，對于納米孔DNA測序，需要確定這一控制過程的誤差率。換言之，當(dāng)單個DNA分子步進(jìn)通過孔時，由于倒滑(backsliding)（對相同核苷酸位置檢查超過1次）或由于向前跳躍（遺漏核苷酸位置）導(dǎo)致的不能登記正確核苷酸的概率如何？為了解決這個問題，我們使用一個標(biāo)準(zhǔn)振幅圖來檢測早前總結(jié)的200個轉(zhuǎn)位事件的精度（圖16）。該標(biāo)準(zhǔn)是這樣建立的：首先從X個隨機選取的軌跡構(gòu)建組成電流振幅系列（圖17a,b）。解析了33個可重復(fù)的振幅，其圍繞25pA中點(位置0)對稱。當(dāng)納米孔緩沖液中一次將一種dNTP底物降低到100nM而所有其它dNTP保持在200uM時，通過測量催化期間的電流振幅暫停，對該圖譜的精度進(jìn)行獨立的確認(rèn)（圖18）。這些實驗的結(jié)果總結(jié)在圖17b中，其中字母G、A、T和C指示phi29DNAP聚合酶催化結(jié)構(gòu)域中的DNA模板堿基，其中暫停與給定的離子電流水平相關(guān)。在一些實例中，多于一個字母被指定給同一個振幅，這是因為順序的模板位置給出了相同的離子電流值。因此，所有25個模板核苷酸位置均在組成圖譜的催化驅(qū)動側(cè)的16種離子電流振幅中得到了反映。我們接著確定在其它190個DNA模板來回穿越α-HL孔時，每個標(biāo)準(zhǔn)振幅位置被跳過或重復(fù)的頻率（圖18c）。在該分析中，我們使用3ms作為我們的最小持續(xù)時間截止限（cutoff）。當(dāng)前后兩個方向均同時被考慮時，它也可以有效地計算對每個捕獲鏈產(chǎn)生核苷酸登記誤差的概率。因此，圖18d顯示了離子電流系列中遺漏或重復(fù)兩個相應(yīng)位置（例如位置-15和15）的頻率。平均而言，分別有5%和2%的機會遺漏或重復(fù)兩個相應(yīng)振幅。最后，我們修飾了封閉寡聚體以提高通量。這是通過將封閉寡聚體的結(jié)合序列從25個核苷酸減少到15個核苷酸實現(xiàn)的（見圖19），其在體相中提供了同等的p/tDNA保護(hù)（見圖19），并允許更快地在納米孔上除去封閉寡聚體，從而激活p/tDNA。使用這種優(yōu)化的封閉寡聚體，在單個納米孔上通過3.8小時的實驗處理了總共500個分子（～130個DNA模板/小時）。實施例XVIII：其它酶研究FPGA/FSM納米孔系統(tǒng)還可用于其它的酶研究。在捕獲DNA/酶復(fù)合體時施加電壓斜坡(voltageramps)，能夠產(chǎn)生數(shù)據(jù)，使用電壓力譜計算鍵能景觀圖(bondenergylandscape)。另外，DNA與孔的相互作用能夠用施加電壓的反饋控制加以表征。酶催化的調(diào)節(jié)可以通過向占據(jù)孔的DNA施加拉力，抵消酶的持續(xù)進(jìn)行力，來實現(xiàn)。實施例XIX：基因組DNA的分離通過肺導(dǎo)管從患者收集血液樣品（2-3ml）并在含EDTA的試管中保存于-80°C，直至使用。使用DNA分離試劑盒按照制造商的使用說明(PUREGENE,GentraSystems,MinneapolisMN)從血液樣品提取基因組DNA。DNA純度用Beckman分光光度計測量260與280nm下吸光度的比值(1cm光程;A260/A280)來確定。實施例XX：SNP鑒定使用針對該區(qū)設(shè)計的引物通過PCR從患者DNA樣品擴增基因區(qū)。PCR產(chǎn)物用上面所述的方法進(jìn)行測序。在序列軌跡中鑒定的SNP用Phred/Phrap/Consed軟件加以確認(rèn)，并與NCBISNP數(shù)據(jù)庫中保存的已知SNP進(jìn)行比較。實施例XXI：cDNA文庫構(gòu)建使用從哺乳動物組織分離的RNA構(gòu)建cDNA文庫。使用POLYTRON勻漿機(BrinkmannInstruments,WestburyN.J.)在異硫氰酸胍溶液中將冷凍組織勻漿和裂解。裂解物在5.7MCsCl保護(hù)墊(5.7MCsCl)上在L8-70M超速離心機(BeckmanCoulter,FullertonCalif.)中使用SW28轉(zhuǎn)子在室溫下以25,000rpm離心18個小時。RNA用pH4.7酸性苯酚抽提，用0.3M醋酸鈉和2.5倍體積乙醇沉淀，重懸浮在無RNA酶水中，并在37°C用DNA酶處理，如前所述重復(fù)RNA提取和沉淀。mRNA用OLIGOTEX試劑盒(Qiagen,ChatsworthCalif.)分離，并用于構(gòu)建cDNA文庫。在SUPERSCRIPT質(zhì)粒系統(tǒng)(Invitrogen)中根據(jù)推薦的操作流程對mRNA進(jìn)行處理。cDNA在SEPHAROSECL4B柱(APB)上進(jìn)行分離，將超過400bp的cDNA連接在表達(dá)質(zhì)粒中。隨后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。實施例XXII：探針標(biāo)記和雜交分析從生物來源分離核酸，并用作其中一種如下方法的標(biāo)準(zhǔn)雜交規(guī)程的底物。靶核酸混合物，其是基因組DNA的限制性消化物，通過在1xTAE[Tris-乙酸-乙二胺四乙酸(EDTA)]電泳緩沖液中電泳通過0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，并使用20x咸檸檬酸鈉(SSC)通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。或者，靶核苷酸單獨地與載體連接并插入到細(xì)菌宿主細(xì)胞，從而形成文庫。靶核苷酸通過如下之一的方法排列在基底(substrate)上。在第方法中，含有單個克隆的細(xì)菌細(xì)胞被機器人拾取并排列在尼龍膜上。將膜置于細(xì)菌生長培養(yǎng)基上，含有羧芐青霉素的LB瓊脂，并在37°C溫育16個小時。將細(xì)菌克隆變性、中和、并用蛋白激酶K消化。在STRATALINKERUV-交聯(lián)劑(Stratagene)中將尼龍膜暴露于UV輻射，使DNA與膜交聯(lián)。在第二個方法中，使用與插入物兩側(cè)載體序列互補的引物通過30個循環(huán)PCR從細(xì)菌載體擴增靶核酸。擴增的靶核酸用SEPHACRYL-400球珠(AmershamPharmaciaBiotech)純化。純化的靶核酸被機器人排列到玻璃顯微片(CorningScienceProducts,CorningNY)上?；惹坝?.05%氨丙基硅烷(aminopropylsilane)(Sigma-Aldrich,St.LouisMo.)涂布，并在110°C處理。在STRATALINKERUV-交聯(lián)劑(Stratagene)中將排列的玻璃滑片（微陣列）暴露于UV輻射。cDNA探針從mRNA模板制成。5微克mRNA與1μg隨機引物(LifeTechnologies)混合，在70°C溫育10分鐘，并凍干。將凍干的樣品重懸浮在50μl含有dNTP混合物,[α-32P]dCTP,二巰基乙醇和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Stratagene)的1x第一鏈緩沖液(cDNA合成系統(tǒng);LifeTechnologies)中，在42°C溫育1-2個小時。溫育后，探針用42μldH2O稀釋，加熱到95°C3分鐘，并在冰上冷卻。探針中的mRNA通過堿降解加以除去。將探針中和，并用PROBEQUANTG-50微柱(AmershamPharmaciaBiotech)除去降解的mRNA和未合并的核苷酸。探針可以用熒光標(biāo)記物，Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(AmershamPharmaciaBiotech)，取代放射性核苷酸[32P]dCTP進(jìn)行標(biāo)記。雜交在含有0.5M磷酸鈉(pH7.2),7%SDS,和1mMEDTA的雜交緩沖液中在65°C下進(jìn)行。底物在雜交緩沖液中于65°C溫育至少2個小時后，緩沖液用10ml含有探針的新鮮緩沖液代替。在65°C溫育18小時后，除去雜交緩沖液，隨后在65°C在強度遞增的條件下清洗底物，最高達(dá)40mM磷酸鈉、1%SDS、1mMEDTA。為了檢測由雜交在膜上的放射性標(biāo)記探針產(chǎn)生的信號，將底物暴露于PHOSPHORIMAGER盒(AmershamPharmaciaBiotech)，并用IMAGEQUANT數(shù)據(jù)分析軟件(AmershamPharmaciaBiotech)對圖像進(jìn)行分析。為了檢測由雜交在微陣列上的熒光探針產(chǎn)生的信號，用激光共聚焦顯微鏡對底物進(jìn)行檢查，收集圖像，并用基因表達(dá)分析軟件進(jìn)行分析。實施例XXIII：互補多核苷酸使用與多核苷酸或其片段互補的分子檢測、降低或抑制基因表達(dá)。盡管描述的是使用包含大約15-大約30個堿基對的寡核苷酸，但是相同的程序可以用于更大或更小的片段或其衍生物（例如肽核酸,PNAs)。寡核苷酸用OLIGO4.06引物分析軟件(NationalBiosciences)和SEQIDNOs:1-163進(jìn)行設(shè)計。為了通過阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄，設(shè)計互補寡核苷酸與最獨特的5'序列結(jié)合，最優(yōu)選地位于開放閱讀框起始密碼子之前大約500-10個核苷酸之間。為了抑制翻譯，設(shè)計阻止核糖體與編碼哺乳動物蛋白質(zhì)的mRNA結(jié)合的互補寡核苷酸。實施例XXIV：特異抗體的生產(chǎn)使用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化包含多核苷酸與結(jié)合蛋白的復(fù)合體的偶聯(lián)物，并用于免疫小鼠或家兔。使用下面的規(guī)程生產(chǎn)抗體。在完全弗氏佐劑中用復(fù)合體免疫家兔。之后在不完全弗氏佐劑中以一定間隔重復(fù)免疫。對于小鼠最少7周，對于家兔最少12周后，抽取抗血清，并檢測抗肽活性。檢測涉及將肽結(jié)合于塑料制品(plastic)，用1%牛血清白蛋白封閉，與兔抗血清反應(yīng)，清洗，與放射性碘標(biāo)記的羊抗兔IgG反應(yīng)。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法確定抗體滴度和復(fù)合體形成量。實施例XXV：篩選與多核苷酸或蛋白偶聯(lián)物特異結(jié)合的分子多核苷酸或其片段分別用32P-dCTP,Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(AmershamPharmaciaBiotech)或用BIODIPY或FITC(MolecularProbes,EugeneOR)標(biāo)記。類似地，包含多核苷酸及其結(jié)合蛋白的復(fù)合體的偶聯(lián)物可以用放射性核苷酸或熒光探針標(biāo)記。將先前排列在基底上的候選分子或化合物文庫在標(biāo)記多核苷酸或蛋白的存在下進(jìn)行溫育。在用于多核苷酸或氨基酸分子的條件下溫育之后，清洗基底，并分析基底上任何保留標(biāo)簽(其指示特異結(jié)合或復(fù)合體形成)的位置，并鑒定配體。將使用不同濃度多核苷酸或蛋白獲得的數(shù)據(jù)用于計算標(biāo)記多核苷酸或蛋白與結(jié)合分子之間的親和力。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會意識到，在不背離本發(fā)明范圍和精神的前提下可以構(gòu)想出對上文描述的實施例的各種修改和修飾。根據(jù)在這里描述的本發(fā)明說明書，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠在多種多樣的具體的形式中采用本領(lǐng)域中已知的其它合適技術(shù)和方法。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可以用與這里的具體描述不同的方式來實施。上面的說明書意圖舉例說明，而沒有限制性。在回顧上面的說明時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明了許多其它的實施方案。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)參考隨附的權(quán)利要求，以及與這些權(quán)利要求所提出的等同的全部范圍加以確定。