本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于血管鈣化診斷的血漿標(biāo)志物、引物對(duì)、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：
血管鈣化(Vascularcalcification)是糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化性血管病變及其他血管損傷等疾病普遍存在的病理改變，是心腦血管疾病高發(fā)病率及高死亡率的重要因素之一，甚至被認(rèn)為是一個(gè)精確預(yù)測(cè)心血管不良事件的指標(biāo)。以往認(rèn)為血管鈣化是鈣鹽在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)的被動(dòng)沉積。然而，近年發(fā)現(xiàn)血管鈣化是一個(gè)主動(dòng)的、高度可調(diào)的生物學(xué)過(guò)程，其過(guò)程類似于骨形成。血管平滑肌細(xì)胞作為心血管系統(tǒng)主要的構(gòu)成細(xì)胞，其由收縮表型向成骨細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)變，是血管鈣化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵病理過(guò)程。目前臨床上對(duì)于血管鈣化尚缺乏安全有效的治療方法。通過(guò)冠脈造影術(shù)和雙能源CT掃描技術(shù)等影像學(xué)檢測(cè)方法確認(rèn)血管鈣化病灶時(shí)，患者的血管鈣化情況一般已經(jīng)較為嚴(yán)重，不易根治，且費(fèi)用較為昂貴。即使新近發(fā)展起來(lái)的旋磨切除術(shù)或切割球囊血管成形術(shù)對(duì)已形成的鈣化病灶進(jìn)行治療的效果也不甚理想。因此，尋找有效、特異的早期診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，對(duì)臨床及時(shí)預(yù)防和治療血管鈣化具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是長(zhǎng)度約18～22個(gè)氨基酸的小分子非編碼調(diào)控RNA，它通過(guò)與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′UTR)相互配對(duì)結(jié)合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。由于血管鈣化與骨形成有相似的機(jī)制，同時(shí)與血管的氧化應(yīng)激、血管損傷、血管平滑肌表型改變、血脂代謝的異常及動(dòng)脈粥樣硬化等密切相關(guān)，故認(rèn)為參與調(diào)節(jié)血管損傷、血管平滑肌表型改變及動(dòng)脈粥樣硬化的miRNA，尤其是調(diào)節(jié)骨形成的miRNA極可能參與血管鈣化的發(fā)生。此外，Chen等的研究已初步證實(shí)miRNAs可作為糖尿病等疾病的血漿生物學(xué)標(biāo)志物(ChenX,etal,CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellRes,2008,18(10):997-1006)，這也使血漿miRNAs作為疾病的診斷標(biāo)記分子應(yīng)用于臨床成為可能。研究表明miR-32-5p在調(diào)節(jié)骨再生方面具有重要作用(PalmieriA,etal，Medporregulatesosteoblast'smicroRNAs[J].BiomedMaterEng,2008.18(2):91-97)，它在血管鈣化過(guò)程中可能同樣起到關(guān)鍵性作用。目前尚無(wú)將血漿miR-32-5p作為血管鈣化相關(guān)標(biāo)志物的報(bào)道，我們首先發(fā)現(xiàn)miR32-5p在血管鈣化血漿中的高表達(dá)，可以為開(kāi)發(fā)試劑盒作為臨床依據(jù)。如果能檢測(cè)出miR-32-5p在血管鈣化患者血漿中的顯著性表達(dá)差異，將對(duì)血管鈣化的臨床早期診斷和治療產(chǎn)生重要的指導(dǎo)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于血管鈣化診斷的血漿標(biāo)志物、引物對(duì)、試劑盒及應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：所述用于血管鈣化診斷的血漿標(biāo)志物為miR-32-5p，序列如SEQIDNO.1所示，該標(biāo)志物可用于制備血管鈣化診斷試劑。檢測(cè)上述標(biāo)志物的引物對(duì)包括miR-32-5p的PCR正向引物和PCR通用反向引物；所述miR-32-5p的PCR正向引物序列如SEQIDNO.2所示，所述PCR通用反向引物序列如SEQIDNO.3所示。血管鈣化診斷試劑盒中含有權(quán)利要求2所述的引物對(duì)。優(yōu)選地，所述試劑盒中還含有內(nèi)參miR-16的PCR正向引物；所述內(nèi)參miR-16序列如SEQIDNO.4所示，所述內(nèi)參miR-16的PCR正向引物序列如SEQIDNO.5所示。檢測(cè)上述標(biāo)志物的方法包括如下步驟：(1)提取miRNA；(2)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cNDA；(3)用上述試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增；(4)通過(guò)溶解曲線和擴(kuò)增曲線分析，2-ΔΔCT法進(jìn)行miR-32-5p的相對(duì)定量。發(fā)明人通過(guò)對(duì)比分析血管鈣化患者及非鈣化對(duì)照組血漿中的miR-32-5p的含量差異，發(fā)現(xiàn)miR-32-5p在血管鈣化患者血漿中的含量明顯高于對(duì)照組血漿，表明miR-32-5p與血管鈣化呈正相關(guān)，以miR-32-5p含量水平為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于血管鈣化診斷的檢測(cè)試劑盒，為早期診斷血管鈣化提供臨床依據(jù)。本發(fā)明首次對(duì)血管鈣化具有特異篩查價(jià)值的生物標(biāo)記物miR-32-5p，發(fā)現(xiàn)血漿miR-32-5p檢測(cè)可以用于血管鈣化患者診斷；通過(guò)血管鈣化相關(guān)的血漿標(biāo)志物miR-32-5p和診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，可以快速診斷血管鈣化病情并及時(shí)有效治療，也為發(fā)掘新型有效的小分子藥物靶標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)。附圖說(shuō)明圖1為血管鈣化患者與非鈣化對(duì)照組血漿中miRNA表達(dá)水平比較。圖2為血管鈣化患者與非鈣化對(duì)照組血漿中miRNA表達(dá)水平ROC曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：血漿miR-32-5p在血管鈣化患者與非鈣化對(duì)照組中的表達(dá)水平一、研究對(duì)象選擇2013年6月至2014年5月間南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈冠脈造影術(shù)和雙源CTC檢查確診冠脈鈣化的患者66例。排除既往有心肌梗死病史，冠狀動(dòng)脈或外周動(dòng)脈血運(yùn)重建病史者，肝腎功能不全、甲狀腺或腎上腺功能紊亂，鈣代謝異常，慢性感染(活動(dòng)性結(jié)核、COPD遷延期)、結(jié)締組織病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病或精神病及其他疾病的終末期等。根據(jù)冠脈CTA的Agatston法積分(CACS)分為冠脈鈣化組與對(duì)照組，其中冠狀動(dòng)脈鈣化積分等于0分患者即非冠脈鈣化組33例，而冠狀動(dòng)脈鈣化積分大于0分患者33例。研究過(guò)程中所涉及的資料收集及血樣采集均在研究對(duì)象知情同意下進(jìn)行。二、研究方法1.血漿收集所有納入觀察的患者均于術(shù)時(shí)抽動(dòng)脈血約3ml置于10mlEDTA-K2抗凝管。標(biāo)本采集后靜置30分鐘后，3000rpm離心10分鐘取上清液血漿分裝于EP管,置于-70℃低溫保存血漿。2.采用miRNA提取分離試劑盒提取血漿中miRNA(miRNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP501)(1)取200ul血漿加入等體積裂解液，振蕩器振蕩混勻30秒。室溫放置5分鐘。室溫12000rpm離心10分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移到新管中。(2)加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置5分鐘，取水相轉(zhuǎn)移至新管中。(3)量取轉(zhuǎn)移液，加入轉(zhuǎn)移液體積1/3的無(wú)水乙醇，混勻。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱miRspin，室溫放置2分鐘，室溫12000rpm離心30秒，離心后棄掉吸附柱miRspin，保留流出液。(4)量取流出液，緩慢加入流出液體積2/3體積的無(wú)水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱miRelute，室溫放置2分鐘，室溫12000rpm離心30秒，離心后棄掉流出液，保留吸附柱miRelute。(5)向吸附柱miRelute中加入500ul去蛋白酶MRD，室溫靜置2分鐘，室溫12000rpm離心30秒，棄廢液。(6)向吸附柱miRelute中加入600ul漂洗液RW，室溫靜置2分鐘，室溫12000rpm離心30秒，棄廢液。(7)重復(fù)步驟(5)。(8)將吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室溫12000rpm離心1分鐘，棄廢液。(9)將吸附柱miRelute轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-Free1.5ml離心管中，加入20ulRNase-Free雙蒸水，室溫靜置2分鐘，室溫12000rpm離心2分鐘，收集得到純凈的miRNA。3.采用Mir-XTMmiRNA第一鏈合成試劑盒(試劑盒購(gòu)自TAKARA公司,貨號(hào)638313)(1)在冰上預(yù)冷RNaseFree的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積10ul(2)移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，37℃反應(yīng)60分鐘，接著85℃反應(yīng)5分鐘，在所得的反應(yīng)液中加入90μl雙蒸水，即得到所需cDNA。4.熒光定量PCR反應(yīng)按照Mir-XTMmiRNAqRT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(試劑盒購(gòu)自TAKARA公司，貨號(hào)：638314)(1)熒光定量PCR反應(yīng)體系配制(2)擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置如下：Stage1：預(yù)變性95℃10秒Stage2：PCR反應(yīng)(40個(gè)循環(huán))95℃5秒60℃20秒Stage3：溶解曲線分析95℃60秒55℃30秒95℃30秒以SYBRGreen作為熒光標(biāo)記物，在ABI熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增miR-32-5p的正向引物序列如SEQIDNO.2(GGCGGCGGTATTGCACATTACTAA)所示，miR-32-5p的序列如SEQIDNO.1(UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA)所示，反向引物為通用反向引物，通用反向引物序列如SEQIDNO.3(GCGCAATGCATCGCATAGCAACTGT)所示。以miR-16作為內(nèi)參基因，內(nèi)參miR-16序列如SEQIDNO.4(UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)所示，內(nèi)參miR-16的PCR正向引物序列如SEQIDNO.5(GCGGCGGTAGCAGCACGTAAATA)所示，反向引物為SEQIDNO.3所示的通用反向引物。5.研究結(jié)果與分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)得的血漿miR-32-5p的表達(dá)量，用Ct32-5p表示，miR-16的表達(dá)量用Ct16表示。血漿miR-32-5p的相對(duì)表達(dá)量＝2﹣ΔΔCt，[ΔΔCt＝(Ct32-5p-Ct16)血管鈣化-(Ct32-5p–Ct16)對(duì)照]。結(jié)果如附圖1所示，與非鈣化對(duì)照組相比，血管鈣化患者血漿中miR-32-5p的含量明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miRNA引物探針信息及目標(biāo)序列如表1所示：表1.miRNA引物探針信息及其成熟序列實(shí)施例2：miR-32-5p對(duì)血管鈣化患者的診斷效果評(píng)價(jià)ROC曲線分析顯示，miR-32-5p作為生物標(biāo)記物對(duì)血管鈣化具有較高診斷價(jià)值(AUC為0.831)，詳細(xì)分析結(jié)果見(jiàn)表2。表2：ROC分析結(jié)果實(shí)施例3：血管鈣化診斷試劑盒檢測(cè)血漿miR-32-5p含量的血管鈣化診斷試劑盒組成如表3所示：表3血管鈣化診斷試劑盒的組成表3中，用于血管鈣化診斷的試劑盒中miR-32-5p的PCR正向引物序列如SEQIDNO.2所示，miR-16的PCR正向引物序列如SEQIDNO.5所示；相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑，如：逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，SYBR預(yù)混物，ROX染料，RNase-Free雙蒸水等，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的；另外還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品。