本發(fā)明涉及中藥有效成分的分離純化方法，具體為應(yīng)用高速逆流色譜分離功勞木中生物堿類化合物(藥根堿、小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿單體)的方法。技術(shù)背景功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.)Carr或細(xì)葉十大功勞Mahoniafortunei(Lindl.)Fedde的干燥莖，其性味苦，寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。主治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、目赤腫痛、胃火牙痛，瘡癤癰腫。功勞木中生物堿類化合物主要為異喹啉類生物堿，包括藥根堿、巴馬汀和小檗堿，研究結(jié)果表明異喹啉類生物堿可以抑制自由基和脂氧合酶活性從而達(dá)到抗炎的作用。此外，生物堿的抗氧化能力還與其抗病性、抗逆性及延緩衰老有關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究表明，功勞木還具有一定的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的作用?，F(xiàn)有關(guān)于功勞木中生物堿類單體化合物分離制備的文獻(xiàn)方法主要采用反復(fù)硅膠柱層析和SephadexLH-20凝膠柱色譜，其局限性是費時費力、污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復(fù)柱層析對樣品有不可逆性吸附作用，分離得到生物堿單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為制備量大的分離技術(shù)。高速逆流色譜(High-speedCounter-currentChromatography，HSCCC)是近30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問題，使用其它液相色譜法進(jìn)行制備型分離時，其分配效率會顯著降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰型分辨度，分離量大、樣品無損失、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。高速逆流色譜能直接進(jìn)大量粗提樣品或合成混合物，分離結(jié)果能達(dá)到相當(dāng)高的純度，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。雖然現(xiàn)有技術(shù)中有利用高速逆流色譜分離中藥中生物堿的報道，本領(lǐng)域公知，高速逆流色譜分離中所用到的溶劑系統(tǒng)是影響分離結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，常用到的溶劑有甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、氯仿、乙腈等，每一溶劑系統(tǒng)中所使用的溶劑至少為兩種，不同中藥成分所具有的成分，以及生物堿的種類和數(shù)量不一樣，中藥經(jīng)過提取得到的生物堿總樣的成分不同，所以針對不同的中藥如何選擇溶劑系統(tǒng)的溶劑種類、各溶劑之間的用量比例以及配合該溶劑系統(tǒng)選擇怎樣的流速、上樣量、轉(zhuǎn)速等等才能得到純度較高的生物堿單體是沒有參考價值的。非洲防己堿具有興奮子宮的作用，目前已知的來源為小檗科植物日本小檗BerberisthunbergiiDC根莖、毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch根莖、防己科植物黃藤FibraureatinetoriaLour根、非洲掌葉防己Jatrorrhizapalmata(DC.)Miers(J.columba.Miers)、罌粟科植物博克尼木BocconiafrutescesLinn葉、番荔枝科植物依南木EnantiachloranthaOliver根。目前，還沒有從功勞木中分離出非洲防己堿的有關(guān)報道，也沒有利用高速逆流色譜分離功勞木中生物堿的記載。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種應(yīng)用高速逆流色譜分離功勞木中生物堿類化合物的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種分離功勞木中生物堿類化合物的方法，應(yīng)用高速逆流色譜分離，所述分離中所用到的條件是：溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：0.5mol·L-1鹽酸溶液＝3.5-4.5:1-2:1.5-2.5(優(yōu)選：4:1.5:2)，高速逆流色譜儀柱體積為200-400(優(yōu)選300mL)，上樣量200-500(優(yōu)選300mg)，轉(zhuǎn)速300-1000rpm(優(yōu)選800rpm)，上相為固定相，下相為流動相，流速1.5-2.5mL/min(優(yōu)選2.0mL/min)，固定相保留率71.67％，檢測波長250-260nm(優(yōu)選254nm)。所述：功勞木中生物堿類化合物的提取方法：(1)采用乙醇對功勞木藥材進(jìn)行提取，將提取液真空濃縮至無醇味，得總提取物；(2)將總提取物調(diào)至酸性，石油醚萃取脫脂后，調(diào)整至堿性，攪拌沉淀，即為功勞木生物堿粗提物。應(yīng)用高速逆流色譜分離的具體步驟如下：(1)將溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相；(2)取功勞木生物堿粗提物溶解于體積比為1:1的上相和下相的混合液中待用，所述功勞木生物堿粗提物與混合液的用量關(guān)系為20:1(g/L)；(3)首先使半制備型高速逆流色譜儀進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以20mL·min-1流速灌滿色譜分離柱，停泵，開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，達(dá)到設(shè)定轉(zhuǎn)速時，設(shè)置流動相流速為1.5-2.5mL/min(優(yōu)選2.0mL/min)，開始泵流動相，達(dá)到流體動力學(xué)平衡后，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱，然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖接收目標(biāo)組分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥得固體粉末。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的方法制備成本低于現(xiàn)有技術(shù)，操作簡便，效率高，可以較大批量從中藥功勞木中，分離制備出純度大于96％的藥根堿、小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿單體化合物的分離制備方法，本發(fā)明首次從中藥功勞木中分離出非洲防己堿。附圖說明圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2為功勞木生物堿總樣分離的高速逆流色譜圖；圖3為生物堿總樣的高效液相色譜圖；圖4為藥根堿單體的高效液相色譜圖；圖5為小檗堿單體的高效液相色譜圖；圖6為巴馬汀單體的高效液相色譜圖；圖7為非洲防己堿單體的高效液相色譜圖；圖8為對比例1功勞木生物堿總樣分離的高速逆流色譜圖；圖9為對比例2功勞木生物堿總樣分離的高速逆流色譜圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例1如圖1功勞木中單體制備流程圖所示。取功勞木藥材2kg粉碎后用95％乙醇回流提取3次(每次2h)，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味。將上述濃縮后的提取液，加鹽酸調(diào)節(jié)pH＝3，石油醚萃取3～5次除去脂溶性成分，萃取后的水層加氨水調(diào)節(jié)pH＝9，過濾得沉淀10.6g，即為所需生物堿總樣。應(yīng)用高速逆流色譜分離純化功勞木生物堿總樣溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：0.5mol·L-1鹽酸溶液＝4:1.5:2，高速逆流色譜儀柱體積為300mL，上樣量300mg，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速2.0mL/min，固定相保留率71.67％，檢測波長254nm。具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相，取200mg功勞木生物堿粗提物溶解于5mL上相和5mL下相的混合物中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300mL)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以流速20mL·min-1灌滿色譜分離柱，停泵。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800rpm時，設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相，達(dá)到流體動力學(xué)平衡后，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖2)接收目標(biāo)成分，得藥根堿(15.1mg)，小檗堿(13.4mg)，非洲防己堿(8.6mg)，巴馬汀(17.3mg)和未知成分(13.2mg)，HPLC分析純度均為96％以上。利用高效液相色譜分析分離物，如圖3-圖7，液相條件：Kromasil100-5C18柱(4.6×250mmmm)，紫外檢測波長265nm，柱溫：25℃，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：10μL，流動相采用乙腈：鹽溶液(1％三乙胺溶液，用磷酸調(diào)pH＝3)＝25:75。結(jié)構(gòu)鑒定：對分離得到的生物堿應(yīng)用Agilent5973N質(zhì)譜儀和Varian600MHz核磁共振波譜儀分別進(jìn)行MS，1HNMR譜的測定，所得數(shù)據(jù)如下：藥根堿：UV(λmax,MeOH):264,345nm.PositiveESI-MSm/z338[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.86(1H,s,H-8),8.98(1H,s,H-13),8.19(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.01(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.69(1H,s,H-1),6.86(1H,s,H-4),4.91(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.09(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.94(3H,s,2-OCH3),3.14(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).小檗堿：UV(λmax,MeOH):263and346nm.PositiveESI-MSm/z336[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.90(1H,s,H-8),8.96(1H,s,H-13),8.21(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.01(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.80(1H,s,H-1),7.09(1H,s,H-4),6.18(2H,s,2,3-OCH2O),4.94(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.10(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.21(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).非洲防己堿：UV(λmax,MeOH):263,345nm.PositiveESI-MSm/z338[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.88(1H,s,H-8),8.82(1H,s,H-13),8.20(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.06(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.57(1H,s,H-1),7.06(1H,s,H-4),4.93(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.09(3H,s,10-OCH3),4.07(3H,s,9-OCH3),3.90(3H,s,3-OCH3),3.19(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).巴馬?。篣V(λmax,MeOH):272,345nm.PositiveESI-MSm/z352[M+H]+.1HNMR(DMSO-d6,600MHz)δppm:9.90(1H,s,H-8),9.08(1H,s,H-13),8.20(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.04(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.73(1H,s,H-1),7.10(1H,s,H-4),4.96(2H,t,J＝6.0Hz,H-6),4.10(3H,s,10-OCH3),4.08(3H,s,9-OCH3),3.94(3H,s,2-OCH3),3.88(3H,s,3-OCH3),3.23(2H,t,J＝6.0Hz,H-5).對比例1：二氯甲烷：甲醇：0.5mol.L-1鹽酸溶液＝5:2:3，流速：2mL.min-1，進(jìn)樣量：200mg，固定相保留：60％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實施例1中的一樣。對比例2：二氯甲烷：甲醇：mol.L-1鹽酸溶液＝4:1.5:2，流速：2mL.min-1，進(jìn)樣量：200mg，固定相保留：66.7％，轉(zhuǎn)速：800rpm。由圖8和圖9可以看出，對比例1與實施例1是在溶劑系統(tǒng)中將三氯甲烷換成了二氯甲烷，并且將溶劑系統(tǒng)的比例發(fā)生了改變，就導(dǎo)致各有效成分之間不能分離，對比例2僅僅是在溶劑系統(tǒng)中將三氯甲烷換成了二氯甲烷，溶劑系統(tǒng)的比例都沒有改變，同樣導(dǎo)致了各有效成分之間不能分離。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)只有本發(fā)明的實驗條件才能將功勞木中的生物堿很好的分離出來，并且得到非洲防己堿。上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。