專利名稱：一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，具體地講，涉及一種甲基 睪酮分子印跡聚合物的沉淀聚合制備方法。
背景技術(shù)：
甲基睪酮是一種人工合成的代謝類固醇，作為一種促生長劑，上個世紀一直廣泛 應(yīng)用于畜牧業(yè)與水產(chǎn)中。但是由于甲基睪酮代謝緩慢，蓄積性強，通過食物鏈進入人體，會 產(chǎn)生嚴重的毒副作用，諸如肝中毒，胎體中毒、致癌等。歐盟早在1988年就開始禁止使用 類固醇激素諸如甲基睪酮來飼養(yǎng)家畜。而在我國，從1999年起也已經(jīng)法令禁止使用甲基睪 酮作為促生長劑。但是到目前為止，仍有少數(shù)企業(yè)在違規(guī)使用。要徹底避免這種情況的發(fā) 生，除了從源頭上控制獸藥的生產(chǎn)和使用之外，及時準(zhǔn)確地檢測和有效富集畜禽產(chǎn)品中獸 藥殘留一直以來都是研究熱點。分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technology)的迅速發(fā)展始于上世紀90 年代，用于制備具有高親和性和選擇性的可以識別和結(jié)合目標(biāo)分子的特定受體，即分子印 跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)。由于孔穴對模板分子的記憶功能， MIPs對模板分子的親和力大大增強，表現(xiàn)出分子識別的能力。MIPs依靠形狀、大小和化學(xué) 功能基的分布對模板分子進行識別，類似于生物體系中酶對底物、抗體對抗原、受體對激素 的作用，具有專一選擇性。而且分子印跡聚合物具有制備簡單、成本低廉、使用壽命長等優(yōu) 點，并且比天然的生物分子具有更好的穩(wěn)定性，更良好的機械性能和高度的交聯(lián)性。更重要 的是，對于那些天然受體不存在或難以得到的目標(biāo)分子，用這種方法都可以量身定做。到目 前為止，有機小分子包括藥物分子、殺蟲劑、氨基酸、肽、核苷酸堿基、留族化合物及糖等的 印跡已經(jīng)取得成功；金屬和其他離子也可用作模板以使功能基具有特定的排布；而體積較 大的分子如蛋白質(zhì)、細胞等的印跡也已經(jīng)有報道。可以應(yīng)用到分子印跡技術(shù)中的目標(biāo)分子 非常多，這也是其發(fā)展如此迅速的原因之一。分子印跡聚合物以其優(yōu)越的分子識別性能被 廣泛應(yīng)用于分離領(lǐng)域，包括高效液相色譜(HPLC)、固相萃取(SPE)、毛細管電色譜(CEC)以 及生物傳感器、模擬抗體、模擬酶等方面，其識別過程具有預(yù)定性、特異性和實用性這三大 特點。與目前常用的固定相相比，具有更強的特異性，能夠更有效地識別特定分子。目前，關(guān)于甲基睪酮分子印跡聚合物及其制備方法尚未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，具有操作簡單、 重現(xiàn)性好、過程容易控制等優(yōu)點；所得到的分子印跡聚合物粒徑可控且大小均勻；該聚合 物對甲基睪酮具有良好的識別能力和選擇特性，并且有良好的結(jié)合能力和分離能力。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下—種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，包括如下步驟(1)將模板分子甲基睪酮與聚合單體以1 3-1 8的比例，加入致孔劑中，2_8°C下攪拌0. 5-3h ；其中，聚合單體可以為甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AA)或三氟甲基丙烯酸 (TFMAA)等；致孔劑可以為乙腈、甲醇或丙酮等中一種或幾種的溶液；致孔劑與甲基睪酮的 比例約為 50-500ml/mmol。(2)在步驟(1)的產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，熱引發(fā)聚合，取其沉淀；其中，交聯(lián) 劑可以為乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)或三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)中的一種 或其混合物；引發(fā)劑可以為偶氮二異丁腈(AIBN)或偶氮二異庚腈(ABVN)。交聯(lián)劑與甲基 睪酮比例為1 10-1 30，引發(fā)劑與甲基睪酮比例為40-100mg/mmol。在熱引發(fā)聚合前，致孔劑優(yōu)選分兩次加入，即當(dāng)所述步驟(1)中致孔劑與甲基睪 酮的比例為lO-lOOml/mmol時，步驟(2)中熱引發(fā)聚合前可再加入致孔劑，使其與甲基睪酮 的總比例為50-500ml/mmol。熱引發(fā)聚合的溫度一般為50-65°C，時間約為16_24h，聚合后，一般經(jīng)高速離心得 到沉淀。(3)步驟(2)中沉淀經(jīng)酸性有機溶劑提取去除模板分子后，再用純有機溶劑提取 以去除殘留的酸性物質(zhì)，即得產(chǎn)物。其中，酸性有機溶劑一般選用甲酸、乙酸或三氟乙酸 中的一種或幾種與甲醇的混合溶液，提取時間一般為12_24h ；所述的純有機溶劑可以為甲 醇、乙醇、乙腈或丙酮等中的一種或幾種，此處所述純有機溶劑是指甲醇、乙醇、乙腈或丙酮 等本身皆為純的該物質(zhì)。所制備的甲基睪酮分子印跡聚合物用掃描電鏡來進行表征，經(jīng)10000倍放大后可 以檢測出顆粒粒徑約為lOOnm-5 μ m,優(yōu)選為200nm-2 μ m ；經(jīng)BET氮氣吸附法進行測定，孔徑 為 15-25nm，優(yōu)選為 19_22nm ；比表面積為 10_100m2/g，優(yōu)選為 25-50m2/g。所述甲基睪酮分子印跡聚合物對模板分子及結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合作用通過平衡吸 附實驗來進行評價。首先配制不同濃度的甲基睪酮溶液，分別加入一定量的分子印跡聚合 物進行結(jié)合研究，得到結(jié)合量隨濃度的變化曲線后用Scatchard方程可以計算出最大結(jié)合 量Qmax及解離常數(shù)Kd，其中Qmax表示結(jié)合位點的最大表觀結(jié)合量，可以表明聚合物的結(jié)合能 力，數(shù)值越大，結(jié)合能力越強；而Kd表示結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)，可以表明聚合物的動力 學(xué)性質(zhì)。具體計算方法如下根據(jù)吸附前后溶液濃度的變化計算吸附量及靜態(tài)吸附分配系數(shù)。作Q對C的曲 線·Q = (C1-C2)Vs ‘ 1000/m式中Q——鍵合容量，μ mol · g—1 ；C1——模板分子的初始濃度，mmol · L—1 ；C2——模板分子的最終濃度，mmol · L—1 ；Vs——實驗溶液的體積，ml;m——分子印跡聚合物的質(zhì)量，mg。由聚合物的結(jié)合量繪制出等溫吸附曲線，聚合物的Q值隨著甲基睪酮濃度的增大 均有不同程度的增大。用于Scatchard 方程Q/C= (Qmax-Q)/Kd式中Q——鍵合容量，μ mol · g—1 ；
C——模板分子的平衡濃度，mmol · L—1 ；Kd——結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)，μ mol · πιΓ1 ；Qmax——結(jié)合位點的最大表觀結(jié)合量，μ mol · g—1。分別計算出甲基睪酮分子印跡聚合物及其空白聚合物的線性回歸方程。根據(jù)曲線 的斜率和截距求出，所述甲基睪酮分子印跡聚合物的最大結(jié)合量Qmax為40-50 μ mol/g，解 離常數(shù) Kd 為 4. 02-4. 2 μ mol/ml ；所述甲基睪酮分子印跡聚合物對模板分子的選擇性能通過以下方法得出將分子 印跡聚合物置于聚四氟乙烯離心管中，分別加入甲基睪酮、丙酸睪酮、17 α-羥孕酮、諾龍、 孕酮、甲孕酮的乙腈溶液，放入振蕩器室溫下結(jié)合，高速離心后取上清液，經(jīng)濾膜過濾，用高 效液相色譜(HPLC)測定所得溶液中各底物的含量，根據(jù)吸附前后溶液濃度的變化可以計 算得出靜態(tài)吸附分配系數(shù)K及識別因子β，據(jù)此可以對該分子印跡聚合物的結(jié)合性能及選 擇性進行評價。其中K表示不同底物在聚合物上的濃度(相當(dāng)于吸附量)與其在溶液中的 濃度的比值，K值越大，表明聚合物的選擇性結(jié)合能力越強；而β表示甲基睪酮分子印跡聚 合物的靜態(tài)分配系數(shù)與空白聚合物的靜態(tài)分配系數(shù)的比值，數(shù)值越大，表明聚合物的特異 性越強。計算方法如下K = CP/CS式中CP——底物在聚合物上的濃度(相當(dāng)于吸附量)，μ mol/g ；Cs——底物在溶液中的濃度，mM。β = ΚΜΙρ/ΚΒρ式中，Kmip—甲基睪酮分子印跡聚合物的靜態(tài)分配系數(shù)；Kbp——空白聚合物的靜態(tài)分配系數(shù)。由上可得，靜態(tài)吸附分配系數(shù)K為5-10，而其他結(jié)構(gòu)類似物均小于5 ；識別因子β 為10-40，一般為20-25，而其他結(jié)構(gòu)類似物均小于10。本發(fā)明的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，具有操作簡單、重現(xiàn)性好、過程容 易控制等優(yōu)點，所得到的分子印跡聚合物大小均勻，具有較高的最大結(jié)合量Qmax和解離常數(shù) Kd，因此有良好的結(jié)合能力和分離能力；同時其靜態(tài)吸附分配系數(shù)K和識別因子β也較高， 因而有良好的識別能力和選擇特性。而且，可以通過調(diào)節(jié)模板、單體、交聯(lián)劑以及致孔劑的 配比，對聚合物的顆粒大小進行調(diào)控，得到適合于不同用途的高分子材料。


圖1為本發(fā)明的一種甲基睪酮分子印跡聚合物的掃描電鏡(SEM)圖。
具體實施例方式
通過下述實施例將有助于理解本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其制備方法包括如下步驟(1)將模板分子甲基睪酮與聚合單體甲基丙烯酸(MAA)以1 5的比例，加入與甲 基睪酮的比例為50ml/mmol的致孔劑乙腈中，于2°C下攪拌3h ；
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(2)在步驟(1)的產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和引發(fā)劑偶氮 二異丁腈(AIBN)，再加入與甲基睪酮的比例為450ml/mmol的致孔劑乙腈，在60°C下熱引發(fā) 聚合20h，經(jīng)高速離心得到沉淀；其中，交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)與甲基睪酮比 例為1 20，引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)與甲基睪酮比例為70mg/mmol。(3)步驟(2)中沉淀經(jīng)甲醇與乙酸混合溶液提取18h去除模板分子后，再用純甲醇 提取以去除殘留的乙酸，即得產(chǎn)物。所制備的甲基睪酮分子印跡聚合物用掃描電鏡來觀察，如圖1所示，顆粒粒徑約 為300-500nm左右；經(jīng)BET氮氣吸附法進行測定，孔徑約為19. 2nm,比表面積約為37m2/g， 總孔體積約0. 188cm7g。稱取20mg的甲基睪酮分子印跡聚合物于聚四氟乙烯離心管中，分別加入5mL不 同濃度的甲基睪酮乙腈溶液，放入振蕩器中室溫下震蕩12h，10000r/min下離心20min， 取上清液，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，用HPLC測定所得溶液中甲基睪酮的含量，根據(jù)吸附前后 溶液濃度的變化計算得出該分子印跡聚合物的最大吸附量Qmax和平衡離解常數(shù)Kd分別為 45 μ mol/g 禾口 4· 1 μ mol/ml。將該分子印跡聚合物置于聚四氟乙烯離心管中，分別加入5mL濃度為1. 00mmol/L 的甲基睪酮、丙酸睪酮、17 α-羥孕酮、諾龍、孕酮、甲孕酮的乙腈溶液，放入振蕩器室溫下結(jié) 合12h，10000r/min下離心20min，取上清液，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，用高效液相色譜(HPLC) 測定所得溶液中各底物的含量，根據(jù)吸附前后溶液濃度的變化可以計算得出靜態(tài)吸附分配 系數(shù)K為8. 69，識別因子β為22.28。實施例2一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其制備方法包括如下步驟(1)將模板分子甲基睪酮與聚合單體丙烯酰胺(AA)以1 3的比例，加入與甲基 睪酮的比例為500ml/mmol的致孔劑甲醇中，于8°C下攪拌0. 5h ；(2)在步驟(1)的產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)和引發(fā) 劑偶氮二異庚腈(ABVN)，在65°C下熱引發(fā)聚合16h，經(jīng)高速離心得到沉淀；其中，交聯(lián)劑乙 二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)與甲基睪酮比例為1 10，引發(fā)劑偶氮二異庚腈(ABVN)與甲 基睪酮比例為40mg/mmol。(3)步驟(2)中沉淀經(jīng)甲醇與三氟乙酸混合溶液提取12h去除模板分子后，再用純 乙醇提取以去除殘留的三氟乙酸，即得產(chǎn)物。所制備的甲基睪酮分子印跡聚合物，顆粒粒徑約為1-2 μ m左右；經(jīng)BET氮氣吸附 法進行測定，孔徑約為19nm，比表面積約為10. 8m2/g。分子印跡聚合物的最大吸附量Qmax和平衡離解常數(shù)Kd分別為40 μ mol/g和 4. 02 μ mol/ml，測定和計算方法同實施例1。該分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附分配系數(shù)K為5. 01，識別因子β為10.30，測定和 計算方法同實施例1。實施例3一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其制備方法包括如下步驟(1)將模板分子甲基睪酮與三氟甲基丙烯酸(TFMAA)以1 8的比例，加入與甲基 睪酮的比例為300ml/mmol的致孔劑丙酮中，于5°C下攪拌1. 5h ；
(2)在步驟(1)的產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑偶氮二異庚腈(ABVN)，在50°C下熱 引發(fā)聚合24h，經(jīng)高速離心得到沉淀；其中，交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和三甲 氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)的混合物，與甲基睪酮比例為1 30，引發(fā)劑偶氮二異庚 腈(ABVN)與甲基睪酮比例為lOOmg/mmol。(3)步驟(2)中沉淀經(jīng)甲醇與甲酸混合溶液提取24h去除模板分子后，再用純乙腈 提取以去除殘留的乙酸，即得產(chǎn)物。所制備的甲基睪酮分子印跡聚合物，顆粒粒徑約為100-200nm左右；經(jīng)BET氮氣吸 附法進行測定，孔徑約為15nm，比表面積約為100. 7m2/g。分子印跡聚合物的最大吸附量Qmax和平衡離解常數(shù)Kd分別為45 μ mol/g和 4. 2μπι01/πι1，測定和計算方法同實施例1。該分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附分配系數(shù)K為7. 53，識別因子β為39.89，測定和 計算方法同實施例1。實施例4一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其制備方法包括如下步驟(1)將模板分子甲基睪酮與甲基丙烯酸(MAA)以1 3的比例，加入與甲基睪酮的 比例為lOml/mmol的致孔劑乙腈中，于5°C下攪拌2h ；(2)在步驟(1)的產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和引發(fā)劑偶 氮二異丁腈(AIBN)，再加入與甲基睪酮的比例為40ml/mmol的致孔劑乙腈，在60°C下熱引 發(fā)聚合24h，經(jīng)高速離心得到沉淀；其中，與甲基睪酮比例為1 20，引發(fā)劑偶氮二異丁腈 (AIBN)與甲基睪酮比例為lOOmg/mmol。(3)步驟(2)中沉淀經(jīng)甲醇與乙酸混合溶液提取24h去除模板分子后，再用純丙酮 提取以去除殘留的乙酸，即得產(chǎn)物。所制備的甲基睪酮分子印跡聚合物，顆粒粒徑約為2_5μπι左右；經(jīng)BET氮氣吸附 法進行測定，孔徑約為22nm，比表面積約為25. 9m2/g。分子印跡聚合物的最大吸附量Qmax和平衡離解常數(shù)Kd分別為50 μ mol/g和 4. lymol/ml，測定和計算方法同實施例1。該分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附分配系數(shù)K為10. 05，識別因子β為20. 05，測定和 計算方法同實施例1。實施例5—種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其制備方法包括如下步驟(1)將模板分子甲基睪酮與甲基丙烯酸(MAA)以1 3的比例，加入與甲基睪酮的 比例為lOml/mmol的致孔劑乙腈中，于5°C下攪拌2h ；(2)在步驟(1)的產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和引發(fā)劑偶 氮二異丁腈(AIBN)，再加入與甲基睪酮的比例為90ml/mmol的致孔劑乙腈，在60°C下熱引 發(fā)聚合24h，經(jīng)高速離心得到沉淀；其中，與甲基睪酮比例為1 20，引發(fā)劑偶氮二異丁腈 (AIBN)與甲基睪酮比例為100mg/mmol。(3)步驟(2)中沉淀經(jīng)甲醇、乙酸和三氟乙酸混合溶液提取24h去除模板分子后， 再用純甲醇、乙醇和丙酮提取以去除殘留的乙酸，即得產(chǎn)物。所制備的甲基睪酮分子印跡聚合物，顆粒粒徑約為200-300nm左右；經(jīng)BET氮氣吸
7附法進行測定，孔徑約為25nm，比表面積約為48. 8m2/g。分子印跡聚合物的最大吸附量Qmax和平衡離解常數(shù)Kd分別為42 μ mol/g和 4. 07μπιΟ1/πι1，測定和計算方法同實施例1。該分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附分配系數(shù)K為7. 32，識別因子β為25.02，測定和 計算方法同實施例1。
權(quán)利要求
一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將模板分子甲基睪酮與聚合單體以1∶3 1∶8的比例，加入致孔劑中，2 8℃下攪拌0.5 3h；(2)在步驟(1)的產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，熱引發(fā)聚合，后經(jīng)高速離心，取其沉淀；(3)步驟(2)中沉淀經(jīng)酸性有機溶劑提取后，再用純有機溶劑提取，即得產(chǎn)物；其中，步驟(1)中致孔劑與甲基睪酮的比例為50 500ml/mmol；步驟(2)中交聯(lián)劑與甲基睪酮比例為1∶10 1∶30，引發(fā)劑與甲基睪酮比例為40 100mg/mmol。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述聚合 單體為甲基丙烯酸、丙烯酰胺或三氟甲基丙烯酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中致孔劑為乙腈、甲醇或丙酮中的一種或幾種溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯或三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一種或其混合 物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述步驟 ⑵中引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)或偶氮二異庚腈(ABVN)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于當(dāng)所述步 驟(1)中致孔劑與甲基睪酮的比例為lO-lOOml/mmol時，步驟(2)中熱引發(fā)聚合前再加入 致孔劑，使其與甲基睪酮的總比例為50-500ml/mmol。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述步驟 ⑵中熱引發(fā)聚合的溫度為50-65°C，時間為16-24h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的酸性有機溶劑為甲酸、乙酸或三氟乙酸中的一種或幾種與甲醇的混合溶液，沉淀提 取時間為12-24h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述步驟 (3)中純有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲基睪酮分子印跡聚合物的制備方法，具體地講涉及一種甲基睪酮分子印跡聚合物的沉淀聚合制備方法。該制備方法為將甲基睪酮與聚合單體以1∶3-1∶8的比例加入致孔劑中，低溫攪拌0.5-3h；然后加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，熱引發(fā)聚合，高速離心后，取其沉淀；沉淀經(jīng)酸性有機溶劑提取去除模板分子后，再用純有機溶劑提取以去除殘留的酸性物質(zhì)，之后真空干燥即得產(chǎn)物。本發(fā)明所涉及的方法具有操作簡單、重現(xiàn)性好、過程容易控制等優(yōu)點；所得到的分子印跡聚合物粒徑可控且大小均勻；該聚合物對甲基睪酮具有良好的識別能力和選擇特性，并且有良好的結(jié)合能力和分離能力。
文檔編號C08F222/14GK101962419SQ20101027962
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者儲曉剛, 楊敏莉, 沈蕊蓮, 王大寧 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院