專利名稱:細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定的制作方法
本項(xiàng)發(fā)明涉及到測(cè)定體內(nèi)和體外細(xì)胞生長(zhǎng)速率的新方法。
目前有兩種測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的普通方法。一種方法是在分析階段開始時(shí)計(jì)細(xì)胞的數(shù)量，而后在該階段結(jié)束時(shí)再計(jì)細(xì)胞的數(shù)量，從而測(cè)定出細(xì)胞數(shù)量的增多?？捎醚蛴?jì)數(shù)器利用顯微鏡方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，或用庫爾特(Coulter)計(jì)數(shù)器或其它的流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器利用儀器輔助的方法進(jìn)行。測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的另一種方法是用β計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞對(duì)氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷的吸收。按照這個(gè)方法，在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)測(cè)定細(xì)胞的數(shù)量，而后在細(xì)胞中加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷，以定期的間隔取出一份培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)，洗去未結(jié)合的氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷，并將洗過的這份細(xì)胞用三氯乙酸(TCA)沉淀，然后對(duì)放射標(biāo)記了的固體沉淀物進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)，從而測(cè)定氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷對(duì)DNA的摻入。這個(gè)方法測(cè)定的只是DNA的合成速度，而并非細(xì)胞生長(zhǎng)本身。但由于這個(gè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，因此常被選用于觀察細(xì)胞的興奮。用于測(cè)定細(xì)胞增殖活動(dòng)的另一種方法是測(cè)定在所考察的組織中，每一百個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行有絲分裂的數(shù)量。這種方法不十分精確，因?yàn)樵谥苽溥^程中會(huì)損失細(xì)胞。一般說來，這些方法能較好地測(cè)定體外細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)于體內(nèi)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)則是十分困難的。
取出組織并在體外監(jiān)測(cè)有規(guī)律的氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷的摻入，就可以判斷組織的生長(zhǎng)速率。將組織切成30μm的切片，與氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷接觸30分鐘，洗去未摻入的氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷，在切片上涂一層核乳膠，并對(duì)膠片曝光放射性同位素的衰變。對(duì)乳膠顯影和定影。組織用蘇木精和伊紅染色，然后鏡檢以測(cè)出被標(biāo)記的部分。這種方法既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。
花青染料已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)，二噁羰花青染料(dioxacar-bocyanine dyes)已用于進(jìn)行白血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，Gunter Valet，Max Planck Ges Wissensch;登記專利號(hào)84-102307/17，“用選擇性染色并測(cè)定體積和熒光法同時(shí)定量測(cè)定血細(xì)胞”。但是，在這些研究中，所用的染料是一些短鏈的羰花青染料(少于10個(gè)碳)，對(duì)細(xì)胞膜電位的變化有反應(yīng)。同時(shí)，這種短鏈的羰花青染料進(jìn)入細(xì)胞的線粒體，有細(xì)胞毒性，當(dāng)洗滌細(xì)胞時(shí)，無論細(xì)胞膜電位是否發(fā)生變化，這種染料都易于從細(xì)胞中漏出來。其它的短脂肪鏈花青染料用于許多其它生物學(xué)分析中。但是這些短鏈的分子對(duì)細(xì)胞膜電位的變化有反應(yīng)并穿過細(xì)胞膜進(jìn)入線粒體。H.M.Shapiro，美國專利號(hào)4，343，782，1982年8月10日。這些短鏈染料對(duì)細(xì)胞也是有毒的，不能用于測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。
三羰花青染料(Fox，I.J.，et al.，Proc.Mayo Clinic，62∶478-484，1957)和伊文思藍(lán)染料(Schad，H.，et al.，Pfluegers Arch.Eur.J.Physiol.，370(2)∶139-144，1977)已經(jīng)以稀釋法用于體內(nèi)測(cè)心輸出量。Dow(Dow，P.，Physiol.Rev.，36∶77-102，1956)描述了這個(gè)方法，其做法是在肺的靜脈端注射已知量的某種血管內(nèi)指示劑，并測(cè)定動(dòng)脈血管內(nèi)指示劑濃度隨時(shí)間的變化，從而確定注射點(diǎn)和取樣點(diǎn)之間的體積。這些染料不能用來染色細(xì)胞。
本項(xiàng)發(fā)明是測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)速率的新方法。按照本發(fā)明，首先用花青染料標(biāo)記活細(xì)胞。測(cè)定被花青染料標(biāo)記的母細(xì)胞所產(chǎn)生的子細(xì)胞質(zhì)膜中花青染料水平的變化，確定細(xì)胞生長(zhǎng)速率。例如本發(fā)明的測(cè)定生長(zhǎng)的方法可用于在體內(nèi)監(jiān)測(cè)角膜上皮的愈合、移植骨髓細(xì)胞的植入。本發(fā)明的方法在體外的用途包括測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)各種化療劑的敏感程度。
圖1是細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而降低的圖示。
圖2是染色和未染色細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線的圖示。
圖3顯示染料不從染色細(xì)胞向未染色細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
圖4是細(xì)胞和熒光動(dòng)力學(xué)的比較的圖示。
在本項(xiàng)發(fā)明的測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)速率方法中，細(xì)胞被花青染料標(biāo)記。有以下結(jié)構(gòu)的化合物在本文中歸為花青染料
其中Y為氧、硫、亞甲基或烷基取代的亞甲基;
m為0-3;
n為12-22。
在此所用的烷基取代的亞甲基是指具有與甲基、乙基或丙基取代基的任何結(jié)合的單或雙取代的亞甲基。
上述結(jié)構(gòu)的化合物可用下述通用的速記公式表示
DiYCn(2m+1)Sims，P.J.，et al.，Biochem，13∶3315(1974)。因此，例如在這個(gè)化合物中Y是硫，有3個(gè)將環(huán)聯(lián)結(jié)的碳原子，還有2個(gè)14碳的脂肪鏈，那么就可寫為DiSC14(3)。相似地，DiIC14(5)表明這個(gè)化合物中Y是異丙基，有5個(gè)碳原子將環(huán)聯(lián)結(jié)，并有2個(gè)14碳的脂肪鏈。
在本文中記敘為花青染料的化合物包括有一個(gè)或一個(gè)以上取代的上述結(jié)構(gòu)的化合物，假定這種取代的化合物能在細(xì)胞標(biāo)記介質(zhì)中至少能溶解至標(biāo)記完成，并且具有足夠高的膜分配系數(shù)，使得它能維持與標(biāo)記的細(xì)胞膜相聯(lián)結(jié)。在標(biāo)記所要求的濃度范圍內(nèi)，這種化合物還必須不顯著影響細(xì)胞的活力?；衔镌诩?xì)胞標(biāo)記反應(yīng)介質(zhì)中的溶解度的測(cè)定方法如下將花青染料分散到標(biāo)記介質(zhì)中，用一般的熒光分光光度技術(shù)測(cè)定熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。熒光強(qiáng)度減小說明染料沉淀并吸附在容器壁上。測(cè)定染料是否與細(xì)胞膜相結(jié)合例如將標(biāo)記后的血紅細(xì)胞重新注射入供體動(dòng)物，并用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法監(jiān)測(cè)其熒光強(qiáng)度。注入后，標(biāo)記細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本不變說明染料在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。
本發(fā)明所用的花青染料可從多處購得，如Molecular Pro-bes，Inc.，Eugene，Oregon，或用已知的合成方法從現(xiàn)有的原始材料制備，Hamer，F(xiàn).M.，“花青染料及有關(guān)化合物”，Inte-rscience Publishers(1964)。
用所描述的步驟，任何活細(xì)胞都可被花青染料標(biāo)記。本文中“細(xì)胞”這個(gè)術(shù)語包括有核細(xì)胞如白血細(xì)胞、各種腫瘤細(xì)胞、其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如組織培養(yǎng)細(xì)胞)，酵母和細(xì)菌。如果一個(gè)細(xì)胞能夠生長(zhǎng)并基本上能發(fā)揮它那類細(xì)胞所該有的功能，那么它就是活細(xì)胞。
細(xì)胞標(biāo)記是在對(duì)細(xì)胞無毒并使細(xì)胞標(biāo)記可重復(fù)的介質(zhì)中進(jìn)行的。為了使介質(zhì)具有這些必要的特性，所使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑要使得花青染料能在其中形成穩(wěn)定的溶液，至少要穩(wěn)定標(biāo)記所需的同樣長(zhǎng)的時(shí)間?？山邮艿臐B透壓調(diào)節(jié)劑包括例如糖，象單糖，如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖，二糖，如蔗糖，糖醇，如甘露醇、甘油、肌醇、木糖醇和阿東糖醇，氨基酸，如甘氨酸和精氨酸，以及一些Good′s緩沖劑如N-三(羥甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸和如下面表2中所列的化合物。Good，N.E.，et al.，Biochem.15，467-477(1966)，Good，N.E.and S.Izawa，Methods Enzymol.，24，Part B，53(1968)，F(xiàn)eguson，W.J.，et al.，Anal.Biochem.104∶301-310(1980)。但某些細(xì)胞株可能對(duì)一種或多種滲透壓調(diào)節(jié)劑敏感，特別是對(duì)糖醇。因此，在標(biāo)記前，要進(jìn)行一些標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)以確定細(xì)胞在這些所要用的滲透壓調(diào)節(jié)劑中是有活力的。此外，在標(biāo)記反應(yīng)液中可加少量緩沖劑以調(diào)節(jié)氫離子的濃度。
接觸各種滲透壓調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞生存力的影響可由測(cè)量Yac細(xì)胞在接觸各種滲透壓調(diào)節(jié)劑30分鐘后的倍增時(shí)間來確定。Yac細(xì)胞是小鼠淋巴瘤組織培養(yǎng)細(xì)胞株，公眾可由American TyPe Culture Collection得到，并由Kiessling，R.，European J.Immunology 5∶112-117(1975)描述。表1的數(shù)據(jù)說明，和磷酸鹽緩沖液相比，與蔗糖、葡萄糖、Good氏緩沖液(TAPS、CAPS、EPPS、HEPPSO和DIPSO)接觸對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間產(chǎn)生可忽略的影響，這表明，未產(chǎn)生因接觸這些試劑而出現(xiàn)的細(xì)胞毒性。
表1滲透壓調(diào)節(jié)劑 倍增時(shí)間(小時(shí))磷酸鹽緩沖液 31.0蔗糖 41.0葡萄糖 34.5TAPS 32.7CAPS 45.8EPPS 32.2HEPPSO 23.4DIPSO 36.73-氨基-1-丙磺酸 99.63-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉(MOPS) A2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇 B2-氨基-2-甲基-1-丙醇 BN-三(羥甲基)-甲氨基乙磺酸(TES) BN，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES) A3-(環(huán)己氨基)-2-羥基-1-丙磺酸(CAPSO) A三乙醇胺 B三(羥甲基)氨基甲烷(TRIZMA) BBis-tris丙烷 B2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES) B3-〔二甲(羥甲基)甲氨基〕-2-羥基丙磺酸(AMPSO) AN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE) 57.73-〔(3-膽酰胺丙基)二甲基銨〕-1-丙磺酸(CHAPS) B
表1(續(xù))滲透壓調(diào)節(jié)劑 倍增時(shí)間(小時(shí))3-〔N-三(羥甲基)-甲氨基〕-2-羥基丙磺酸 63.6(TAPSO)3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(MOPSO) 178.42-〔(2-氨基-2-氧代乙基)氨基〕-乙磺酸 1038.4(ACES)雙(2-羥乙基)-亞氨基-三(羥甲基) A-甲烷(BIS-TRIS)2-(N-環(huán)己氨基)乙磺酸(CHES) 51.5N-三(羥甲基)-甲基甘氨酸(TRICINE) A葡糖胺 288.4咪唑 B甘氨酰甘氨酸 66.9A未生長(zhǎng)或有部分細(xì)胞毒性B有劇烈細(xì)胞毒性。
表2顯示了用來考察花青染料溶解度的各種滲透壓調(diào)節(jié)劑，濃度的測(cè)定都是在離心除去沉淀后進(jìn)行的，將少量含有花青染料的滲透壓調(diào)節(jié)劑溶于乙醇中，進(jìn)行熒光分光光度分析。所用的染料是DiSC14(5)和DiOC14(3)，滲透壓調(diào)節(jié)劑處于對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說是等滲的濃度，其熒光強(qiáng)度如果對(duì)乙醇標(biāo)準(zhǔn)液來說是降低了時(shí)，則直接與花青染料的溶解度降低有關(guān)。
表2滲透壓調(diào)節(jié)劑 相對(duì)熒光強(qiáng)度(CONC)DiSC14(5) DiOC14(3)乙醇 100 100葡萄糖 31 100果糖 35 100山梨糖 40 100蔗糖 41 100木糖 36 19～52核糖 24 100來蘇糖 0.12 1.8甘氨酸 31 93精氨酸 17 17.2甘油 39 99.5肌醇 42 92木糖醇 34 76.4甘露醇 29 ＊阿東糖醇 34 ND三(羥甲基)-甲氨基丙磺酸 18 ND(TAPS)3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸 40 ND(CAPS)N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-3- 18 ND丙磺酸(EPPS)
表2(續(xù))滲透壓調(diào)節(jié)劑 相對(duì)熒光強(qiáng)度(CONC)DiSC14(5) DiOC14(3)N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-羥基 20 ND丙磺酸(HEPPSO)3-〔N-N-雙(2-羥乙基)氨基〕-2-羥基 43＊＊＊ND丙磺酸(DIPSO)NaCl 6 1.7磷酸鹽緩沖液 2.1 6.5Na2SO47.4 1.6NaI 1.1 0.14氯化膽堿 11＊＊6.3碘化膽堿 0.16 2.3＊于乙醇中沉淀，未得到數(shù)據(jù)。
＊＊由不形成沉淀的大結(jié)晶引起的假象。
＊＊＊于乙醇中沉淀(數(shù)據(jù)可疑)。
ND沒有進(jìn)行測(cè)定。
從表2可以看出，花青染料在一般鹽中的溶解度要比在糖(除了來蘇糖)、糖醇、氨基酸、和Good氏緩沖劑(TAPS、HEPPO、DIPSO、CAPS和EPPS中)的溶解度小得多。另外，已經(jīng)測(cè)定了DiSC14(5)在糖溶液中，如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖、蔗糖和木糖，糖醇如甘油、肌醇、木糖醇和阿東糖醇以及氨基酸如甘氨酸、精氨酸溶液中的穩(wěn)定性?；ㄇ嗳玖显跍y(cè)試溶液中至少能穩(wěn)定20分鐘，這個(gè)時(shí)間足夠進(jìn)行可重復(fù)的標(biāo)記，在許多試劑中花青染料在溶液中的量在60分鐘內(nèi)無明顯減少。
接著，測(cè)定花青染料在含有一般鹽和染料能在其中溶解的滲透壓調(diào)節(jié)劑的介質(zhì)中的溶解度。DiSC14(5)在等滲葡萄糖溶液中的溶解度不因用蒸餾水稀釋而受到明顯的影響，但是，DiSC14(5)在等滲葡萄糖溶液中，只要用大約20%的等滲氯化鈉溶液稀釋，則其溶解度明顯降低。因此，用花青染料進(jìn)行可重復(fù)的細(xì)胞標(biāo)記的介質(zhì)，只能含少量的一般鹽類，如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乙酸鈉、乙酸鉀、硫酸鈉、碘化鈉、氯化膽堿或碘化膽堿。最好在不用一般鹽調(diào)節(jié)滲透壓的介質(zhì)中進(jìn)行。
對(duì)按本發(fā)明程序用花青染料標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分析以確定標(biāo)記對(duì)細(xì)胞活力的影響。可由American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到的V79細(xì)胞(這種細(xì)胞由Prescott，D.M.，Ann.New York Acad.Sci.，397∶101-109(1982)描述)用含DiOC14(3)10-5或4×10-5M的溶液進(jìn)行標(biāo)記，并將染色細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)與未染色的細(xì)胞及染色與未染色細(xì)胞各占一半的混合物的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)做了比較?；ㄇ嗳玖蠘?biāo)記并不影響細(xì)胞倍增時(shí)間。因此，標(biāo)記對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)并無影響。另外，其它一些測(cè)定細(xì)胞活力的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，如臺(tái)盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)和Propidium iodide排除實(shí)驗(yàn)也證明，按所述程序進(jìn)行的花青染料標(biāo)記對(duì)細(xì)胞活力并無影響。
為了測(cè)試按本發(fā)明方法用花青染料標(biāo)記的細(xì)胞的體內(nèi)穩(wěn)定性，取兔紅血細(xì)胞，用DiSC14(5)標(biāo)記再回輸入兔體內(nèi)，此后定期采血樣，分析標(biāo)記細(xì)胞的百分比以及標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。循環(huán)的紅血細(xì)胞的數(shù)量隨時(shí)間而線性降低，所測(cè)出的標(biāo)記細(xì)胞的壽命為52天，這與已報(bào)導(dǎo)的兔紅細(xì)胞的平均壽命為40-60天十分接近。因此，花青染料標(biāo)記并不影響紅血細(xì)胞的清除率。
在受試的5只兔子中，除一只外，其余動(dòng)物的染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在標(biāo)記并重新注入后的60天基本上保持不變。在第5只動(dòng)物中，在處于兔的循環(huán)系統(tǒng)中60天中，有不超過20%的花青染料從標(biāo)記細(xì)胞中流出。這些數(shù)據(jù)與在組織培養(yǎng)中顯示未見染料從標(biāo)記細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未標(biāo)記細(xì)胞的結(jié)果一起，證明了細(xì)胞被這種染料穩(wěn)定標(biāo)記。
花青染料標(biāo)記的活細(xì)胞在所發(fā)明的方法中用于測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)率。測(cè)定花青染料在細(xì)胞質(zhì)膜中水平的變化從而確定細(xì)胞生長(zhǎng)速率，每次細(xì)胞分裂時(shí)，與質(zhì)膜結(jié)合的花青染料均等地分布于兩個(gè)子細(xì)胞上。因此，測(cè)定一系列標(biāo)記的生長(zhǎng)著的細(xì)胞質(zhì)膜中花青染料的水平，可用于計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。
利用常規(guī)技術(shù)的流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)法，適于測(cè)定不貼壁的細(xì)胞或可從其生長(zhǎng)基質(zhì)中取出而以單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)懸浮的細(xì)胞質(zhì)膜上花青染料的水平。一種用于貼壁細(xì)胞的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Meridian ACAS 470)適于細(xì)胞不易或不能從生長(zhǎng)基質(zhì)中取出的情況。
細(xì)胞生長(zhǎng)速率測(cè)定用于許多用途。例如組織培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定可用來選擇最適生長(zhǎng)條件。測(cè)定腫瘤細(xì)胞在含化療劑的介質(zhì)中的生長(zhǎng)速率就可確定腫瘤細(xì)胞對(duì)化療劑的敏感度。相似地，測(cè)定酵母細(xì)胞在含各種抗真菌劑的介質(zhì)中的生長(zhǎng)速率就可確定酵母細(xì)胞對(duì)各種抗真菌劑的敏感度。
本發(fā)明方法也用于監(jiān)測(cè)體內(nèi)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。例如測(cè)定骨髓細(xì)胞在被移植后的生長(zhǎng)速率就能了解骨髓移植物的植入情況，測(cè)定其它體內(nèi)細(xì)胞如角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)率可以了解創(chuàng)傷后或手術(shù)后的愈合情況。
以下實(shí)施例闡述本項(xiàng)發(fā)明，并不對(duì)上文明確說明的本項(xiàng)發(fā)明的范圍加以限定，也并不做為對(duì)下述的權(quán)利要求
的限定。
實(shí)施例1組織培養(yǎng)細(xì)胞的染色方法Ⅰ.細(xì)胞的準(zhǔn)備利用對(duì)數(shù)期的組織培養(yǎng)細(xì)胞能得到最佳結(jié)果。從培養(yǎng)器皿中取出懸浮培養(yǎng)物，放到聚丙烯離心管中。
如果用的是單層培養(yǎng)，必須除去上清液，用不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖液洗滌貼壁細(xì)胞，以除去培養(yǎng)瓶中的血清蛋白。加入胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco Laboratories，Grand Island，New York，＃610-5300)，覆蓋培養(yǎng)瓶的底部，室溫下培養(yǎng)，直至細(xì)胞單層松動(dòng)并解聚。將所得的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到聚丙烯離心管中，加入等體積的含10%小牛血清(FBS)(Hazelton)的培養(yǎng)液，以終止胰蛋白酶的酶作用。
細(xì)胞在室溫下以400×g離心10分鐘。吸出上清液，代之以等體積的等滲甘露醇以重新懸浮沉淀的細(xì)胞。用甘露醇洗滌的目的是除去細(xì)胞懸浮液中的血漿蛋白，并準(zhǔn)備對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。細(xì)胞在室溫下以400×g再離心10分鐘。吸出上清液，所得的細(xì)胞沉淀再懸浮于甘露醇溶液中，使每毫升懸浮液中含2×106個(gè)細(xì)胞，以便染色。但有些細(xì)胞株對(duì)糖醇(甘露醇)的使用敏感，在這種情況下可用等滲的葡萄糖溶液(MW 180.16，54.05g/l)。
Ⅱ.染料原液的制備用無水乙醇配制2×10-3M的原液如下DiO-C14(3) MW 800(1.600mg/ml)
DiS-C14(5) MW 814(1.628mg/ml)DiO-C18(3) MW 936(1.872mg/ml)DiI-C14(5) MW 850(1.700mg/ml)從Molecular Probes，Eugene，Oregon得到所有的染料。
染料原液經(jīng)超聲處理使其完全溶解并減少對(duì)試管的粘附。用聚苯乙烯管來制備原液以便能觀察到染料的溶解情況。但是，用聚丙乙烯管來進(jìn)行細(xì)胞染色，因?yàn)榕c聚苯乙烯相比，染料在水性環(huán)境中對(duì)聚丙乙烯的粘附要少得多。
Ⅲ.細(xì)胞染色細(xì)胞在等滲甘露醇溶液中調(diào)到濃度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml。按每毫升細(xì)胞懸浮液中加2×10-3M的染料原液5μl將染料原液加到染色溶液中，使終濃度達(dá)到10μM，將染色的樣品用吸管吹吸或攪拌使其充分混合。細(xì)胞與染料共孵育十分鐘后，取一小份樣品在熒光顯微鏡下觀察，以確認(rèn)已產(chǎn)生強(qiáng)烈而均勻的染色。對(duì)于DiO系列的染料，使用對(duì)488nm的激發(fā)光具有選擇性的顯微鏡濾光片，而DiS和DiI染料系列則需在靠近575nm激發(fā)，以觀察熒光。
保溫后，于染色細(xì)胞懸浮液中加等體積的PBS。細(xì)胞在20℃下以400×g離心10分鐘。吸出上清液，用PBS將沉淀重新懸浮。重復(fù)離心過程，觀察所得上清液中是否有染料存在。如果上清液中仍有染料存在，重復(fù)洗滌直到用熒光分光光度法測(cè)不出上清液中有染料為止。最后一次洗滌后，除去上清液，將沉淀重新以所需濃度懸浮于合適的培養(yǎng)液中。全部操作均在無菌條件下進(jìn)行。
實(shí)施例2組織培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定按實(shí)施例1中所述的方法用DiOC14(3)對(duì)V79細(xì)胞進(jìn)行染色。用EPICS753型流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定熒光強(qiáng)度(Coulter Elec-tronics，Inc.)。染色后立即取一份被染色的細(xì)胞測(cè)定熒光強(qiáng)度，其余的細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)完全培養(yǎng)介質(zhì)中，37℃于濕潤的空氣-CO2(7.5%CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在染色后的第一天、第二天、第三天分別取細(xì)胞樣品進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定。
圖1顯示生長(zhǎng)中的V79細(xì)胞熒光強(qiáng)度對(duì)數(shù)的曲線。每一個(gè)峰上標(biāo)出的數(shù)值是那一天平均熒光強(qiáng)度值的對(duì)數(shù)值。如圖1所示，隨著培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度的平均對(duì)數(shù)值逐天減小。
通過對(duì)熒光的測(cè)量，從與熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間所做曲線的直線部分配合的回歸線的斜率，可測(cè)定出生長(zhǎng)速率。
為了確認(rèn)細(xì)胞染色并不影響其生長(zhǎng)速率，比較了被染色的V79細(xì)胞和未染色的V79細(xì)胞的生長(zhǎng)率。圖2的結(jié)果表明，未染色的細(xì)胞與用10-5或4×10-5M染料染色的細(xì)胞，或與未染色細(xì)胞和染色細(xì)胞的等量混合物，以同樣的速率生長(zhǎng)。
因?yàn)槿玖嫌扇旧?xì)胞向未染色細(xì)胞轉(zhuǎn)移將引起生長(zhǎng)率測(cè)定不正確，所以將染色與未染色的細(xì)胞放在一起共同培養(yǎng)。將一株人類結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29(可由American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，由J.Fogh and G.Tremp，《人類體外癌細(xì)胞》，PP.115-159.Plenum Press，New York(1975)描述)用DiOC14(3)染色，并將它與人前骨髓白血病細(xì)胞HL60(可由American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，由Collins，S.J.，et al.，Nature，270∶347-349(1977)描述)以1∶1的比例共同培養(yǎng)。所得的結(jié)果示于圖3。
圖3中，單獨(dú)培養(yǎng)的染色的HT29細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(菱形點(diǎn))表明熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間而降低的特征。未染色的HL60細(xì)胞在4天內(nèi)幾乎無熒光，4天后熒光強(qiáng)度顯示大約中等程度的增加。進(jìn)一步，染色的HT29細(xì)胞與HL60細(xì)胞共同培養(yǎng)(方形點(diǎn))，直到大約第5天以前，其熒光強(qiáng)度的損失與沒有和HL60細(xì)胞一起培養(yǎng)的HT29細(xì)胞熒光強(qiáng)度的損失完全一樣，此后只出現(xiàn)一些額外的、但只是極小量的熒光強(qiáng)度的損失。從這些數(shù)據(jù)可清楚地看到，HL60細(xì)胞在與HT29細(xì)胞培養(yǎng)4天后也許也吸收一些熒光染料。但是應(yīng)該注意到HL60細(xì)胞是前髓細(xì)胞，具有某種吞噬細(xì)胞和細(xì)胞碎片的能力。培養(yǎng)4天后混和培養(yǎng)中未染色亞種群所經(jīng)歷的熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)或許實(shí)際上是由于它們吞噬了有熒光的碎片的結(jié)果。更重要的是在4天的培養(yǎng)中，在未染色的HL60細(xì)胞中熒光強(qiáng)度沒有增加。再者，在同一混合物中染色的HT29細(xì)胞的熒光動(dòng)態(tài)與未經(jīng)混合的HT29細(xì)胞的熒光動(dòng)態(tài)表現(xiàn)一致。因此，并未因細(xì)胞與細(xì)胞間染料的轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致錯(cuò)誤的生長(zhǎng)率測(cè)定。
實(shí)施例3腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率的測(cè)定如果研究的腫瘤細(xì)胞是適應(yīng)于體外培養(yǎng)條件的組織培養(yǎng)系，那么就按實(shí)施例1及實(shí)施例2中所述的方法進(jìn)行細(xì)胞染色和測(cè)定。如果研究的細(xì)胞來自腫瘤組織外植體，那么就用一般技術(shù)將其打散成單個(gè)細(xì)胞，把它們涂到Lab-Tech組織培養(yǎng)箱的載片上。按實(shí)施例1中所述的方法用花青染料染色細(xì)胞。然后放在37℃濕潤的空氣-CO2培養(yǎng)箱中保溫進(jìn)行平衡。每隔一段時(shí)間，將載片放在貼壁細(xì)胞分析儀(即Meridian ACAS470)的顯微鏡鏡臺(tái)上測(cè)定熒光強(qiáng)度。細(xì)胞相對(duì)于參比標(biāo)記的位置可用計(jì)算機(jī)進(jìn)行測(cè)定，所以能進(jìn)行一系列的熒光強(qiáng)度測(cè)定。將載片放回培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。顯微鏡載片上應(yīng)有熒光標(biāo)準(zhǔn)，如庫爾特(Coulter)全光聚苯乙烯微球(Coulter Electronics，Hialeah，F(xiàn)lorida)，使得在培養(yǎng)過程中熒光強(qiáng)度不隨時(shí)間而變化。此標(biāo)準(zhǔn)即用來進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)量比較。
可用顯微鏡上的相鏡片測(cè)量形態(tài)學(xué)參數(shù)，或用熒光標(biāo)記的對(duì)腫瘤細(xì)胞特異的單克隆抗體，將腫瘤細(xì)胞從正?；|(zhì)細(xì)胞中鑒定出來。細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定則是監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在每次分裂后花青染料熒光的稀釋，并應(yīng)用實(shí)施例9中的公式。
也可用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來測(cè)定熒光強(qiáng)度。但是在進(jìn)行流式細(xì)胞分析前需將細(xì)胞從顯微鏡載片上取下來。這種方法不能用同一個(gè)細(xì)胞每天進(jìn)行測(cè)定而進(jìn)行染料稀釋的一系列定量分析。但在某些例子中，如白血病細(xì)胞，這種方法較好。
測(cè)定體外細(xì)胞生長(zhǎng)是用在最適培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞或用在各種水水平的治療腫瘤制劑存在下培養(yǎng)的細(xì)胞。治療劑抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力可通過抑制熒光強(qiáng)度的降低來測(cè)量，這可用于測(cè)定制劑殺傷腫瘤細(xì)胞的效力。
實(shí)施例4白血細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定用常規(guī)技術(shù)由脾臟切除術(shù)或靜脈抽血法取淋巴細(xì)胞。用實(shí)施例1的方法以花青染料標(biāo)記細(xì)胞，但是用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作為滲透支持介質(zhì)。被染色的細(xì)胞分置到微量滴定板的每一個(gè)孔中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞(Mazumder，A.，Grimm，E.A.，Zhang，H.z.，and Rosenberg，S.A.，Cancer Res.42，918(1982))，與適當(dāng)?shù)募?xì)胞分裂素如白細(xì)胞介素-2、高碘酸鈉、植物凝集素、伴刀豆球蛋白A、美洲商陸(Pokeweed)細(xì)胞分裂素和B細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BCGF)一起培養(yǎng)，將細(xì)胞放在37℃濕潤的空氣-CO2培養(yǎng)箱中使細(xì)胞生長(zhǎng)。隔一定的時(shí)間將細(xì)胞從培養(yǎng)容器中取出，用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定。得到的數(shù)據(jù)同實(shí)施例2得到的數(shù)據(jù)類似，并用實(shí)施例9中的方程進(jìn)行分析。
實(shí)施例5細(xì)菌生長(zhǎng)率的測(cè)定用實(shí)施例1中的方法以花青染料標(biāo)記細(xì)胞，但是用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作為滲透支持介質(zhì)。被染色的細(xì)胞按每一小孔中5×105個(gè)細(xì)胞的水平分置于微量滴定板的各個(gè)含有肉湯培養(yǎng)液的小孔中，將細(xì)胞放入37℃濕潤的培養(yǎng)箱中使細(xì)胞生長(zhǎng)。隔一定時(shí)間，將細(xì)胞從培養(yǎng)容器中取出，用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法測(cè)定。測(cè)得的數(shù)據(jù)與實(shí)施例2中所得的數(shù)據(jù)類似，并用實(shí)施例9中的方程分析。
測(cè)定體外細(xì)胞生長(zhǎng)的方法是用在最適培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞或在有不同水平的抗生素存在下培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行的，加入抗生素是為了測(cè)定它們的抗菌能力。用對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度減小的抑制程度來測(cè)定殺菌劑抑制細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，這個(gè)能力是這種制劑殺死細(xì)菌有效性的指標(biāo)。
實(shí)施例6酵母生長(zhǎng)率的測(cè)定用實(shí)施例1中的方法用花青染料標(biāo)記細(xì)胞，但用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作為滲透支持介質(zhì)。被染色的細(xì)胞以每個(gè)小孔中5×105個(gè)細(xì)胞的水平分置于微量滴定板上的每個(gè)含有肉湯培養(yǎng)液的小孔中。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中使其生長(zhǎng)。隔一定時(shí)間，從培養(yǎng)容器中取出細(xì)胞，并用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)法或貼壁細(xì)胞測(cè)定法(Meridian ACAS470)進(jìn)行測(cè)定。所得的數(shù)據(jù)與實(shí)施例2得到的數(shù)據(jù)類似，并用實(shí)施例9中的方程進(jìn)行分析。
測(cè)定體外細(xì)胞生長(zhǎng)的方法是用在最適生長(zhǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞，或是在待測(cè)其抗真菌能力的化合物以各種所選水平存在下培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行的。殺真菌劑抑制真菌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，可由其對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低的抑制來加以測(cè)量，這種能力是這種制劑殺真菌效力的一個(gè)指標(biāo)。
實(shí)施例7骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)率的測(cè)定在胸骨或髂骨嵴處用吸出法(Illinois針頭)或中心活組織檢查法(Jamshiti針頭)取出骨髓細(xì)胞。按實(shí)施例1中的方法用花青染料標(biāo)記細(xì)胞，但是用葡萄糖或蔗糖代替甘露醇作為滲透支持介質(zhì)。在將骨髓細(xì)胞輸給受體以前，先用流式血細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)定其熒光強(qiáng)度的水平。將標(biāo)記的細(xì)胞由靜脈注入，在從外周血和骨髓中取樣前要等待適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。由受體采血和骨髓，與抗凝劑混合，按常規(guī)技術(shù)制備細(xì)胞以用于流式血細(xì)胞分析。這些樣品中含有正在生長(zhǎng)的細(xì)胞，也含有未進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞。這個(gè)直方圖會(huì)很復(fù)雜，但是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的分析與由實(shí)施例2過程中所得到資料以實(shí)施例9中的方程進(jìn)行分析的情況類似。
因?yàn)槭聚櫲玖鲜菬晒饩G，另一種與單克隆抗體偶聯(lián)的染料用來鑒定在骨髓中的每一個(gè)細(xì)胞譜系。用染色紅細(xì)胞及其前體的單克隆抗體，用紅色的熒光來鑒定出這一譜系的細(xì)胞，然后監(jiān)測(cè)該細(xì)胞中綠色熒光(及細(xì)胞生長(zhǎng))的降低。
與此相似的雙色法被用于測(cè)定淋巴樣細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和單核細(xì)胞的生長(zhǎng)。
實(shí)施例8角膜上皮生長(zhǎng)率的測(cè)定這個(gè)方法用于檢測(cè)角膜上皮移植后的生長(zhǎng)情況，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，用不傷害細(xì)胞生長(zhǎng)，眼睛不痛的技術(shù)。移植后立即用眼科配方的花青染料洗眼睛，此花青染料吸收大于680nm波長(zhǎng)的光。此操作也可用吸收低于680nm波長(zhǎng)的光的染料進(jìn)行，但激發(fā)光束在檢查組織時(shí)會(huì)引起劇烈頭痛。
在零時(shí)刻，在激發(fā)結(jié)合到角膜上的花青染料時(shí)進(jìn)行紅外照相(波長(zhǎng)大于染料的最大吸收波長(zhǎng))。熒光強(qiáng)度的水平是在零時(shí)刻細(xì)胞染色情況的指標(biāo)。之后再給眼睛照相，并將圖象與零時(shí)刻拍的照片進(jìn)行比較。在細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域內(nèi)，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減小。熒光強(qiáng)度的定量測(cè)定用于測(cè)定細(xì)胞倍增的數(shù)目。
實(shí)施例9細(xì)胞生長(zhǎng)率的計(jì)算下列數(shù)學(xué)公式用于計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間TD= (0.693(t2-t1))/(lnF(t1)-lnF(t2))其中TD是細(xì)胞倍增時(shí)間，t2和t1是細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩個(gè)任意時(shí)刻，F(xiàn)(t2)和F(t1)分別是在t2和t1時(shí)刻的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，
ln表示自然對(duì)數(shù)(底數(shù)是e)。
某生長(zhǎng)期中的細(xì)胞倍增數(shù)由下列公式?jīng)Q定N= (lnF0-lnF(t))/(ln 2)其中N是細(xì)胞倍增數(shù)目，F(xiàn)0是初始時(shí)刻的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)(t)是細(xì)胞生長(zhǎng)期后任一時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。為了測(cè)定細(xì)胞倍增數(shù)，不必一定在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期測(cè)熒光。
下面的推論說明上述公式能精確算出細(xì)胞倍增時(shí)間及細(xì)胞倍增數(shù)，用數(shù)學(xué)模擬預(yù)測(cè)的在生長(zhǎng)中的細(xì)胞質(zhì)膜上花青染料的水平，與實(shí)測(cè)結(jié)果相平行。
推論基于以下假設(shè)1.細(xì)胞以低密度培養(yǎng)，具有起始數(shù)目(No)。平均起始熒光強(qiáng)度(F0)及細(xì)胞周期時(shí)間(T2)。
2.在細(xì)胞分裂后，染料均勻地分布于子細(xì)胞中。
3.細(xì)胞培養(yǎng)過程中無延遲時(shí)間。
4.細(xì)胞的死亡是可忽略的。
5.染色是永久的，不存在細(xì)胞與細(xì)胞之間的染料轉(zhuǎn)移。
基于以上的第2個(gè)假設(shè)，細(xì)胞群體的平均熒光強(qiáng)度應(yīng)與任何時(shí)刻t的群體中細(xì)胞數(shù)目成反比。這個(gè)關(guān)系可用方程1表示F(t)·N(t)＝K (1)其中F(t)和(N(t)分別是t時(shí)刻細(xì)胞群體的平均熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)。K是比例常數(shù)。如果我們?cè)诹銜r(shí)刻計(jì)算這個(gè)方程，就成為K＝F0N0。把它代入方程1解F(t)，得到F(t)＝F0N0(1/N(t)). (2)F0和N0在假設(shè)1中定義。
從方程2中可明顯看出，如果所用的染料以理想的方式作用，熒光動(dòng)力學(xué)定與生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)直接有關(guān)?，F(xiàn)在，可確定定義熒光動(dòng)力學(xué)的關(guān)系式。方程2中的細(xì)胞數(shù)目遵從如下定義的一般的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。
dN(t)/dt＝AN(t) (3)其中A是群體生長(zhǎng)率與種群中細(xì)胞數(shù)之間關(guān)系的一個(gè)比例常數(shù)，方程4-7給出方程3的簡(jiǎn)單解法dN(t)/dN(t)＝dlnN(t)＝Adt (4)N(t)＝exp(At+C) (5)N(t)＝Noexp(At) (6)N(t)＝Noexp(0.693t/T2) (7)方程(7)的結(jié)果可代入方程(2)求出F(t)。
F(t)= (F0N0)/(N0exp(0.693t/T2)) (8)
直接簡(jiǎn)化為F(t)＝Foexp(-0.693t/T2). (9)對(duì)這個(gè)方程進(jìn)行解釋時(shí)要慎重考慮。首先，因我們已假定忽略細(xì)胞死亡，所以T2代表細(xì)胞周期時(shí)間而不是細(xì)胞倍增時(shí)間。這一點(diǎn)將在下面更仔細(xì)地考慮。如果有細(xì)胞死亡，只要結(jié)合在死亡細(xì)胞上的染料不被活細(xì)胞重新吸收，這個(gè)方程仍然正確。發(fā)生重吸收的情況將在下文中進(jìn)行處理。如果細(xì)胞群中有一部分細(xì)胞不生長(zhǎng)時(shí)，方程9只對(duì)生長(zhǎng)的部分正確。相應(yīng)地，F(xiàn)0和N0只分別用于生長(zhǎng)部分。
細(xì)胞死亡對(duì)熒光動(dòng)力學(xué)的影響讓我們考慮有明顯的細(xì)胞死亡并且染料能很快移入活細(xì)胞的情況。細(xì)胞死亡的動(dòng)力學(xué)可由方程10表示(dN(t)/dt)1＝BN(t) (10)以上B是細(xì)胞從群體中消失的速率與群體大小的比例常數(shù)。將導(dǎo)數(shù)下算，1相應(yīng)于細(xì)胞死亡的過程。讓我們以相似的方式重寫方程3。
(dN(t)/dt)2＝AN(t) (3)其中，2相應(yīng)于細(xì)胞生長(zhǎng)過程。合并生長(zhǎng)和死亡過程，得出dN(t)/dt＝(dN(t)/dt)1+(dN(t)/dt)2(11)這個(gè)方程是兩個(gè)獨(dú)立過程簡(jiǎn)單疊加的結(jié)果，也可以代換成下式dN(t)/dt＝(A+B)N(t) (12)
按方程4～6類推，這個(gè)方程簡(jiǎn)化為N(t)＝N0exp((A+B)t). (13)在方程7中測(cè)出A為0.693/T2。與此相似，可知B等于-0.693/T
。負(fù)號(hào)表示細(xì)胞死亡過程是一個(gè)消減過程。因此T
代表消減常數(shù)，我們可將它稱為群體中細(xì)胞平均半衰期。變換方程13為N(t)＝Noexp(0.693/T2-0.693/T1/2)t) (14)合并方程3和14，我們可解出熒光動(dòng)力學(xué)F(t)＝Foexp((0.693/T1/2-0.693/T2)t) (15)在以上方程中，我們可將常數(shù)T2和T
做如下合并1/TD＝1/T2-1/T1/2(16)將方程16的關(guān)系式代入方程14和15中，可以得出如下的細(xì)胞和熒光動(dòng)力學(xué)方程N(yùn)(t)＝Noexp(0.693t/TD) (17a)F(t)＝Foexp(-0.693t/TD) (17b)在方程17a和17b中，參考TD有時(shí)間單位，代表實(shí)際的細(xì)胞倍增時(shí)間而不是細(xì)胞周期時(shí)間。方程17b將限定培養(yǎng)物中熒光的分布，該培養(yǎng)物中有明顯的細(xì)胞死亡并有快速的染料重吸收。如果不滿足這兩個(gè)條件中的任何一項(xiàng)，就用方程9。比較方程17a和方程17b表明細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和熒光動(dòng)力學(xué)成反比關(guān)系，這樣細(xì)胞動(dòng)力學(xué)曲線與熒光動(dòng)力學(xué)倒數(shù)的曲線可以重疊。這一事實(shí)在圖4中清楚地說明。
細(xì)胞生長(zhǎng)延遲時(shí)間的考慮我們現(xiàn)在假定當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)時(shí)有一段延遲時(shí)間。進(jìn)一步還假定種群將從生長(zhǎng)率為零一步就達(dá)到最大生長(zhǎng)率，從而簡(jiǎn)化處理過程。在這些條件下，限定細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系式就可以容易地表示為N(t)＝Not≥tL(18a)N(t)＝Noexp(0.693(t-tL)/TD) t＜tL(18b)這里TL定義為延遲時(shí)間。將方程3與上述關(guān)系式合并，得出F(t)＝Fot≥tL(19a)F(t)＝Foexp(-0.693(t-tL)/TD) t＜tL(19b)利用這些方程，已知F0并在指數(shù)生長(zhǎng)期間測(cè)三或四次F(t)，倍增時(shí)間和延遲時(shí)間就都可測(cè)出。
生長(zhǎng)份額的測(cè)定讓我們考慮種群中部分細(xì)胞不生長(zhǎng)的情況。首先讓我們假定沒有延遲時(shí)間。我們將在后面回?cái)⒀舆t時(shí)間。為進(jìn)行推導(dǎo)，需要一個(gè)定義。在方程21中No＝(No)g+(No)n(20)
下標(biāo)g和n分別代表生長(zhǎng)和不生長(zhǎng)的部分。在任意時(shí)刻t，種群中細(xì)胞的數(shù)目應(yīng)是生長(zhǎng)的和不生長(zhǎng)的種群之和。
N(t)＝(No)n+(No)gexp(0.693t/TD) (21)但是，這個(gè)方程不能象前面那樣代入方程3。這里，生長(zhǎng)和不生長(zhǎng)的部分必須分別處理。為此目的，必須改寫方程3如下F(t)＝(Fo)n(No)n(1/N(t))n+(Fo)g(No)g(1/N(t))g(22)方程22中，(1/N(t))n等于(1/(N0)n)。因此，方程可如下簡(jiǎn)化為為F(t)＝(Fo)n+(Fo)g(No)g(1/N(t))g(23)F(t)＝(Fo)n+(Fo)gexp(-0.693t/TD) (24)我們還可按方程19b類推而引入延遲時(shí)間。
F(t)＝(Fo)n+(Fo)gexp(-0.693(t-tL)/TD) (25)種群中生長(zhǎng)細(xì)胞的部分可用方程25測(cè)定。因?yàn)樯婕暗絹喎N群，這個(gè)測(cè)定比前面的情況復(fù)雜。為測(cè)定生長(zhǎng)部分，必須等到可以區(qū)別兩個(gè)亞種群。在這一點(diǎn)上，不生長(zhǎng)部分的熒光強(qiáng)度可直接測(cè)定。將生長(zhǎng)部分的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化外推至零時(shí)刻，就可計(jì)算出生長(zhǎng)部分在零時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。生長(zhǎng)部分的份額即簡(jiǎn)單地是生長(zhǎng)部分零時(shí)刻的熒光強(qiáng)度與種群總熒光強(qiáng)度的比值。
本發(fā)明較好的實(shí)施例說明如上，然而，本發(fā)明并不限于在此公開的說明，保留所有的在下面的權(quán)利要求
書范圍內(nèi)的所有修正的權(quán)利。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率的方法，包括測(cè)定來自用花青染料標(biāo)記的母細(xì)胞的子細(xì)胞的質(zhì)膜中花青染料水平的變化。
2.一種權(quán)利要求
1的方法，其中用熒光來測(cè)定花青染料水平的變化。
3.一種權(quán)利要求
2的方法，其中的細(xì)胞是組織培養(yǎng)細(xì)胞。
4.一種權(quán)利要求
3的方法，其中的細(xì)胞是人類腫瘤細(xì)胞。
5.一種權(quán)利要求
4的方法，其中，在含有腫瘤治療劑的介質(zhì)中培養(yǎng)人類腫瘤細(xì)胞，以測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)這些制劑的敏感性。
6.一種權(quán)利要求
3的方法，其中的細(xì)胞是白血細(xì)胞。
7.一種權(quán)利要求
3的方法，其中的花青染料是DiSC14(5)或DiOC14(3)。
8.一種權(quán)利要求
2的方法，其中的細(xì)胞是細(xì)菌。
9.一種權(quán)利要求
8的方法，其中，在含有抗菌劑的介質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)菌以測(cè)定細(xì)菌對(duì)這些制劑的敏感性。
10.一種權(quán)利要求
9的方法，其中的花青染料是DiSC14(5)或DiOC14(3)。
11.一種權(quán)利要求
2的方法，其中的細(xì)胞是酵母。
12.一種權(quán)利要求
2的方法，其中，在含有抗真菌劑的介質(zhì)中培養(yǎng)酵母，以便可以測(cè)定對(duì)這些制劑的敏感性。
13.一種權(quán)利要求
12的方法，其中的花青染料是DiSC14(5)或DiOC14(3)。
14.一種權(quán)利要求
2的方法，其中的細(xì)胞是體內(nèi)組織細(xì)胞。
15.一種權(quán)利要求
14的方法，其中的體內(nèi)組織細(xì)胞是移植的細(xì)胞。
16.一種權(quán)利要求
15的方法，其中移植的細(xì)胞是骨髓細(xì)胞。
17.一種權(quán)利要求
14的方法，其中的體內(nèi)組織細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞。
18.一種權(quán)利要求
2的方法，其中的花青染料是DiSC14(5)或DiOC14(3)。
19.一種權(quán)利要求
2的方法，其中花青染料吸收波長(zhǎng)大于680nm的光。
20.一種權(quán)利要求
17的方法，其中花青染料吸收波長(zhǎng)大于680nm的光。
專利摘要
測(cè)定體內(nèi)和體外細(xì)胞生長(zhǎng)率的方法。用花青染料標(biāo)記細(xì)胞，用質(zhì)膜上花青染料水平的變化測(cè)定生長(zhǎng)率。利用細(xì)胞生長(zhǎng)率測(cè)定檢測(cè)移植的骨髓細(xì)胞的植入和手術(shù)后角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。所發(fā)明的方法還用于測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤治療劑的敏感性、酵母對(duì)抗真菌劑的敏感性和細(xì)菌對(duì)抗菌劑的敏感性。
文檔編號(hào)G01N33/50GK87107220SQ87107220
公開日1988年5月11日 申請(qǐng)日期1987年10月30日
發(fā)明者保羅·卡爾·霍蘭, 布魯斯·戴維·詹森, 休·埃倫·斯萊扎克 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩貝克曼公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan