專利名稱:體內(nèi)細(xì)胞示蹤的制作方法
本發(fā)明涉及體內(nèi)示蹤細(xì)胞的方法及測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞壽命的方法。
體內(nèi)細(xì)胞示蹤及壽命測(cè)定需要用一個(gè)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的標(biāo)志來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，即，該標(biāo)志不會(huì)從細(xì)胞中丟失也不顯著地影響細(xì)胞功能?，F(xiàn)有可用的標(biāo)志不能提供這些必需的特性。例如，熒光抗體因其容易從細(xì)胞上解離而不適用。其它可能的標(biāo)志因其干擾細(xì)胞功能而不能使用。
花青染料已用于各種生物學(xué)用途。二氧羰花青染料已用來(lái)進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。Gunter Valet，Max Planck Ges Wissensch;專利登記號(hào)84-102307/17，《通過(guò)選擇性染色及測(cè)量體積和熒光同時(shí)定量測(cè)定血細(xì)胞》。但在這些研究中用的染料是短鏈羰花青染料(少于10個(gè)碳)并對(duì)膜電位的變化起反應(yīng)。而且，短鏈羰花青染料進(jìn)入細(xì)胞的線粒體，是有細(xì)胞毒性的，并且當(dāng)洗滌細(xì)胞時(shí)，不論細(xì)胞膜電位是否改變，這些染料都容易滲漏出細(xì)胞。在許多其它生物學(xué)試驗(yàn)中用其它短脂肪鏈花青染料。但短鏈分子會(huì)對(duì)膜電位起反應(yīng)并穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入線粒體。H.M.Shapiro，美國(guó)專利號(hào)4，343，782，1982年8月10日。短鏈染料也對(duì)細(xì)胞有毒性而不能用于體內(nèi)示蹤細(xì)胞。
三羰花青染料(Fox，I.J.，et al.，proc.Mayo Clinic，32478-484，1957)和伊文思藍(lán)(Evans-Blue)染料(SChad，H.，et al.，Pfluegers Arch.Eur.J.Physiol.，370(2)139-144，1977)已通過(guò)釋釋法用于體內(nèi)測(cè)定心輸出量。Dow(Dow，P.，Physiol.Rev.，3677-102，1956)將此方法描述為，在肺的靜脈側(cè)注射已知量的某種血管內(nèi)指示劑，測(cè)定該指示劑的動(dòng)脈濃度的時(shí)間過(guò)程，以確定在注射和取樣兩點(diǎn)間的容量。這些染料不用來(lái)染色細(xì)胞。
本發(fā)明是體內(nèi)示蹤細(xì)胞和測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞壽命的新方法。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞示蹤新方法，首先將細(xì)胞用花青類染料標(biāo)記，然后將其注射給受試者，花青類染料用來(lái)確定細(xì)胞的位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量標(biāo)記細(xì)胞消失的速率來(lái)確定細(xì)胞壽命。
在本發(fā)明的體內(nèi)示蹤細(xì)胞及測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞壽命的方法中，用花青類染料標(biāo)記細(xì)胞。在此，具有下列結(jié)構(gòu)的化合物稱為花青類染料
其中y是氧、硫、亞甲基或烷基取代的亞甲基;
m是0-3;
n是12-22。
此處所用的烷基取代的亞甲基系指以任何組合的甲基、乙基或丙基取代的單或雙取代的亞甲基。
上述結(jié)構(gòu)的化合物可用下列通用的速記式來(lái)表示DiYCn(2m+1)Sims，P.J.，et al.，Biochem，133315(1974)。這樣，如該化合物中Y是硫，有三個(gè)碳連接兩個(gè)環(huán)，并有兩個(gè)十四碳的脂肪鏈，則表示為DiSC14(3)。類似地，DiIC14(5)表示該化合物中Y是異丙基，有五個(gè)碳連接兩個(gè)環(huán)，并有兩個(gè)十四碳的脂肪鏈。
包括在此處稱為花青類染料的化合物，是具有一個(gè)或多個(gè)取代的上述結(jié)構(gòu)的化合物，假定這樣的取代化合物至少在標(biāo)記所需的時(shí)間內(nèi)溶于細(xì)胞標(biāo)記介質(zhì)，并且有足夠高的膜分配系數(shù)以保持與標(biāo)記的細(xì)胞膜相連。這樣的化合物還必須在標(biāo)記所需的濃度下不顯著影響細(xì)胞的活性。如下所述測(cè)定染料在細(xì)胞標(biāo)記介質(zhì)中的溶解度通過(guò)將花青類染料分散在標(biāo)記介質(zhì)中，用常規(guī)熒光分光光度技術(shù)測(cè)量熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。熒光強(qiáng)度減弱表明染料沉淀并附著于容器壁上。例如，可用已知的流式細(xì)胞儀方法監(jiān)測(cè)標(biāo)記后注入供體動(dòng)物的紅血細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，測(cè)定染料是否保持同細(xì)胞膜相連，注射后基本恒定的標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，可證實(shí)染料在細(xì)胞膜中的穩(wěn)定性。
摻入一個(gè)可用磁共振成象技術(shù)檢測(cè)的原子的上述結(jié)構(gòu)的化合物，也包括在此處稱為花青類染料的化合物中。這樣的化合物可用已知技術(shù)制備，例如，把氟原子摻入脂肪鏈的一個(gè)甲基中。用一伽馬放射體如125I標(biāo)記的上述結(jié)構(gòu)的化合物在此也歸入花青類染料。
本發(fā)明中所用的花青類染料可從各種來(lái)源如Molecular Probe，Inc.，Eugene，Oregon買到，也可用已知的合成方法從現(xiàn)有的起始物質(zhì)制備。Hamer，F(xiàn).M.，《花青染料和有關(guān)化合物》，Interscience Publishers(1964)。
使用所發(fā)明的方法，任何活細(xì)胞都可用花青類染料標(biāo)記。此處所用的術(shù)語(yǔ)細(xì)胞，包括有核的真核細(xì)胞如白血細(xì)胞、各種腫瘤細(xì)胞、其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如組織培養(yǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞)、酵母;無(wú)核的細(xì)胞如紅血細(xì)胞和血小板。一個(gè)有核細(xì)胞如基本上能象對(duì)本類型的細(xì)胞所期望的那樣生長(zhǎng)或行使功能，那末就是活的;無(wú)核細(xì)胞如果能表現(xiàn)其預(yù)期的功能就是活的，如，一個(gè)活的紅細(xì)胞能運(yùn)輸氧的二氧化碳;例如活的血小板在凝集和釋放試驗(yàn)中象預(yù)期的那樣表現(xiàn)出它的功能。
細(xì)胞標(biāo)記是在對(duì)細(xì)胞非致死的、能提供可重復(fù)的細(xì)胞標(biāo)記的介質(zhì)中進(jìn)行。為使介質(zhì)具有必備的特性，使用滲透性調(diào)節(jié)劑，至少在標(biāo)記所需的時(shí)間內(nèi)，花青染料在滲透性調(diào)節(jié)劑中形成穩(wěn)定溶液。可用的滲透性調(diào)節(jié)劑包括象糖，單糖如葡萄糖、果糖、山梨糖、木糖、核糖，以及雙糖如蔗糖，糖醇如甘露糖醇、甘油、肌醇、木糖醇、阿東糖醇、氨基酸如甘氨酸和精氨酸，還有某些顧氏緩沖劑(Good′s buffers)如N-三(羥甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸。Good，N.E.，et al.，Biochem.15，467-477(1966)，Good，N.E.and S.Izawa，Methods Enzymol.，24，Part B，53(1968)，F(xiàn)eguson，W.J.，et al.，Anal.Biochem.104301-310(1980)。然而，某些細(xì)胞系可能對(duì)一種或多種滲透性調(diào)節(jié)劑敏感，特別是對(duì)糖醇。因此，在標(biāo)記前要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)以確定細(xì)胞在所要用的滲透性調(diào)節(jié)劑中能存活。此外，可將少量緩沖劑加入標(biāo)記介質(zhì)以調(diào)節(jié)氫離子濃度。
接觸各種滲透性調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞活性的影響，通過(guò)在細(xì)胞接觸各種滲透性調(diào)節(jié)劑30分鐘后測(cè)量Yac細(xì)胞的倍增時(shí)間來(lái)確定。Yac細(xì)胞是一種小鼠淋巴瘤組織培養(yǎng)細(xì)胞系，可從American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到，并在European Journal of Immunology 5112-117(1975)中作了描述。表1所示的數(shù)據(jù)表明，與用磷酸鹽緩沖液相比，接觸蔗糖、葡萄糖、顧氏緩沖劑(TAPS、CAPS、EPPS、HEPPSO、DIPSO)對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間沒(méi)有影響，表明不存在與接觸相關(guān)的細(xì)胞毒性。
表1滲透性調(diào)節(jié)劑 倍增時(shí)間(小時(shí))磷酸鹽緩沖液 31.0蔗糖 41.0葡萄糖 34.5TAPS 32.7CAPS 45.8EPPS 32.2HEPPSO 23.4DIPSO 36.73-氨基-1-丙磺酸 99.63-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉(MOPS) A2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇 B2-氨基-2-甲基-1-丙醇 BN-三(羥甲基)甲氨基乙磺酸(TES) BN，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES) A3-(環(huán)己氨基)-2-羥基-1-丙磺酸(CAPSO) A三乙醇胺 B三(羥甲基)氨基甲烷(TRIZMA) BBis-tris丙烷 B2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES) B3-〔二甲基(羥甲基)甲氨基〕-2-羥基丙磺酸(AMPSO) A
表1(續(xù))滲透性調(diào)節(jié)劑 倍增時(shí)間(小時(shí))N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE) 57.73-〔(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨〕-1- B丙磺酸鹽(CHAPS) B3-〔N-三(羥甲基)甲氨基〕2-羥基丙磺酸(TAPSO) 63.63-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(MOPSO) 178.42-〔(2-氨基-2-氧代乙基)氨基〕乙磺酸(ACES) 1038.4雙(2-羥乙基)亞氨基-三-(羥甲基)甲烷(BIS-TRIS) A2-(N-環(huán)己氨基)乙烷磺酸(CHES) 51.5N-三-(羥甲基)甲基甘氨酸(TRICINE) A葡萄糖胺 288.4咪唑 B甘氨酰甘氨酸 66.9A-不生長(zhǎng)或部分細(xì)胞毒性B-急性細(xì)胞毒性表2給出了用來(lái)檢查花青類染料溶解度的各種滲透性調(diào)節(jié)劑。用離心法除去沉淀后，取一定量含花青類染料的滲透性調(diào)節(jié)劑溶解到乙醇中，用熒光分光光度法測(cè)濃度。所用的染料為DiSC14(5)和DiOC14(3)，滲透性調(diào)節(jié)劑為等滲濃度。以乙醇溶液為標(biāo)準(zhǔn)的熒光強(qiáng)度的降低直接與花青類染料溶解度的降低相關(guān)。
表2滲透性調(diào)節(jié)劑 相對(duì)熒光強(qiáng)度(CONC)DiSC14(5) DiOC14(3)乙醇 100 100葡萄糖 31 100果糖 35 100山梨糖 40 100蔗糖 41 100木糖 36 19-52核糖 24 100來(lái)蘇糖 0.12 1.8甘氨酸 31 93精氨酸 17 17.2甘油 39 99.5肌醇 42 92木糖醇 34 76.4甘露醇 29 ＊阿東糖醇 34 ND三(羥甲基)-甲氨基丙磺酸(TAPS) 18 ND3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸(CAPS) 40 NDN-(2-羥乙基)哌嗪-N′-3-丙磺酸(EPPS) 18 ND
表2(續(xù))滲透性調(diào)節(jié)劑 相對(duì)熒光強(qiáng)度(CONC)DiSC14(5) DiOC14(3)N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-羥基丙磺酸(HEPPSO) 20 ND3-〔N-N-雙(2-羥乙基)氨基〕-2-羥基丙磺酸(DIPSO) 43＊＊＊NDNaCl 6 1.7磷酸鹽緩沖液 2.1 6.5Na2SO47.4 1.6NaI 1.1 0.14氯化膽堿 11＊＊6.3碘化膽堿 0.16 2.3＊在乙醇中沉淀，沒(méi)有得到數(shù)據(jù)。
＊＊由于大結(jié)晶不沉淀造成的假象。
＊＊＊在乙醇中沉淀(可疑數(shù)據(jù))ND 未測(cè)由表2可見(jiàn)，花青類染料在有一般鹽存在時(shí)的溶解性，比在有糖(來(lái)蘇糖除外)、糖醇、氨基酸、顧氏緩沖劑TAPS、HEPPSO、DIPSO、CAPS和EPPS存在時(shí)低得多。此外，測(cè)定了DiSC14(5)在下列溶液中的穩(wěn)定性糖如葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖、蔗糖、木糖、糖醇如甘油、肌醇、木糖醇、阿東糖醇，氨基酸如甘氨酸和精氨酸?；ㄇ囝惾玖显跍y(cè)試過(guò)的溶液中至少穩(wěn)定20分鐘，這個(gè)時(shí)間足夠進(jìn)行可重復(fù)的標(biāo)記，并且，在許多試劑中，溶液中花青類染料的量在60分鐘時(shí)沒(méi)有顯著減少。
進(jìn)一步，測(cè)定了花青類染料在含有一般鹽類及可溶解該染料的滲透性調(diào)節(jié)劑的介質(zhì)中的溶解度。蒸餾水稀釋不顯著影響DiSC14(5)在等滲葡萄糖溶液中的溶解度。但是，用僅約20%的等滲氯化鈉溶液稀釋，DiSC14(5)在等滲的葡萄糖溶液中的溶解度就顯著降低。因此，可在僅含少量一般鹽類的介質(zhì)中用花青染料進(jìn)行可重復(fù)的細(xì)胞標(biāo)記，這些鹽類如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乙酸鈉、乙酸鉀、硫酸鈉、碘化鈉、氯化膽堿，或碘化膽堿。最好在不用一般鹽類調(diào)節(jié)滲透性的介質(zhì)中進(jìn)行。
分析采用本發(fā)明標(biāo)記了花青類染料的細(xì)胞，以確定標(biāo)記過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性的影響。將可從American Type Culture Collection，Rockville，Maryland得到的V79細(xì)胞用含有濃度為10-5或4×10-5MDiOC14(3)的溶液進(jìn)行標(biāo)記，并將染色細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)與未染色細(xì)胞及染色和未染色細(xì)胞的等量混合物相比較。V79細(xì)胞由Prescott，D.M.，Ann.New York Acad.Sci.，397101-109(1982)描述?；ㄇ囝惾玖蠘?biāo)記不影響細(xì)胞倍增時(shí)間。所以標(biāo)記對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響。而且，幾種其它的常規(guī)細(xì)胞活性試驗(yàn)如臺(tái)盼藍(lán)排除法(Trypan Blue Exclusion)和Propidium Iodide排除法，也證實(shí)了按所述方法進(jìn)行的花青類染料標(biāo)記對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響。
花青類染料標(biāo)記對(duì)細(xì)胞活性的影響也可通過(guò)測(cè)定紅細(xì)胞脆性來(lái)確定。通過(guò)改變鹽濃度，把標(biāo)記的和未標(biāo)記的紅血細(xì)胞懸浮在各種滲透強(qiáng)度的氯化鈉介質(zhì)中。細(xì)胞的體積分布用連有一個(gè)管道附件的庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器(Coulter Counter)來(lái)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)定平均體積并對(duì)每個(gè)鹽濃度作圖，體積隨氯化鈉濃度的下降而增大，直至鹽濃度為大約0.5克/100ml時(shí)，體積出現(xiàn)陡降。在這個(gè)點(diǎn)上紅細(xì)胞溶解。而且，不論細(xì)胞用花青類染料標(biāo)記與否，體積變化都相同。以相似的方式，在平行樣品中將溶血作為氯化鈉濃度的函數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。將紅細(xì)胞放入氯化鈉中約2-3分鐘后，離心溶液以沉降任何未溶解的細(xì)胞。上清溶液進(jìn)行分光光度分析以測(cè)定血紅蛋白濃度。將每個(gè)樣品的血紅蛋白濃度與全部溶解的對(duì)照樣品相比較，確定溶解百分比。游離血紅蛋白的濃度相當(dāng)?shù)停敝谅然c濃度達(dá)到約0.5克/100ml，此后，血紅蛋白迅速釋放。與紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較，體積變化直接與血紅蛋白的釋放相關(guān)。而且，血紅蛋白的釋放在標(biāo)記和未標(biāo)記的細(xì)胞中是相同的。
為檢驗(yàn)按本發(fā)明的方法以花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞的體內(nèi)穩(wěn)定性，取出兔紅細(xì)胞，用DiSC14(5)標(biāo)記，再重新輸入。此后定期取血樣分析標(biāo)記細(xì)胞的百分比及標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。循環(huán)的紅細(xì)胞的數(shù)目作為時(shí)間的函數(shù)線性下降，所測(cè)得的標(biāo)記細(xì)胞的壽命52天，與報(bào)導(dǎo)過(guò)的兔紅細(xì)胞的平均壽命40至60天非常接近。因此，花青類染料標(biāo)記不影響紅血細(xì)胞的清除率。
在所試驗(yàn)的五只兔子中，除一只外，標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在標(biāo)記和重新注射60天后都基本保持不變。在第五只動(dòng)物中，不超過(guò)20%的花青類染料在循環(huán)60天后，從標(biāo)記細(xì)胞中釋放出來(lái)。這些數(shù)據(jù)加上從組織培養(yǎng)得來(lái)的數(shù)據(jù)，表明沒(méi)有染料從標(biāo)記細(xì)胞向未標(biāo)記細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，說(shuō)明細(xì)胞是被染料穩(wěn)定標(biāo)記的。
在本發(fā)明中花青類染料標(biāo)記的活細(xì)胞用于哺乳動(dòng)物，包括人的體內(nèi)細(xì)胞示蹤及體內(nèi)細(xì)胞壽命分析。此處所用的體內(nèi)細(xì)胞示蹤，包括測(cè)定細(xì)胞在受試者體內(nèi)的定位及測(cè)量細(xì)胞通過(guò)固定點(diǎn)的速率，如細(xì)胞流過(guò)血管的速率。
輸入一部分花青類染料標(biāo)記的紅血細(xì)胞來(lái)測(cè)定輸入的紅血細(xì)胞的壽命。輸入后，用常規(guī)技術(shù)立即測(cè)定系統(tǒng)循環(huán)中標(biāo)記紅血細(xì)胞的百分率。隨后，標(biāo)記細(xì)胞的百分比用于計(jì)算輸入細(xì)胞的壽命。進(jìn)一步，通過(guò)比較標(biāo)記細(xì)胞百分比的變化和血細(xì)胞比容的變化，將輸入后出血與免疫反應(yīng)區(qū)別開(kāi)來(lái)。輸入速率與標(biāo)記細(xì)胞百分比降低率相同，表明由出血造成的失血，而標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)降低率較高則表明對(duì)輸入細(xì)胞的免疫反應(yīng)。為避免血紅蛋白引起的自身熒光和自身淬滅，最好用在紅光波長(zhǎng)范圍內(nèi)受激發(fā)并發(fā)射比血紅蛋白的激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光的花青染料來(lái)標(biāo)記紅細(xì)胞。這類染料的例子包括DiC14(5)和DiSC14(3)。
使用與對(duì)紅血細(xì)胞所用的技術(shù)相似的技術(shù)，可得出血小板的體內(nèi)壽命及區(qū)別出血與免疫反應(yīng)造成的血小板減少。但由于血小板缺少在所用的波長(zhǎng)內(nèi)吸收或發(fā)射光的分子，各種花青類染料用于血小板的測(cè)定，利用上述的用于紅血細(xì)胞的方法，這樣的血小板壽命測(cè)定可用來(lái)區(qū)別輸血后的出血和免疫反應(yīng)，也可用于診斷動(dòng)脈粥樣硬化或其它疾病，在這些疾病中，受疾病影響的患者的血小板壽命與未受疾病影響的患者的血小板壽命不同。此外，上述的方法可用來(lái)進(jìn)行其它細(xì)胞的體內(nèi)壽命的測(cè)定，包括白血細(xì)胞。
在體內(nèi)細(xì)胞示蹤分析中，細(xì)胞用可從外部檢測(cè)的花青類染料進(jìn)行標(biāo)記。這種可從外部檢測(cè)的染料包括花青類染料如125I標(biāo)記的DiOC14(3)。也可用帶有核磁共振探針的花青類染料進(jìn)行細(xì)胞示蹤，這樣就可用核磁共振成象來(lái)確定標(biāo)記細(xì)胞的位置。此外，花青類染料的熒光可用來(lái)在體外觀察體內(nèi)的示蹤細(xì)胞。最常見(jiàn)的是，熒光用來(lái)在眼睛的斑點(diǎn)、視網(wǎng)膜和血管中示蹤細(xì)胞。如下面的實(shí)施例所述，體內(nèi)細(xì)胞示蹤的用途包括原發(fā)癌癥和轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的檢測(cè)，感染部位的檢測(cè)、動(dòng)脈縮狹的成象及移植排斥反應(yīng)的測(cè)定。
下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，并不意味著限制上面所定義及下面所要求的發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 組織培養(yǎng)細(xì)胞的染色方法Ⅰ.細(xì)胞的制備使用對(duì)數(shù)期的組織培養(yǎng)細(xì)胞以得到最好的結(jié)果。將懸浮培養(yǎng)物從培養(yǎng)容器中取出并放入聚丙烯離心管中。
用單層培養(yǎng)時(shí)，必須除去上清液并用無(wú)鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液洗滌附著的細(xì)胞，以從瓶中除去血清蛋白。加入胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco Laboratories，Grand Island，New York，＃610-5300)覆蓋瓶底并在室溫下培養(yǎng)，直至細(xì)胞單層松動(dòng)并分散開(kāi)來(lái)。將所得細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中，加入等體積的含10%胎牛血清(FBS)(Hazelton)的培養(yǎng)介質(zhì)以終止胰蛋白酶的作用。細(xì)胞以400×g在室溫下離心10分鐘。吸出上清液，代之以等體積的等滲的甘露醇，以重新懸浮細(xì)胞沉淀。這次甘露醇洗滌是為了從細(xì)胞懸浮液中除去血漿蛋白并制備用于染色的細(xì)胞。細(xì)胞再次在室溫下以400×g離心10分鐘。吸出上清液，所得細(xì)胞沉淀在甘露醇溶液中以2×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮而用于染色。但某些細(xì)胞系對(duì)糖醇(甘露醇)的使用敏感;在這種情況下，可用等滲的葡萄糖溶液(MW 180.16，54.05g/l)。
Ⅱ.染料原液的配制用無(wú)水乙醇制備2×10-3M原液如下DiO-C14(3) MW 800(1.600mg/ml)DiS-C14(5) MW 814(1.628mg/ml)DiO-C18(3) MW 936(1.872mg/ml)DiI-C14(5) MW 850(1.700mg/ml)所有染料都來(lái)自Molecular Probes，Eugene，Oregon。
染料原液進(jìn)行聲處理以保證染料完全溶解，并使其對(duì)管的附著降至最低。用聚苯乙烯管來(lái)制備原液，便可觀察到染料的溶解。但用聚丙烯管來(lái)染色細(xì)胞，因?yàn)榛ㄇ囝惾玖显谒原h(huán)境中對(duì)聚丙烯的附著比對(duì)聚苯乙烯的附著要小得多。
Ⅲ.細(xì)胞染色在等滲的甘露醇中，將細(xì)胞濃度調(diào)至2×106個(gè)細(xì)胞/ml。為染色細(xì)胞，將2×10-3M的染料原液加入染色液中，每1ml細(xì)胞懸浮液加5ul染料。抽吸或攪拌用于染色的樣品以使樣品充分混合。細(xì)胞在染料中培育10分鐘后，取出一小部分在熒光顯微鏡下檢查，以確保達(dá)到強(qiáng)烈而均勻的染色。DiO系列的染料用對(duì)488nm的激發(fā)光具有選擇性的顯微鏡濾光片，而DiS和DiI系列的染料在575nm附近激發(fā)才能觀察到熒光。
培育后，將等體積的PBS加到染色細(xì)胞的懸浮液中。細(xì)胞在20℃以400×g離心10分鐘。吸出上清液，沉淀用PBS重新懸浮。重復(fù)離心步驟，觀察所得上清液中存在的染料。如果染料明顯存在于上清液中，重復(fù)洗滌，直至上清液用熒光分光光度法測(cè)不到游離的染料。在最后一次洗滌后，除去上滑液并用合適的培養(yǎng)介質(zhì)重新懸浮沉淀至所需的濃度。所有步驟都在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
實(shí)施例2 紅細(xì)胞染色Ⅰ.試劑配制A.檸檬酸鹽抗凝劑1.66g 檸檬酸鈉0.206g 檸檬酸0.140g NaH2PO41.61g 葡萄糖將所列各組分溶于63ml蒸餾水中，溶液PH調(diào)至5.6。最后溶液通過(guò)0.22微米的濾膜滅菌。
B.等滲葡萄糖溶液將葡萄糖(54.05g)溶于1升蒸餾水中。用菲克(Fiske)滲透壓計(jì)檢查克分子滲透壓濃度，如需要，調(diào)至320mOsm。
Ⅱ.染料原液的配制在無(wú)水乙醇中溶解1.628mg/ml的染料，配成2×10-3M的DiIC14(5)原液?？赡苄枰曁幚韥?lái)完全溶解染料。
Ⅲ.染色步驟使用裝有檸檬酸鈉的抽血管，或裝有所配制的檸檬酸鹽抗凝劑的注射器，抗凝劑的量為注射器體積的十分之一，無(wú)菌收集全血。留出一小部分用作流式細(xì)胞儀或功能試驗(yàn)。血液在室溫下以100×g離心10分鐘以沉淀紅細(xì)胞。取出含血小板的血漿并保存，加入五倍于紅細(xì)胞壓積的等滲葡萄糖洗滌紅細(xì)胞。應(yīng)再次在室溫下以100×g離心細(xì)胞10分鐘，吸出上清液。除去血清蛋白而使染色更強(qiáng)烈而均勻的洗滌重復(fù)一次以上。在最后一次離心并吸出上清液之后，在等滲的葡萄糖中重新懸浮紅細(xì)胞，使其濃度達(dá)4×108個(gè)細(xì)胞/ml。
加入染料之前，抽吸或攪拌樣品以確保不發(fā)生沉降。每一毫升的紅細(xì)胞懸浮液加入15微升的DiSC14(5)原液(乙醇中濃度為2mM)。立即混合樣品以保證染料迅速而均勻地分布于溶液中。大約5分鐘后，取出一小部分作顯微鏡觀察。用蠟筆在顯微鏡玻片上畫(huà)一個(gè)圈，將染色液中的少量細(xì)胞樣品放進(jìn)圈內(nèi)。在玻片上放一個(gè)蓋片，觀察樣品。用蠟圈可減少由玻片和蓋片引起的盤(pán)狀細(xì)胞-棘狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化(discocyte-echinocyte transformation)。用塑料玻片和蓋片也可防止這種轉(zhuǎn)化。這樣，就可以在整個(gè)染色步驟中保證產(chǎn)生強(qiáng)烈而均一的染色的同時(shí)，保持紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。5分鐘后，細(xì)胞應(yīng)被均勻染色，接觸染料時(shí)間不必長(zhǎng)于10分鐘。
確定細(xì)胞已被均勻染色之后，將等體積的磷酸鹽緩沖液加入染色懸浮液中。細(xì)胞在室溫下以400×g離心10分鐘，除去上清液。離心后，上清液常會(huì)見(jiàn)到有游離染料存在的痕跡，因此必須用含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖液重復(fù)洗滌，直到用熒光分光光度法在上清液中測(cè)不到游離染料。
在此，可將細(xì)胞懸浮于適當(dāng)?shù)娜芤褐杏糜趯?shí)驗(yàn)，也可懸浮于無(wú)血小板的血漿中用于重新注射給受試動(dòng)物。對(duì)重新注射來(lái)說(shuō)，一般的方法是將已染色的紅細(xì)胞重新懸浮于一定量的血漿中，該血漿從所收集的全血的首次離心中得到并在400×g下離心除去了血小板。所有步驟都使用無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行。
實(shí)施例3 血小板染色Ⅰ.細(xì)胞的制備使用裝有檸檬酸鈉的抽血管，或裝有所配制的檸檬酸鈉抗凝劑的注射器，抗凝劑的量為注射器總體積的十分之一，收集全血。細(xì)胞在室溫下以100×g離心10分鐘以得到血小板豐富的血漿。在涉及血小板的所有步驟中都要使用塑料吸管和聚丙烯離心管以防止激活。
吸出血小板豐富的血漿并將其轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中。然后在20℃下以1000×g離心10分鐘使血小板從血漿中沉淀下來(lái)。然后收集血漿留作功能試驗(yàn)用，也可作重新注射的懸浮介質(zhì)用。該血漿應(yīng)在4000×g下離心10分鐘，以確保在用作重新懸浮的介質(zhì)前，除去任何殘留的血小板，這種血漿被稱為無(wú)血小板血漿(PPP)。
從1000×g下離心得到的血小板沉淀，應(yīng)小心地重新懸浮于少量的檸檬酸鹽抗凝血?jiǎng)┲?，以得到濃縮的均一的懸浮液。此后，可將與初始血漿等量的等滲葡萄糖作為稀釋劑加入其中。然后血小板在300×g下離心5分鐘，吸出上清液。此步葡萄糖洗滌除去殘余的血漿蛋白并使得染色均一而更強(qiáng)。在葡萄糖溶液中重新懸浮血小板沉淀，即可進(jìn)行染色。
將血小板濃度調(diào)至4×108個(gè)細(xì)胞/ml，每毫升血小板懸浮液中加入15ul DiOC14(3)原液(在無(wú)水乙醇中濃度為2mM)。立即小心地充分混合懸浮液以確保染料均勻分布。用熒光顯微鏡觀察血小板，確保達(dá)到均勻染色，如果是這樣，就可進(jìn)行血小板與懸浮液中游離染料的分離。
Ⅱ.使用Sephadex G-100柱分離標(biāo)記的血小板傳統(tǒng)上用Sepharose 2B從血小板豐富的血漿中分離血小板。我們發(fā)現(xiàn)，Sephadex G-100在血小板的分離中也很有效。本技術(shù)與染色技術(shù)一起使用，并按下列方法進(jìn)行操作。將血小板-染料懸浮液上柱。小分子量的染料截留在顆粒中，而大個(gè)的血小板則直接通過(guò)柱子。Sephadex G-100可以這種方式用于熒光標(biāo)記的血小板與懸浮液中的游離染料的分離。
A.柱的制備按生產(chǎn)廠(Pharmacia Laboratories，Piscataway，New Jersey)的操作說(shuō)明書(shū)將Sephadex G-100溶脹，并在丙酮(100%)中洗滌，以制備分離血小板的介質(zhì)。洗滌步驟如下進(jìn)行Sephadex在室溫下以300×g離心10分鐘，除去上清液后重新懸浮于Hanks平衡鹽溶液中。應(yīng)用Hanks平衡鹽溶液重復(fù)洗滌Sephadex，直至不再聞到丙酮味。將所得溶液置于沸水浴或置于真空中進(jìn)行除氣。
用Sephadex漿灌柱。。用一個(gè)不帶插塞的10cc的注射器作柱子。將硅酮管連到注射器的頭上，用一個(gè)可調(diào)節(jié)的小管夾調(diào)節(jié)過(guò)柱的液流。用47微米孔徑的尼龍網(wǎng)作注射器底部的支持物擋住Sephadex珠。應(yīng)避免用以帶燒結(jié)玻璃濾片為支持物的常規(guī)玻璃柱，因?yàn)檫@些柱可能會(huì)激活血小板。用Hanks溶液灌入柱內(nèi)，將少量Sephadex漿加入柱中。將夾子開(kāi)大到足以使液流緩慢而連續(xù)地流。此操作使Sephadex均勻地壓緊并防止形成孔道或氣隙。重復(fù)加HBSS和Sephadex漿的步驟，直至得到所需大小的柱體積。使用前應(yīng)用HBSS(2個(gè)外水體積)將柱徹底沖洗。
B.血小板的分離將血小板染料及懸浮液小心地鋪在Sephadex上。應(yīng)將柱底部的夾子打開(kāi)并應(yīng)使柱中的液面下降，直至達(dá)到Sephadex液的頂部。繼續(xù)流動(dòng)使懸浮液穿過(guò)Sephadex。當(dāng)液面處在Sephadex頂部時(shí)，再次減慢流動(dòng)。在柱的頂部小心加入足夠的HBSS形成緩沖層，以便再加入HBSS時(shí)不擾亂Sephadex珠面。再次恢復(fù)柱的流動(dòng)。用這種方法可使血小板懸浮液在凝膠中形成致密帶，并以非常均勻的速度移動(dòng)穿過(guò)整個(gè)柱子。用這種方法可得到較濃縮的血小板流出液。繼續(xù)流過(guò)柱子，以0.5到1.0ml為一管收集。含血小板的各管可由其不透明性而觀察到并將它們合并在一起。然后將合并的各組分以300×g離心10分鐘。吸出上清液，可用合適的介質(zhì)重新懸浮沉淀用于實(shí)驗(yàn)或分析，或?qū)o(wú)血小板血漿上清液用于功能測(cè)定或重新注射。
實(shí)施例4 區(qū)別輸入后出血和免疫反應(yīng)輸入前，用熒光形式的標(biāo)記分子標(biāo)記每份欲輸入的血液中的少量紅血細(xì)胞。在手術(shù)和血液輸入之后，立即取出少量靜脈血，用常規(guī)流式細(xì)胞儀或熒光分光光度法測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞的百分比(熒光百分比)。首次靜脈抽血后，以定期的間隔取一定量血液進(jìn)行類似的分析。如果發(fā)生內(nèi)出血，即使血容量下降，染色細(xì)胞與未染色細(xì)胞的比率也不改變。如果病人正經(jīng)受一個(gè)輸血后反應(yīng)，則染色的細(xì)胞(它們是輸入的細(xì)胞)首先被破壞，染色細(xì)胞與未染色細(xì)胞的比率下降。這種方法使人們有可能區(qū)分出血和輸血后免疫反應(yīng)。
實(shí)施例5 自發(fā)性血小板減少癥的診斷除了要測(cè)定血小板壽命和血小板產(chǎn)生速率外，本方法與實(shí)施例4相同。因此，輸入前要標(biāo)記患者本身的血小板(見(jiàn)實(shí)施例3)。輸入血小板后，立即取少量靜脈血，用常規(guī)的流式細(xì)胞儀或熒光分光光度法測(cè)定每毫升中標(biāo)記血小板的數(shù)目(熒光百分比)。首次靜脈抽血后，以一定的間隔取另外的一定量的血液分析熒光陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。將染色的血小板和未染色的血小板的百分比作為時(shí)間的函數(shù)作圖，為臨床醫(yī)生提供了標(biāo)記血小板消亡速率和未標(biāo)記血小板產(chǎn)生速率。血小板產(chǎn)生或消亡的速率是血小板減少癥過(guò)程的動(dòng)態(tài)尺度。以此方式，臨床醫(yī)生可確定，類似于自發(fā)性血小板減少病的癥狀是否處在血小板產(chǎn)生或血小板壽命的水平。
輸入的血小板也用這些染料標(biāo)記。而且，供血者血小板壽命的測(cè)定也與已描述的用于自身血小板的方式相同。
實(shí)施例6 動(dòng)脈粥樣硬化的診斷使用本方法診斷動(dòng)脈粥樣硬化是基于這樣一個(gè)假設(shè)，即動(dòng)脈粥樣硬化患者的血小板的壽命比正常血小板的壽命短。將患者的一小部分血小板用熒光、NMR、或放射標(biāo)記的形式的細(xì)胞標(biāo)記染料進(jìn)行標(biāo)記(按實(shí)施例3的方案)。
重新注射用該分子的熒光形式標(biāo)記的血小板(方法見(jiàn)實(shí)施例3)，血小板的壽命用連續(xù)靜脈穿刺法進(jìn)行測(cè)定，剩下的標(biāo)記血小板的數(shù)量作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行測(cè)定(見(jiàn)實(shí)施例5)。血小板壽命的測(cè)定指示了血小板壽命的降低，可用于動(dòng)脈粥樣硬化的診斷。
另一個(gè)診斷方法是利用該分子的放射性同位素形式(伽馬發(fā)射體)，在體外標(biāo)記患者的血小板(用實(shí)施例3的方法)。重新輸入標(biāo)記的血小板，用常規(guī)同位素計(jì)數(shù)方法測(cè)定血小板的壽命，也可用常規(guī)伽馬照相機(jī)給患者照相以確定標(biāo)記血小板是否粘附于血管壁上。
實(shí)施例7 原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)用兩種不同的細(xì)胞學(xué)方法與該分子的伽馬發(fā)射體或NMR敏感的形式相結(jié)合。在兩種方法中都使用了親腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞(tumor cell-seeking cells)。一種方法用活化的或未活化的淋巴細(xì)胞，另一種方法用單核細(xì)胞、中性白細(xì)胞或血小板示蹤。
淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞在體內(nèi)采用白細(xì)胞介素-2或等效分子用已方法進(jìn)行活化。然后利用實(shí)施例1的方法，用該分子的放射性或NMR形式標(biāo)記這些細(xì)胞，并重新輸入患者體內(nèi)。然后把患者置于合適的顯像裝置下，監(jiān)測(cè)白細(xì)胞的“歸巢”以確定未知起源的腫瘤的位置。
一種相似的方法使用受試患者的單核細(xì)胞代替淋巴細(xì)胞。在此方法中，單核細(xì)胞用對(duì)腫瘤類型特異的人或小鼠的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，以保持對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別。Foris，G.，et al.，Cell.Immuno.78276-284(1983)。然后把這些細(xì)胞用標(biāo)記分子的放射性同位素或NMR成象形式來(lái)標(biāo)記，并重新注射給患者。時(shí)間連續(xù)的成象揭示出趨靶單核細(xì)胞的歸位。
在另一個(gè)定位原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶的方法中，單核細(xì)胞、中性白細(xì)胞或血小板如實(shí)施例3所述進(jìn)行標(biāo)記并用來(lái)尋找腫瘤或轉(zhuǎn)移灶。由于這些細(xì)胞在腫瘤部位出現(xiàn)得早，所以顯示標(biāo)記細(xì)胞能定位腫瘤。
實(shí)施例8 感染部位的檢測(cè)在本項(xiàng)應(yīng)用中示蹤中性白細(xì)胞。取待試患者的中性白細(xì)胞，用標(biāo)記分子的放射性同位素或NMR成象形式來(lái)標(biāo)記(用實(shí)施例1和2的方法標(biāo)記)。然后回輸這些細(xì)胞，用伽馬照相機(jī)或核磁成象技術(shù)做中性白細(xì)胞歸位的成象以鑒定出感染部位。連續(xù)成象可用于鑒定中性白細(xì)胞聚集過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，監(jiān)測(cè)由治療所致的變化。
實(shí)施例9 通過(guò)檢查黃斑變性檢測(cè)糖尿病患者的視網(wǎng)膜病用一種形式的標(biāo)記分子標(biāo)記(方法見(jiàn)實(shí)施例2)少量紅血細(xì)胞(O型或自身細(xì)胞)，該標(biāo)記分子的激發(fā)波長(zhǎng)在人類可見(jiàn)范圍之外(大于700nm)。然后將細(xì)胞由靜脈重新注射給患者。用常規(guī)的熒光視網(wǎng)膜照相，可攝下連續(xù)的視網(wǎng)膜血管的照片。用適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)激發(fā)攜帶熒光示蹤化合物的細(xì)胞，在照相底片上捕獲所發(fā)射的熒光。由于紅細(xì)胞吸收染料，而紅細(xì)胞不會(huì)流動(dòng)到脈管系統(tǒng)之外，所以只有視網(wǎng)膜血管才有熒光圖象。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用常規(guī)雙光束激光激發(fā)器來(lái)測(cè)量血流速率，該激發(fā)器在血管內(nèi)的兩個(gè)不同點(diǎn)上激發(fā)相同的細(xì)胞。但兩個(gè)激發(fā)點(diǎn)間的距離是固定的。在每個(gè)激發(fā)點(diǎn)測(cè)熒光，在兩個(gè)激發(fā)點(diǎn)間所需的時(shí)間的長(zhǎng)度，是細(xì)胞在血管中流動(dòng)速率的一個(gè)尺度。
用血管完整性和血流速率來(lái)檢查視網(wǎng)膜變性。這樣一種檢測(cè)用來(lái)確定視覺(jué)損傷的程度及對(duì)糖尿病患者治療的成功性。
實(shí)施例10 緊接前次發(fā)病檢測(cè)患者即將產(chǎn)生的下一次發(fā)病將待檢查病人的血小板用一種形式的標(biāo)記分子進(jìn)行標(biāo)記(方法見(jiàn)實(shí)施例3)，該分子的激發(fā)波長(zhǎng)在人類可見(jiàn)范圍之外(大于700nm)。然后將標(biāo)記細(xì)胞由靜脈回注給患者。將一個(gè)常規(guī)聚光鏡(在激發(fā)波長(zhǎng))對(duì)準(zhǔn)視網(wǎng)膜床中的一個(gè)單個(gè)血管。用合適的常規(guī)聚焦鏡片和一個(gè)光電倍增管來(lái)測(cè)定熒光。將光電倍增管的輸出由數(shù)字顯示并存入計(jì)算機(jī)。熒光強(qiáng)度可作為一個(gè)尺度，指示靜脈中的血小板是單個(gè)、二個(gè)、三個(gè)，等等。血小板聚集物增加表示第二次發(fā)病的危險(xiǎn)很大。
實(shí)施例11 動(dòng)脈縮窄的顯象用該分子的放射性同位素形式(伽馬放射體)在體外標(biāo)記患者自身的血小板(用實(shí)施例3的方法)或紅細(xì)胞(用實(shí)施例2的方法)。輸入標(biāo)記細(xì)胞，用常規(guī)伽馬照相機(jī)給患者照相，確定血管腔是否縮窄。紅細(xì)胞標(biāo)記可用自身的或任何供血者的O型細(xì)胞來(lái)做。
實(shí)施例12 關(guān)節(jié)炎的診斷和分期用該分子的放射性同位素或NMR成象形式標(biāo)記(實(shí)施例1或2的方法)待測(cè)試患者的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或中性白細(xì)胞。然后把這些標(biāo)記細(xì)胞回輸給患者，用常規(guī)成象設(shè)備觀察其聚集。在關(guān)節(jié)炎時(shí)，預(yù)期單核細(xì)胞示蹤更為有用，而在變性關(guān)節(jié)病(Degenerative Joint Disease)時(shí)，預(yù)期淋巴細(xì)胞示蹤更為有用。這使我們可測(cè)定強(qiáng)放射性關(guān)節(jié)的數(shù)目并確定對(duì)患者病情的治療效果。
實(shí)施例13 移植排斥反應(yīng)的快速測(cè)定淋巴細(xì)胞、中性白細(xì)胞或血小板各在移植或器官排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。取出患者的細(xì)胞，用染料分子的放射性同位素或NMR成象形式進(jìn)行標(biāo)記(用實(shí)施例1-3的方法)?；刈?biāo)記細(xì)胞，對(duì)患者做連續(xù)顯像。在將將發(fā)生排斥前，注入的細(xì)胞積聚在移植物部分的量增加可用此法檢測(cè)。
實(shí)施例14 多發(fā)性硬化的診斷除了要測(cè)定細(xì)胞在脊髓區(qū)或其它富于髓脂質(zhì)的區(qū)域中的位置外，本項(xiàng)應(yīng)用具有與實(shí)施例13相同的方法。
實(shí)施例15 測(cè)定紅細(xì)胞壽期、紅細(xì)胞和血液的體積為區(qū)別出血和輸血后的反應(yīng)，用與上述相同的方法測(cè)定紅細(xì)胞壽期(實(shí)施例4)。唯一的不同是，標(biāo)記并回注患者自身的紅細(xì)胞。注射后，將每毫升標(biāo)記紅細(xì)胞的數(shù)量作為時(shí)間的函數(shù)(使用流式細(xì)胞儀或熒光分光光度法)，以測(cè)定這些細(xì)胞的壽期。用熒光形式的染料染染色已知數(shù)量的紅細(xì)胞(自身的或O型的)以測(cè)定紅細(xì)胞群和血液的體積。將已知數(shù)量的染色紅細(xì)胞(109)在零時(shí)注射給個(gè)體，5分鐘后取出一小部分血液。用流式細(xì)胞儀或熒光分光光度法測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞的百分率。由這個(gè)稀釋因子和每立方毫米中的細(xì)胞總數(shù)，可以確定紅細(xì)胞群和血液的體積。
以上闡述本發(fā)明的一些較好的實(shí)施例，但本發(fā)明不限于在此公開(kāi)的說(shuō)明，我們保留所有在下列權(quán)利要求
的范圍內(nèi)進(jìn)行修改的權(quán)利。
權(quán)利要求
1.一種在受試者體內(nèi)示蹤細(xì)胞的方法，包括測(cè)定預(yù)先引入受試者體內(nèi)的花青類染料標(biāo)記細(xì)胞的位置。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是親腫瘤細(xì)胞的，所以可檢測(cè)原發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求
3的方法，其中的淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞在引入受試者之前被激活。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中親腫瘤細(xì)胞的花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是單核細(xì)胞。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中親腫瘤細(xì)胞是單核細(xì)胞，由于它與腫瘤特異的單克隆抗體相連所以保持了對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中的親腫瘤細(xì)胞的花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是血小板。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中的親腫瘤細(xì)胞的花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是中性白細(xì)胞。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中的花青類染料是DiSC14(5)或DiOC14(3)。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其中的花青類染料用一個(gè)伽馬放射體標(biāo)記。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其中的花青類染料用一個(gè)核磁共振探針標(biāo)記。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞特異地與感染受試者的感染原相互作用以確定感染部位。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求
12的方法，其中的感染原是細(xì)菌或真菌。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求
13的方法，其中的花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是中性白細(xì)胞。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是紅血細(xì)胞。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其中，觀察受試者的視網(wǎng)膜中花青類染料標(biāo)記的紅血細(xì)胞的存在，以檢測(cè)視網(wǎng)膜病或者血管變性。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其中測(cè)量花青類染料標(biāo)記的紅血細(xì)胞在血管中的流動(dòng)速率。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其中花青類染料的激發(fā)波長(zhǎng)在人類可見(jiàn)光譜之外。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是血小板。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求
19的方法，其中，在視網(wǎng)膜血管中檢測(cè)花青類染料標(biāo)記的血小板的凝集。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中的花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是單核細(xì)胞、中性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或血小板。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求
21的方法，其中的花青類染料用一個(gè)伽馬放射體標(biāo)記。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中的花青類染料具有一個(gè)核磁共振探針。
24.一種測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞壽命的方法，包括測(cè)定花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞從受試者中消失的速率。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中的花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是紅血細(xì)胞。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求
25的方法，其中花青染料標(biāo)記的紅血細(xì)胞消失的速率與血容量的變化相比以區(qū)別出血和對(duì)紅血細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求
25的方法，其中利用注射固定數(shù)量的完全標(biāo)記的細(xì)胞及在平衡后測(cè)量稀釋因子來(lái)測(cè)定全血體積。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求
25的方法，其中花青類染料標(biāo)記的紅血細(xì)胞由標(biāo)記受試者的細(xì)胞來(lái)制備。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求
25的方法，其中，花青類染料標(biāo)記的紅血細(xì)胞由標(biāo)記任意供體O型紅血細(xì)胞來(lái)制備。
30.一種根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中的花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞是血小板。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求
30的方法，其中，花青類染料標(biāo)記的血小板消失的速率與血小板總計(jì)數(shù)相比以區(qū)別出血或血小板生成量減少和對(duì)血小板的免疫反應(yīng)。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中的花青類染料為DiSC14(5)或DiOC14(3)。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求
30的方法，其中，測(cè)定花青類染料標(biāo)記的血小板的壽命作為測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化的指標(biāo)。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求
22的方法，其中，用花青類染料標(biāo)記的中性白細(xì)胞來(lái)檢測(cè)感染位置。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求
32的方法，其中，眼內(nèi)測(cè)定花青類染料標(biāo)記的血小板以檢測(cè)微栓子。
36.一種根據(jù)權(quán)利要求
22的方法，其中，花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞同成象方法一起使用以測(cè)定動(dòng)脈狹縮。
37.一種根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中，花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞用于關(guān)節(jié)炎的分期。
38.一種根據(jù)權(quán)利要求
22的方法，其中，花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞用于關(guān)節(jié)炎的分期。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求
22的方法，其中，花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞用于監(jiān)測(cè)移植或器官排斥反應(yīng)。
40.一種在受試者體內(nèi)示蹤細(xì)胞的方法，包括獲得要用花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞，用花青類染料標(biāo)記細(xì)胞，將花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞引入受試者中，檢測(cè)花青類染料標(biāo)記的細(xì)胞。
專利摘要
體內(nèi)示蹤細(xì)胞并用于體內(nèi)測(cè)定細(xì)胞壽命的方法。細(xì)胞用花青類染料標(biāo)記并通過(guò)測(cè)定熒光、吸光率或通過(guò)探測(cè)花青類染料中所包含的核磁共振探針來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。例如，用本發(fā)明的方法，可測(cè)定紅血細(xì)胞及血小板的壽命。還可示蹤細(xì)胞以測(cè)定原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤的位置，或隱蔽的感染部位。此外，用細(xì)胞通過(guò)血管的速率測(cè)定血管的升放及血小板凝聚。
文檔編號(hào)A61K49/00GK87107218SQ87107218
公開(kāi)日1988年6月8日 申請(qǐng)日期1987年10月30日
發(fā)明者保羅·卡爾·霍蘭, 休·埃倫·斯萊扎克 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩貝克曼公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan