專利名稱：改良裸鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型的構(gòu)建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學科研用的一種新的結(jié)腸癌移植瘤模型，是在裸鼠結(jié)腸癌原位移植 瘤模型的基礎上改良而來。
背景技術：
目前國內(nèi)外腸道腫瘤的動物模型有化學致癌物誘導法、腫瘤移植法和轉(zhuǎn)基因動 物模型?；瘜W致癌物誘導法造模周期長，成功率低，目前已較少使用。轉(zhuǎn)基因鼠成本高，品系少，在長期大規(guī)模試驗中應用有一定困難。腫瘤移植法是目前最常用的方法。其優(yōu)點是使一群動物同時接種同樣量的瘤 細胞，生長速率比較一致，個體差異較小，接種成活率近100%，對宿主的影響相類似，易于 客觀判斷療效，可在同種或同品系動物中連續(xù)移植，長期保留供試驗用，試驗周期一般均較 短，試驗條件易于控制等。腫瘤移植法又包括皮下移植瘤法、腹水瘤法、原位移植法等。原 位移植因為可以提供給被移植物類似于人體的微環(huán)境，所以近年來得到廣泛應用。目前裸 鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型國內(nèi)外均可見報道。但在我們的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了該模型的一 些缺點瘤體生長過快，容易形成消化道的梗阻，導致試驗動物死亡，試驗周期內(nèi)試驗動物 的死亡率過高(見圖2)。本發(fā)明在實驗過程中巧妙地使用了一種新方法，將移植瘤塊移植到結(jié)腸系膜內(nèi)血 管旁，成功地建立了改良裸鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種方法簡單、能 提供給被移植物類似于人體的微環(huán)境、不影響腫瘤的轉(zhuǎn)移途經(jīng)、不易導致消化道梗阻、宿主 存活率高的的結(jié)腸癌移植瘤模型。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供的結(jié)腸癌移植瘤模型的構(gòu)建包括如下步驟(1)瘤源的制備將結(jié)腸腫瘤細胞培養(yǎng)、傳代后，用對數(shù)生長期的腫瘤細胞制備成單細胞懸液，調(diào)整 細胞濃度至2X 107/ml ；注射前用碘酊局部皮膚消毒，以0. Iml/只裸鼠，用無菌一次性注射 器注入裸鼠右側(cè)腋下皮下；注射完畢后裸鼠自然進食；待瘤體直徑達Icm左右時，處死荷瘤 鼠，消毒皮膚，切下瘤塊，去除壞死部分，選用淡黃色或呈魚肉狀瘤組織置于生理鹽水中，剪 成直徑2mm的瘤塊備用；(2)模型制作方法造模裸鼠禁食4h，以0. 5%戊巴比妥溶液35 50mg/kg體重腹腔注射麻醉；用碘 酊消毒，取下腹正中或經(jīng)右側(cè)腹直肌切口約2cm，逐層切開腹壁各層，以血管鉗牽開腹膜，辨 認升結(jié)腸；在距回盲部2cm的升結(jié)腸系膜上沿結(jié)腸腸軸平行方向做一 0. 3 0. 4cm切口，將 已制備好的瘤塊2塊置于結(jié)腸系膜內(nèi)血管附近，并用3-0絲線縫合腸系膜切口 ；常規(guī)縫合腹壁切口，麻醉清醒后自然進食；飲水中添加琥乙紅霉素lg/100ml ；將裸鼠飼養(yǎng)于無菌層流 室中，室溫控制在(25士 1) °C，相對濕度40% 50%，連續(xù)觀察3周。本發(fā)明將制備好的瘤塊移植于結(jié)腸系膜內(nèi)血管附近，而非腸管的漿膜層。該方法 建立了能重現(xiàn)人結(jié)腸癌自然臨床病理過程，短期內(nèi)不會發(fā)生消化道管腔梗阻，且轉(zhuǎn)移模式 與臨床患者相似的動物模型，使模型動物造模后的生存時間明顯延長。這對于抗腫瘤藥物 的研發(fā)、尤其對中醫(yī)藥抗腫瘤藥物的篩選及作用機制的研究具有重要的現(xiàn)實意義。本發(fā)明能實現(xiàn)類似于結(jié)腸癌原位移植瘤模型的目的，又能使在試驗過程中因消化 道管腔梗阻發(fā)生的宿主死亡率明顯降低。本發(fā)明方法簡單，造模成功率高，實用性強，具有 一定的經(jīng)濟、實用價值。


圖1為本發(fā)明改良裸鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型的構(gòu)建流程圖。圖2是腫瘤結(jié)腸原位移植法構(gòu)建的動物模型示意圖(圖中箭頭所示為壓迫腸道的 移植瘤，可見腸道梗阻，梗阻近端腸管充氣擴張)。圖3為本發(fā)明構(gòu)建方法中移植瘤塊種植部位示意圖。圖3中(1)瘤塊種植部位；(2)結(jié)腸；(3)腸系膜前動靜脈分支；⑷腸系膜前動 脈；(5)盲腸。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例應理解為僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領域技術 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限 定的范圍。實施例11.材料和方法1. 1細胞株及試劑消化液(0.25%胰酶溶液+ImM EDTA)、含10%胎牛血清的 RPMI1640+雙抗培養(yǎng)液、PBS液、C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、琥乙紅霉素片1. 2動物BALB/C裸鼠20只，SPF級，購自中科院，鼠齡6 8周，體重18 20g。 隨機分為對照組10只、模型組10只。2.動物模型的構(gòu)建構(gòu)建流程如圖1所示。2. 1瘤源的制備將人結(jié)腸癌細胞SW480培養(yǎng)、傳代后，用對數(shù)生長期的腫瘤細胞制備成單細胞懸 液，注入裸鼠右側(cè)腋下皮下，制備瘤源。具體方法同發(fā)明內(nèi)容中描述。2. 2模型制作方法具體同發(fā)明內(nèi)容中描述。對照組將瘤塊移植至距回盲部2cm的升結(jié)腸漿膜。模型組將瘤塊移植至距回盲部2cm的升結(jié)腸系膜血管旁(如圖3所示)。如表1所示，模型組動物的生存天數(shù)明顯長于對照組，具有統(tǒng)計學意義(P< 0. 05)。
表1.荷秀_裸小鼠(SW480)的生存情況
腫瘤細胞株小鼠生存天數(shù)(天)模型組人結(jié)腸癌細胞SW48052. 40±5. 27對照組人結(jié)腸癌細胞SW48014. 00±2. 05實施例21.材料和方法1. 1細胞株及試劑消化液(0.25%胰酶溶液+ImM EDTA)、含10%胎牛血清的 RPMI1640+雙抗培養(yǎng)液、PBS液、C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、琥乙紅霉素片1. 2動物BALB/C裸鼠20只，SPF級，購自中科院，鼠齡6 8周，體重18 20g。 隨機分為對照組10只、模型組10只。2.動物模型的構(gòu)建構(gòu)建流程如圖1所示。2. 1瘤源的制備將人結(jié)腸癌細胞LOVO培養(yǎng)、傳代后，用對數(shù)生長期的腫瘤細胞制 備成單細胞懸液，注入裸鼠右側(cè)腋下皮下，制備瘤源。具體方法同發(fā)明內(nèi)容中描述。2. 2模型制作方法具體同發(fā)明內(nèi)容中描述。對照組將瘤塊移植至距回盲部2cm的升結(jié)腸漿膜。模型組將瘤塊移植至距回盲部2cm的升結(jié)腸系膜血管旁(如圖3所示)。如表2所示，模型組動物的生存天數(shù)明顯長于對照組，具有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)。表2.荷瘤裸小鼠(LOVO)的生存情況
腫瘤細胞株小鼠生存天數(shù)(天)模型組人結(jié)腸癌細胞LOVO48. 60±6. 29對照組人結(jié)腸癌細胞LOVO16. 78±2· 17實施例31.材料和方法1. 1細胞株及試劑消化液(0.25%胰酶溶液+ImM EDTA)、含10 %胎牛血清的 RPMI1640+雙抗培養(yǎng)液、PBS液、C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、琥乙紅霉素片1. 2動物BALB/C裸鼠20只，SPF級，購自中科院，鼠齡6 8周，體重18 20g。 隨機分為對照組10只、模型組10只。2.動物模型的構(gòu)建構(gòu)建流程如圖1所示。2. 1瘤源的制備將人胃癌細胞MKN-45培養(yǎng)、傳代后，用對數(shù)生長期的腫瘤細胞制 備成單細胞懸液，注入裸鼠右側(cè)腋下皮下，制備瘤源。具體方法同發(fā)明內(nèi)容中描述。2. 2模型制作方法
具體同發(fā)明內(nèi)容中描述。對照組將瘤塊移植至距回盲部2cm的升結(jié)腸漿膜。模型組將瘤塊移植至距回盲部2cm的升結(jié)腸系膜血管旁(如圖3所示)。如表3所示，模型組動物的生存天數(shù)明顯長于對照組，具有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)。表3.荷瘤裸小鼠(MKN45)的生存情況 以上實施例均說明，模型組動物的生存天數(shù)明顯長于對照組。結(jié)果說明將瘤塊移 植至裸小鼠升結(jié)腸系膜血管附近可明顯延長小鼠的生存天數(shù)，延緩因腫瘤所致的腸道梗阻 導致的模型動物死亡。
權(quán)利要求
一種改良裸鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型的構(gòu)建方法，其特征是，包括如下步驟(1)瘤源的制備將結(jié)腸腫瘤細胞培養(yǎng)、傳代后，用對數(shù)生長期的腫瘤細胞制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至2×107/ml；注射前用碘酊局部皮膚消毒，以0.1ml/只裸鼠，用無菌一次性注射器注入裸鼠右側(cè)腋下皮下；注射完畢后裸鼠自然進食；待瘤體直徑達1cm左右時，處死荷瘤鼠，消毒皮膚，切下瘤塊，去除壞死部分，選用淡黃色或呈魚肉狀瘤組織置于生理鹽水中，剪成直徑2mm的瘤塊備用；(2)模型制作方法造模裸鼠禁食4h，以0.5％戊巴比妥溶液35～50mg/kg體重腹腔注射麻醉；用碘酊消毒，取下腹正中或經(jīng)右側(cè)腹直肌切口約2cm，逐層切開腹壁各層，以血管鉗牽開腹膜，辨認升結(jié)腸；在距回盲部2cm的升結(jié)腸系膜上沿結(jié)腸腸軸平行方向做一0.3～0.4cm切口，將已制備好的瘤塊2塊置于結(jié)腸系膜內(nèi)血管附近，并用3 0絲線縫合腸系膜切口；常規(guī)縫合腹壁切口，麻醉清醒后自然進食；飲水中添加琥乙紅霉素1g/100ml；將裸鼠飼養(yǎng)于無菌層流室中，室溫控制在(25±1)℃，相對濕度40％～50％，連續(xù)觀察3周。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良裸鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型的構(gòu)建方法，其特征是，瘤 源的制備過程中，消毒和注射過程在制備成單細胞懸液后1小時內(nèi)完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種涉及醫(yī)學科研用的結(jié)腸癌移植瘤模型，是在裸鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型的基礎上改良而來，旨在克服結(jié)腸癌原位移植瘤模型腸道梗阻發(fā)生率高、模型動物生存時間短、不能適用于較長時間實驗的缺陷。本發(fā)明將制備好的瘤塊移植到結(jié)腸系膜內(nèi)血管附近，包括以下步驟①瘤塊的制備將腫瘤細胞的單細胞懸液，注入裸鼠皮下，制備移植瘤的瘤源；②將制備好的瘤塊移植于裸鼠腸系膜內(nèi)血管附近，而非腸管的漿膜層；③將裸鼠飼養(yǎng)于無菌層流室中，室溫控制在(25±1)℃，相對濕度40％～50％，連續(xù)觀察。按照本發(fā)明構(gòu)建的動物模型能重現(xiàn)人結(jié)腸癌自然臨床病理過程，短期內(nèi)不會發(fā)生消化道管腔的梗阻，且轉(zhuǎn)移模式與臨床患者相似。
文檔編號A61D7/00GK101919747SQ20091005743
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者宋華榮, 張靜喆, 楊海波, 梁曉強, 章學林, 蔡駿 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院