專利名稱:獲取巖薔薇型雙萜的方法，特別是由印度鞘蕊制取鞘蕊雙萜的方法
植物印度鞘蕊(Coleus forskohlii)屬唇形科(Lamiaceae)，產(chǎn)地印度，含有數(shù)種巖薔薇型雙萜。含量最多的雙萜是1，9-二脫氧鞘蕊雙萜(1，9-dideoxyforskolin，DDF)和鞘蕊雙萜(forscokin)(BHAT等;四面體通訊19，1669-1672(1977))。鞘蕊雙萜的含量按全植物重計(jì)大約為0.05%，根中含量為0.1%(SHAH等藥用植物39，183-185(1980))。
鞘蕊雙萜(7β-乙酰氧基-8，13-環(huán)氧-1α，6β，9α-三羥基-巖薔薇-14-烯-11-酮)的結(jié)構(gòu)式如下
對(duì)植物印度鞘蕊的興趣是由于鞘蕊雙萜具有明確的藥理作用。它有陽性的收縮能效應(yīng)，可增加心率和降低血壓(LINDNER等藥物研究28(I)No.2，284-289(1978)。調(diào)節(jié)這種作用和其它許多作用是通過對(duì)膜上的腺苷酸環(huán)化酶的活化，從而增加了細(xì)胞內(nèi)的環(huán)腺苷-磷酸(cAMP)的濃度(METZGER H.，LINDNER E.藥物研究31(Ⅱ)No.8，1248-1250，(1981);SEAMON K.B.，DALY J.W.環(huán)核苷酸研究7(4)201-224，(1981);DESOUZA N.等醫(yī)學(xué)研究述評(píng)3(1983)，201-219)。因而鞘蕊雙萜的重要意義是雙重的一方面它是一種藥物，另一方面它通過作為第二信使的cAMP而啟動(dòng)激素的作用，是研究激素作用的極好輔助劑。
鞘蕊雙萜迄今主要是從野生的印度鞘蕊的干燥根中提取而得，在某些情況下也可從栽培的植物根中獲得。
下面所述的本發(fā)明的方法是獲得各種雙萜，特別是鞘蕊雙萜的新方法。
為此，將印度鞘蕊細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在稱作維持培養(yǎng)基中生成的鞘蕊雙萜衍生物是零或只是微量。為了刺激其產(chǎn)生，將細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到“誘導(dǎo)培養(yǎng)基”中，它與維持培養(yǎng)基的區(qū)別特別是在植物激素激素的含量方面。在2-6周后，雙萜的生成達(dá)到最大值，按干細(xì)胞物質(zhì)計(jì)算，鞘蕊雙萜的濃度為0.005-0.06%。
這種新的生產(chǎn)方法的優(yōu)點(diǎn)是制備該物質(zhì)時(shí)不受季節(jié)和氣候制約;不限于印度的產(chǎn)地，也減少了經(jīng)濟(jì)和政治的風(fēng)險(xiǎn)。
下面詳述本發(fā)明的方法。首先，用已知的方法制成印度鞘蕊植物的愈傷組織培養(yǎng)物。在用瓊脂固化了的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上經(jīng)過數(shù)個(gè)培養(yǎng)周期后，可將細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，并以懸浮培養(yǎng)物形式保持之。
維持培養(yǎng)的適宜的培養(yǎng)條件是貯存在玻璃器皿例如錐形瓶?jī)?nèi);通氣是靠在80-150轉(zhuǎn)/分鐘的軌道搖床上經(jīng)振蕩實(shí)現(xiàn)的;溫度為18-38℃;連續(xù)光照，持續(xù)黑暗，或光暗交替。
常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基可以作為維持培養(yǎng)基，例如蓋姆伯格的B5培養(yǎng)基(GAMBORG D.L植物生理45，372(1970)或MS培養(yǎng)基(MURASHIGE，T，及SKOOG，F(xiàn)植物生理28，473-497(1962))加上植物激素，例如適當(dāng)濃度的植物生長(zhǎng)素如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，吲哚-3-丁酸(IBA)或萘乙酸(NAA)，濃度例如為0.2-5mg/l，最好是0.5-2mg/l，和(或)加入適當(dāng)濃度的植物細(xì)胞分裂素，如激動(dòng)素或6-芐基氨基瞟呤(BAP)，濃度例如為0.05-2mg/l，最好是0.1-0.5mg/l。
刺激鞘蕊雙萜產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟是將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到“工作培養(yǎng)基或誘導(dǎo)培養(yǎng)基”中。該培養(yǎng)基與維持培養(yǎng)基的不同是a)它不含有植物激素;或b)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有一個(gè)或多個(gè)其它的植物生長(zhǎng)素，例如IBA或NAA代替具有強(qiáng)去分化作用的植物生長(zhǎng)素，2，4-D，或c)不含有植物生長(zhǎng)素而只含有植物細(xì)胞分裂素;或d)含有濃度較維持培養(yǎng)基低的植物生長(zhǎng)素和(或)植物細(xì)胞分裂素。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基每7-30天的間隔加以更新，在每個(gè)培養(yǎng)周期后，要收獲部分細(xì)胞物質(zhì)以得到鞘蕊雙萜。
在產(chǎn)生鞘蕊雙萜期間，最好是在持續(xù)的黑暗條件下培養(yǎng)。
在第一誘導(dǎo)培養(yǎng)周期中，起初的培養(yǎng)幾乎看不到生長(zhǎng)有什么變化，鞘蕊雙萜衍生物的形成通常只限于小量的1，9二脫氧鞘蕊雙萜(DDF)和痕量的其它雙萜。最早到第二個(gè)或第三個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期時(shí)，鞘蕊雙萜及其衍生物的生成量達(dá)到最大值。在植物根中發(fā)現(xiàn)的所有的雙萜化合物都生成了。
產(chǎn)生階段可以在錐形瓶?jī)?nèi)持續(xù)達(dá)數(shù)月，然而鞘蕊雙萜的含量和培養(yǎng)物的生長(zhǎng)主要取決于該方法是在無激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行(→產(chǎn)生期間大約3個(gè)培養(yǎng)周期)，還是在以植物生長(zhǎng)素/植物細(xì)胞分裂素的組合形式的植物激素的存在下進(jìn)行。例如，含有1.0mg/l的IBA和0.1mg/l的BAP的培養(yǎng)基適于進(jìn)行長(zhǎng)期產(chǎn)生。
為了較大規(guī)模地獲得含雙萜的細(xì)胞物質(zhì)，培養(yǎng)物要在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中要在商業(yè)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)。這類實(shí)驗(yàn)的預(yù)培養(yǎng)(即在誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)開始之前的培養(yǎng)周期)最好是在錐形瓶中進(jìn)行，但也可移到發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，此時(shí)可用適當(dāng)?shù)姆N類換掉維持培養(yǎng)基。
產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)完成以后，將細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分開，因營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中含雙萜量很低，故可棄去。細(xì)胞干燥后，用有機(jī)溶劑(特別是甲苯，二氯甲烷，甲醇)萃取，這與由根中萃取方法相似(見德國(guó)專利No.2，557，784)。最后，用層析的方法，例如用硅膠柱將鞘蕊雙萜及在適當(dāng)?shù)那闆r下將其它的巖薔薇型的衍生物，例如1，9-二脫氧鞘蕊雙萜和1-脫氧鞘蕊雙萜從粗萃取物中分離出來。
含量測(cè)定的方法可用例如氣液層析，高效液相層析(INAMDAR等藥物科學(xué)雜志69，1449-1451(1980);藥用植物50，30-34(1984))或薄層層析掃描。
實(shí)例1光照懸浮液的誘導(dǎo)作用使用保持在連續(xù)光照下的印度鞘蕊懸浮培養(yǎng)物。
預(yù)培養(yǎng)開始重量16g細(xì)胞材料(濕重)置于含有300ml培養(yǎng)液的錐形瓶中培養(yǎng)基B5(蓋姆伯格的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，植物生理45，372(1970))，其中含有1.0mg/l的2，4-D和0.2mg/l的激動(dòng)素溫度24℃振搖速度每分鐘100轉(zhuǎn)光照連續(xù)光照培養(yǎng)時(shí)間14天增殖12
誘導(dǎo)和產(chǎn)生階段培養(yǎng)基含有0.4mg/l的吲哚-3-丁酸的B5培養(yǎng)基光照持續(xù)暗處溫度24℃振搖速度每分鐘100轉(zhuǎn)進(jìn)一步詳細(xì)的方法，見下面表1
表1三個(gè)連續(xù)培養(yǎng)周期的光照懸浮液(即在持續(xù)光照下的懸浮培養(yǎng)物)的誘導(dǎo)作用第一個(gè)誘導(dǎo) 第二個(gè)誘導(dǎo) 第三個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期 培養(yǎng)周期 培養(yǎng)周期細(xì)胞材料的開始重量(每300ml培養(yǎng)基中 15g 16g 24g的細(xì)胞鮮重)培養(yǎng)時(shí)間 15日 13日 12日增殖＊ 10.1 6.0 4.6鞘蕊雙萜 (+) 0.0516 0.0239(干重的百分?jǐn)?shù))DDF 0.0181 0.0542 0.0209(干重的百分?jǐn)?shù))＊基于冷凍干燥細(xì)胞的生物量的增殖因子處理及含量測(cè)定除掉營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基后，將新鮮收獲的細(xì)胞冷凍干燥;
在瓷乳缽中將細(xì)胞材料研成粉末;
在常壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，一邊旋轉(zhuǎn)一邊用甲苯萃取雙萜(2小時(shí)，50℃);
萃取液過濾后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將濾液濃縮至干(溫度為50℃);
粗萃取物在超聲波浴中用甲醇處理。
鞘蕊雙萜衍生物的含量測(cè)定是用薄層層析法展開，薄層掃描檢測(cè)流動(dòng)相甲苯∶乙酸乙酯為85∶15展開板2×15cm鋪板硅膠60 F254檢測(cè)STAHL茴香醛/硫酸試劑，浸泡浴;然后于130-140℃加熱約5分鐘掃描島津二元CS-930由Desaga波長(zhǎng)500nm始實(shí)例2光照懸浮法發(fā)酵，無激素培養(yǎng)基中產(chǎn)生。
本實(shí)例說明在誘導(dǎo)條件下對(duì)印度鞘蕊也可以較大規(guī)模地進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。所用的培養(yǎng)容器是20升的氣升式發(fā)酵罐(WAHL J.，博士論文，吐賓根，1977)，并帶有能自動(dòng)維持培養(yǎng)基中氧氣溶解量(pO2)的恒定裝置。
起始是在發(fā)酵罐中，在正常的維持培養(yǎng)基中進(jìn)行一次生長(zhǎng)培養(yǎng)周期，然后留下4升并除去細(xì)胞懸浮物，發(fā)酵罐的工作容積為19升，再加入無激素的B5培養(yǎng)液。
現(xiàn)在緊接著是第一個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，培養(yǎng)物的生長(zhǎng)持續(xù)旺盛;僅僅約13天后，填充細(xì)胞體積(PCV)可達(dá)到95%。此時(shí)在細(xì)胞內(nèi)只能檢測(cè)到小量的DDF，但沒有鞘蕊雙萜。
為繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，可再將細(xì)胞懸浮物除留下的3.5升外除去，換上無激素的新鮮B5培養(yǎng)液。在第二個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期中，開始生成大量的雙萜，在第9天鞘蕊雙萜含量達(dá)到最大值0.0053%，DDF為0.0116%，因而第9天是收獲細(xì)胞材料的最佳時(shí)刻。若繼續(xù)發(fā)酵，則由于培養(yǎng)細(xì)胞的部分死亡，使雙萜的含量不斷下降。
發(fā)酵數(shù)據(jù)培養(yǎng)法印度鞘蕊的光照懸浮法瓶中預(yù)培養(yǎng)15天，在300ml的B5維持培養(yǎng)基中，新鮮細(xì)胞的起始重量為16-17g(新鮮細(xì)胞重量＝去掉培養(yǎng)基后濕細(xì)胞重量)。
溫度24℃工作容積19升蔗糖葡萄糖加入蔗糖溶液(30%)以保持殘留的葡萄糖含量＞0.5%生長(zhǎng)培養(yǎng)周期(散射的陽光)培養(yǎng)基B5(1.0mg/l的2，4-D和0.2mg/l的激動(dòng)素)接種細(xì)胞量2.4升＝8個(gè)預(yù)培養(yǎng)瓶(接種量)培養(yǎng)時(shí)間16天
pO235%，自第14天增至50%第一個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期(持續(xù)暗處)培養(yǎng)基無激素的B5接種細(xì)胞量由生長(zhǎng)培養(yǎng)周期得到的4升懸浮物培養(yǎng)時(shí)間13天pO235%泡沫消除總體積中加入大約250ml的聚丙二醇溶液第二個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期(持續(xù)暗處)培養(yǎng)基無激素的B5接種細(xì)胞量由第一個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期得到的3.5升懸浮物培養(yǎng)時(shí)間26天pO2由70%降到40%通氣速度vvm＝0.06-0.10(＝每小時(shí)和每19升工作容積中通入空氣70-110升)雙萜含量(重量百分?jǐn)?shù)) 鞘蕊雙萜 DDF第7日 0.0035 0.0092第8日 0.0032 0.0093第9日 0.0053 0.0116第11日 0.0016 0.0102
實(shí)例3光照懸浮法的誘導(dǎo)，雙萜的分離使用維持于連續(xù)光照下的印度鞘蕊的懸浮培養(yǎng)物。
預(yù)培養(yǎng)如實(shí)例1所述誘導(dǎo)和產(chǎn)生階段如實(shí)例1所述，但有以下區(qū)別培養(yǎng)基無激素的B5起始重量每300ml培養(yǎng)基中含有22.5g到29.5g新鮮細(xì)胞(第二個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期)培養(yǎng)時(shí)間第一個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期15天第二個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期11天第二個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)周期終結(jié)的，收獲細(xì)胞，分離雙萜。
萃取用甲苯萃取2.26g冷凍干燥細(xì)胞(見實(shí)例1)粗萃取物68.6mg＝3.0%，只部分地溶解于甲醇中用柱層析法純制鞘蕊雙萜衍生物層析柱Labomatic，約50ml，裝填30μm的硅膠流動(dòng)相二氯甲烷∶乙酸乙酯為8∶1萃取溶劑流動(dòng)相作為溶劑取代甲醇進(jìn)行分離的物料量約25mg(即原溶出的粗萃取物的一半)由可洗脫物質(zhì)的總量12.8mg中主要得到
0.7mg鞘蕊雙萜1.0mg1，9-雙脫氧鞘蕊雙萜(DDF)0.4mg1-脫氧鞘蕊雙萜各個(gè)組分是由氣-液層析，高效液相層析(INAMDAR等，1980及1984)或雙向薄層層析法鑒定核實(shí)的。
薄層層析板HPTLC，硅膠60F25410×10cm流動(dòng)相Ⅰ二氯甲烷∶乙酸乙酯為8∶1Ⅱ異丙醚∶氯仿為7∶權(quán)利要求
1.獲得巖薔薇型雙萜的方法，該方法是在有適當(dāng)?shù)闹参锛に卮嬖诘木S持培養(yǎng)基中對(duì)印度鞘蕊細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中，誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生鞘蕊雙萜，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與維持培養(yǎng)基的不同是加入的植物激素的濃度和(或)種類不同，以后用已知的方法分離雙萜。
2.按照權(quán)利要求
1的方法，其中所用的維持培養(yǎng)基是植物細(xì)胞培養(yǎng)中常規(guī)用的培養(yǎng)基，加入濃度為0.2-5mg/l的植物生長(zhǎng)素和(或)濃度為0.05-2mg/l的植物細(xì)胞分裂素。
3.按照權(quán)利要求
1的方法，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基與維持培養(yǎng)基的區(qū)別是a)不含植物激素;或b)不用具有強(qiáng)去分化作用的植物生長(zhǎng)素，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，而是含有一個(gè)或多個(gè)其它的植物生長(zhǎng)素;或c)不含植物生長(zhǎng)素，但只含一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞分裂素;或d)含有一個(gè)或多個(gè)植物生長(zhǎng)素和(或)植物細(xì)胞分裂素，但濃度比維持培養(yǎng)基所含的低。
4.按照權(quán)利要求
1的方法，其中在維持培養(yǎng)基中的所用的植物生長(zhǎng)素是2，4-二氯苯氧乙酸和(或)萘乙酸，這兩種植物生長(zhǎng)素在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中改為吲哚-3-丁酸或其它具有較弱去分化作用的植物生長(zhǎng)素，或者根本不用植物生長(zhǎng)素。
5.按照權(quán)利要求
1的方法，其中使用的是浸沒培養(yǎng)物。
6.按照權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)是在光照，在黑暗，或在光照-黑暗交替下進(jìn)行的。
7.按照權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)是在溫度為18到38℃下進(jìn)行的。
8.按照權(quán)利要求
1的方法，誘導(dǎo)時(shí)間為7到30天。
9.按照權(quán)利要求
1的方法，數(shù)個(gè)誘導(dǎo)階段是相繼發(fā)生的，是靠一部分細(xì)胞受到刺激而產(chǎn)生了雙萜，每種情況下，都是在新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。
10.按照權(quán)利要求
1的方法，可得到鞘蕊雙萜。
專利摘要
本發(fā)明是關(guān)于制取巖薔薇型雙萜的方法，特別是從印度鞘蕊的細(xì)胞培養(yǎng)物中獲取鞘蕊雙萜。該方法是將細(xì)胞培養(yǎng)物由維持培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基與維持培養(yǎng)基的區(qū)別主要是植物激素的含量，以及在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中經(jīng)過特定的時(shí)間后，用有機(jī)溶劑萃取得到雙萜。
文檔編號(hào)C12N5/02GK87107118SQ87107118
公開日1988年6月15日 申請(qǐng)日期1987年10月24日
發(fā)明者埃內(nèi)斯特·賴恩蘭, 雷納·梅爾新哥, 安德列亞·曼德勒 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan