專利名稱:轉(zhuǎn)氨酶基因ilve的克隆和應(yīng)用的制作方法
體內(nèi)合成脂肪族氨基酸的最后步驟包括借助氨基轉(zhuǎn)移酶使相應(yīng)的酮前體產(chǎn)生胺化。雖然各種轉(zhuǎn)氨酶均可完成轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成脂族氨基酸，但這種作用在細(xì)胞內(nèi)主要是靠脂族轉(zhuǎn)氨酶完成的。遺傳學(xué)中所用的脂族轉(zhuǎn)氨酶基因的縮寫(xiě)符號(hào)是iLvE(Umbarger，Ann.Rev.Biochemistry 47(1978)，533-606)。對(duì)于大腸桿菌K12來(lái)說(shuō)，已確切知道了該基因在“細(xì)菌染色體”上的定位，其基因產(chǎn)物為E.C.2.6.1.42號(hào)(Bachmann等，Microbiological Reviews 44(1980)，1-56)。
歐洲專利申請(qǐng)(EP-A)0116860號(hào)描述了分離大腸桿菌K12中iLvE基因及將這種氨基轉(zhuǎn)移酶基因克隆到一個(gè)多拷貝質(zhì)粒上的方法，沒(méi)有說(shuō)明被克隆的iLvE基因產(chǎn)物的生物活性。EP-A 0152275號(hào)中提到通過(guò)克隆iLvE基因來(lái)提高酶的活性，但沒(méi)有關(guān)于增加脂族氨基酸產(chǎn)率的資料。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，分離大腸桿菌ATCC11303中的iLvE基因，並將其克隆到一個(gè)多拷貝質(zhì)粒中，再用這一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化始發(fā)菌株之后，可使該氨基酸的產(chǎn)率至少增加3到5倍。
因此，本發(fā)明涉及1、一個(gè)染色體外的復(fù)制成分，其含有自大腸桿菌ATCC11303分離的iLvE基因。
2、由(1)指出的“染色體外”復(fù)制成分，在脂族氨基轉(zhuǎn)移酶合成中的應(yīng)用。
3、由(1)所規(guī)定的“染色體外”復(fù)制成分在微生物體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生分枝鏈氨基酸中的應(yīng)用，包括a)將“染色體外”復(fù)制成分引入微生物內(nèi);
b)在該微生物內(nèi)表達(dá)iLvE基因並合成有活性的脂族轉(zhuǎn)氨酶;
c)由轉(zhuǎn)氨基酶與相應(yīng)的酮前體產(chǎn)生胺化作用。
本發(fā)明在說(shuō)明書(shū)的詳述部分及權(quán)利要求
書(shū)中給以更充分的說(shuō)明。
該基因不僅可用于野生型大腸桿菌ATCC 11303，而且還可用于其變種和突變體。例如，它可用于由已知方法(E.Adelberg等Biochem.Biophys.Res.Comm.18，788(1965))致突變的菌株以及根據(jù)過(guò)量產(chǎn)生分枝鏈氨基酸而選擇的菌株。大腸桿菌ATCC 11303中iLvE基因編碼的脂族氨基轉(zhuǎn)移酶，可借助這種酶自谷氨酸鹽轉(zhuǎn)移氨基，由相關(guān)酮前體合成纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。此外，亦可使用脂族轉(zhuǎn)氨酶合成苯丙氨酸和谷氨酸。除iLvE基因產(chǎn)物外，還發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌細(xì)胞中的其他轉(zhuǎn)氨酶基因的產(chǎn)物。
例如，芳族轉(zhuǎn)氨酶是tyrB基因的產(chǎn)物，可催化苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的合成，aspC基因的產(chǎn)物催化天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的合成。然而，上述的轉(zhuǎn)氨酶也在其它族的氨基酸合成中顯示微弱的活性。
為了進(jìn)一步增加分枝鏈氨基酸的合成，而克隆了編碼脂族氨基轉(zhuǎn)移酶的iLvE基因。先分離大腸桿菌ATCC11303的DNA，部分消化該DNA之后，將所得的20-30Kb的片段連接到有復(fù)制子的裝配型質(zhì)粒中(該質(zhì)粒具有廣泛的宿主)，並包裹在λ噬菌體的頭部。裝配型質(zhì)粒最好選用pIMS 6026。該質(zhì)粒是由裝配型質(zhì)粒pLAFR 1(ATCC37167)衍生來(lái)的就是將編碼有轉(zhuǎn)座子Tn 903的卡那霉素抗性基因的商品EcoR1片段(Pharmacia，Uppsala，Sweden)克隆到pLAFR1的單一EcoR1切點(diǎn)中。因BamHJ切點(diǎn)兩側(cè)鄰接2個(gè)EcoR1切點(diǎn)，用BamH1酶切刪去EcoR1片段的大部分，保留作為插入部分的短DNA片斷。這個(gè)不存在于裝配型質(zhì)粒pLAFR 1上的BamHI切點(diǎn)可用于克隆。將適當(dāng)配制的大腸桿菌DG 30懸液與已包裝的裝配型質(zhì)粒保溫，將裝配型質(zhì)粒引入微生物體內(nèi)。大腸桿菌DG30缺少三種轉(zhuǎn)氨酶aspC、iLvE和tyrB。因此，盡管該菌株能在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)須添加它們不能合成的各種氨基酸。由于適當(dāng)?shù)剡x擇培養(yǎng)基，有助于檢測(cè)該菌株是否已由外界攝入的DNA來(lái)彌補(bǔ)其染色體合成特殊轉(zhuǎn)氨酶的缺陷。iLvE基因的引入是由大腸桿菌DG 30在無(wú)酪氨酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而確定的。只有能通過(guò)攝入含有aspC、tyrB或iLvE的DNA以補(bǔ)足其染色體合成酪氨酸的缺陷，且來(lái)源于大腸桿菌菌株ATCC 11303的克隆才能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。由基因aspC、tyrB和iLvE編碼的三種轉(zhuǎn)氨酶的區(qū)別在于它們的底物不同-盡管所有這三種轉(zhuǎn)氨酶都能催化酪氨酸的生成。
由基因tyrB編碼的芳族轉(zhuǎn)氨酶，不能由酮前體生成異亮氨酸，但能夠由相應(yīng)的酮前體中以較高的產(chǎn)率合成亮氨酸。由基因aspC編碼的轉(zhuǎn)氨酶不能合成異亮氨酸，也不能使異亮氨酸轉(zhuǎn)化為亮氨酸。但iLvE基因產(chǎn)物能以轉(zhuǎn)較高產(chǎn)率產(chǎn)生異亮氨酸。
因此，可根據(jù)在添加了除特定基因之特異氨基酸以外的代謝所必需的氨基酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況，來(lái)區(qū)分含不同轉(zhuǎn)氨酶的各個(gè)克隆。含有iLvE基因的DG30克隆菌株就是用這種方法選擇出來(lái)的。
鑒定這些克隆是否具有iLvE基因，須自克隆中分離質(zhì)粒DNA。然而，從菌株DG 30中分離質(zhì)粒DNA可能有一些困難，雖然有可能得到質(zhì)粒DNA，但產(chǎn)率較低。因此，在微溶解(minilysis)后，用含有插入外源基因的裝配型質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株之后，便可能以較好產(chǎn)率自該菌株重新分離所引入的DNA。大腸桿菌DH1(ATCC 33849)特別適用于這一目的。
下一步是，將重新分離的裝配型質(zhì)粒DNA與一高拷貝數(shù)的載體相連。由大腸桿菌K12菌株的染色體基因圖可知，iLvE基因位于Sal Ⅰ-SmaⅠ片段上。該片段只含有iLvE的結(jié)構(gòu)基因，而不含天然啟動(dòng)子。這有可能與大腸桿菌ATCC 11303情況相似。為此，最好使用一種多拷貝質(zhì)粒作載體，使其Sal-Ⅰ-SmaⅠ片段在質(zhì)粒啟動(dòng)子的控制之下被克隆。特別優(yōu)選的載體是質(zhì)粒pBR322，其序列是已知的並可由市場(chǎng)上購(gòu)買。
用SalⅠ和SmaⅠ確完全切斷裝配型質(zhì)粒DNA，並用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和PvuⅡ完全切斷載體。將兩種DNA混合並連接在一起，用所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞，可望在其中提高分枝鏈氨基酸的產(chǎn)量。這種宿主菌最好使用腸道細(xì)菌，特別是大腸桿菌和大腸桿菌ATCC11303菌株及其突變株和變種。用氨芐青霉素選擇抗性菌落，用微溶解法自適當(dāng)?shù)木浞蛛x質(zhì)粒DNA，並用限制性內(nèi)切酶SalⅠ完全切斷以鑒定載體DNA大小的改變。進(jìn)行限制性分析以確保所有原來(lái)DNA部分中的片段均以這種方式再克隆。然后使用文獻(xiàn)(Duggan等，Anal，Biochem.51(1973)67-79)中報(bào)導(dǎo)的方法檢驗(yàn)各含有SalⅠ-SmaⅠ片段之克隆的脂族轉(zhuǎn)氨酶(即iLvE的基因產(chǎn)物)活性。有可能以這種方法使iLvE活性提高10倍以上。瓊脂凝膠電泳的結(jié)果表明，宿主菌株的載體含有ATCC 11303片段大小約1MD。
下列實(shí)例將詳細(xì)描述本發(fā)明。除特別指出者外，所用百分?jǐn)?shù)據(jù)均為重量百分比。
實(shí)施例1自大腸桿菌分離並用限制性內(nèi)切酶消化裝配型質(zhì)粒pIMS 6026。
使用Humphreys等人的方法(Biochim.Biophys.Acta383，457-63(1975))或用Birnboim和Doly的方法(Nucleic Acids Res.71513(1979))在一10倍規(guī)模上進(jìn)行堿溶解，自大腸桿菌分離裝配型質(zhì)粒pIMS 6026。每種方法分離，均至少用CsCL/EtBr密度梯度離心法將質(zhì)微NDNA純化一次。
使用制造商(New England Biolabs)推薦的方法用限制性內(nèi)切酶BamHI完全切斷質(zhì)粒pIMS 6062。為檢驗(yàn)這一酶切過(guò)程的完全程度，將等分的限制性酶切混合物加于0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離。用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色后並用短波紫外光(254nm)照射，只顯現(xiàn)一條帶，此表明已經(jīng)完全切斷。用苯酚處理，以由已經(jīng)酶切的裝配型質(zhì)粒DNA除去限制性內(nèi)切酶，用乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，再用70%乙醇洗DNA，真空下干燥並在適當(dāng)體積的TE緩沖液(10mM Tris;1mM EDTA，PH8.0)中重新溶解。然后可按制造商(Boehringer Mannheim)推薦的方法用堿性磷酸酶作適當(dāng)處理。加入1μl堿性磷酸酶(CIP)后，將反應(yīng)混合物于37℃保溫30分鐘並用苯酚處理以除去酶，再以上述方法純化DNA。最后將純化的質(zhì)粒DNA重新懸浮于TE緩沖液中。
實(shí)施例2來(lái)自于大腸桿菌ATCC 11303的DNA部分消化。
依照Marmur的方法(J.Mol.Biol.53，155-162(1961))自大腸桿菌ATCC 11303分離總DNA。用限制性內(nèi)切酶Sau3A部分酶切，使所得片段大部分在20-30Kb大小的范圍內(nèi)。為此目的，須進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以確定DNA和酶的最適比例以及酶作用于DNA的最適時(shí)間。所用的適當(dāng)方法已在BRL出版的出版物“focus”第7卷2期(1985)第3頁(yè)上述及。過(guò)了最適反應(yīng)時(shí)間之后，于65℃加熱10分鐘使酶降解，並使用適當(dāng)?shù)腄NA標(biāo)志物(如用EcoRI酶切的噬菌體λDNA)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法檢驗(yàn)所得DNA片段是否有預(yù)期的長(zhǎng)度范圍。
實(shí)施例3連接限制性酶切混合物將預(yù)先用Sau3A部分酶切的大腸桿菌ATCC 11303的總DNA與已用BamHI部分酶切並用堿性磷酸酶處理過(guò)的pIMS6062裝配型質(zhì)粒DNA，以大約1∶5的摩爾比例混合。按New England Biolabs制造商所介紹的方法將所得混合物以離子濃度最適于T4DNA連接酶之作用效果的方式與幾倍濃縮的緩沖液混合，並將該混合物與1μl連接酶于16℃保溫至少14小時(shí)。該反應(yīng)混合物的總體積為50μl，且總DNA濃度為20μg/ml。
實(shí)施例4λ噬菌體的包裹連接酶反應(yīng)之后，將實(shí)施例3所得DNA于體外包裹到λ噬菌體頭部?？捎肏ohn，B.的方法(in Wu，R.e
itorRecombinant DNA，Methods in Enzymology，Vol.68，Academic Press，New York，Pages 299-309(1979))制得或由Boehringer Mannheim公司或Amersham Buchl公司(Braunschweig)購(gòu)得為此目的所必須的兩種不同細(xì)菌菌株的提取物。
將3μl依實(shí)施例3方法制得的混合物，在冰中冷卻同時(shí)與Amersham公司提供的細(xì)菌提取物(已于放前融解)混合。將混合物于20℃保溫30-60分鐘之后，加入200μl SM緩沖液(100mM NaCl 10mM MgSO4，50mM tris-HCl(pH7.5)、0.01%明膠)。該混合物可直接用于轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)或加10μl氯仿后于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>實(shí)施例5大腸桿菌DG30的轉(zhuǎn)導(dǎo)將0.4%麥芽糖加到5ml L培養(yǎng)液(1% Bacto Tryptone、0.5%酵母提取物和0.5%NaCl)內(nèi)，將混合物與50μl處于生長(zhǎng)靜止期的大腸桿菌DG 30的液體培養(yǎng)物混勻，于37℃保溫12小時(shí)直至達(dá)到早期靜止期。離心收集細(xì)菌並小心地再懸浮于2.5ml 10mM的MgCl2水溶液中。將實(shí)施例4中制得的10μl混合物與20μl濃縮的細(xì)菌懸液混合，並于室溫下將混合物保溫50分鐘。
之后加入200μl L培養(yǎng)液，並于37℃保溫1小時(shí)，同時(shí)間斷搖動(dòng)。取50μl等份的混合物在含有20μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)液瓊脂上鋪板。將瓊脂板于37℃保溫至少12小時(shí)。依所述方法，有可能由混合物獲得平均約1000個(gè)菌落。
實(shí)施例6攜帶aspC或iLvE或tyrB基因的大腸桿菌DG 30菌株的選擇按已述方法在含有20μg/ml四環(huán)素的L培養(yǎng)基瓊脂板上轉(zhuǎn)錄大腸桿菌DG 30菌株后得到約800個(gè)菌落，並將其采集到基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂板上?；A(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂板由含葡萄糖的M9培養(yǎng)基配制而成(Mller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor，1972)並添加有異亮氨酸、亮氨酸纈氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸等氨基酸。但培養(yǎng)基內(nèi)沒(méi)有加菌株DG30現(xiàn)仍不能合成的酪氨酸。800個(gè)菌落中，有7個(gè)能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
為了區(qū)分大腸桿菌DG 30中三個(gè)可能的基因aspC、iLvE和tyrB，將這7個(gè)菌落再采集到添加了除各種情況中一種以外所列氨基酸的上述基本培養(yǎng)基中，對(duì)于每種情況，由上述基因之一編碼的每種轉(zhuǎn)氨酶均表現(xiàn)有底物特異性。結(jié)果顯示于下表中
含下列一種外補(bǔ)充氨基酸克隆 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 假定的基因Asp Leu Ilu Tyr1 + + - + tyrB2 + + - + tyrB3 - +- + +- iLvE4 - +- + +- iLvE5 + + - + tyrB6 + + - + tyrB7 - +- + +- iLve+＝滿意的生長(zhǎng)+-＝生長(zhǎng)差-＝不生長(zhǎng)實(shí)施例7iLvE基因的定位按照Maniatis等(Cold Spring Harboy，P366-370 1982)的方法，經(jīng)微溶解由實(shí)施例6克隆1-7中，制得裝配型質(zhì)粒DNA，然后將該裝配型質(zhì)粒DNA引入大腸桿菌DH 1(ATCC 33849)，其可以由該菌株中以高產(chǎn)率再次進(jìn)行分離。
從大腸桿菌DH 1菌株中分離質(zhì)粒DNA，並依照制造商(New Enghand Biolabs)介紹的方法用限制性內(nèi)切酶Sal 1和SmaⅠ完全消化之。同樣用SalⅠ、PvuⅡ和AvaⅠ酶完全切斷載體pBR322(用AvaⅠ酶切是為了防止原來(lái)PBR322的SalⅠ-SmaⅠ片段回復(fù)連到載體中)。將兩種DNA混合並按實(shí)施例4中所述的方法連接在一起，然后用一等份的(如10μl)連接酶混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC 11303菌株的感受態(tài)細(xì)胞。在含有50μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基瓊脂平板上選擇抗性菌落，用微溶解法分離質(zhì)粒DNA，經(jīng)用限制性內(nèi)切酶SalⅠ完全消化並檢查載體DNA長(zhǎng)度的變化。
實(shí)施例8使用特定試驗(yàn)方法檢驗(yàn)例7中所得克隆的脂族轉(zhuǎn)氨酶(即iLvE的基因產(chǎn)物)活性。用未轉(zhuǎn)化的起始菌株ATCC 11303與轉(zhuǎn)化后的起始菌株ATCC 11303進(jìn)行比較。結(jié)果表明，含有iLvE基因的轉(zhuǎn)化菌株的脂族轉(zhuǎn)氨酶的活性比未轉(zhuǎn)化的起始菌株高10倍。
使用適當(dāng)標(biāo)志物作瓊脂糖凝膠電泳，可以表明增加了iLvE基因活性的菌株有PBR 322載體，而且該載體DNA含有一個(gè)來(lái)自ATCC 11303菌株，大小約1MD的摻入片段。當(dāng)用分離的質(zhì)粒DNA再次轉(zhuǎn)化無(wú)質(zhì)粒菌株大腸桿菌ATCC 11303時(shí)，均可觀察到iLvE基因活性增加約10倍。
實(shí)施例9iLvE基因的溫度誘導(dǎo)性表達(dá)得自大腸桿菌ATCC 11303的DNA片段是作為約1MD的SalⅠ-SmaⅠ片段被克隆的，其載帶iLvE基因但沒(méi)有天然啟動(dòng)子。更確切地說(shuō)，基因的表達(dá)是在已用SalⅠ和PvuⅡ酶切的PBR 322中克隆后，經(jīng)過(guò)由PBR322的四環(huán)素啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄開(kāi)始之后，再翻譯相應(yīng)于iLvE的mRNA而完成的。雖然來(lái)自PBR322的四環(huán)素啟動(dòng)子的功能相當(dāng)強(qiáng)並能得到理想的蛋白產(chǎn)量，但它不能通過(guò)溫度的變化而進(jìn)行調(diào)節(jié)。為了利用溫度的變化來(lái)調(diào)節(jié)iLvE的表達(dá)，用其上有λ噬菌體的PR啟動(dòng)子和溫度敏感性阻遏物基因CI 857的SalⅠ-EcoRI片段取代在iLvE的5′末端攜帶四環(huán)素啟動(dòng)子的SalⅠ-EcoRI片段。載體pCQV2被用作這個(gè)片段的來(lái)源(Queen，J.Molec and Applied Genetics，2(1983)1-10)。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalⅠ完全消化載體PCQV2。同樣用這些酶完全消化實(shí)施例8中制得的載體。這就必需將特定的酶同時(shí)加到DNA中，並在REB緩沖液〔50mM NaCl、10mM tris-HCl、PH7.5;6mM 2-巰基乙醇、6mM MgCl2、100μg/ml小牛血清白蛋白、0.01%非離子表面活性劑(RTriton X-100)〕中于37℃將混合物保溫1小時(shí)。混合物的總體積為50μl，DNA濃度為20μg/ml。對(duì)各5μl等分的混合物作瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗(yàn)酶消化的完全性。于65℃將兩種混合物加熱10分鐘，經(jīng)用苯酚處理除去限制性內(nèi)切酶，用乙醇沉淀之后用70%強(qiáng)度乙醇洗，以純化切斷的質(zhì)粒DNA。真空干燥后，將DNA分別再懸浮于50μl TE緩沖液中，並將各10μl混合物吸入同一容器內(nèi)。調(diào)整混合物使適合于制造商(New England Biolabs)推薦的T4DNA連接酶反應(yīng)的培養(yǎng)基，並加入10單位T4DNA連接酶。將混合物于16℃保溫16小時(shí)之后，用10μl等分的連接酶混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HB 101的感受態(tài)細(xì)胞。選擇氨芐青霉素抗性菌落，微溶解之后，用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和EcoRI對(duì)得自這些克隆的質(zhì)粒DNA作雙酶消化。作瓊脂糖凝膠電泳有可能鑒定出含有預(yù)期基因片段的克隆。
將用這種方法鑒定的兩個(gè)克隆于30℃或37℃培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基(Miller，Loc.cit)中。分析結(jié)果表明，由37℃培養(yǎng)的細(xì)菌所得iLvE基因產(chǎn)物之酶活性的數(shù)值為無(wú)質(zhì)粒對(duì)照菌株的5-10倍。而30℃培養(yǎng)的菌株酶的活性實(shí)際上與無(wú)質(zhì)粒對(duì)照菌株完全相同。反之，如果將細(xì)菌培養(yǎng)于30℃，然后于65℃水浴中搖動(dòng)使培養(yǎng)物的溫度提高到45℃，再將培養(yǎng)物于37℃保溫2小時(shí)，酶的活性至少增加10倍。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)制性的、含“染色體外”的含iLvE基因的結(jié)構(gòu)基因的制備方法，其包括自大腸桿菌ATCC11303中分離iLvE基因，並克隆到質(zhì)粒中。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所使用的質(zhì)粒為多拷貝質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中所用的質(zhì)粒為PBR322。
4.一種在微生物體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生分支鏈氨基酸的方法，其包括a)將按權(quán)利要求
1的方法制得的染色體外結(jié)構(gòu)元件插入到微生物體內(nèi);b)在微生物體內(nèi)表達(dá)iLvE基因，並合成活性脂族轉(zhuǎn)氨酶，以及c)借助轉(zhuǎn)氨酶完成相關(guān)酮前體的胺化作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中微生物是腸道菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中微生物是大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中微生物是大腸桿菌ATCC11303及其變種。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)制性“染色體外”的含ilvE基因的結(jié)構(gòu)基因的制備方法，包括自大腸桿菌ATCC11303中分離ilvE基因并克隆到質(zhì)粒中。還涉及將該質(zhì)粒插入到微生物中通過(guò)表達(dá)產(chǎn)生活性脂族轉(zhuǎn)氨酶，由轉(zhuǎn)氨酶完成相關(guān)酮前體的胺化作用，從而大量地產(chǎn)生氨基酸。
文檔編號(hào)C12R1/19GK87107205SQ87107205
公開(kāi)日1988年7月20日 申請(qǐng)日期1987年10月28日
發(fā)明者魯?shù)细瘛ゑR奎特, 約翰·森, 翰斯·馬希斯·迪格, 格哈德·沃納, 馬蒂恩·羅賓森, 安德魯·多赫蒂 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan