專利名稱：人血管內(nèi)皮生長因子2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是Rosen，C.等人于1994年3月8日在美國專利商標(biāo)局申請的申請?zhí)枮?8/207,550的申請的繼續(xù)部分申請。
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸，該多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸和多肽的用途以及該多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。本發(fā)明的多肽已鑒定為血管內(nèi)皮生長因子家族的一個(gè)成員，更具體地，本發(fā)明的多肽為血管內(nèi)皮生長因子2，在下文中有時(shí)稱作“VEGF2”。本發(fā)明也涉及抑制該多肽的作用。
新血管的形成或稱血管生成對于胚胎發(fā)育、后續(xù)的生長以及組織修復(fù)是非常重要的，然而血管生成也是某些病理狀態(tài)如瘤形成(例如腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤)的重要部分，異常血管生成與其它一些疾病相關(guān)，如炎癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和糖尿病性視網(wǎng)膜病(Folkman，J.and Klagsbrun，M.，科學(xué)235442-447(1987))。
酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子分子均是內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞的促分裂原。盡管血管趨向肽(angiotropin)和血管生成素的功能尚不清楚，但是它們可以誘導(dǎo)血管生成(Folkman，J.，1993，癌癥藥物，153-170頁，Lea and Febiger出版社)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種高度選擇性促分裂原是血管內(nèi)皮生長因子或稱VEGF(Ferrara，N.等，內(nèi)分泌綜述1319-32(1992))，其也稱為血管通透因子(VPF)，血管內(nèi)皮生長因子是分泌的血管生成促分裂原，其靶細(xì)胞特異性似乎限于血管內(nèi)皮細(xì)胞。
已鑒別了小鼠VEGF基因并分析了其在胚胎發(fā)生中的表達(dá)模式。在鄰近透明內(nèi)皮的上皮細(xì)胞中，例如在脈絡(luò)膜叢和腎小球中觀察到VEGF的持續(xù)表達(dá)。該資料與VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的多功能調(diào)節(jié)物的作用一致(Breier，G.等，發(fā)育114521-532(1992))。
VEGF在結(jié)構(gòu)上與血小板衍生生長因子(PDGF)和胎盤生長因子(PLGF)的α和β鏈相關(guān)，PDGF是間質(zhì)細(xì)胞的促分裂原，PLGF是內(nèi)皮細(xì)胞的促分裂原。這三個(gè)蛋白屬于同一家族并共享一保守基序，在這些蛋白中負(fù)責(zé)形成二硫鍵的8個(gè)半胱氨酸嚴(yán)格保守。已鑒別了VEGF、PLGF和PDGF的可變剪接mRNA，這些不同的剪接產(chǎn)物的生物學(xué)活性和受體結(jié)合特異性不同。VEGF和PDGF以同二聚體或異二聚體起作用并結(jié)合受體，這些受體在二聚化后激發(fā)內(nèi)在的酪氨酸激酶活性。
由于可變剪接，VEGF具有4種不同形式，分別含121、165、189和206個(gè)氨基酸，VEGF121和VEGF165是可溶的并能促進(jìn)血管生成，而VEGF189和VEGF206與細(xì)胞表面的含有肝素的蛋白聚糖結(jié)合。VEGF的時(shí)空表達(dá)已證明與血管的生理性增殖相關(guān)(Gajdusek，C.M.and Carbon，S.J.，細(xì)胞生理學(xué)139570-579(1989)；McNeil，P.L.，Muthukrishnan，L.，Warder，E.，D’Amore，P.A.，細(xì)胞生物學(xué)雜志109811-822(1989))。其高親和性結(jié)合位點(diǎn)只位于組織切片中的內(nèi)皮細(xì)胞(Jakeman，LB.等，臨床研究89244-253(1989))。所述的因子可以從垂體細(xì)胞和幾種腫瘤細(xì)胞系中分離并已用于某些人神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Plate，K.H.，自然359845-848(1992))。令人感興趣的是VEGF121或VEGF165的表達(dá)賦予中國倉鼠卵巢細(xì)胞以在裸鼠中形成腫瘤的能力(Ferrara，N.等，臨床研究雜志91160-170(1993))。已證明用抗VEGF單克隆抗體對VEGF的抑制可以在免疫缺陷的小鼠中抑制腫瘤生長(Kim，K.J.，自然362841-844(1993))。另外，VEGF受體的一種顯性陰性突變體已證明能抑制小鼠中的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的生長。
已發(fā)現(xiàn)血管通透因子負(fù)責(zé)甚至在損傷停止后仍持續(xù)的對于細(xì)胞質(zhì)蛋白的微血管高通透性，這是正常傷口愈合的一個(gè)特征，提示VPF是傷口愈合中的一個(gè)重要因子，Brown，L.F.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761375-9(1992)。
VEGF在血管化組織(例如肺、心臟、胎盤和實(shí)體腫瘤)中的表達(dá)很高并與血管生成在時(shí)間和空間上相關(guān)。還證明VEGF能在體內(nèi)誘導(dǎo)血管生成。由于血管生成對于正常組織特別是血管組織的修復(fù)很重要，所以VEGF已被提議用于促進(jìn)血管組織修復(fù)(例如在動(dòng)脈粥樣硬化中)。
美國專利5,073,492(1991年12月17日授予Chen等)公開了一種在合適環(huán)境中協(xié)同增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞生長的方法，該方法包括向該環(huán)境中加入VEGF，效應(yīng)子以及血清衍生因子。另外，還通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)制備了血管內(nèi)皮生長因子C亞基DNA，該DNA編碼一種能以異二聚體或同二聚體存在的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原，因此能用于促進(jìn)血管發(fā)育和修復(fù)，如歐洲專利申請92302750.2(1992年9月30日公開)中所公開的一樣。
根據(jù)與人VEGF的氨基酸序列同源性，本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為一種新的血管內(nèi)皮生長因子。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的成熟多肽及其具有生物學(xué)活性并在診斷學(xué)或治療學(xué)上有用的片段，類似物與衍生物。本發(fā)明的多肽是人源的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子，該核酸分子包括mRNA，DNA，cDNA，基因組DNA，及其具有生物學(xué)活性并在診斷學(xué)或治療學(xué)上有用的片段、類似物和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法，該方法包括在促進(jìn)所述蛋白表達(dá)及所述蛋白的隨后回收的條件下培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了一種利用該多肽或編碼該多肽的多核苷酸用于治療目的的方法，例如刺激血管生成、傷口愈合和促進(jìn)血管組織修復(fù)。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了抗這種多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了抗這種多肽的拮抗劑，其可用于抑制這種多肽的作用，例如抑制腫瘤生長，治療糖尿病性視網(wǎng)膜病、炎癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有足夠長的核酸分子的核酸探針，該探針可以特異地雜交到本發(fā)明的核酸序列上。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了用于診斷與本發(fā)明的核酸序列中的突變以及由這種核酸序列編碼的蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病或疾病易感性的方法。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種將這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸用于與科學(xué)研究、DNA合成以及DNA載體的生產(chǎn)有關(guān)的體外目的的方法。
根據(jù)本文的教導(dǎo)，本發(fā)明的這些以及其它方面對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言應(yīng)該是顯而易見的。
下面的附圖僅僅意味著是對本發(fā)明的具體實(shí)施方案的說明，而并不意味著以任何的方式限制本發(fā)明。


圖1示出了本發(fā)明的多肽的cDNA序列以及相應(yīng)推導(dǎo)的氨基酸序列，使用了標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸縮寫。測序用373自動(dòng)DNA測序儀(Applied Biosystems，Inc.)進(jìn)行，測序精度預(yù)計(jì)大于97％。
圖2示出本發(fā)明的多肽和人PDGF/VEGF家族其它成員之間的氨基酸序列同源性。加框的區(qū)域指示保守的序列以及8個(gè)保守半胱氨酸的位置。
圖3示出體外轉(zhuǎn)錄、翻譯和電泳本發(fā)明的多肽后的凝膠照相，泳道114C和彩虹(rainbow)分子量標(biāo)記；泳道2FGF對照；泳道3由M13-反向和正向引物生產(chǎn)的VEGF2；泳道4由M13-反向和VEGF-F4引物生產(chǎn)的VEGF2；泳道5由M13-反向和VEGF-F5引物生產(chǎn)的VEGF2。
圖4在由Sf9細(xì)胞組成的桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)VEGF2多肽，在還原和非還原條件下通過SDS-PAGE分析來自培養(yǎng)基和細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)。
圖5沉淀來自用本發(fā)明的核酸序列感染的Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)基，然后用SDS-PAGE分析重懸的沉淀并用考馬斯亮藍(lán)染色。
圖6從培養(yǎng)基上清純化VEGF2并在還原劑β-巰基乙醇的存在或不存在下通過SDS-PAGE分析，并用考馬斯亮藍(lán)染色。
圖7示出用RP-300柱(0.21×3cm，Applied Biosystems，Inc.)對純化的VEGF2進(jìn)行反相HPLC分析，柱用0.1％三氟乙酸(溶劑A)平衡并用0-60％溶劑B(由含0.07％TFA的乙腈組成)的7.5min梯度洗脫蛋白質(zhì)。蛋白洗脫液用在215nm(紅線)和280nm(藍(lán)線)處的吸收值而監(jiān)控。溶劑B的百分比由綠線示出。
圖8示出與堿性成纖維細(xì)胞生長因子相比，部分純化的VEGF2蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長的作用。
圖9示出純化的VEGF2蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長的作用。
術(shù)語“基因”是指參與產(chǎn)生一個(gè)多肽鏈的DNA區(qū)段；它包括在編碼區(qū)之前與之后的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)與尾區(qū))以及在各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分離的核酸分子(多核苷酸)，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽，或者編碼由1995年5月24日保藏的ATCC保藏號為97161的克隆的cDNA所編碼的成熟多肽，或者編碼具有比圖1所示少的氨基酸殘基的多肽。
編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸可以從早期人胚胎(8周至9周)破骨細(xì)胞瘤、成人心臟或幾種乳腺癌細(xì)胞系中獲得，本發(fā)明的多核苷酸在衍生自9周的早期人胚胎衍生的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。它在結(jié)構(gòu)上與VEGF/PDGF家族相關(guān)。VEGF2含有一個(gè)編碼419個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框，其中大約前23個(gè)氨基酸殘基是推斷的前導(dǎo)序列，從而成熟蛋白包括396個(gè)氨基酸，該蛋白質(zhì)顯示與人血管內(nèi)皮生長因子具有最高的氨基酸序列同源性，有30％相同性，依次是PDGFα(23％)和PDGFβ(22％)。
特別重要的是在這一家族的所有4個(gè)成員中所有8個(gè)半胱氨酸均是保守的(見圖2的加框區(qū)域)，另外PDGF/VEGF家族的特征，PXCVXXXRCXGCCN(SEQ ID NO3)在VEGF2中是保守的(見圖2)。
本發(fā)明的VEGF2多肽意在包括全長多肽和編碼任何前導(dǎo)序列和全長多肽的活性片段的多核苷酸序列，活性片段意在包括任何具有比SEQ ID NO.2和圖2所示的完整419個(gè)氨基酸的全長氨基酸序列短的氨基酸序列但是仍含有在圖2中顯示保守的8個(gè)半胱氨酸殘基的全長氨基酸序列的部分，這種片段仍含有VEGF2活性。
在正常組織中至少存在兩種可變剪接的VEGF2 mRNA序列，圖3示出了分別對應(yīng)于全長和截短譯本的兩種VEGF2 mRNA序列的大小，泳道5示出兩條帶，指示存在編碼本發(fā)明的VEGF2多肽的可變剪接的mRNA。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因組DNA和合成DNA，該DNA可以是雙鏈或者是單鏈的，如果是單鏈則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與顯示在圖1中的編碼序列或者保藏克隆的編碼序列相同，或者該序列可以是一個(gè)不同的編碼序列，但由于遺傳密碼的豐余性或簡并性它編碼與圖1的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或者編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列(以及任選的附加的編碼序列)與非編碼序列，如內(nèi)含子或者成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包括僅包括該多肽編碼序列的多核苷酸以及包括附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述的多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽的片段、類似物與衍生物或者由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物與衍生物。該多核苷酸的變異體可以是該多核苷酸的一種天然發(fā)生的等位基因變異體，或者是該多核苷酸的一種非天然發(fā)生的變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼如圖1所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸及其變異體，其中該變異體編碼圖1的多肽或者由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或者類似物。該核苷酸變異體包括缺失變異體，取代變異體以及添加或插入變異體。
如上文所示，所述的多核苷酸可以具有是圖1所示的編碼序列或者保藏克隆的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列。正如在本領(lǐng)域中已知的，一種等位基因變異體是一個(gè)多核苷酸序列的可變形式，它可以具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，缺失或添加，但它基本上不改變所編碼多肽的功能。
本發(fā)明的多核苷酸也可具有在同一讀框內(nèi)與標(biāo)記序列融合的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得能純化本發(fā)明的多肽。在細(xì)菌宿主的情況下，標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物以使與標(biāo)記融合的成熟多肽純化，或者，例如當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記序列可以是血凝素(HA)標(biāo)記物，HA標(biāo)記物對應(yīng)于從流感血凝素蛋白衍生的一個(gè)表位(Wilson，I.等，細(xì)胞37767(1984))。
術(shù)語“基因”是指參與產(chǎn)生一個(gè)多肽鏈的DNA區(qū)段；它包括在編碼區(qū)之前與之后的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)與尾區(qū))以及在各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
本發(fā)明的全長基因的片段可以用作一個(gè)cDNA文庫的雜交探針，以便于分離全長cDNA并且分離與該基因具有高的序列相似性或相似的生物學(xué)活性的其它c(diǎn)DNA。這種類型的探針優(yōu)選具有至少30個(gè)堿基并且可以含有例如50或更多個(gè)堿基。該探針也可以用于鑒定對應(yīng)于一個(gè)全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆以及含有完整基因的一個(gè)基因組克隆或多個(gè)基因組克隆，其中完整基因包括調(diào)節(jié)區(qū)與啟動(dòng)子區(qū)，外顯子和內(nèi)含子。一個(gè)篩選的實(shí)例包括通過使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針以分離出基因的編碼區(qū)。具有互補(bǔ)于本發(fā)明基因序列的序列的標(biāo)記寡核苷酸可以用于篩選人cDNA、基因組DNA或mRNA的文庫，從而測定與該探針雜交的文庫成員。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間存在至少70％、優(yōu)選至少90％且更優(yōu)選至少95％的相同性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。文中所使用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指只有序列間存在至少95％且優(yōu)選至少97％的相同性時(shí)才發(fā)生雜交。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽基本上保留了與由圖1的cDNAs(SEQID NO1)或保藏的cDNA(s)所編碼的成熟多肽所具有的同樣的生物學(xué)功能或活性。
另一方面，多核苷酸可以含有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選30個(gè)堿基并且更優(yōu)選至少50個(gè)堿基與本發(fā)明的多核苷酸雜交且與之具有如上所述相同性，并且可以保留或不保留活性。例如這樣的多核苷酸可以用作SEQ ID NO1的多核苷酸的探針，例如用于回收多核苷酸或用作診斷探針或PCR引物。
因此，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸及其片段具有至少70％的相同性、優(yōu)選至少90％的相同性且更優(yōu)選至少95％的相同性的多核苷酸，以及該多核苷酸所編碼的多肽，其中所述的片段具有至少30個(gè)堿基并且優(yōu)選至少50個(gè)堿基。
本文所涉及的保藏物將按照關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行保存。這些保藏物僅為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便而提供，不是對按35 U.S.C.§112要求保藏物的許可。包含在保藏材料中的多核苷酸的序列及其所編碼的多肽的氨基酸序列在本文中作為參考而附入，并且在與本文序列描述有沖突的任意的一種情況下起決定作用。制造、使用或銷售該保藏材料需要許可證，并且此處不頒發(fā)這樣的許可證。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列或者具有由保藏的cDNA所編碼的氨基酸序列的多肽以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)涉及圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語“片段”、“衍生物”與“類似物”是指保留了圖2所示的VEGF蛋白的保守基序并基本上保留了該多肽的同樣的生物學(xué)功能或活性的多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被一個(gè)保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選一個(gè)保守的氨基酸殘基)所取代并且被取代的氨基酸殘基可以是或可以不是由該遺傳密碼所編碼，或者(ii)一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含一個(gè)取代基，或者(iii)一種多肽，其中成熟多肽與另一種化合物，諸如一種提高該多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)一種多肽，其中成熟多肽與附加的氨基酸融合，或者(v)一種多肽，其包括比SEQ ID NO.2所示少的氨基酸殘基并保留保守基序而且仍保持VEGF家族多肽的活性特征。從本文的教導(dǎo)出發(fā)，這樣的片段、衍生物與類似物視為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的范圍內(nèi)的。
本發(fā)明的多肽與多核苷酸優(yōu)選以一種分離的形式而提供，并且優(yōu)選將其純化成均一物質(zhì)。
術(shù)語“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如如果該物質(zhì)是天然存在的，即指天然環(huán)境)中分離出該物質(zhì)。例如，一種存在于活體動(dòng)物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分離的，但是從天然系統(tǒng)中一些或所有的共存物質(zhì)里分離出的同樣的多核苷酸或DNA或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是一個(gè)載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是一種組合物的一部分，并且如果該載體或組合物并非是其天然環(huán)境的一部分，則其仍然是分離的。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽(特別是成熟多肽)以及與SEQ ID NO2的多肽具有至少70％的相似性(優(yōu)選至少70％的相同性)的多肽、更優(yōu)選與SEQ ID NO2的多肽具有至少90％的相似性(更優(yōu)選至少90％的相同性)的多肽、并且特別優(yōu)選與SEQ ID NO2的多肽具有至少95％的相似性(特別優(yōu)選至少90％的相同性)的多肽，本發(fā)明的多肽也包括該多肽的部分，其中該多肽的這些部分通常含有至少30個(gè)氨基酸并且更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
正如在本領(lǐng)域中已知的，兩種多肽之間的“相似性”是通過把一個(gè)多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與第二個(gè)多肽的序列進(jìn)行比較而確定的。
通過肽合成，本發(fā)明多肽的片段或部分可以用于生產(chǎn)相應(yīng)的全長的多肽；因此，該片段可以用作生產(chǎn)全長多肽的中間體。本發(fā)明的多核苷酸的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長的多核苷酸。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體基因工程化的宿主細(xì)胞以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞可以是用本發(fā)明的載體進(jìn)行基因工程化的(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，其中載體例如可以是克隆載體或表達(dá)載體，載體例如可以呈質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等的形式。基因工程化的宿主細(xì)胞可以在經(jīng)改良以適于激活啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增VEGF2基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(諸如溫度、pH及其它)是為了表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞以前所采用的條件，并且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來講是顯而易見的。
通過重組技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸可以用于生產(chǎn)多肽。因此，例如該多核苷酸序列可以包含在表達(dá)多肽的多種表達(dá)載體中的任意一種中，具體而言如載體或質(zhì)粒中。這樣的載體包括染色體、非染色體及合成DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；質(zhì)粒與噬菌體DNA結(jié)合所得到的載體、病毒DNA(諸如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒與假狂犬病)。但是，只要任意一種其它的載體或質(zhì)粒在宿主中可以復(fù)制并且存活便可以使用它們。
可通過許多種方法把合適的DNA序列插入到載體中。一般而言，通過本領(lǐng)域已知的方法可以把DNA序列插入到一個(gè)合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上。該方法及其它方法被視為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的范圍之內(nèi)。
表達(dá)載體中的DNA序列可操作地與一個(gè)合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)連接以指導(dǎo)mRNA的合成。作為上述啟動(dòng)子有代表性的實(shí)例可以提到的有LTR或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體λPL啟動(dòng)子以及其它已知調(diào)控原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中基因表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體也含有一個(gè)用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)與一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。載體也可以包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適序列。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一種為轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的篩選而提供一種表型性狀的基因，諸如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者諸如在大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
含有如上所述的合適的DNA序列以及一個(gè)合適的啟動(dòng)子或調(diào)控序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化一種合適的宿主從而允許該宿主表達(dá)蛋白。
作為合適宿主有代表性的實(shí)例可以提到的有細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌，鏈霉菌屬，鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅S2與苜蓿銀紋夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等等。根據(jù)本文的教導(dǎo)，選擇合適的宿主被認(rèn)為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的范圍之內(nèi)。
更具體地講，本發(fā)明也包括含有一個(gè)或多個(gè)如上廣義所述的序列的重組構(gòu)建體。構(gòu)建體包括將本發(fā)明的序列以正向或逆向插入其中的載體，如質(zhì)?；虿《据d體。在這一實(shí)施方案一個(gè)優(yōu)選方面，構(gòu)建體進(jìn)一步包括可操作地與序列連接的調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子。許多合適的載體與啟動(dòng)子是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的并且可以通過商業(yè)途徑得到。下面的載體以舉例的方式提供細(xì)菌載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)；真核載體pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT 1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。但是，只要任意一種其它的質(zhì)?；蜉d體在該宿主中可以復(fù)制并存活便可以使用它們。
采用具有選擇標(biāo)記的CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它載體，可以從任意一種所需要的基因中篩選出啟動(dòng)子區(qū)域。兩個(gè)合適的載體為pKK232-8與pCM7。特別指出的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PL和trp。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期與晚期SV40，來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體與啟動(dòng)子在本領(lǐng)域普通的技術(shù)水平上是可以完成的。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，或是低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE一葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔可以實(shí)現(xiàn)該構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的引入(Davies，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)基本方法，(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以以常規(guī)的方式使用從而生產(chǎn)由該重組序列所編碼的基因產(chǎn)物。另一方面，本發(fā)明的多肽也可以通過常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)。
在合適的啟動(dòng)子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)。采用從本發(fā)明的DNA構(gòu)建體得到的RNAs，也可通過無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)該蛋白。用于原核與真核宿主的合適的克隆與表達(dá)載體在Sambrook等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)》，第二版(紐約冷泉港，1989)中進(jìn)行了描述，其公開內(nèi)容此處引用為參考。
通過向載體中插入增強(qiáng)子序列可提高通過高等真核生物對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子為DNA的順式作用元件，一般大約從10至300bp，它作用于啟動(dòng)子以提高其轉(zhuǎn)錄。它的例子包含有位于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100至270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，位于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子與腺病毒增強(qiáng)子。
一般而言，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)與允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記(例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因)以及從一個(gè)高度表達(dá)的基因中得到的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以從編碼如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)這樣的糖酵解酶、α因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白等的操縱子中得到。異源結(jié)構(gòu)序列以合適的方式與翻譯起始和終止序列、以及優(yōu)選地一個(gè)能夠指導(dǎo)被翻譯的蛋白分泌至周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列進(jìn)行裝配。異源序列可以任選地編碼一種融合蛋白，該蛋白含有一個(gè)N-末端鑒定肽，其中的鑒定肽賦予了表達(dá)的重組產(chǎn)物所需要的特征，例如穩(wěn)定性或易于純化的特性。
通過將編碼一種所需蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始與終止信號以可操縱的閱讀方式和一個(gè)功能啟動(dòng)子一起插入，可以構(gòu)建對細(xì)菌的使用而言有用的表達(dá)載體。該載體將包括一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記和一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以確保維持該載體并且如果需要的話可以保證在宿主中進(jìn)行擴(kuò)增。用于轉(zhuǎn)化的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及屬于假單胞桿菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬中的許多種，當(dāng)然其它種的生物也可以采用。
作為代表性但非限制性的例子，對細(xì)菌的使用而言有用的表達(dá)載體可以包括選擇標(biāo)記和來自含有所熟知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳因子的商購質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這些商購載體包括如pKK223-3(Phamacia精細(xì)化學(xué)公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“骨架”部分與一種合適的啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相結(jié)合。
進(jìn)行合適的宿主株系的轉(zhuǎn)化并且該宿主株系生長至合適的細(xì)胞密度后，通過合適的方法(例如溫度變動(dòng)或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子并且再將細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。
細(xì)胞通常經(jīng)離心收獲，通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行破碎，并且保留得到的粗提物以便進(jìn)一步的純化。
在蛋白表達(dá)中所使用的微生物細(xì)胞可以通過任意一種方便的方法進(jìn)行破碎，該方法包括冷凍-融化循環(huán)，超聲處理，機(jī)械破碎，或者使用細(xì)胞裂解劑，這種方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)重組蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))所述的猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系以及可以表達(dá)相容載體的其它細(xì)胞系，例如C127，3T3，CHO,HeLa與BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。從SV40病毒基因組中得到的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)，早期啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，剪接與聚腺苷酸化位點(diǎn)可以用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
本發(fā)明的多肽可以通過迄今為止所使用的方法從重組的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化，該方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析與凝集素層析。如果需要的話，在完成該成熟蛋白的構(gòu)型中可以采用蛋白重折疊步驟。最后，可以采用高效液相層析(HPLC)用于最終的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是一種天然純化的產(chǎn)物，或者是一種化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或者是從原核或真核宿主(例如通過細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))經(jīng)重組技術(shù)制備的。根據(jù)在重組生產(chǎn)方法中所使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化或者可以是非糖基化的。該多肽也可以包含一個(gè)起始的甲硫氨酸殘基。
如圖8和9所示，SEQ ID NO.2的VEGF2多肽(減去開始的46個(gè)氨基酸)是血管內(nèi)皮細(xì)胞潛在的促分裂原并且刺激其生長和增殖。針對編碼這一多肽的VEGF2核酸序列進(jìn)行的Northern印跡分析(在這一分析中用32P-VEGF2探查來自幾種人組織的20μg RNA)的結(jié)果顯示這一蛋白在心臟和肺中活躍表達(dá)，這是促分裂原活性的進(jìn)一步的證據(jù)。
因此，VEGF2多肽可以用于促進(jìn)血管生成，例如刺激進(jìn)行冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)的移植組織的生長，VEGF2也可以用于促進(jìn)傷口愈合，特別是對于再血管化損害的組織，或在局部缺血過程中以及希望新的毛細(xì)血管生成的地方刺激旁路血流。VEGF2可以用來治療深度傷口如真皮潰瘍，包括壓傷、靜脈潰瘍和糖尿病性潰瘍。另外，當(dāng)使用皮膚移植物或皮瓣來修復(fù)深度燒傷和損傷時(shí)，VEGF2可以用來治療深度燒傷和損傷。VEGF2還可用于整形外科，例如用于修復(fù)外傷和手術(shù)切口的傷口。
除此之外，VEGF2可以用于誘導(dǎo)損傷骨骼、牙周或韌帶組織的生長，VEGF2還可用于再生由于疾病和外傷而損害的牙齒支持組織如牙釉質(zhì)和牙周韌帶。
由于血管生成對于保持傷口清潔及不發(fā)生感染是重要的，因此VEGF2可以用于外科手術(shù)以及后來的切口修復(fù)中，其也可以用來治療處于感染高危狀態(tài)的腹膜傷口。
VEGF2可以在血管移植手術(shù)中用于促進(jìn)內(nèi)皮化，在使用移植的或合成的材料的血管移植物時(shí)，可以將VEGF2施加到移植物的表面或者連接處以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長。VEGF2還可用于修復(fù)由于心肌梗塞所致的心肌組織損傷，VEGF2還可用于修復(fù)局部缺血后的心血管系統(tǒng)，VEGF2還可用于治療冠狀動(dòng)脈疾病以及周圍和CNS血管疾病導(dǎo)致的損傷的血管組織。
VEGF2還可用于涂覆待移植進(jìn)體內(nèi)的人工修補(bǔ)物或天然器官以最大程度地降低對移植材料的排斥并刺激移植材料的血管化。
VEGF2例如還可用于在動(dòng)脈粥樣硬化和隨后的氣囊血管移植中損傷的血管組織所需的血管組織修復(fù)中。
VEGF2核酸序列和VEGF2多肽還可以用于各種體外目的，如科學(xué)研究、DNA合成和DNA載體的制備，以及生產(chǎn)治療人類疾病的診斷劑和治療劑。例如，VEGF2可以用于體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，其是以10pg/ml-10ng/ml的濃度加入條件培養(yǎng)基中。
全長VEGF2基因的片段可以用作一cDNA文庫的雜交探針以分離與該基因有高度序列相似性或相似生物學(xué)活性的其它基因。這種類型的探針通常至少為50bp，當(dāng)然它們可以具有更多個(gè)堿基。探針還可用于鑒別對應(yīng)于全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆以及含有完整的VEGF2基因(包括調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子)的基因組克隆。一個(gè)篩選例子包括用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針以分離VEGF2基因的編碼區(qū)。具有互補(bǔ)于本發(fā)明基因的序列的標(biāo)記寡核苷酸可用于篩選人cDNA、基因組DNA或mRNA文庫以確定探針與哪些文庫成員雜交。
本發(fā)明提供了鑒定VEGF2受體的方法。編碼受體的基因可以通過許多為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行鑒定，例如配體淘選與FACS分選(Coligan，等，免疫學(xué)通用方案，1(2)，第五章，(1991))。優(yōu)選采用表達(dá)克隆法，其中從對VEGF2有反應(yīng)的細(xì)胞中制備聚腺苷酸化的RNA，并且把從該RNA產(chǎn)生的cDNA文庫分割成多個(gè)集合體并且將其用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或其它對VEGF2無反應(yīng)的細(xì)胞。將生長于載玻片上的轉(zhuǎn)染細(xì)胞與標(biāo)記的VEGF2接觸，VEGF2可通過許多方法，包括碘化作用或引入一個(gè)位點(diǎn)特異性蛋白激酶的識(shí)別位點(diǎn)來標(biāo)記。固定與溫育后，對玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒定陽性集合體并且采用一種重復(fù)亞集合與再篩選方法來制備和再轉(zhuǎn)染亞集合體，最終得到一種編碼推定的受體的單一克隆。
作為一種用于受體鑒定的替代方法，標(biāo)記的VEGF2可以和細(xì)胞膜或表達(dá)該受體分子的提取制劑光親和連接。交聯(lián)物質(zhì)通過PAGE分析進(jìn)行分辨并且在X-光膠片上曝光。可以切下含有VEGF2的標(biāo)記復(fù)合物，分解成肽片段并且對之進(jìn)行蛋白微量測序。從微量測序得到的氨基酸序列可以用來設(shè)計(jì)一套簡并的用于篩選cDNA文庫的寡核苷酸探針，從而鑒定編碼該推定受體的基因。
本發(fā)明還設(shè)計(jì)一種篩選化合物以鑒定那些是VEGF2的激動(dòng)劑或拮抗劑的物質(zhì)的方法。這種方法的一個(gè)實(shí)例是利用VEGF2在comitogen Con A存在下能明顯刺激人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。取內(nèi)皮細(xì)胞在96孔平底培養(yǎng)板(Costar，Cambridge，MA)中的補(bǔ)加Con-A(Calbiochem，La Jolla，CA)的反應(yīng)混合物中培養(yǎng)，加入Con-A，本發(fā)明的多肽以及待篩選的化合物，在37℃溫育后用1μCi3[H]胸苷(5Ci/mmol；1Ci＝37BGq；NEN)脈沖培養(yǎng)物足夠時(shí)間以摻入3[H]并收獲至玻璃纖維濾膜(PhD；Cambridge Technology，Watertown，MA)上。用液閃計(jì)數(shù)儀(Beckman Instruments，Irvine，CA)確定三份重復(fù)培養(yǎng)物的平均3[H]胸苷摻入(cpm)。與不加化合物的對照測定相比顯著的3[H]胸苷摻入指示對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的刺激。
為測定拮抗劑化合物，可以進(jìn)行上述分析測定，在VEGF2存在下該化合物抑制3[H]胸苷摻入的能力指示該化合物是VEGF2的一種拮抗劑?；蛘?，可以在適合競爭抑制分析的條件下將VEGF2和一潛在的拮抗劑化合物與膜結(jié)合VEGF2受體或重組受體合并來檢測VEGF2拮抗劑。VEGF2可以標(biāo)記如用放射性標(biāo)記，從而與受體結(jié)合的VEGF2分子數(shù)可以用來確定潛在的拮抗劑的效果。
或者，可以在化合物存在或不存在下測定VEGF2和受體相互作用后已知的第二信使系統(tǒng)的反應(yīng)并進(jìn)行比較。這種第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道或磷酸肌醇水解。在另一方法中，在化合物的存在下將表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或表達(dá)VEGF2受體的膜制劑與標(biāo)記的VEGF2保溫，然后可以測定化合物增強(qiáng)或阻斷這一相互作用的能力。
潛在的VEGF2拮抗劑包括抗體，或者在某些情況下為寡核苷酸，它們與多肽結(jié)合并有效地消除VEGF2功能?；蛘撸环N潛在的拮抗劑可以是一種結(jié)合VEGF2受體的緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，但是它們是多肽的失活形式并因此阻止VEGF2的作用。這些拮抗劑的例子包括VEGF2多肽的陰性顯性突變體，例如異二聚體形式的VEGF2的一條鏈可以是顯性的并可以經(jīng)突變而不再保持生物學(xué)活性。陰性顯性突變體的一個(gè)例子包括二聚體化VEGF2的截短譯本，其能與另一二聚體相互作用形成野生型VEGF2，然而，得到的同二聚體是失活的，不能顯示特征性VEGF活性。
另一種潛在的VEGF2拮抗劑為采用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。通過三股螺旋形成或反義DNA或RNA，反義技術(shù)可以用于控制基因的表達(dá)，上述兩種方法均是建立在一種多核苷酸結(jié)合到DNA或RNA的基礎(chǔ)上的。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用于設(shè)計(jì)一種反義RNA寡核苷酸，其長度從大約10至40個(gè)堿基對。將一種DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)成互補(bǔ)于涉及轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域(三股螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456(1988)；與Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，從而阻止轉(zhuǎn)錄以及VEGF2的生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)雜交到mRNA上并且阻止mRNA分子翻譯成VEGF2多肽(反義-Okano，神經(jīng)化學(xué)雜志，56560(1991)；作為基因表達(dá)的反義抑制劑的寡脫氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。還可以把上述寡核苷酸傳遞至細(xì)胞，從而該反義RNA或DNA可以在體內(nèi)表達(dá)以抑制VEGF2的生產(chǎn)。
潛在的VEGF2拮抗劑還包括一些小分子，這些小分子可以結(jié)合并占據(jù)多肽的活性位點(diǎn)從而使催化位點(diǎn)接觸不到底物以阻止正常生物學(xué)活性。小分子的實(shí)例包括但不限于小肽或類肽分子。
拮抗劑可以用于治療固體腫瘤轉(zhuǎn)移所需的有限血管生成。
發(fā)現(xiàn)編碼VEGF2的mRNA在至少兩種乳腺腫瘤細(xì)胞系中以中等水平表達(dá)，提示VEGF2多肽在惡性表型中的作用。神經(jīng)膠質(zhì)瘤也是瘤形成的一種類型，其可用本發(fā)明的拮抗劑治療。
拮抗劑還可用于治療由增加的血管通透性導(dǎo)致的炎癥，除這些紊亂外，拮抗劑還可用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病。
拮抗劑可以與一種如下所述的藥物學(xué)可接受的載體一起用于組合物中。
VEGF2多肽和激動(dòng)劑和拮抗劑可以結(jié)合一種合適的藥物載體而使用，這種組合物包括治療上有效量的多肽或激動(dòng)劑或拮抗劑以及一種藥用可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其混合物。配方應(yīng)當(dāng)適合于給藥的方式。
本發(fā)明也提供了一種藥物包裝或試劑盒，它們包括一個(gè)或多個(gè)容器，該容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分。與該容器相伴的可以是一則以管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式存在的通知，該通知反映出生產(chǎn)、使用或銷售機(jī)構(gòu)對人體給藥的批準(zhǔn)。此外，該藥物組合物可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
該藥物組合物可以按照常規(guī)的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或者真皮內(nèi)的途徑。該藥物組合物以對治療和/或預(yù)防具體癥狀有效的量進(jìn)行給藥。一般而言，該組合物以至少約10μg/kg體重的量進(jìn)行給藥，并且在大多數(shù)情況下該組合物的給藥量將不超過約8mg/kg體重/天。在大多數(shù)情況下考慮到給藥的途徑、癥狀等，該劑量從每天約10μg/kg體重至約1mg/kg體重。
根據(jù)本發(fā)明，VEGF2多肽以及同為多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑也可以通過在體內(nèi)表達(dá)所述多肽而使用，這通常稱作“基因治療”。
因此，例如可以采用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在體外工程化細(xì)胞如骨髓瘤細(xì)胞，隨后將工程化的細(xì)胞提供給待采用該多肽治療的患者。上述方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，可以通過本領(lǐng)域已知的方法、采用一種含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒來工程化細(xì)胞。
類似地，為了在體內(nèi)表達(dá)多肽，例如可以通過本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)工程化細(xì)胞。正如在本領(lǐng)域已知的，為了在體內(nèi)工程化細(xì)胞并且在體內(nèi)表達(dá)多肽，可以給予患者一種生產(chǎn)含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞。從本發(fā)明的教導(dǎo)出發(fā)，通過上述方法給予本發(fā)明的一種多肽的這些或者其它的方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的。例如，除了逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒以外，用于工程化的細(xì)胞的表達(dá)載體還可以是如一種腺病毒，它可以在與一種合適的輸送載體結(jié)合后用于在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
可以得到上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney小鼠白血病病毒，脾壞死病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，長臂猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生性肉瘤病毒與乳房腫瘤病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體是從Moloney小鼠白血病病毒得到的。
載體包含一個(gè)或者多個(gè)啟動(dòng)子?？梢圆捎玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動(dòng)子；以及在Miller，等，生物技術(shù)，第7卷，第9期，第980-990頁(1989)中所描述的人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，或者任何一種其它的啟動(dòng)子(例如細(xì)胞啟動(dòng)子，如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。其它可以采用的病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子及B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。根據(jù)本文中的教導(dǎo)，選擇合適的啟動(dòng)子對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在合適的啟動(dòng)子的控制下。可以采用的合適的啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或者異源啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人珠蛋白啟動(dòng)子；病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子，如單純皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上述修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；以及人生長激素啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子也可以是控制編碼該多肽的基因的天然啟動(dòng)子。
采用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系從而形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于在Miller，人類基因治療，第1卷，第5-14頁(1990)中所描述的PE501，PA317，φ-2，φ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，φCRE，φCRIP，GP+E-86，GP+envAm12以及DAN細(xì)胞系，其中該文獻(xiàn)以其全文引入本文以供參考。載體可以通過本領(lǐng)域已知的任何一種方法來轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，這些方法包括但不限于電穿孔，采用脂質(zhì)體以及CaPO4沉淀。在另一種方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包埋在脂質(zhì)體中，或者被偶聯(lián)到脂類上，然后再將該載體引入宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生含有編碼該多肽的核酸序列的侵染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，然后可以使用這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?；蛟隗w外或在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼該多肽的核酸序列。可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚干細(xì)胞，胚胎癌性細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成肌細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及VEGF2基因作為一種診斷測定的一部分的用途從而檢測與在VEGF2核酸序列中存在的突變相關(guān)的疾病或疾病易感性。
攜帶VEGF2基因中的突變的個(gè)體可以通過許多技術(shù)在DNA水平上進(jìn)行檢測。用于診斷的核酸可以從病人的細(xì)胞中得到，如來自血液、尿液、唾液、活組織檢查與尸體剖檢材料的細(xì)胞?；蚪MDNA可以直接用于檢測或者在分析之前可以通過采用PCR(Saiki等，自然，324163-166(1986))進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以用于同樣的目的。作為一個(gè)實(shí)例，互補(bǔ)于編碼VEGF2的核酸的PCR引物可以用于測定和分析VEGF2突變。例如，與正常的基因型比較，通過擴(kuò)增產(chǎn)物大小的變化可以檢測缺失和插入。通過將擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的VEGF2 RNA或者放射性標(biāo)記的VEGF2反義DNA序列雜交便可以測定點(diǎn)突變。通過RNase A消化或通過解鏈溫度的差異，完全配對序列可以同錯(cuò)配的雙螺旋區(qū)別開來。
基于DNA序列差異的基因測試可以通過檢測DNA片段在含有或者不含變性劑的凝膠中的電泳遷移率的變化來實(shí)現(xiàn)。小的序列缺失與插入可以通過高分辨率的凝膠電泳觀測。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上進(jìn)行區(qū)分，其中根據(jù)DNA片段的特殊解鏈溫度或部分解鏈溫度、不同DNA片段的遷移率被阻滯在凝膠不同的位置上(參見例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
通過如RNase和S1保護(hù)的核酸酶保護(hù)分析或化學(xué)切割方法(例如，Cotton等，PANS，美國，854397-4401(1985))也可以揭示在特殊位置上的序列變化。
因此可以通過如雜交，RNase保護(hù)，化學(xué)切割，直接DNA測序或者使用限制性酶(例如，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法這些方法來實(shí)現(xiàn)特異DNA序列的檢測。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測序外，突變也可以通過原位分析進(jìn)行檢測。
本發(fā)明也涉及一種用于檢測在不同組織中VEGF2蛋白的變化水平的診斷分析，這是由于與正常對照組織樣品相比該蛋白的過量表達(dá)可以檢測疾病或疾病易感性的存在，例如異常細(xì)胞分化。用于檢測從宿主得到的樣品中的VEGF2蛋白含量的分析方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并且包括放射免疫測定、競爭結(jié)合測定、Western斑點(diǎn)印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定和“夾心”測定。酶聯(lián)免疫吸附測定(Coligan，等，免疫學(xué)通用方案，1(2)，第六章，(1991))最初包括制備一種特異于VEGF2抗原的抗體，優(yōu)選為一種單克隆抗體。此外制備一種抗該單克隆抗體的報(bào)道抗體，將該報(bào)道抗體結(jié)合到一個(gè)可檢測的試劑上，如放射性、熒光性或在本實(shí)施例中為辣根過氧化物酶上。從宿主中取樣并將其在一種結(jié)合樣品中的蛋白的固相載體、如聚苯乙烯平皿上進(jìn)行溫育。然后通過用非特異性蛋白如牛血清白蛋白的溫育來覆蓋平皿上任意游離的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。接下來，在平皿上溫育該單克隆抗體，在此期間該單克隆抗體結(jié)合到已被附著在聚苯乙烯平皿上的任何VEGF2蛋白。用緩沖液洗去所有未結(jié)合的單克隆抗體。將連接到辣根過氧化物酶上的報(bào)道抗體放置在平皿上，使得該報(bào)道抗體結(jié)合到已和VEGF2結(jié)合的任何單克隆抗體上。然后洗去未被附著的報(bào)道抗體。隨后把過氧化物酶的底物加入到平皿中，并且當(dāng)與一條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照時(shí)，在給定的時(shí)間段內(nèi)形成的顏色量是對存在于給定體積的病人樣品中的VEGF2蛋白的量的測量值。
可以采用一種競爭測定，其中將特異于VEGF2的抗體結(jié)合到固相支持物上，然后例如通過放射性標(biāo)記本發(fā)明的多肽，將從宿主得到的樣品通過該固相支持物，然后例如通過液閃計(jì)數(shù)檢測的標(biāo)記量可以與該樣品中VEGF2量相互關(guān)聯(lián)。
“夾心”測定類似于酶聯(lián)免疫吸附測定。在“夾心”測定中，將VEGF2多肽通過固相支持物并結(jié)合到已附著在該固相支持物上的抗體上，然后將第二抗體結(jié)合到VEGF2上。隨后將已標(biāo)記并且特異于第二抗體的第三抗體引入固相支持物并結(jié)合到第二抗體上，之后可以定量測定其量。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列特異地靶向位于單個(gè)的人染色體上的特定位置并能與之雜交。此外，現(xiàn)在需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前，僅有少數(shù)幾種以實(shí)際的序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)為基礎(chǔ)的染色體標(biāo)記試劑可以用于標(biāo)記染色體的位置。本發(fā)明的DNA染色體作圖是將這些序列和疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)的重要的第一步。
簡而言之，通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)便可以把序列定位到染色體上。采用3’未翻譯區(qū)域的計(jì)算機(jī)分析可以快速地選擇引物，其中引物不應(yīng)跨越超過基因組DNA上的一個(gè)外顯子，否則使得擴(kuò)增方法復(fù)雜化。然后采用這些引物用于PCR篩選含有單個(gè)的人染色體的體細(xì)胞雜交體。只有那些含有與該引物對應(yīng)的人基因的雜交體才會(huì)生產(chǎn)擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜交體的PCR作圖是將一個(gè)特定的DNA定位于特定的染色體上的快速程序。根據(jù)本發(fā)明采用同樣的寡核苷酸引物，用來自于特定染色體或者大基因組克隆集合體的一組片段、按照類似方式可以實(shí)現(xiàn)亞定位(sublocalization)。可以類似地用于對染色體作圖的其它的作圖策略包括原位雜交，用標(biāo)記的經(jīng)流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及通過雜交進(jìn)行預(yù)選，從而構(gòu)建出染色體特異性的cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來實(shí)現(xiàn)一步法準(zhǔn)確染色體定位。該技術(shù)可以采用50或60個(gè)堿基長短的cDNA。關(guān)于該技術(shù)的綜述參閱Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦一個(gè)序列已定位到一個(gè)準(zhǔn)確的染色體位置，則染色體上該序列的物理位置可與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)例如可在V.McKusick，人類的孟德爾遺傳中找到(可以通過Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)文庫聯(lián)機(jī)得到)。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)來鑒定基因與已定位到相同染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接下來需要測定在受影響的和未受影響的個(gè)體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果突變是在一些或所有的受影響個(gè)體中觀察到的、但是又沒有在任何一個(gè)正常個(gè)體中被觀察到的話，那么該突變可能是疾病的病原體。
根據(jù)物理作圖和遺傳作圖技術(shù)目前的分辨率，一個(gè)被準(zhǔn)確定位到與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的病原(causative)基因中的一種(其中假定有1兆堿基的作圖分辨率且每20kb為一個(gè)基因)。
多肽、其片段或該多肽的其它衍生物或類似物、或者表達(dá)上述物質(zhì)的細(xì)胞可以用作生產(chǎn)其抗體的免疫原。這些抗體可以是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合，單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用于生產(chǎn)這些抗體和片段。
針對相應(yīng)于本發(fā)明的一個(gè)序列的多肽而生成的抗體可以通過將該多肽直接注射入動(dòng)物體內(nèi)或者通過將該多肽向動(dòng)物給藥來得到，其中的動(dòng)物優(yōu)選非人類。然后，如此得到的抗體會(huì)結(jié)合到該多肽上。通過這種方式，即使是僅僅編碼該多肽的一個(gè)片段的序列也可用于生成能結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。然后，該抗體可以用于從表達(dá)該多肽的組織中分離這種多肽。為了制備單克隆抗體，可以采用任何一種提供了通過連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的技術(shù)。該實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler與Milstein，1975，自然，256495-497)，三體雜交瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)，472)以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，等，1985，單克隆抗體與癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以把所述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)進(jìn)行修改從而生產(chǎn)出對本發(fā)明免疫原性的多肽產(chǎn)品有抗性的單鏈抗體。也可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠來表達(dá)對本發(fā)明免疫原性的多肽產(chǎn)品有抗性的人源化抗體。
本發(fā)明將參照下面的實(shí)施例進(jìn)一步加以說明；但是，應(yīng)當(dāng)了解到本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。除非另作聲明的以外，所有的部分或數(shù)量均為重量單位。
為了有利于理解以下的實(shí)施例，現(xiàn)敘述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)粒”通過一個(gè)在前的小寫p和/或跟隨幾個(gè)大寫字母和/或數(shù)字加以命名。本文中的起始質(zhì)粒或者可以通過商業(yè)途徑得到或在不受限制的基礎(chǔ)上可以通過公眾得到，或者可以根據(jù)已公開的方法從可得到的質(zhì)粒中構(gòu)建出來。此外，對于與那些所述相當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的并且對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用一種僅對DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多種限制性酶可以通過商業(yè)途徑得到，并且其反應(yīng)條件、輔因子和其它的使用要求對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。為了分析的目的，通常把1μg的質(zhì)?；駾NA片段與溶于約20μl緩沖溶液的約2個(gè)單位的酶一起使用。為了分離用于質(zhì)粒構(gòu)建的DNA片段，通常在一個(gè)更大的體積內(nèi)用20至250個(gè)單位的酶消化5至50μg的DNA。針對特殊的限制性酶而言，合適的緩沖溶液和底物的量是由生產(chǎn)者規(guī)定的。通常采用在37℃下大約1小時(shí)的溫育時(shí)間，但是該時(shí)間可以根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)者的指示而變化。在消化后，該反應(yīng)直接在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳以分離出所需的片段。采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所描述的8％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行被切片段的大小分離。
“寡核苷酸”或指一種單鏈的多脫氧核苷酸，或指可以通過化學(xué)合成的兩條互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此當(dāng)沒有在一種激酶存在下以ATP添加一個(gè)磷酸時(shí)，該寡核苷酸將不會(huì)連接到另一個(gè)寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到未被去磷酸化的一個(gè)片段上。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，出處同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的緩沖液和條件、每0.5μg大約等摩爾量的待連接的DNA片段10個(gè)單位的T4DNA連接酶(“連接酶”)來實(shí)現(xiàn)連接。
除非另有說明，按Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1VEGF2在人組織和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)模式進(jìn)行Northern印跡分析以檢測VEGF2基因在入組織和人乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。用RNAzolTMB系統(tǒng)(Biotecx Laboratories，Inc.)分離總細(xì)胞RNA樣品。在1％瓊脂糖凝膠上分離約10μg來自每種乳腺組織和特定的細(xì)胞系的總RNA，并印跡到尼龍濾膜上，(分子克隆，Sambrook Fritsch，and Maniatis，冷泉港出版社，1989)。根據(jù)Stratagene Cloning Systems，Inc.，Prime-It試劑盒用50ngDNA片段進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記的DNA用來自5Prime--3Prime，Inc.，Boulder，CO，USA的Select-G-50柱純化。然后將濾膜與1,000,000cpm/ml的放射性標(biāo)記的全長VEGF2基因在0.5MNaPO4和7％SDS中于65℃雜交過夜。用0.5×SSC，0.1％SDS在室溫洗2次并且在60℃洗2次后將濾膜用增感屏在-70℃曝光過夜，在2個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中觀察到1.6Kd的信號。
實(shí)施例2采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)VEGF2采用與基因的5’和3’序列對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物來擴(kuò)增編碼不帶N-末端46個(gè)氨基酸的VEGF2蛋白的DNA序列，見ATCC#971615’引物序列為5’TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAT CCCGCC ATG GAG GCC ACG GCT TAT GC 3’(SEQ ID NO4)，它含有一個(gè)BamHI限制性酶位點(diǎn)(黑體)和互補(bǔ)于VEGF25’序列(150-166位核苷酸)的17個(gè)核苷酸序列。
3’引物具有序列5’GATC TCT AGA TTA GCT CAT TTG TGGTCT 3’(SEQ ID NO5)，并且含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaI的切割位點(diǎn)以及互補(bǔ)于VEGF2的3’序列(包括終止密碼子和終止密碼子之前的15個(gè)核苷酸序列)的18個(gè)核苷酸。
采用一種可以通過商業(yè)途徑得到的試劑盒(“Geneclean”，BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠中分離擴(kuò)增序列。然后，該片段用內(nèi)切核酸酶BamHI和XbaI進(jìn)行消化并且在1％的瓊脂糖凝膠上再次純化。將這一片段在BamHI和XbaI位點(diǎn)與pAcGP67A桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體(PHarmingen)連接，通過這一連接，VEGF2 cDNA克隆到桿狀病毒gp67基因的信號序列的同一讀框中，并位于載體中的信號序列的3’末端，這一載體命名為pAcGP67A-VEGF2。
為了將帶有g(shù)p67基因的信號序列的VEGF2克隆到pRG1載體中用于表達(dá)，通過XhoI和XbaI限制性酶在位于VEGF2 cDNA上游的Xho限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)和XbaI限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)從pAcGP67A-VEGF2質(zhì)粒上切下帶有信號序列的VEGF2和一些上游序列，在1％瓊脂糖凝膠上將這一片段從載體的其余部分分離出并用“Geneclean”試劑盒純化，其被命名為F2。
通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(綜述參閱Summers，M.D.與Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體與昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)步驟的方法手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站會(huì)刊No.1555)，利用載體PRG1(pVL941載體的改進(jìn))來表達(dá)VEGF2蛋白。該表達(dá)載體含有苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子，其后跟隨了限制性內(nèi)切核酸酶BamHI、SmaI、XbaI、BglII和Asp718的識(shí)別位點(diǎn)。限制性內(nèi)切核酸酶XhoI的位點(diǎn)位于BamHI位點(diǎn)的上游，XhoI和BamHI之間的序列與PAcGp67A載體的對應(yīng)部分相同。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化作用。為了容易地選擇出重組病毒，將來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動(dòng)子同樣的取向插入，其后面是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。為了實(shí)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組，多角體蛋白序列兩側(cè)為病毒序列。許多其它的桿狀病毒載體，如pAc373，pVL941和pAcIM1可以用于代替pRG1(Luckow，VA.與Summers，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
質(zhì)粒以限制性酶XhoI和XbaI消化并且通過本領(lǐng)域已知的方法采用牛小腸磷酸酶使其去磷酸化，然后采用可以通過商業(yè)途徑得到的試劑盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠中分離出DNA，該載體DNA命名為V2。
片段F2和去磷酸化的質(zhì)粒V2通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞并且采用限制性酶BamHI和XbaI來鑒定含有帶VEGF2基因的質(zhì)粒(pBac gp67-VEGF2)的細(xì)菌?？寺∑蔚男蛄型ㄟ^DNA測序加以證實(shí)。
采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國，847413-7417(1987))將5μg的質(zhì)粒pBac gp67-VEGF2和1.0μg的一種可以通過商業(yè)途徑得到的線性化桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。
將1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的質(zhì)粒pBac gp67-VEGF2在一個(gè)含有50μl無血清Grace培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司，Gaithersburg，MD)的無菌微量滴定板的孔中進(jìn)行混合。之后加入10μl的Lipofectin和90μl的Grace培養(yǎng)基，混合并在室溫下溫育15分鐘。然后將該轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入在35mm組織培養(yǎng)平板上接種的Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 1711)，其中平板上含有1毫升無血清的Grace培養(yǎng)基。來回?fù)u動(dòng)該平板以混合新添加的溶液。然后該平板于27℃下溫育5小時(shí)。5小時(shí)后，從平板中除去轉(zhuǎn)染溶液并且加入1ml補(bǔ)充有10％的胎牛血清的Grace昆蟲培養(yǎng)基。將該平板放回至一個(gè)溫育箱中并且于27℃下持續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后收集上清液，并且與Summers和Smith所述(出處同上)類似地進(jìn)行噬斑測定。作為一種改進(jìn)，采用一種含有“Blue Gal”(生命技術(shù)公司，Gaithersburg，MD)的瓊脂糖凝膠，它可以使染上藍(lán)色的噬斑易于分離。(“噬斑測定”的詳細(xì)描述也可以在用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)的使用者指南的第9-10頁中找到，該指南由生命技術(shù)公司，Gaithersburg分發(fā))。
在連續(xù)稀釋4天后將病毒加入細(xì)胞中，并且用Eppendorf移液管的尖端挑取染上藍(lán)色的噬斑。然后將含有該重組病毒的瓊脂重新懸浮在一個(gè)含有200μl Grace培養(yǎng)基的Eppendorf管中。通過短時(shí)間的離心除去瓊脂并且采用含有該重組桿狀病毒的上清液去感染在35mm平皿上接種的Sf9細(xì)胞。4天后收集這些培養(yǎng)平皿中的上清液，然后于4℃下進(jìn)行儲(chǔ)藏。
將Sf9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％熱滅活的FBS的Grace培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的條件下，采用重組桿狀病毒V-gp67-VEGF2感染細(xì)胞。6小時(shí)后除去該培養(yǎng)基并且代之以不含蛋氨酸和半胱氨酸的SF900 II培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司，Gaithersburg)。42小時(shí)后加入5μCi的35S-蛋氨酸和5μCi的35S半胱氨酸(Amersham)。在離心收獲細(xì)胞前將細(xì)胞進(jìn)一步溫育16小時(shí)，并且通過SDS-PAGE和放射性自顯影觀察被標(biāo)記的蛋白。
在還原和非還原條件下通過SDS-PAGE分析得自Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)基和細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)。見圖4。將培養(yǎng)基對50mM MES，pH5.8透析，透析后獲得沉淀物并重懸于100mM檸檬酸鈉pH5.0中，用SDS-PAGE再次分析重懸的沉淀物并用考馬斯亮藍(lán)染色。見圖5。
將培養(yǎng)基上清在50mM MES，pH5.8中以1∶10稀釋并以1ml/分鐘的流速加到SP-650M柱(1.0×6.6cm，Toyopearl)中。以200、300和500mM NaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)，用在500mMNaCl處的洗脫液獲得VEGF2蛋白。在還原劑β-巰基乙醇的存在或不存在下通過SDS-PAGE分析洗脫液并用考馬斯亮藍(lán)染色。見圖6。
實(shí)施例3重組VEGF2在COS細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒VEGF2-HA衍生自載體pcDNAI/Amp(Initrogen)，其含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)E.coli復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，后接多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和多腺苷酸化位點(diǎn)。編碼完整VEGF2前體和在框內(nèi)融合到其3’末端的HA標(biāo)記的DNA片段被克隆至載體的多接頭區(qū)，從而重組蛋白質(zhì)在CMV啟動(dòng)子控制下表達(dá)。HA標(biāo)記對應(yīng)于衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，andR.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA標(biāo)記與靶蛋白質(zhì)融合使得用識(shí)別HA表位的抗體很容易檢測重組蛋白質(zhì)。
下面闡述質(zhì)粒構(gòu)建策略使用兩種引物由PCR構(gòu)建編碼VEGF2的DNA序列，ATTC#97161，5’引物(CGC GGA TCC ATG ACT GTA CTC TAC CCA)(SEQ ID NO6)含有一BamHI位點(diǎn)，后接18個(gè)起自起始密碼子的VEGF2編碼序列的核苷酸；3’序列為(CGC TCT AGA TCAAGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CATTTG TGG TCT 3’)(SEQ ID NO7)含有互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)、HA標(biāo)記、XhoI位點(diǎn)及VEGF2編碼序列的最后15個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)的序列。因此PCR產(chǎn)物含有一BamHI位點(diǎn)，編碼序列，后接一XhoI限制性位點(diǎn)和框內(nèi)融合的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記后的轉(zhuǎn)譯終止密碼子及XbaI位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體，pcDNAI/Amp，用BamHI和XabI限制性酶消化并連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌體SURE(得自Strategene Cloning Systems，11099North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)，在氨芐青霉素培養(yǎng)平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離出質(zhì)粒DNA并用限制性分析檢測正確片段的存在。為表達(dá)重組VEGF2，將COS細(xì)胞通過DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Laboratory Press，(1987)。用放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測VEGF2-HA蛋白的表達(dá)(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)。轉(zhuǎn)染二天后，將細(xì)胞用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)物培養(yǎng)基，用去污劑(RIPA緩沖液(150mM氯化鈉，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))將細(xì)胞裂解，將細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基用HA特異性單克隆抗體沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)在15％SDS-PAGE凝膠上分析。
實(shí)施例4部分純化的VEGF2蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長的作用在第1天，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以2-5×104細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿的密度接種在含4％胎牛血清(FBS)、16單位/ml肝素和50單位/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(ECGS，Biotechnique，Inc.)的M199培養(yǎng)基中。在第2天，用含10％FBS、8單位/ml肝素的M199替換前述培養(yǎng)基。以所示濃度加入SEQ ID NO.2的VEGF2蛋白(減去開始的45個(gè)氨基酸殘基)(VEGF)和堿性FGF(bFGF)。在第4、6天替換培養(yǎng)基，在第8天用Coulter計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞數(shù)(見圖8)。
實(shí)施例5純化的VEGF2蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長的作用在第1天，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以2-5×104細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿的密度接種在含4％胎牛血清(FBS)、16單位/ml肝素和50單位/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(ECGS，Biotechnique，Inc.)的M199培養(yǎng)基中。在第2天，用含10％FBS、8單位/ml肝素的M199替換前述培養(yǎng)基。在此時(shí)向培養(yǎng)基中加入SEQ ID NO.2所示的純化的VEGF2蛋白(減去開始的45個(gè)氨基酸殘基)。在第4、6天用新鮮培養(yǎng)基和添加劑替換培養(yǎng)基，在第8天用Coulter計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞數(shù)(見圖9)。
實(shí)施例6通過基因治療的表達(dá)成纖維細(xì)胞是通過皮膚活組織檢查從一個(gè)研究對象中得到的。將得到的組織放置在組織培養(yǎng)基上并且分割成小塊。將小的組織塊放置在組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，其中每個(gè)培養(yǎng)瓶中放置大約10塊組織。將培養(yǎng)瓶倒置，合緊并于室溫下保留過夜。在室溫下過24小時(shí)后顛倒培養(yǎng)瓶，組織塊仍固定在培養(yǎng)瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如含有10％FBS，青霉素和鏈霉素的Ham’s F12培養(yǎng)基)，然后于37℃下溫育大約1周。這時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基，隨后每隔幾天更換一次培養(yǎng)基。再培養(yǎng)2周后，出現(xiàn)了一單層成纖維細(xì)胞。該單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并放入更大的培養(yǎng)瓶中。
用EcoKI和Hind III消化側(cè)翼有Moloney鼠肉瘤病毒長末端重復(fù)的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下來用牛小腸磷酸酶進(jìn)行處理，將該線性載體在瓊脂糖凝膠上分級分離并使用玻璃珠加以純化。
采用分別與5’和3’末端序列對應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。5’引物包含一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，3’引物含有一個(gè)Hind III位點(diǎn)。在T4 DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性化骨架與EcoRI和Hind III片段加在一起，在適于兩個(gè)片段連接的條件下維持所得到的混合物。將連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后將該細(xì)菌涂布在含有卡那霉素的瓊脂上以證實(shí)該載體具有插入正確的感興趣的基因。
將兼嗜性的(amphotropic)pA3 17或GP+aml2包裝細(xì)胞在組織培養(yǎng)物上進(jìn)行培養(yǎng)，直至在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)上達(dá)到匯合密度。然后將含有該基因的MSV載體加入培養(yǎng)基中并用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，包裝細(xì)胞隨即產(chǎn)生含有該基因的具有感染性的病毒粒(現(xiàn)在包裝細(xì)胞被稱作生產(chǎn)細(xì)胞)。
向經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，接下來從一個(gè)鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。含有感染性病毒粒的舊培養(yǎng)基經(jīng)一個(gè)微孔過濾器過濾以除去脫離(detached)的生產(chǎn)細(xì)胞，然后利用該培養(yǎng)基去感染成纖維細(xì)胞。從亞匯合的成纖維細(xì)胞的平板中除去培養(yǎng)基并迅速地代之以來自于生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基。除去該培養(yǎng)基并代之以新鮮的培養(yǎng)基。如果該病毒的滴度高的話，那么實(shí)質(zhì)上所有的成纖維細(xì)胞均被感染并且無需選擇。如果滴度非常低，那么就需要采用具有如neo或his這樣的選擇性標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
然后將工程化的成纖維細(xì)胞注射入宿主，或者單獨(dú)注射或者在一個(gè)cytodex 3微載體珠上已培養(yǎng)至匯合之后再注射。現(xiàn)在成纖維細(xì)胞生產(chǎn)蛋白產(chǎn)物。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化都是可能的，因此在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以不同于所述的方式實(shí)施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請人Hu等人(ii)發(fā)明名稱人血管內(nèi)皮生長因子2(iii)序列數(shù)(iv)聯(lián)系地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARMROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西(E)國家美國(F)郵政碼07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)存儲(chǔ)媒體類型3.5英寸軟磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORDPERFECT 5.1(vi)目前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/465,968(B)申請日1995年6月6日(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/207,550(B)申請日1994年3月8日(vii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36，134(C)案號/文檔號325800-288(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度1674個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GTCCTTCCAC CATGCACTCG CTGGGCTTCT TCTCTGTGGC GTGTTCTCTG CTCGCCGCTG 60CGCTGCTCCC GGGTCCTCGC GAGGCGCCCG CCGCCGCCGC CGCCTTCGAG TCCGGACTCG 120ACCTCTCGGA CGCGGAGCCC GACGCGGGCG AGGCCACGGC TTATGCAAGC AAAGATCTGG 180AGGAGCAGTT ACGGTCTGTG TCCAGTGTAG ATGAACTCAT GACTGTACTC TACCCAGAAT 240ATTGGAAAAT GTACAAGTGT CAGCTAAGGA AAGGAGGCTG GCAACATAAC AGAGAACAGG 200CCAACCTCAA CTCAAGGACA GAAGAGACTA TAAAATTTCG GTGCAGCACT TATAATACAG 360AGATCTTGAA AAGTATTGAT AATGAGTGGA GAAAGACTCA ATGCATGCCA CGGGAGGTGT 420GTATAGATGT GGGGAAGGAG TTTGGAGTCG CGACAAACAC CTTCTTTAAA CCTCCATGTG 480TGTCCGTCTA CAGATGTAGG GGTTGCTGCA ATAGTGAGGG GCTGCAGTGC ATGAACACCA 540GCACGAGCTA CCTCAGCAAG ACGTTATTTG AAATTACAGT GCCTCTCTCT CAAGGCCCCA 600AACCAGTAAC AATCAGTTTT GCCAATCACA CTTCCTGCCG ATGCATGTCT AAACTGGATG 660TTTACAGACA AGTTCATTCC ATTATTAGAC GTTCCCTGCC AGCAACACTA CCACAGTGTC 720AGGCAGCGAA CAAGACCTGC CCCACCAATT ACATGTGGAA TAATCACATC TGCAGATGCC 780TGGCTCAGGA AGATTTTATG TTTTCCTCGG ATGCTGGAGA TGACTCAACA GATGGATTCC 840ATGACATCTG TGGACCAAAC AAGGAGCTGG ATGAAGAGAC CTGTCAGTGT GTCTGCAGAG 900CGGGGCTTCG GCCTGCCAGC TGTGGACCCC ACAAAGAACT AGACAGAAAC TCATGCCAGT 960GTGTCTGTAA AAACAAACTC TTCCCCAGCC AATGRGGGGC CAACCGACAA TTTGATGAAA 1020ACACATGCCA GTGTGTATGT AAAAGAACCT GCCCCAGAAA TCAACCCCTA AATCCTGGAA 1080AATGTGCCTG TGAATGTACA GAAAGTCCAC AGAAATGCTT GTTAAAAGGA AAGAAGTTCC 1140ACCACCAAAC ATGCAGCTGT TACAGACGGC CATGTACGAA CCGCCAGAAG GCTTGTGAGC 1200CAGGATTTTC ATATAGTGAA GAAGTGTGTC GTTGTGTCCC TTCATATTGG CAAAGACCAC 1260AAATGAGCTA AGATTGTACT GTTTTCGAGT TCATCGATTT TCTATTATGG AAAACTGTGT 1320TGCCACAGTA GAACTGTCTG TGAACAGAGA GACCCTTGTG GGTCCATGCT AACAAAGACA 1360AAAGTCTGTC TTTCCTGAAC CATGTGGATA ACTTTACAGA AATGGACTGG AGCTCATCTG 1440CAAAAGGCCT CTTGTAAAGA CTGGTTTTCT GCCAATGACC AAACAGCCAA GATTTTCCTC 1500TTGTGATTTC TTTAAAAGAA TGACTATATA ATTTATTTCC ACTAAAAATA TTGTTTCTGC 1560ATTCATTTTT ATAGCAACAA CAATGGTAAA AACTCACTGT GATCAATATT TTTATATCAT 1620GCAAAATATG TTTAAAATAA AATGAAAATT GTATTATAAA AAAAAAAAAA AAAA 1674(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度419個(gè)氨基酸(B)類型 氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述 SEQ ID NO2Met His Ser Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala-45 -40 -35Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe-30 -25 -20 -15Glu Ser Gly Leu Asp Lau Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala-10 -5 1Tur Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser5 10 15Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Lys Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met20 25 30Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln35 40 45 50Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala55 60 65His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys70 75 80Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe85 90 95Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr100 105 110Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr115 120 125 130Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu135 140 145Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser150 155 160Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile165 170 175Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn180 185 190Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys195 200 205 210Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser215 220 225Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu230 235 240Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Lau Arg Pro Als Ser Cys245 250 255Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys260 265 270Asn Lys Leu Phe Pro Seu Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Aap Glu275 280 285 290Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro295 300 305Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys310 315 320Cys Leu Lau Lys Gly Lys Lys Phe His Hia Gln Thr Cys Ser Cys Tyr325 330 335Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser340 345 350Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Gln Arg Pro355 360 365 370Gln Met Ser(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Pro Xaa Cys Val Xaa Xaa Xaa Arg Cys Xaa Gly Cys Cys Asn5 10(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度50個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4TGTAATACGA CTCACTATAG GGATCCCGCC ATGGAGGCCA CGGCTTATGC50(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCTCTAGA TTAGCTCATT TGTGGTCT 28(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CGCGGATCCA TGACTGTACT CTACCCA27(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度60個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAC TCGAGGCTCA TTTGTGGTCT60(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度196個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Arg Thr Leu Ala Cys Leu Leu Leu Leu Gly Cys Gly Tyr Leu5 10 15Ala His Val Leu Ala Glu Glu Ala Glu Ile Pro Arg Glu Val Ile20 25 30Glu Arg Leu Ala Arg Ser Gln Ile His Ser Ile Arg Asp Leu Gln35 40 45Arg Leu Leu Glu Ile Asp Ser Val Gly Ser Glu Asp Ser Leu Asp50 55 60Thr Ser Leu Arg Ala His Gly Val His Ala Thr Lys His Val Pro65 70 75Glu Lys Arg Pro Leu Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Ile Glu Glu80 85 90Ala Val Pro Ala Val Cys Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu Ile95 100 105Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp110 115 120Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr125 130 135Ser Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg Val His His Arg Ser Val140 145 150Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys Lys Pro Lys Leu Lys155 160 165Glu Val Gln Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu Cys Ala Cys Ala170 175 180Thr Thr Ser Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp Thr Asp Val185 190 195Arg(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度241個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu5 10 15Arg Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr20 25 30Glu Met Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln35 40 45Arg Leu Leu His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu50 55 60Asp Leu Asn Met Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser65 70 75Leu Ala Arg Gly Arg Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu80 85 90Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu95 100 105Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val110 115 120Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn125 130 135Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln Val Gln Leu Arg Pro140 145 150Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro Ile Phe155 160 165Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys Cys170 175 180Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser Pro Gly Gly185 190 195Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val Thr Ile200 205 210Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg Lys215 220 225Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly230 235 240Ala(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度231個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu5 10 15Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala20 25 30Glu Gly Gly Gly Gln Asn His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val35 40 45Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile50 55 60Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser65 70 75Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly80 85 90Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile95 100 105Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser110 115 120Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg125 130 135Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln140 145 150Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Tyr155 160 165Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp Ser Leu Pro Gly Pro170 175 180His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val185 190 195Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser200 205 210Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg215 220 225Cys Asp Lys Pro Arg Arg230
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，它包括選自如下一組中的一個(gè)成員(a)一種編碼SEQ ID NO2所示的多肽的多核苷酸；(b)一種能夠與(a)的多核苷酸雜交并且與(a)的多核苷酸至少有70％相同性的多核苷酸；以及(c)(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，它編碼SEQ ID NO2所示的多肽。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸，它編碼SEQ ID NO2的-46至373位氨基酸所示的多肽。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，它編碼SEQ ID NO2的1-373位氨基酸所示的多肽。
6.一種分離的多核苷酸，它包括選自如下一組中的一個(gè)成員(a)一種編碼由ATCC保藏號97161中所含的DNA編碼的成熟多肽的多核苷酸；(b)一種編碼由ATCC保藏號97161中所含的DNA表達(dá)的多肽的多核苷酸；(c)一種能夠與(a)或(b)的多核苷酸雜交并且與(a)或(b)的多核苷酸之間至少有70％相同性的多核苷酸；以及(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
7.一種含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
8.一種用權(quán)利要求7的載體基因工程化的宿主細(xì)胞。
9.一種用于生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞中表達(dá)由所說的DNA編碼的多肽。
10.一種用于生產(chǎn)能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求7的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
11.一種多肽，選自如下一組(i)一種具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽及其片段，類似物與衍生物；(ii)一種包括SEQ ID NO2的1-373位氨基酸的多肽；和(iii)一種由ATCC保藏號97161的cDNA編碼的多肽，以及所說多肽的片段，類似物和衍生物。
12.一種作為權(quán)利要求11的多肽的激動(dòng)劑有效的化合物。
13.一種作為權(quán)利要求11的多肽的拮抗劑有效的化合物。
14.一種用于治療需要VEGF2的病人的方法，該方法包括給予病人治療有效量的權(quán)利要求11的多肽。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說的治療有效量的所說多肽是通過向病人提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)該多肽的方式來給藥的。
16.一種用于治療需要VEGF2的病人的方法，該方法包括給予病人治療有效量的權(quán)利要求12的化合物。
17.一種用于治療需要抑制VEGF2的病人的方法，該方法包括給予病人治療有效量的權(quán)利要求13的拮抗劑。
18.一種用于診斷與權(quán)利要求11的多肽的表達(dá)有關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，該方法包括測定在編碼所說的多肽的核酸序列中的突變。
19.一種診斷方法，包括分析來源于宿主的樣品中是否存在權(quán)利要求11的多肽。
20.一種用于鑒定結(jié)合并激活或抑制權(quán)利要求11的多肽的受體的化合物的方法，該方法包括在允許結(jié)合受體的條件下，將在其表面表達(dá)所述多肽的受體的細(xì)胞與待篩選的化合物接觸，所述的受體與能夠提供反映化合物與所述受體結(jié)合的可檢測信號的第二種成分結(jié)合；以及通過檢測是否存在由所述化合物與受體結(jié)合而產(chǎn)生的信號來確定該化合物是否結(jié)合并激活或抑制受體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人VEGF2多肽和編碼該VEGF2多肽的DNA(RNA),以及一種通過重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽的方法和針對該多肽的抗體和拮抗劑。本發(fā)明還公開了利用這種多肽刺激傷口愈合和血管組織修復(fù)的方法。本發(fā)明也公開了使用所述的拮抗劑抑制腫瘤生長、炎癥以及治療糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病的方法。本發(fā)明還公開了用于檢測來自宿主的樣品中VEGF2編碼序列中的突變以及VEGF2蛋白濃度的改變的診斷方法。
文檔編號C07K16/24GK1186518SQ96194405
公開日1998年7月1日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者克雷格·A·羅森, 胡靜珊, 曹亮 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司