專利名稱：抗vegf/ang2雙特異性抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及雙特異性單克隆抗體藥物，特別涉及抗腫瘤血管新生的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)的雙特異性單克隆抗體藥物；
背景技術(shù)：
早在一個(gè)多世紀(jì)以前，就有文獻(xiàn)報(bào)道過腫瘤生長(zhǎng)伴隨著新生血管生成(!^errara 2002)。但直到1939年，才由Ide及其同事首次提出，可能存在著某種腫瘤來源的血管生長(zhǎng)刺激因子為腫瘤的生長(zhǎng)提供血管供應(yīng)(Ide et al. 1939)。數(shù)年后，由于觀察到血管密度的增高會(huì)先于腫瘤的快速生長(zhǎng)，Algire等人認(rèn)為“腫瘤的快速擴(kuò)散取決于豐富的血管供給”(Algire et al. 1945)。在上個(gè)世紀(jì)六十年代，Greenblatt、Shubik(Greenblatt et al. 1968)和Ehrmann、Knoth (Ehrmann et al. 1968)兩個(gè)研究小組的實(shí)驗(yàn)相繼提供初步證據(jù)，證實(shí)腫瘤的血管生成是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的某些可擴(kuò)散因子介導(dǎo)。1971年，美國(guó)科學(xué)家?？寺?Judah Folkman)在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中提出， 抗血管生成可能是一種有效的抗癌手段(Folkman 1971)。從七十年代早期開始，以這個(gè)前瞻性的假說為基礎(chǔ)，?？寺捌溲芯啃〗M致力于從人體和動(dòng)物的腫瘤中分離某種‘腫瘤血管生成因子‘(Folkman et al. 1971)。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌癥的觀點(diǎn)(Gullino 1978)。隨后，多種血管源因子(如，表皮生長(zhǎng)因子EGF，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-α、TGF-β，腫瘤生長(zhǎng)因子TNF-α和血管生長(zhǎng)素等)先后被發(fā)現(xiàn)(Folkman et al. 1987)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，也可寫作 VEGF-A)是一個(gè)血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)于VEGF基因家族在血管生成調(diào)節(jié)中所扮演的角色，人們已經(jīng)深入研究了十多年之久Perrara 2002)。VEGF家族目前主要包括原型成員(VEGF-A)、胎盤生長(zhǎng)因子(placenta growth factor, P1GF) (Maglione et al. 1991)、 VEGF-B (Olofsson et al. 1996), VEGF-C (Joukov et al. 1996), VEGF-D (Orlandini et al. 1996)。其中VEGF-A是誘導(dǎo)腫瘤血管生成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子。VEGF 有3個(gè)高親合性的酪氨酸激酶受體(RTKs)，分別為VEGFR-I (Flt-I) (Shibuya et al. 1990 ； de Vries et al. 1992)、VEGFR-2 (KDR、Flk-1) (Yoshiji et al. 1996 ；Ellis et al. 1998 ； Tomisawa et al. 1999)和 VEGFR3 (Flt_4) (Joukov et al. 1996)。KDR 是血管形成的主要調(diào)控分子，具有明顯的化學(xué)趨化和促分裂作用，與血管島、血管形成和造血有關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是促成上述轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如果沒有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)不會(huì)超過1 2mm3。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因，而在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的多步驟過程中，血管生成均發(fā)揮著重要作用。原位雜交研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA在多種人類腫瘤中都有表達(dá)，包括肺癌(Volm
3et al. 1997)、乳腺癌(Yoshiji et al. 1996)、胃腸癌(Ellis et al. 1998)、腎癌(Tomisawa et al. 1999)和卵巢癌(Sowter et al. 1997)。多家實(shí)驗(yàn)室使用多種抗VEGF的手段均已實(shí)現(xiàn)了腫瘤生長(zhǎng)的抑制，這些方法包括針對(duì)VEGF或其受體(VEGFRs)的抗體、可溶性受體， VEGFRs酪氨酸激酶的小分子抑制劑以及利用VEGF的突變異二聚體封閉其受體結(jié)合位點(diǎn)寸。1993年，費(fèi)拉拉制備了 VEGF的鼠源性抗體，在體外實(shí)驗(yàn)中，鼠源性抗體可以顯著抑制數(shù)種人類癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)。從此，VEGF抗體的臨床應(yīng)用價(jià)值開始顯露。為了降低鼠源性抗體的免疫原性，費(fèi)拉拉將鼠源抗體的骨架換做了人源抗體IgGl的部分，由此誕生了基因泰克公司“重磅炸彈級(jí)”藥物一貝伐單抗(Avastin)。它是一種抗VEGF的人源化抗體(IgGl)，93 %的人源結(jié)構(gòu)域和7 %的鼠源結(jié)合區(qū)域組成，是全世界第一個(gè)被批準(zhǔn)用于抑制血管生長(zhǎng)的單克隆抗體藥物，2004年2月美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)該藥用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌(mCRC)、小細(xì)胞分子肺癌(GBM)和轉(zhuǎn)移性腎癌。阿瓦斯汀區(qū)別于已有抗癌藥物，以VEGF為藥物靶點(diǎn)，加之抗體的特異性結(jié)合能力，使其臨床療效顯著。在人體試驗(yàn)中，即使對(duì)于晚期的癌癥患者，注射阿瓦斯汀也可延長(zhǎng)壽命數(shù)月。2007年ASCO會(huì)議Souglakos報(bào)道Avastin聯(lián)合靶向EGFR的單克隆抗體 Cetuximab (西妥昔單抗)可以安全有效地治療化療失敗的晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。基因泰克公司正在用Avastin對(duì)超過40種癌癥進(jìn)行適應(yīng)癥研究，希望可以生產(chǎn)出更多的單抗延伸產(chǎn)品。同時(shí)，他們也在研究將全抗體分子IgG切割之后，先將蛋白用原核細(xì)胞表達(dá)，然后再將其通過基因工程的手段連接為IgG。除了癌癥外，VEGF也是治療包括老年性黃斑變性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在內(nèi)的多種眼科疾病關(guān)鍵。為了治療這些疾病，在Avastin的基礎(chǔ)上，基因泰克公司又將其全抗體分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡(jiǎn)化，保留能夠中和VEGF的抗體片段，同時(shí)將給藥途徑由靜脈注射改為玻璃體直接注射，由此成就另一藥物一Avastin的孿生姊妹蘭尼單抗(Lucentis)。 2006年，蘭尼單抗被美國(guó)藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于治療老年黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)，很快就成為治療老年性黃斑變性，糖尿病引起的眼底病的首選藥，占領(lǐng)北美市場(chǎng)80%以上的份額。血管生成素2(Ang2)美國(guó)科學(xué)家?？寺?J.Folkman)在1971年提出，腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成(Folkman 1971)。這個(gè)觀點(diǎn)在隨后的幾十年中被許多研究所證實(shí)。血管生成素 (Angiopoietin, Ang)是第一個(gè)被確定的來源于人腫瘤組織具有促進(jìn)血管生成作用的細(xì)胞因子。Ang是一種分泌型單鏈堿性蛋白，是促血管生成因子中唯一具有核糖核酸酶(foiase) 活性的物質(zhì)。目前已知的Ang包括四個(gè)亞型，Angl, Ang2, Ang3和Ang4，其中Angl和Ang2 與血管的生成關(guān)系最為密切，而對(duì)Ang2的研究較多(李國(guó)灝et al. 2004)。人類Ang2基因位于8號(hào)染色體短臂區(qū)(8p23. 1)，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為1491bp， 編碼496個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子量為75kD。Ang2可與Tie2(tyrosinekinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domain 2)結(jié)合，是其天然白勺 體。Ang2主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，通過自分泌作用與自身細(xì)胞膜上的Tie2受體特異性結(jié)合，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制由Angl誘導(dǎo)形成的不穩(wěn)定血管。實(shí)驗(yàn)證明，VEGF的存在可以提高Ang2 的表達(dá)(Gu et al. 2006)。
Ang2參與多種腫瘤的血管生成，且與腫瘤血管形成的數(shù)目、腫瘤的臨床分期及預(yù)后關(guān)系密切。應(yīng)用Ang2cDNA轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HD9建立小鼠荷瘤模型，Ahmad等人發(fā)現(xiàn) Ang2轉(zhuǎn)染的腫瘤體積明顯變大，腫瘤內(nèi)血管密度增高，腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)變高(Ahmad et al. 2001)。Etoh等對(duì)胃癌病例的研究也發(fā)現(xiàn)，組織中Ang2高表達(dá)同時(shí)伴有血管密度增高、 成熟度下降，患者臨床 M分期晚，術(shù)后生存率低(Etoh et al.2001)。用Ang2轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞接種裸鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移率增高，且轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞在體外VEGF存在的條件下， 能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌更多的金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP) 和尿激酶等蛋白水解酶，這可能與Ang2促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。陳林鶯等人的研究表明， Angl可以抑制胃癌組織血管的生成，而Ang2拈抗Angl的功能，對(duì)血管生成具有雙向調(diào)節(jié)作用，并呈VEGF依賴性(陳林鶯et al. 2004)。張真真等人認(rèn)為，Ang2/Angl的比值是決定胃癌組織血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的最終因素。當(dāng)Ang2/Angl > 1時(shí)，促進(jìn)胃癌組織血管生成，反之則抑制其血管的生成。同時(shí)他們推測(cè)血管生成素及其受體在胃癌血管生成的調(diào)解作用是以Ang2為主導(dǎo)的(張真真et al. 2006)。Ang2在胃癌的發(fā)生，發(fā)展中起到了重要的作用，可以成為胃癌抗血管治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。另外，Ang2除了在胃癌腫瘤血管生成中的作用外，其表達(dá)還與膠質(zhì)瘤，結(jié)腸癌，前列腺癌和乳腺癌等的侵襲和轉(zhuǎn)移表型有關(guān)(Bach et al. 2001，Imanishi et al.2001)。除了以上提到的癌癥外，Ang2還與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤組織的血管新生和生長(zhǎng)有密切的關(guān)系。邢麗華等和Takanami應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了 NSCLC腫瘤細(xì)胞中ANG2 基因的表達(dá)水平，他們發(fā)現(xiàn)ANG2的mRNA量明顯高于作為對(duì)照的正常細(xì)胞組織(邢麗華et al. 2003, Takanami 2004)。另外，Park等人及蕭淑華等人分別用ELISA技術(shù)對(duì)136例及82 例NSCLC病人血液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，NSCLC病人血液中ANG2和VEGF的濃度明顯高于前者(Park et al. 2007，蕭淑華et al.2011)。國(guó)內(nèi)張軒斌等人對(duì)37例NSCLC病人腫瘤樣本進(jìn)行了免疫組化(ICH)的檢測(cè)，他們發(fā)現(xiàn)NSCLC病人腫瘤標(biāo)本中ANG2，VEGF以及微血管密度(MVD)均明顯高于用于對(duì)照的正常組織。因此他們認(rèn)為Ang-2與非小細(xì)胞肺癌的浸潤(rùn)、進(jìn)展密切相關(guān)；其對(duì)非小細(xì)胞肺癌腫瘤血管生成有促進(jìn)作用，而且這種作用具有明顯的VEGF依賴性(張軒斌et al. 2000) 0在最近發(fā)表的一項(xiàng)研究中，Andersen等人也提出了類似的觀點(diǎn)。這些研究人員分別應(yīng)用芯片(microarray)和免疫組化(ICH)的方法對(duì)隨機(jī)抽取的335例NSCLC患者腫瘤樣本進(jìn)行了針對(duì)ANG和VEGF-A的檢測(cè)，他們發(fā)現(xiàn)ANG2和 VEGF-A的表達(dá)量在腫瘤組織中有明顯的增長(zhǎng)，且兩者的表達(dá)量密切相關(guān)，存在正相關(guān)的關(guān)系(Andersen et al.2011)o參考文獻(xiàn)Ahmad A S, Lin W, Jung Y D, et al. The effects of angiopoietinl and 2 on tumor growth andangiogenesis in human colon cancer [J]. Cancer Res,2001,61(4) 12551259.Algire, G. H. , Chalkley, H. W. , Legallais, F. Y. &Park, H. D. Vascular reactions of normal andmalignant tissues in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastictransplants. J. Natl Cancer Inst.1945,6,73-85.Andersen S,Donnem T,Al-Shibli K,Al-Saad S,Stenvold H,Busund LT,Bremnes RM. Prognostic Impacts of Angiopoietins in NSCLC Tumor Cells and Stroma VEGF-A
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發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明提供抗VEGF/ANG2雙特異性抗體，其運(yùn)用基因工程等技術(shù)手段，將識(shí)別 VEGF和識(shí)別ANG2的抗體片段構(gòu)建在同一抗體分子中，能夠特異性的與這兩者結(jié)合，其抑制腫瘤組織血管新生的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用抗VEGF抗體。技術(shù)方案抗VEGF/ANG2雙特異性抗體，其特征在于該抗體由SEQ NO. 5的N端依次連接有 SEQ NO. 4、SEQ NO. 3、SEQ NO. 2 和 SEQ NO. 1，其中 SEQ NO. 5 的 C 端通過(GGGGS)3 封閉?？筕EGF/ANG2雙特異性抗體在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。具體來說氨基酸序列表SEQ NO. 1為Anti_ANG2Fab VL-CL ；氨基酸序列表SEQ N0. 2 為 Anti-ANG2Fab VH-CH ；氨基酸序列表 SEQ N0. 3 為 Anti-VEGFA Fab VH-CH ；氨基酸序列表 SEQ N0. 3 為 Anti-VEGF A Fab VL-CL ；氨基酸序列表 SEQ N0. 3 為 Fc ；有益效果1、本專利涉及的雙特異性抗體是運(yùn)用基因工程等技術(shù)手段，將識(shí)別VEGF和識(shí)別 ANG2的抗體片段構(gòu)建在同一抗體分子中，能夠特異性的與這兩者結(jié)合，其抑制腫瘤組織血管新生的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用抗VEGF抗體，并且具有很好看腫瘤活性。2、本專利涉及的雙特異性抗體可以特異性結(jié)合VEGF-A和ANG2分子，抑制其刺激新生血管生長(zhǎng)的生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)表明，該雙特異性抗體單獨(dú)結(jié)合VEGF-A或ANG2的能力與抗VEGF-A或抗ANG2單克隆抗體近似，并且其具有很強(qiáng)的同時(shí)與這兩種抗原結(jié)合的能力。 實(shí)驗(yàn)表明，同時(shí)抑制VEGF-A和ANG2比單獨(dú)抑制兩者中的一種能夠更好的抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)，因此使用該雙特異性抗體即能有效的抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，又能避免同時(shí)使用兩種單克隆抗體時(shí)用藥量的增加，給患者帶來的不可預(yù)知的風(fēng)險(xiǎn)。3、抗VEGF-PDGFR beta雙特異性抗體對(duì)多種腫瘤都有效果，是廣譜的抗腫瘤藥物。


圖1.抗VEGF-ANG2雙特異性抗體結(jié)構(gòu)示意圖。；
圖2. Anti-VEGF-ANG2雙特異性抗體重鏈表達(dá)載體；圖3. Anti-VEGF抗體輕鏈表達(dá)載體；圖4、Anti-ANG2抗體輕鏈表達(dá)載體圖5. ELISA測(cè)定抗體與抗原VEGF特異性結(jié)合能力。bsAb 抗VEGF-ANG2雙特異性抗體；anti-VEGF眼明抗VEGF Fab片斷；anti_ANG2 抗ANG2單克隆抗體。圖6. ELISA測(cè)定抗體同時(shí)與抗原VEGF和ANG2特異性結(jié)合能力。bsAb 抗 VEGF-ANG2雙特異性抗體；anti-VEGF眼明抗VEGF Fab片斷；anti_ANG2 抗ANG2單克隆圖7. HUVECs和HBVP共培養(yǎng)，測(cè)試抗VEGF_ANG2bsAb對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，及內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞結(jié)合的抑制作用A. Bevacizumab, Bevacizumab+antiANG2 和anti-VEGF-ANG2bsAb (同為25nM)對(duì)新生血管生長(zhǎng)的抑制效果；B.不同濃度的 Bevacizumab和anti_VEGF_ANG2bsAb對(duì)新生血管生長(zhǎng)的抑制效果(ρ < 0. 01)。圖8.重組雙特異性單克隆抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與生產(chǎn)流程圖。構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，在96孔板中培養(yǎng)，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞株逐級(jí)放大培養(yǎng)，最后在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.抗VEGF-ANG2雙特異性抗體(bsAb)核苷酸序列設(shè)計(jì)和合成根據(jù)該bsAb重鏈HCvkf (GGGGS) 3-HCMG2 (反向)的氨基酸序列和連接形式設(shè)計(jì)重鏈核苷酸序列，并在該序列5’端加入Me I酶切位點(diǎn)，KOZAK序列及前導(dǎo)序列，在其3’端加入Bio I酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)3個(gè)3’端含EcoR I酶切位點(diǎn)的寡核苷酸引物，分別合成重鏈 HCvecf-(GGGGS)3和HCanc2 (反向)片斷，應(yīng)用PCR直接連接法(SDLPCR)合成全長(zhǎng)的 bsAb重鏈基因。根據(jù)人抗VEGF-A IgGl輕鏈氨基酸序列及人抗ANG2IgGl輕鏈氨基酸序列，設(shè)計(jì)5’ 端含Not I酶切位點(diǎn)，KOZAK序列及前導(dǎo)序列，3’端含hi I酶切位點(diǎn)的PCR引物，應(yīng)用PCR 法擴(kuò)增全長(zhǎng)639bp的人抗VEGF-A輕鏈基因及全長(zhǎng)63;3bp的人抗ANG2輕鏈基因。2.抗VEGF_ANG2bsAb表達(dá)載體的構(gòu)建將該bsAb重鏈基因用Me I和Xho I雙酶切，將輕鏈基因用Not I,Psi I雙酶切后，用T4連接酶將重鏈基因連接到經(jīng)Mc I和B10 I處理的真核表達(dá)載體中；將輕鏈基因連接到經(jīng)Not I和hi I處理的真核表達(dá)載體中。含有重鏈基因的表達(dá)載體和含輕鏈基因(抗VEGF或抗ANG》的表達(dá)載體(均包含phoA啟動(dòng)子)接著被同時(shí)轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)大腸桿菌菌株。轉(zhuǎn)化后的BL21菌株選取陽性克隆，在含50ug/mL的LB培養(yǎng)基QmL)中于37°C過夜培養(yǎng)。之后菌株轉(zhuǎn)入2L含50ug/ mL的CRAP培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)M小時(shí)。菌液3000轉(zhuǎn)常溫離心棄上清，所得的大腸桿菌用Qiagen公司的質(zhì)粒提取試劑盒裂解并提取質(zhì)粒，獲得含重鏈和輕鏈的表達(dá)載體。3.抗VEGF_ANG2bsAb的表達(dá)和分離純化純化后的兩個(gè)表達(dá)載體用電穿孔法共轉(zhuǎn)染FIp-^itmCHO細(xì)胞anvitrogen)，在 500ug/ml新霉素(neo)存在的條件下懸浮培養(yǎng)，篩選陽性細(xì)胞株。重組抗體用親和層析法(Protein Α)和分子篩層析分離提純分子量為200kDa左右的完整雙特異性抗體分子。提純后的各個(gè)組分通過SDS-PAGE法鑒定。具體方法1.上樣應(yīng)用Protein A-Sepharose CL-4B親和層析法純化單克隆抗體， AKTAexplorerlOO進(jìn)行監(jiān)測(cè)。收集放大培養(yǎng)篩選得到的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液用0. 02M, pH7. 4 的磷酸鹽緩沖液稀釋，以lml/min的流速上樣。2.洗脫用上樣緩沖液進(jìn)行流洗，10倍柱床體積，流速為lml/min。然后用0. 02M, pH4. O的檸檬酸緩沖液洗脫抗體。同時(shí)用AKTAexplorerlOO進(jìn)行監(jiān)測(cè)，當(dāng)出現(xiàn)洗脫峰時(shí)，取干凈的離心管收集。每收集3ml后，立即用說，？!19.0的1^化-!1(1緩沖液調(diào)整？!1值至7.0。實(shí)施例2抗原抗體結(jié)合測(cè)試(ELISA法)1.包被用0. 05M PH9.軸碳酸鹽包被緩沖液將抗原(hVEGF_A或ANG2)稀釋至蛋白質(zhì)含量為5yg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶
9液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。2.加樣加一定稀釋的待檢抗體(anti-VEGF Fab, anti_ANG2單抗或 anti-VEGF-ANG2bsAb)0. Iml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。3.加酶標(biāo)抗體(羊抗人IgG-gamma):于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 (經(jīng)滴定后的稀釋度)0. Iml0 37°C孵育0. 5 1小時(shí)，洗滌。4.加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0. Iml, 37°C 10 30分鐘。5.終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05ml。6.結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ + ”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)0 · D 值在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔0 · D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2. 1倍，即為陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果單獨(dú)測(cè)試bsAb與VEGF或ANG2結(jié)合能力時(shí)，該雙特異性抗體與抗原的結(jié)合能力與單一特異性的對(duì)應(yīng)單抗于抗原的結(jié)合能力相同(圖6，圖7)。圖8顯示，該雙特異性抗體能夠特異性的同時(shí)結(jié)合VEGF和ANG2，而單一特異性的bevacizumab或抗ANG2單抗沒有這種能力。實(shí)施例3抗VEGF/ANG2雙特異性抗對(duì)人鼻咽癌CNE裸小鼠異種移植腫瘤生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)取生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織剪切成1. 5mm3左右，在無菌條件下，接種于裸小鼠右側(cè)皮下。小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm3后動(dòng)物隨機(jī)分組。 使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察被試動(dòng)物抗腫瘤的效果。腫瘤直徑的測(cè)量次數(shù)為每2天1 次，每次測(cè)量同時(shí)還需稱量鼠重。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射抗VEGF/ANG2雙特異性抗，每天1次， 陰性組同時(shí)給等量生理鹽水。腫瘤體積計(jì)算公式TV = 0.52 XaXb2其中a、b分別表示長(zhǎng)寬。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/c(% )，計(jì)算公式如下T/C(% ) = Tetv/CetvX 100%Tetv 治療組RTV ；Cetv 陰性對(duì)照組RTV表3.抗VEGF/ANG2雙特異性抗對(duì)人鼻咽癌CNE裸鼠異種移植腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用
權(quán)利要求
1.抗VEGF/ANG2雙特異性抗體，其特征在于該抗體由SEQNO. 5的N端依次連接有 SEQ NO. 4、SEQ NO. 3、SEQ NO. 2 和 SEQ NO. 1，其中 SEQ NO. 5 的 C 端通過(GGGGS) 3 封閉。
2.抗VEGF/ANG2雙特異性抗體雙特異性抗體在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙特異性單克隆抗體藥物，特別涉及抗腫瘤血管新生的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF/VEGF-A)和人血管生成素2(angiopoietin2，ANG2)的雙特異性單克隆抗體藥物；抗VEGF/ANG2雙特異性抗體，其特征在于該抗體由抗VEGF單克隆抗體為基礎(chǔ)，將其第二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)置換為特異性結(jié)合ANG2的抗體片斷。
文檔編號(hào)C07K16/46GK102250248SQ20111016149
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者葉亞東, 朱文華, 滕凌, 潘鸝, 路易斯易格那羅, 霍世元 申請(qǐng)人:常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司