專利名稱：全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗體及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因重組抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及全人源基因重組Fab抗體，尤其涉及特異地針對丙型肝炎核心抗原的基因工程Fab抗體及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(Hepatitis Virus C type, HCV)是一種能夠引起人類非甲非乙型肝炎的RNA病毒，其主要經(jīng)血液途徑傳播，據(jù)統(tǒng)計目前全世界約有1.7億HCV的感染者，我國的丙型肝炎感染者已經(jīng)超過4000萬。目前還沒有針對HCV的有效疫苗用以預防丙型肝炎的傳播，因此為防止醫(yī)源性 的丙型肝炎的傳染，HCV感染的診斷和血液制品生產(chǎn)相關(guān)領(lǐng)域的篩查，對于阻止HCV的傳播具有重要的意義。目前，國內(nèi)外針對丙型肝炎的診斷試劑盒分為兩種，一種是檢測病人血液或其它樣品中存在的HCV病毒基因組，而采用RT-PCR方法進行定量檢測；另一種則采用免疫學方法檢測樣品中的HCV相關(guān)的抗原和或抗體。針對抗HCV病毒相關(guān)的抗體類試劑盒在檢測HCV感染的“窗口期”約70-80天；而針對HCV核心抗原的，用抗HCV核心抗原的單抗的雙抗體夾心法檢測樣品中存在的HCV核心抗原，使檢測HCV感染的“窗口期”提高至14天，但兩種試劑盒均各有優(yōu)缺點。單克隆抗體技術(shù)、基因重組抗體技術(shù)已經(jīng)是比較成熟的技術(shù)，并且通過雜交瘤技術(shù)已經(jīng)制備了多種針對HCV的單克隆抗體。也有采用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建了針對HCV的抗體庫。我們通過噬菌體技術(shù)從HCV感染者中分離外周血單個核細胞，建立了相應的抗HCV抗體展示庫，并從該庫中篩選到能夠與HCV核心抗原具有高親和力的噬菌體顆粒，并通過基因克隆技術(shù)獲得相應的抗體基因，采用全人源抗體基因工程表達技術(shù)，在大腸桿菌中實現(xiàn)全人源Fab抗體的表達。利用本方法制備的Fab抗體可能作為HCV診斷試劑盒的組分用于診斷試劑盒的開發(fā)，并且該Fab抗體可能具有治療HCV的潛在價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過基因重組技術(shù)，克隆抗HCV核心抗原的抗體基因，表達并分離純化全人源抗HCV核心抗原的基因工程Fab抗體，并將該抗體用于研制HCV診斷試劑盒，尤其是用于早期復查HCV感染的HCV核心抗原的檢測。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗體及其制備方法和應用、編碼該Fab抗體的DNA分子、包含該DNA分子的表達載體，以及被該表達載體轉(zhuǎn)化的原核宿主細胞。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗體，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中:(I)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
(2)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。一種DNA分子，編碼上述的基因工程Fab抗體的重鏈或/和輕鏈。在本發(fā)明的一個較佳的實施例中，上述的DNA分子編碼所述基因工程Fab抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示，以及編碼所述基因工程Fab抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。一種表達載體，包含有上述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的表達調(diào)控序列。一種原核宿主細胞，它被上述的表達載體轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，所述的原核宿主細胞是大腸桿菌。進一步優(yōu)選地，所述的原核宿主細胞是大腸桿菌BL21。上述的基因工程Fab抗體可以用于制備診斷、預防和/或治療丙型肝炎病的試劑或藥物。一種制備上述的基因工程Fab抗體的方法，包括如下步驟:(I)提供一表達載體，該表達載體含有權(quán)利要求2所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的表達調(diào)控序列；(2)用步驟(I)所述的表達載體轉(zhuǎn)化原核宿主細胞；(3)在適合所述的基因工程Fab抗體表達的條件下培養(yǎng)步驟(2)所得的原核宿主細胞；(4)分離純化獲 得所述的基因工程Fab抗體。上述的制備方法，其中所述的表達載體為分泌型表達載體，該分泌型表達載體能在分泌信號引導下使所述基因工程Fab抗體的多肽鏈被分泌到原核宿主細胞周質(zhì)中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的基因工程Fab抗體及其制備方法具有如下優(yōu)點和顯著的進步:(I)采用從感染者淋巴細胞中分離抗體基因的方法獲得一種全人源的抗體基因序列，并采用基因工程技術(shù)表達FAB抗體技術(shù)，獲得的一組全人源的基因工程FAB抗體；(2)通過體外組合的方法，獲得的FAB抗體具有雙識別的特性。


圖1抗體重鏈基因PCR克隆(以pMD-VHl為例)圖2FAB抗體基因表達載體pFAB_VHl的構(gòu)建圖3FAB抗體基因表達載體pFAB_VH2的構(gòu)建圖4FAB抗體基因表達載體pFAB_VKl的構(gòu)建圖5FAB抗體基因表達載體pFAB_VK2的構(gòu)建圖6分泌FAB抗體基因表達載體pFAB_pelB_VHlCH的構(gòu)建圖7分泌FAB抗體基因表達載體pFAB_pelB_VH2CH的構(gòu)建圖8分泌FAB抗體基因表達載體pFAB_pelB_VKlCK的構(gòu)建圖9分泌FAB抗體基因表達載體pFAB_pelB_VK2CK的構(gòu)建圖10分泌成熟FAB抗體表達載體pFAB_pelB-VHlCH-VKlCK的構(gòu)建圖11分泌成熟FAB抗體表達載體pFAB_pelB-VH2CH_VKlCK的構(gòu)建圖12分泌成熟FAB抗體表達載體pFAB_pelB-VHlCH_VK2CK的構(gòu)建
圖13分泌成熟FAB抗體表達載體pFAB_pelB-VH2CH_VK2CK的構(gòu)建。
具體實施例方式本發(fā)明涉及的基因工程Fab抗體的制備包括如下步驟:1、采用HCV感染病人，經(jīng)過診斷是抗HCV核心抗原抗體陽性的患者，從一病人中分離出外周血單個核細胞，采用常規(guī)分子生物學技術(shù)，分離細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，并用針對抗體基因重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的通用引物進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并膠回收相應的特異擴增基因產(chǎn)物，經(jīng)過雙酶切并與同樣酶切的PC0MB3，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在輔助噬菌體作用下，建立相應的噬菌體展示庫。2、將重組人HCV核心抗原包被到酶標板上，將上述噬菌體展示庫經(jīng)過四輪淘洗篩選，獲得表達具有抗HCV核心抗原高親和力的噬菌粒。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴增、提取噬菌體DNA，將陽性克隆進行測序并分析抗體可變區(qū)基因序列及編碼氨基酸。共選擇具有較高親和力的兩個陽性克隆，對它們的輕鏈和重鏈分別進行序列分析，結(jié)果為重鏈可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示，輕鏈可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。其對應的重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示。3、設(shè)計與Fab抗體表達載體pFABs相匹配的帶相應酶切位點的針對前述各個抗體重鏈和輕鏈基因引物，PCR,以陽性噬菌粒為模板，擴增各個基因片段，并亞克隆到pMD-18 (TaKRa，Inc)載體中，分別得到各個基因重組質(zhì)粒，標記為pMD_VHl、pMD_VH2、pMD-VKl 和 pMD-VK2 (參見圖1)。4、按設(shè)計的限制性內(nèi)切酶位點，進行雙酶切獲得相應的基因片段，采用基因亞克隆技術(shù)將獲得的各個抗體基因可變區(qū)與含有人源抗體基因相應的恒定區(qū)的PFabl和pFab2連接，構(gòu)建相應的抗HCV核心抗原抗體的重鏈和輕鏈表達載體，pFABl-VHlCH, pFABl_VH2CH，PFAB2-VK1CK, pFAB2_VK2CK四個重組載體，經(jīng)過篩選鑒定后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21菌，并進行誘導表達分析，建立表達抗HCV核心抗原的Fab抗體的工程菌，用于制備重組全人源Fab抗體。5、為優(yōu)化或提高表達抗體表達水平，采用一個抗體鏈一個表達載體、一個工程菌進行表達的方式。6、表達工程菌經(jīng)過發(fā)酵、收集發(fā)酵菌體、破菌、分離純化包涵體，并經(jīng)過包涵體的洗滌、變性和復性，然后采用離子交換、凝膠過濾等純化手段，獲得純化多肽，按分子摩爾比進行重鏈多肽與輕鏈多的混合以完全復性成為FAB抗體，并經(jīng)過親和層析純化得到最終獲得具有高親和力的抗HCV核心抗原的Fab抗體。更佳地是，采用變性后的抗體輕鏈與重鏈蛋白，經(jīng)過兩兩組合后，一起復性的方法，以抗體輕鏈與重鏈的相互作用促進復性過程。此夕卜，通過輕鏈和重鏈的組合，可以使產(chǎn)生的抗體可能識別兩個不同表位的特點。7、又通過將表達重鏈基因的轉(zhuǎn)錄表達盒子亞克隆到表達抗體基因輕鏈基因轉(zhuǎn)錄盒子的載體中，建立雙順反子以同時在一個菌體內(nèi)表達重鏈、輕鏈基因多肽，獲得相應的Fab抗體蛋白表達， 并在編碼基因上游包含有分泌表達相關(guān)的信號肽序列以實現(xiàn)Fab抗體的分泌表達。8、對于以分泌表達表達的FAB抗體直接應用親和層析進行純化，獲得重組抗體。
9、對獲得的全人源重組Fab抗體進行表位識別分析，確定所獲得的抗體具有不同的識別表位，分別是HCV核心抗原的表位FPGGGQIV和EDGVNYATGN。以下通過實施例形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例1抗HCV抗體噬菌體展示庫的建立1、人外周血淋巴細胞的分離從醫(yī)院門診隨機取5例經(jīng)第2代ELISA試劑檢測血清抗HCVIG強陽性，PCR檢測HCVRNA陽性的慢性丙型肝炎患者的外周血。每例采血10mL，用淋巴細胞分層液按常規(guī)方法制備人外周血淋巴細胞，并用冷PBS洗3次，混合后用倒置顯微鏡計數(shù)，分裝(每管5 X 106細胞)。5例患者經(jīng)HCV5'端非編碼區(qū)型特異性引物PCR分型，4例為Ib型，I例為3型。2、總RNA提取和cDNA第I鏈的合成以Trizol提取細胞總RNA，按說明書操作。取RNA2 μ L測A260nm和A280nm值鑒定其濃度和純度。另取5 μ LRNA，用6g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA的完整性。取10 μ g RNA 溶液，加入 Oligo dT 4“1^0.4 4 8)，于701:變性81^11，冰浴51^11。分別加入 5 X BufferlO μ L, 2.5mmol/LdNTP10 μ L, 0.lmol/LDTT5 μ L, RNA 酶抑制物 40U 和 M-MLV400U，用DEPC處理水補足體積至50 μ L，37°C水浴lh，95°C 5min,冰浴lOmin，于_20°C儲存。3、引物設(shè)計及擴增Fd和k基因PCR所用人抗體引物，根據(jù)`Kang [6)的設(shè)計加適當改動和簡并，由上海生工生物工程公司合成，PAGE純化。IgGlCH 3'端引物為:5' -GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG ；VH5/ 端引物:Pl 為:5' -SAGGTGCAGCTCGAGSAGTCTGG(由 VHla 與 VH3a 簡并與);P2 為:5' -SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG (由 VHlf■與 VH3f 簡并)；P3 為:5' -CAGGTGCAGCTRCTCGAGTCGGG (由 VH 與 VH4f 簡并)。Ck3/ 端引物為:5' -GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTACGGGCAAG；Vk5'端引物為:5' -GAMATYGAGCTCACSCAGTCTCCA(由 Vkla 與 Vk3a 簡并)。其中M=A或C，S=C或G，Y=C或T。重鏈引物中分別含有內(nèi)切酶XhoI和SpeI的識別序列(下畫線部分)；輕鏈引物中分別含有內(nèi)切酶SacI和XbaI的識別序列(下畫線部分)。每管以5 μ I cDNA為PCR反應的模板，分別對Fd和k基因進行擴增。4、大腸桿菌的電穿孔轉(zhuǎn)化將2.5mL過夜培養(yǎng)的XLl-Blue菌液，接種在400mL含有四環(huán)素10mg/L的SB中，37°C培養(yǎng)至A600nm值為0.5。置冰浴中15min，于4°C離心棄上清，用100mL/L冷甘油水將細菌洗滌3次后，懸于4mL100mL/L甘油中即為感受態(tài)細胞。分裝(每管0.2mL)，于液氮中凍5min后，取出，置-70°C凍存。按Bio-Rad基因脈沖儀說明書中所述方法進行電穿孔轉(zhuǎn)化。5、噬菌體抗體庫的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，以QIAGEN凝膠提取Kit純化，SacI + XbaI雙酶切，再以PCR產(chǎn)物純化Kit純化。然后用T4DNA連接酶使之與相應酶切純化的噬菌粒pComb3連接，電穿孔轉(zhuǎn)化XLl-Blue細胞，擴增轉(zhuǎn)化后的細菌。擴增后提取質(zhì)粒得到含輕鏈片段的pComb3。對其進行XhoI + SpeI雙酶切，并與用相應酶切的重鏈FdPCR產(chǎn)物連接，電穿孔轉(zhuǎn)化XLl-Blue。轉(zhuǎn)化后的細菌加2mL預熱的S0C，置37°C振蕩培養(yǎng)Ih后，轉(zhuǎn)移至SOC固體平板(含氨芐青霉素100mg/L，四環(huán)素10mg/L)，于37°C培養(yǎng)24h。用SB洗下菌苔，取20 μ L菌液加入20mL含氨芐青霉素的SB中，37°C培養(yǎng)至A600nm約為0.5。加入約IOllpfu的輔助噬菌體VCSM13，37°C培養(yǎng)lh，再加入終濃度為70mg/L的卡那霉素，振蕩培養(yǎng)過夜。離心、收集上清，加入PEG6000到40g/L，NaCl到30g/L，置冰浴Ih后，于4°C以12000r/min離心。棄上清，以3mLPBS溶解沉淀，再以12000r/min離心5min，棄去不溶物，收集上清即為噬囷體抗體庫，對庫各測定結(jié)果為1.2*107。實施例2抗HCV核心抗原陽性噬菌粒的分離1、曬菌體抗體庫的篩選將HCV核心抗原蛋白以每孔IOOng包被ELISA板條，用30g/LBSA封閉、PBS洗后，加入噬菌體抗體庫100 μ L (約1012cfu)，37°C溫育2h。吸出噬菌體抗體液，以PBST洗I次(第2輪洗5次，第3，4，5輪各洗10次)，PBS洗I次，加入100 μ L洗脫液(0.lmol/LHCl,以甘氨酸調(diào)至PH2.2，并含lg/LBSA)于室溫靜置lOmin。將洗脫液稍加吹打后吸出，立即用6μ L2mol/L Tris中和，并加入2mLXLl_Blue，于37°C靜置20min后，再加入20mLSB (含氨芐青霉素和四環(huán)素)，取10 μ L稀釋鋪平板測定cfu。其余細菌置37°C培養(yǎng)2h后，加入VCSMl3和卡那霉素。噬菌體的沉淀和收集均按實施例1步驟5中的程序進行。反復進行“吸附一洗脫一擴增”4次淘洗，以使特異性噬菌體抗體高度富集。

2、單克隆嗤囷體抗體的制備及鑒定將經(jīng)第4輪篩選、洗脫的噬菌體感染XLl-Blue后劃平板，過夜培養(yǎng)。隨機挑選細菌菌落，接種于4mL含氨芐青霉素和四環(huán)素的SB中，置37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取200 μ L加到4mL含同樣量抗菌素的SB中，再37 °C振蕩培養(yǎng)2h，加入40 μ L的VCSMl3培養(yǎng)2h后，力口卡那霉素至70mg/L，置30°C振蕩培養(yǎng)過夜。離心收集上清，即為單克隆噬菌體抗體，置4°C保存。將待檢噬菌體抗體與等量10g/LBSA混合后，置室溫孵育20min，加到已經(jīng)HCV核心抗原包被和BSA封閉的ELISA板中，于37°C溫育2h。用PBST洗4次、PBS洗2次后，加入HRP-羊抗M13抗體進行結(jié)合反應，以TMB顯色。實驗中采用VCSM13作為陰性對照。3、抗HCV核心抗原抗體基因的分離與鑒定將篩選到的陽性克隆，采用Qiagen小量質(zhì)粒抽提試劑盒，送公司進行測序，獲得表達抗體基因的序列。實施例3抗HCV核心抗原Fab抗體的表達載體構(gòu)建與表達1、設(shè)計引物根據(jù)已經(jīng)測定的抗體重鏈和輕鏈基因序列，分別設(shè)計擴增出抗體基因的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的引物，如下表1:表I抗體擴增引物
權(quán)利要求
1.一種全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗體，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于:(I)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；(2)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
2.—種DNA分子，編碼權(quán)利要求1所述的基因工程Fab抗體的重鏈或/和輕鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于:它編碼所述基因工程Fab抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6所示，以及編碼所述基因工程Fab抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。
4.一種表達載體，包含有權(quán)利要求2所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的表達調(diào)控序列。
5.一種原核宿主細胞,它被權(quán)利要求4所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的原核宿主細胞，其特征在于:它是大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的原核宿主細胞，其特征在于:它是大腸桿菌BL21。
8.權(quán)利要求1所述的基因工程Fab抗體在制備診斷、預防和/或治療丙型肝炎病的試劑或藥物中的用途。
9.一種制備權(quán)利要求1所述的基因工程Fab抗體的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)提供一表達載體，該表達載體含有權(quán)利要求2所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的表達調(diào)控序列； (2)用步驟(I)所述的表達載體轉(zhuǎn)化原核宿主細胞； (3)在適合所述的基因工程Fab抗體表達的條件下培養(yǎng)步驟(2)所得的原核宿主細胞； (4)分離純化獲得所述的基因工程Fab抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述的表達載體為分泌型表達載體，該分泌型表達載體能在分泌信號引導下使所述基因工程Fab抗體的多肽鏈被分泌到原核宿主細胞周質(zhì)中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗體及其制備方法和應用，該Fab抗體是按照如下方法制備而成從丙型肝炎感染患者中分離淋巴細胞，并通過噬菌體展示技術(shù)分離全人源抗丙型肝炎核心抗原的抗體基因，采用Fab抗體基因表達方法，表達并分離得到相應的抗體蛋白，其可用于丙肝炎核心抗原的檢測。
文檔編號C07K16/10GK103159853SQ201310057388
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月23日
發(fā)明者婁永華 申請人:浙江家和制藥有限公司