專利名稱：一個新的丙型肝炎病毒抗原表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物信息學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，預(yù)測了一個新的丙型肝炎病毒抗原表位， 初步的體內(nèi)、體外實驗證明這個抗原表位具有免疫原性。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝病的主要病原體之一，全世界約有HCV感染者 1.7億-2.0億，我國人群HCV感染率約3.2%，估計全國感染者在4000萬以上。HCV感染后，約50% -85%轉(zhuǎn)為慢性肝炎，其中20%-30%發(fā)展為肝硬化，部分轉(zhuǎn)為肝細胞肝癌(HCC)，嚴(yán)重危害人類健康，已成為全球性的、嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。迄今為止，尚缺乏理想的抗病毒治療措施，干擾素治療也不太令人滿意。由于HCV病毒變異率高，以保護性中和抗體為主的預(yù)防性HCV疫苗的研究步履維艱，因此，尋求抗HCV的疫苗和有效抗病毒藥物一直是研究的執(zhí)占。HCV基因組有9. 6kb，編碼3010aa的多肽，由結(jié)構(gòu)蛋白(Core、El和E2)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B )組成。HCV感染后，機體細胞模式識別受體(pattern recognition rec印tors，PRR)感受外來分子的侵入，誘導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)， 產(chǎn)生I類干擾素等固有免疫反應(yīng)，以抵抗病毒的侵襲；同時通過DC介導(dǎo)特異性細胞免疫，清除病毒感染，恢復(fù)細胞的“健康狀態(tài)”。對急性HCV感染病人觀察發(fā)現(xiàn)，如病人能早期出現(xiàn)針對包膜蛋白的抗體，則有利于病毒清除。早期疫苗研究中也證明了 HCV確實具有中和抗原表位，用真核載體表達的重組膜蛋白免疫黑猩猩，可以保護動物免受同株病毒的攻擊。 由于HCV中和抗原表位存在于編碼包膜糖蛋白的E區(qū)，而HCV E區(qū)基因高度變異，尤其是E2 區(qū)N端存在高變區(qū)(HRV1和HRV2)，從而使機體產(chǎn)生的中和抗體因抗原變異而缺乏保護力， 不能有效地清除病毒準(zhǔn)種或其它型別病毒株的感染。近年來，應(yīng)用更特異的ELISP0T法檢測免疫活性細胞在特異性表位肽刺激下的細胞因子分泌，分別觀察⑶4+ Th細胞和⑶8+ CTL細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)， 早期有強烈Th免疫反應(yīng)的病人，HCV病毒檢查陰轉(zhuǎn)，若Th免疫反應(yīng)下降，病毒血癥又可復(fù)發(fā)，說明Th細胞免疫反應(yīng)在病毒清除中的重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染的患者若能在感染的早期產(chǎn)生較強的針對HCV各個蛋白的多表位特異性CTL，則患者的感染多表現(xiàn)為自限性；而當(dāng)患者特異性CTL的活性較低或僅針對個別表位時，則可導(dǎo)致HCV感染的持續(xù)狀態(tài)，并可造成肝組織的慢性損傷，提示CTL活性對HCV感染的控制具有重要作用。黑猩猩感染實驗?zāi)芨屑毜赜^察初次感染時不同時相的免疫反應(yīng)，結(jié)果說明CD4+ T細胞和CD8+ T細胞均在HCV清除和維持病毒抑制狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。由于HCV疫苗研究的必要性和迫切性，自1989年HCV基因獲得克隆以來，人們一直在致力于疫苗的研究，但是進展緩慢。早些時候，人們注重發(fā)展HCV包膜糖蛋白或多肽亞單位疫苗，同HIV疫苗的研究一樣，由于HCV包膜糖蛋白高度的變異特性，使以產(chǎn)生中和性抗體控制病毒感染和復(fù)制的研究遇到困難。HCV疫苗難以實現(xiàn)的主要原因歸納為以下三點①HCV基因組變異率較高，病毒準(zhǔn)種多，缺乏保護性抗體，不能預(yù)防黑猩猩和人類再次感染，傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗的研究遇到困難；②HCV復(fù)制能力差，感染力弱，使體內(nèi)病毒滴度較低，在體外又不易培養(yǎng)，病毒復(fù)制感染過程及發(fā)病機制仍不清楚，而且HCV編碼的某些蛋白，如核心蛋白和NS蛋白還可能與HCV的致癌性有關(guān)，免疫原的選擇以及強度均受到一定的限制；③缺乏理想的體外感染細胞模型，動物模型除黑猩猩外，其他動物，即使靈長類動物，如狒狒、恒河猴等都不能為HCV所感染，限制了對疫苗評價的研究。近10年來，HCV疫苗研究的焦點主要集中在核酸疫苗、病毒載體疫苗、重組多表位疫苗以抗原遞呈細胞為載體的DC疫苗等。重組多表位疫苗因其可以同時攜帶多個相關(guān)目標(biāo)抗原以及輔助性表位，能夠有效地應(yīng)對病原微生物變異和免疫反應(yīng)中HLA限制性等不利因素。已在腫瘤疫苗、HIV疫苗和 HCV疫苗的研究方面進行了探索，顯示其在誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)方面具有獨特的優(yōu)勢。為了誘導(dǎo)出針對多個HCV表位的特異性細胞免疫反應(yīng)，選擇HCV基因組中不同區(qū)的多表位，進行科學(xué)設(shè)計、合理組合是目前HCV疫苗開發(fā)研究的熱點。越來越多的證據(jù)表明，要獲得具有較強免疫原性的HCV多肽，必須能廣泛地激發(fā)機體的CD4+和CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)， 必須具有HCV不同區(qū)段的多個表位。同時，細胞免疫反應(yīng)無論是CTL還是Th反應(yīng)，免疫原在抗原遞呈細胞(APC)內(nèi)都要經(jīng)過一個復(fù)雜的加工及由主要組織相容性抗原(MHC)遞呈的過程，其I類和II類抗原分別遞呈能激活⑶8+ T細胞和⑶4+T細胞的抗原表位。在多表位疫苗的設(shè)計中還要考慮所選擇的表位必須要能覆蓋不同人群的HLA限制型，才能使疫苗對絕大多數(shù)個體都有作用。最近(2007年)，以色列學(xué)者Vider-Shalit等，根據(jù)CTL表位由MHC-I類分子呈遞抗原(胞質(zhì)溶膠途徑)的分子免疫學(xué)知識，基于基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析工具，以互聯(lián)網(wǎng)上的HCV蛋白數(shù)據(jù)庫LANL (包含已報道的所有HCV基因型)為對象，依次運用模擬退火算法計算肽切割的概率、應(yīng)用殘基結(jié)合能線形組合方法計算與TAP結(jié)合的概率、應(yīng)用BIMAS算法計算與包含所有HLA多態(tài)性的MHC結(jié)合概率，從中選取一些覆蓋大多數(shù)人群的HLA限制性表位；然后，運用HLALigancUMHCBN、AntiJen等數(shù)據(jù)庫去驗證，在此基礎(chǔ)上分析這些表位在所有已報道HCV基因型中的保守性以及去除與人自身肽相似性強的表位，將這些候選的表位按照遺傳學(xué)算法進行串聯(lián)，兩個表位用潛在氨基酸序列可以被切割。這樣獲得的多表位組合是來自幾乎所有HCV基因型及亞型，同時既能夠被有效呈遞，又能夠覆蓋大多數(shù)人群HLA多態(tài)性，并為小鼠實驗研究設(shè)計了 HCV多表位基因序列，該序列由225aa組成，含有 25個CTL表位。近10年來，隨著對HCV持續(xù)感染機制的認識，結(jié)合我們多年的HCV研究工作基礎(chǔ)， 通過與國、內(nèi)外學(xué)者交流，我們提出了 HCV疫苗研究的新理念需要結(jié)合HCV的生物學(xué)特性、 感染發(fā)病特征、抗病毒免疫機制，改變“單純預(yù)防”為“預(yù)防與治療相結(jié)合”，改變“多次接種為多次反復(fù)接種”，發(fā)展能夠誘導(dǎo)出強大的、針對多個病毒表位的、持續(xù)較長時間的特異性 CD8+和CD4+T細胞反應(yīng)的疫苗研究策略，以誘導(dǎo)持續(xù)免疫應(yīng)答和維持病毒抑制狀態(tài)為“基本目標(biāo)”的HCV疫苗研究的新理念。因此，我們首先要發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)出特異性T細胞反應(yīng)的 HCV抗原表位。受此啟發(fā)，我們應(yīng)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測了涵蓋中國人HLA I類和HLA II類基因座等位基因頻率較高的抗原表位，包括HCV基因不同區(qū)的多個CTL表位和Th表位。選擇HCV核心(C)區(qū)、NS3、NS4、NS5區(qū)的CTL表位和Hi表位共12個，進行優(yōu)勢組合串聯(lián)，設(shè)計、合成了重組HCV多表位疫苗的基因序列，進行了真核表達，并用此基因疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出體液和細胞免疫應(yīng)答。這預(yù)測的12個表位均做了體外實驗，其中一個表位能刺激T 細胞增殖并產(chǎn)生IFN - Y，用這個表位合成的多肽疫苗免疫小鼠能誘導(dǎo)出細胞免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個新的丙型肝炎病毒抗原表位，它構(gòu)建的肽疫苗序列為 肽NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL。經(jīng)體內(nèi)、體外實驗表明這個抗原表位具有免疫原性。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一個新的丙型肝炎病毒抗原表位，其序列是抗原表位多JftNS4B (1793-1801) SMMAFSAAL。所述的抗原表位多肽在制備治療丙型肝炎藥物中的應(yīng)用。所述的抗原表位多肽在制備丙型肝炎疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的特點是經(jīng)體內(nèi)、體外實驗表明這新發(fā)現(xiàn)的丙型肝炎病毒抗原表位，具有免疫原性，它構(gòu)建的肽疫苗序列為肽NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL。


下面結(jié)合實施例附圖對本發(fā)明做進一步說明，但不做為對本發(fā)明的限定
圖1 是重組質(zhì)粒pEGFP-mcg雙酶切鑒定(1 :DL2000 Marker ； 2，3，4，5 為 Hind III +BamH I 雙酶切 pEGFP-mcg)；
圖2是重組質(zhì)粒pEGFP-mcg轉(zhuǎn)染C0S-7細胞后mRNA的提取及RT-PCR (M :DL2000 Marker ；1,2 :pEGFP_mcg 轉(zhuǎn)染 C0S-7 細胞后 mRNA 提取后的 RT-PCR 結(jié)果)；
圖3是熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果(X 400)(其中A :pEGFP-Nl轉(zhuǎn)染C0S-7細胞組；B 重組載體pEGFP-mcg轉(zhuǎn)染C0S-7組)；
圖4是western blot檢測目的蛋白的表達(1 =Hicg-EGFP融合蛋白的表達；2 =EGFP蛋白的表達)；
圖 5A. LaneM :KB Ladder ( Lanel :pcDNA3. 1-mcg plasmid ； Lane 2 :pcDNA3. 1-mcg PCR鑒定結(jié)果；Lane 3 :pcDNA3. 1-mcg用EcoR I酶切鑒定結(jié)果)； 圖5B. pcDNA3. 1-mcg的測序鑒定；
圖6. pcDNA3. I-Em基因免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體； 圖7. pcDNA3. I-Em基因免疫小鼠脾淋巴細胞特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)； 圖8 倒置顯微鏡下PBMC的形態(tài)學(xué)變化(X200)(其中A 合成肽刺激72 h后；B 陰性對照72 h后)；
圖9 IFN- γ的檢測結(jié)果(A: 11號肽組IFN- γ的檢測結(jié)果；B 6號肽組IFN- γ的檢測結(jié)果；1 實驗組；2 陽性對照；3 陰性對照)；
圖IOA ELISP0T斑點形態(tài)(其中A: 11號肽刺激組；Β:6號肽刺激組；C 陽性對照組； D 陰性對照組)；
圖IOB肽刺激HCV患者PBMC產(chǎn)生的斑點數(shù)(1 11號肽刺激組；2 6號肽刺激組；3 陽性對照組；4 陰性對照組)；
圖11多肽免疫小鼠特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)。
具體實施例方式實施例1.重組HCV多表位疫苗的基因序列的設(shè)計 1、建立HCV蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫
以關(guān)鍵詞organism: "hepatitis c virus" AND name: "genome polyprotein〃 AND fragment:no AND reviewed:yes 搜索 uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://beta. uniprot. org/)，選擇中國流行的HCV基因型lb、2a、2b、3a、;3b、6a的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(表1)。 該數(shù)據(jù)庫包含有17株HCV蛋白質(zhì)組序列。表1.選定的HCV蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫
UniprotIDNO.genotypeisolatestrainP26663IbBKQ9WMX2IbConlQ03463IbHC-Jl092972IbHC-J4P26662IbJapaneseQ00269IbHC-JTQ913V3IbHCR6P29846IbTaiwanP266602aHC-J6Q99IB82aJFH-IP266612bHC-J8Q9DHD62bJPUT97017Q814953ak3aQ812583aNZLlQ814873bTr-KjQ5I2N36a6a330399276aEUHK2
2、HCV多聚蛋白蛋白酶體初步剪切預(yù)測
經(jīng)計算，17株HCV蛋白質(zhì)組可形成51799條九肽單體，采用P印Cleave (http:// peptibase. cs.biu. ac. il/PepCleave_II/)預(yù)測蛋白質(zhì)序列可能的蛋白酶水解9肽，選用 bad overweight score打分矩陣。預(yù)測的可能蛋白酶體水解(Score>0)9肽共有8347個， 其中不同位置不同病毒株的非重復(fù)九肽達4075條。編寫perl語言腳本處理P印Cleave結(jié)果輸出序列，僅保留九肽部分序列，并保存成fasta格式序列文件。通過Blast比對，去除同源性100%序列，剩余3789條蛋白酶體可能水解九肽。3、針對中國人HLA基因頻率的重組HCV多表位疫苗基因序列的生物學(xué)設(shè)計 ①HCV候選表位肽TAP結(jié)合力預(yù)測
用通過多聚蛋白蛋白酶體剪切預(yù)測得到的3789條蛋白酶體水解九肽，通過PREDTAP (http://antigen. i2r. a—star. edu. sg/predTAP/)軟件隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Models method, HMM)計算3789條與TAP結(jié)合能力，獲取其中TAP-binding score大于等于6的九肽共514條。②HCV候選表位肽與HLA分子親和力計算
采用 BIMAS (http://www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind/)分別預(yù)測上述 514 條候選九肽與HLA-I A2、AM、A3、B7超型和B40亞型分子結(jié)合情況。選取結(jié)合力打分大于 1的九肽。
③初步確定HCV候選表位肽段
分別統(tǒng)計HLA-I A類分子A2、A3、AM超型共有和B7、B40共有的可能結(jié)合CTL表位及
其覆蓋的病毒株及基因型。，采用函數(shù)Χ = Σ巧 名分別計算HLA-I A和B類分子CTL表位
抗原肽的總分。其中，Si預(yù)測CTL表位各對應(yīng)HLA-I超型的分值，fi為該超型在中國人群中的表型頻率。綜合評價各CTL表位打分值、覆蓋的病毒基因型、病毒株占本研究中HCV數(shù)據(jù)庫的比例及該九肽對于不同HLA分子(超型)的預(yù)測結(jié)合能力，初步選擇CTL表位(表2)。表2.構(gòu)建多肽疫苗的CTL表位篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1.一個新的丙型肝炎病毒抗原表位，其序列是抗原表位多肽NS4B (1793-1801) SMMAFSAALo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個新的丙型肝炎病毒抗原表位，其特征是所述的抗原表位多肽在制備治療丙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個新的丙型肝炎病毒抗原表位，其特征是所述的抗原表位多肽在制備丙型肝炎疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物信息學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，預(yù)測了一個新的丙型肝炎病毒抗原表位，其序列是抗原表位多肽NS4B(1793-1801)SMMAFSAAL；所述的抗原表位多肽在制備治療丙型肝炎藥物中的應(yīng)用；所述的抗原表位多肽在制備丙型肝炎疫苗中的應(yīng)用。它經(jīng)體內(nèi)、體外實驗表明這個抗原表位具有免疫原性。
文檔編號A61P31/14GK102212114SQ20111014340
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者周云, 李端, 潘蕾, 賈戰(zhàn)生 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)