專利名稱：微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凝集素的分離純化方法，尤其涉及一種使用反膠束萃取技術(shù)直接從水提液中分離純化蕓豆凝集素的方法。
背景技術(shù)：
凝集素(lectin或agglutinin)是一類具有糖專一'丨生,可與細(xì)胞表面特殊糖蛋白、糖脂的寡糖結(jié)構(gòu)結(jié)合，促使細(xì)胞凝集或糖復(fù)合物沉淀的，非免疫來(lái)源的糖蛋白或糖結(jié)合蛋白。凝集素用途廣泛，在生物化學(xué)研究中可用于含糖高分子的分離純化和糖鏈結(jié)構(gòu)的鑒定；在生物學(xué)研究中可專一識(shí)別細(xì)胞表面信號(hào)分子，用于選擇突變細(xì)胞株、研究細(xì)胞機(jī)制和細(xì)胞表面特征及鑒定微生物；在免疫學(xué)研究中可促細(xì)胞有絲分裂，抑制腫瘤等惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)；在醫(yī)學(xué)上可鑒定血型，診斷病變和作為載體分子使藥物專一地靶向不同的細(xì)胞和組織。因此，凝集素在現(xiàn)代科研領(lǐng)域是一種重要的研究工具，凝集素的分離純化具有極為誘人的科研價(jià)值和市場(chǎng)前景。凝集素的研究始于1888年Herman Stillmark偶然發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素(Ricicn)。至今已發(fā)現(xiàn)的凝集素以植物凝集素類為主，近1000種，廣泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾木科、百合科和石蒜科等眾多的植物類群中，其中以豆科植物中的凝集素種類最為豐富，目前已有600余種。我國(guó)大部分地區(qū)具有蕓豆品種多、產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)，其豆中凝集素具有含量高、凝血效價(jià)高的特點(diǎn)，因此，蕓豆凝集素的分離和純化研究有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，凝集素的分離純化方法基本按照蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)分離方法進(jìn)行，一般先將提取物經(jīng)酸沉或鹽析，然后經(jīng)陰離子和陽(yáng)離子交換多次層析。在凝集素糖結(jié)合專一性已知的情況下，可利用親和層析法進(jìn)行分離純化。程悅生等(1997)利用凝集素特殊的疏水結(jié)合位點(diǎn)，采用疏水相互作用色譜法分離得到大豆凝集素。200510011480.2通過(guò)不同飽和度的硫酸銨分級(jí)沉淀及多步的離子交換柱層析，得到一種黃芪凝集素蛋白。200610097429.2通過(guò)超聲強(qiáng)化酸提、鹽析、熱處理、超濾、親和層析等技術(shù)手段獲得麥胚凝集素。201110114904.3公開(kāi)了一種純化大豆凝集素的親和層析填料D-GalN-FF-s印harose4B。201110025266.8用硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾除鹽和濃縮、離子交換層析等方法純化得到一種蒜頭果仁凝集素。但是，以上方法還尚未擺脫凝集素分離純化過(guò)程中存在的操作繁瑣、處理量低、損耗大和耗時(shí)長(zhǎng)(一般為I 3天)的不足之處。因此，建立快速、高效的凝集素分離純化技術(shù)勢(shì)在必行。近年來(lái)，反膠束萃取技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、成本低、綠色、無(wú)污染、萃取率高、條件溫和、溶劑可反復(fù)使用和不易引起蛋白變性的優(yōu)點(diǎn)而受到各國(guó)研究人員的廣泛關(guān)注。反膠束是特定表面活性劑分子在非表面活性劑體系中自發(fā)形成的納米級(jí)分子聚集體(lO-lOOnm)，一般為W/0形式。反膠束萃取技術(shù)通常包括前萃取和反萃取兩步過(guò)程。在前萃取過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散到水相和有機(jī)相界面，通過(guò)控制萃取過(guò)程的有關(guān)工藝條件，在界面形成包容特定目標(biāo)蛋白質(zhì)分子的反膠束體系，含有蛋白質(zhì)的反膠束在有機(jī)相中擴(kuò)散而離開(kāi)界面。在反萃取過(guò)程中，通過(guò)改變有關(guān)工 藝條件，含有蛋白質(zhì)的反膠束在水相和有機(jī)相界面崩裂，特定目標(biāo)蛋白從界面擴(kuò)散到水溶液主體。候玉芳等(2010)和劉艷艷等(2011)以紅蕓豆細(xì)粉為原料，利用反膠束萃取技術(shù)在固-液狀態(tài)下提取植物凝集素。但固-液反膠束萃取具有分離純化倍率低(2 5倍)、特定蛋白選擇性差的局限性，而基于液-液反膠束技術(shù)萃取蕓豆凝集素的技術(shù)尚無(wú)系統(tǒng)性報(bào)道或?qū)＠?，更無(wú)微波輔助的相關(guān)報(bào)道或?qū)＠?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，解決蕓豆凝集素分離純化倍率低、成本高、工藝多、時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，提供一種高效率、易于操作、成本低且安全環(huán)保的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法。本發(fā)明提出的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，為直接從蕓豆凝集素水提液中分離純化凝集素，包括前萃取過(guò)程和反萃取過(guò)程，如

圖1所示，具體步驟如下:
(I)蕓豆凝集素水提液制備:所述蕓豆凝集素水提液為蕓豆磨粉，過(guò)40 100目篩，溶于5 50體積倍水溶液中，10 60°C下微波輔助浸提5 60min，功率為150 800W，浸提后經(jīng)8000 15000rpm、4°C離心10 20min,取上清液；
所述蕓豆種類為紅蕓豆、紅花蕓豆、奶花蕓豆、黑蕓豆、白蕓豆和黃蕓豆等蕓豆品種；所述水溶液為蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，所述緩沖溶液濃度為10 50mM，所述水溶液pH值為6.0 8.0 ;
所述浸提微波輔助條件優(yōu)選溫度25°C，功率325W，時(shí)間30min。(2)反膠束溶液配制:所述反膠束溶液 的組分包括表面活性劑、有機(jī)溶劑和水； 所述表面活性劑為陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑
中的一種，優(yōu)選方案為陰離子型表面活性劑或陽(yáng)離子型表面活性劑，所述的陰離子型表面活性劑優(yōu)選丁二酸-2-乙基己基磺酸鈉(Α0Τ)，所述的陽(yáng)離子型表面活性劑優(yōu)選溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴(CTAB)；
所述表面活性劑溶于有機(jī)溶劑的濃度為15 300mM ；
所述的水分添加量以調(diào)節(jié)W。值(反膠束含水率)在15 35為依據(jù)；
所述有機(jī)溶劑為η-烴類(C6 C1(I)、戊烷、環(huán)己烷、正己烷、辛烷、異辛烷、己醇和丁醇中的一種或兩種或多種，優(yōu)選有機(jī)溶劑為異辛烷，優(yōu)選助溶劑為己醇和丁醇的一種或兩種，優(yōu)選助溶劑添加體積比為5 20 % ；
所述反膠束溶液的配制步驟為:按比例將表面活性劑加入到有機(jī)溶劑中，攪拌至表面活性劑完全溶解，加入一定的量的水，使體系W。值處于適宜范圍內(nèi)，靜置所得透明溶液即為反膠束溶液。(3)前萃取過(guò)程:調(diào)節(jié)蕓豆凝集素水提液pH值和離子強(qiáng)度，將蕓豆凝集素水提液與所述反膠束溶液混合，搖床震蕩混合一定時(shí)間后，1500 5000rpm離心分層,取上層有機(jī)相；
所述蕓豆凝集素水提液PH值在陰離子型表面活性劑反膠束體系中為4.0 6.0，優(yōu)選
5.6 ;在陽(yáng)離子型表面活性劑反膠束體系中為6.0 10.0，優(yōu)選8.0 ；
所述蕓豆凝集素水提液離子強(qiáng)度為20 200mM，鹽離子類型優(yōu)選NaCl，在陰離子型表面活性劑反膠束體系中優(yōu)選80mM，在陰離子型表面活性劑反膠束體系中優(yōu)選IOOmM ；
所述蕓豆凝集素水提液與反膠束溶液混合體積比為蕓豆凝集素水提液體積:反膠束溶液體積=1:1 1:50 ;所述混合時(shí)間為5 40min。(4)反萃取過(guò)程:將所述上層有機(jī)相與具有一定離子強(qiáng)度的反萃緩沖溶液混合，搖床震蕩混合一定時(shí)間后，1500 5000rpm離心分層，取下層水相，經(jīng)除鹽、冷凍干燥，得到分離純化后的蕓豆凝集素。所述反萃緩沖溶液為在陰離子型表面活性劑反膠束體系中優(yōu)選磷酸鹽緩沖溶液或TriS-HCl緩沖溶液，濃度為10 50mM，pH值為6.0 10.0 ;所述反萃緩沖溶液為在陽(yáng)離子型表面活性劑反膠束體系中優(yōu)選磷酸鹽-檸檬酸緩沖溶液，濃度為10 50mM，pH值為 3.5 5.5 ;
所述反萃緩沖溶液離子強(qiáng)度為100 IOOOmM,鹽離子類型優(yōu)選KCl或KBr，優(yōu)選500mM ；所述反萃取緩沖溶液助劑為乙醇、丙醇或丁醇，優(yōu)選丁醇，優(yōu)選反萃取緩沖溶液助劑添加體積比為O 10 % ；
所述上層有機(jī)相與反萃緩沖溶液混合體積比為上層水相:反萃緩沖溶液=1:1 1:50 ；
所述混合時(shí)間為5 40min。本發(fā)明蕓豆凝集素分離純化效率評(píng)價(jià)為:
權(quán)利要求
1.一種微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述方法為直接從蕓豆凝集素水提液中分離純化凝集素，包括前萃取過(guò)程和反萃取過(guò)程，具體步驟如下: (1)蕓豆凝集素水提液制備:蕓豆磨粉，過(guò)40 100目篩，溶于5 50體積倍水溶液中，10 60°C下微波輔助浸提5 60min，功率為150 800W，浸提后經(jīng)8000 15000rpm、4°C離心10 20min,取上清液； (2)反膠束溶液配制:將表面活性劑加入到有機(jī)溶劑中，攪拌至表面活性劑完全溶解，加入一定的量的水，使體系W。值處于15 35范圍內(nèi)，靜置所得透明溶液即為反膠束溶液，其濃度為15 300mM ； (3)前萃取過(guò)程:調(diào)節(jié)蕓豆凝集素水提液pH值為4.0 10.0，離子強(qiáng)度為20 200mM，將蕓豆凝集素水提液與反膠束溶液按照體積比為1:1 1:50的比例混合5 40min后，1500 5000rpm離心分層，取上層有機(jī)相； (4)反萃取過(guò)程:將上述上層有機(jī)相與具有一定離子強(qiáng)度的反萃緩沖溶液按照體積比為1:1 1:50的比例混合5 40min后，1500 5000rpm離心分層,取下層水相,經(jīng)除鹽、冷凍干燥，得到分離純化后的蕓豆凝集素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述蕓豆種類為紅蕓豆、紅花蕓豆、奶花蕓豆、黑蕓豆、白蕓豆或黃蕓豆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述水溶液為蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，水溶液pH值為6.0 8.0，緩沖溶液濃度為10 50mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述表面活性劑為陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為烴類、戊烷、環(huán)己烷、正己烷、辛烷、異辛烷、己醇和丁醇中的一種或幾種的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于在前萃取過(guò)程中，調(diào)節(jié)蕓豆凝集素水提液PH值在陰離子型表面活性劑反膠束體系中為4.0 6.0 ;在陽(yáng)離子型表面活性劑反膠束體系中為6.0 10.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述反萃緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液或磷酸鹽-檸檬酸緩沖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述反萃緩沖溶液在陰離子型表面活性劑反膠束體系中為磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，濃度為10 50mM，pH值為6.0 10.0 ;所述反萃緩沖溶液在陽(yáng)離子型表面活性劑反膠束體系中優(yōu)選磷酸鹽-檸檬酸緩沖溶液，濃度為10 50mM，pH值為3.5 5.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述反萃緩沖溶液離子強(qiáng)度為100 lOOOmM。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述反萃取緩沖溶液助劑為乙醇、丙醇或丁醇，反萃取緩沖溶液助劑添加體積比為O 10 %。
全文摘要
微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，涉及一種凝集素的分離純化方法。為了解決蕓豆凝集素分離純化倍率低、成本高、工藝多、時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，本發(fā)明提出的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法為直接從蕓豆凝集素水提液中分離純化凝集素，包括前萃取過(guò)程和反萃取過(guò)程。本發(fā)明在微波輔助作用下，使蕓豆中水溶性蛋白迅速溶入水提液，大大提高了溶解度，縮短了浸提時(shí)間。本發(fā)明基于液-液萃取原理，提高了萃取的選擇性，可實(shí)現(xiàn)蕓豆凝集素的高效前萃取和反萃取。應(yīng)用反膠束萃取技術(shù)只需前萃取和反萃取兩步即可達(dá)到較好的分離純化效果，步驟簡(jiǎn)單，操作方便，與微波輔助集合可極大縮短前處理時(shí)間，節(jié)約成本。
文檔編號(hào)C07K1/14GK103073627SQ20131005639
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者馬鶯, 何述棟, 李琳, 何勝華, 王超 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)