專利名稱：：以重組的三股螺旋支架為基礎(chǔ)的復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有支架(scaffold)的蛋白質(zhì)復(fù)合物(proteincomplex),且特別涉及具有三股螺旋(triple-helix)支架的蛋白質(zhì)復(fù)合物,其可用于抗腫瘤、感染性疾病與免疫調(diào)節(jié)(immunomodulatory)的用途。
背景技術(shù)：
：基于蛋白質(zhì)的結(jié)合試劑在治療或診斷應(yīng)用上具有多種用途?？贵w就是個(gè)極佳的范例，許多單克隆抗體(rnAbs)(以下簡稱mAbs)已經(jīng)成功地用于治療癌癥、感染性疾病和炎性疾病(inflammatorydiseases)(Adamsetal.,Nat.Biotechnol.2005Sep;23(9):1147-57)。通過重組DNA技術(shù),包括嵌合化(chimerization)和人源化(humanization),增強(qiáng)了鼠科動(dòng)物mAbs的功效與安全性。然而使用CDR(互補(bǔ)決定區(qū)，以下簡稱CDR)移植來進(jìn)行鼠科動(dòng)物mAbs人源化時(shí),通常使其結(jié)合親和力低于鼠科動(dòng)物的對應(yīng)物(counterpart)?？贵w的親和力是抗體作為治療劑成功與否的關(guān)鍵因素。具有高親和力的抗體可使抗體與天然的配體對靶向受體有效地競爭以減少劑量、毒性與花費(fèi)。親和力也影響抗體的藥物動(dòng)力學(xué)，例如在靶向組織與宿主循環(huán)之內(nèi)的分布與分泌。在體內(nèi)有效的單克隆抗體的必要條件是對靶向抗原具有強(qiáng)的親和力且對非相關(guān)蛋白質(zhì)沒有非特異性的結(jié)合?？乖Y(jié)合位點(diǎn)的多聚化(multimerization)已被證實(shí)是增加抗體與抗原結(jié)合的整體強(qiáng)度的有效方式，其中抗體與抗原結(jié)合的整體強(qiáng)度被定義為抗體親和力(antibodyavidity)(功能性親和力(functionalaffinity))(Milleretal.,JImmunol170:4854-4861,2003;Rheinneckeretal.,JImmunol157:2989-2997，1996;Shopes,JTmmunol148:2918-2922,1992;Shufordetal.,Science252:724-727,1991;Wolffetal.,JImmunol148:2469-2474,1992)。在體內(nèi)它們具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性(Liuetal.,IntImmunopharmaco16:791-799,2006;Wolffetal.，CancerRes53:2560-2565，1993)。由于免疫球蛋白G(IgG)(以下簡稱IgG)分子結(jié)構(gòu)的二價(jià)性質(zhì)，常用的和經(jīng)過改造的IgG不能用來結(jié)合同時(shí)結(jié)合兩個(gè)以上的不同抗原。因此需要多價(jià)或多特異性(mult1-specific)的蛋白質(zhì)結(jié)合試劑。在一些實(shí)例中，為了減少促有絲分裂副作用(mitogenicityside-effect),需要通過改造Fe區(qū)來避免效應(yīng)功能(effectorfunction),例如依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)以及依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(complementdependentcytotoxicity,Q)C)。例如，鼠科動(dòng)物抗-人類⑶3單克隆抗體(正純種系(Orthoclone)0KT3,莫羅莫那-⑶3(Muromonab-⑶3))作為以人類T細(xì)胞上的T-細(xì)胞受體/CD3復(fù)合物為靶標(biāo)的強(qiáng)有力免疫抑制試劑。它用來預(yù)防或治療同種異體移植排斥(allograftrejection)已有二十年的時(shí)間(Cosimietal.,NEnglJMed305:308-314,1981;Group,NEnglJMed313:337-342,1985;Kungetal.,Science206:347-349,1979)。然而進(jìn)行這種治療的一個(gè)主要缺點(diǎn)是細(xì)胞因子，例如TNF-α、IL-2和IFN-Y的全身釋放，其導(dǎo)致一系列有害的促有絲分裂作用(mitogeniceffects),包括感冒樣癥狀(flu-likesymptoms)、呼吸窘迫(respiratorydistress)、神經(jīng)癥狀(neurologicalsymptoms)和急性腎小管壞死(acutetubularnecrosis)(Abramowiczetal.,Transplantation47:606-608,1989;Chatenoudetal.,NEnglJMed320:1420-1421，1989;Goldmanetal.,Transplantation50:158-159，1990;Toussaintetal.，Transplantation48:524-526,1989)。因?yàn)?KT3和其它抗_CD3mAbs的促有絲分裂作用依賴于與帶有Fe受體的細(xì)胞(FcR-positivecell)(例如單核細(xì)胞)結(jié)合從而發(fā)生廣泛的TCR/⑶3交聯(lián)(cross-linking)，因此最近有許多研究都希望通過改變與FcR的結(jié)合，來開發(fā)抗-⑶3抗體的非促有絲分裂作用形式(nonmitogenicforms)。由以上說明可知，目前亟需一種具有高親和力、低促有絲分裂作用和體內(nèi)高穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)結(jié)合試劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了具有高親和力、低有絲分裂作用和體內(nèi)高穩(wěn)定性的以蛋白質(zhì)復(fù)合物為基礎(chǔ)的結(jié)合試劑(proteincomplex-basedbindingreagent)。本發(fā)明試劑也可為多價(jià)的(mult1-valenyt)或多特異性的(mult1-specific)。在一方面，本發(fā)明涉及分離的重組蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含第一融合多肽鏈，包含第一支架區(qū)和一該第一支架區(qū)一端框內(nèi)(in-frame)融合的第一異源性(heterologous)區(qū)、第二融合多肽鏈，包含第二支架區(qū)，以及第三融合多肽鏈，包含第三支架區(qū)。上述第一、第二與第三支架區(qū)互相比對(align)以形成三股螺旋卷曲。而且上述第一支架區(qū)域與第一異源性區(qū)框內(nèi)融合且在相同的多肽鏈上。上述異源性區(qū)可包含酶促結(jié)構(gòu)域或熒光蛋白質(zhì)的序列。熒光蛋白質(zhì)的例子包括GFP和dsRed及其變體(variant)。酶促結(jié)構(gòu)域的例子包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase)、螢光素酶(Iuciferase)、β-半乳糖昔酶(β-galactosidase)與β-內(nèi)酸胺酶(β-lactamase)。上述異源性區(qū)可包括與結(jié)合配偶體(bindingpartner)結(jié)合的結(jié)合區(qū)(例如,配體(ligand)結(jié)合區(qū)、配體、受體、親和標(biāo)記物或蛋白聚糖)?！敖Y(jié)合配偶體”意指對于感興趣的靶向化合物的一部分(例如，蛋白質(zhì))具有特異性的、共價(jià)或非共價(jià)的親和性的任何分子。結(jié)合配偶體的例子包括抗原/抗體配對物、蛋白質(zhì)/抑制物配對物、受體/配體配對物(例如，細(xì)胞表面或細(xì)胞核受體/配體配對物)、酶/底物配對物(例如，激酶(kinase)/底物配對物)、凝集素(lectin)/碳水化合物(carbohydrate)配對物、寡聚的(oligomeric)或異源寡聚的(heterooligomeric)蛋白質(zhì)配對物、DNA結(jié)合蛋白/DNA結(jié)合位點(diǎn)的配對物和RNA/蛋白質(zhì)配對物。結(jié)合區(qū)的例子也包括親和標(biāo)記物的序列，例如，組氨酸-標(biāo)記物(histidine-tag)、myc標(biāo)記物(myctag)或血凝素標(biāo)記物(hemagglutintag)。上述第一異源性區(qū)可包含免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)⑶R。因此異源性區(qū)可包含抗體的抗原結(jié)合部分，例如Vh區(qū)和Fab。在實(shí)施例中第一異源性區(qū)包含抗原結(jié)合片段或單鏈抗體的序列，例如對簇命名3(ClusterDesignation3,0)3)(以下簡稱⑶3)或表皮生長因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)(以下簡稱EGFR)特異的序列。上述第一多肽鏈還可包含與上述第一支架區(qū)另一端框內(nèi)融合的第二異源性區(qū)。如上述第一支架區(qū)，第二異源性區(qū)也可包含與結(jié)合配偶體結(jié)合的結(jié)合區(qū)。第一和第二異源性區(qū)可彼此相同或不同。它們可與相同的結(jié)合配偶體或兩個(gè)不同的結(jié)合配偶體結(jié)合。例如，第一異源性區(qū)和第二異源性區(qū)可分別包含第一單鏈抗體和第二單鏈抗體的序列，上述兩抗體分別與CD3與EGFR特異性結(jié)合。在上述蛋白質(zhì)復(fù)合物中，第二融合多肽鏈可以包含與上述第二支架區(qū)一端框內(nèi)融合的第三異源性區(qū)、框內(nèi)融合至第二支架區(qū)另一端的第四異源性區(qū)或框內(nèi)融合至該兩端的兩個(gè)區(qū)。同樣地，前述第三融合多肽鏈可包含框內(nèi)融合至第三支架區(qū)一端的第五異源性區(qū)或框內(nèi)融合至第三支架區(qū)另一端的第六異源性區(qū)或兩者皆有。如同上述第一和第二異源性區(qū)，其它四個(gè)異源性區(qū)中的每一個(gè)均可包含與結(jié)合配偶體結(jié)合的結(jié)合區(qū)。全部六個(gè)異源性區(qū)可彼此相同或不同。因此它們可與1、2、3、4、5或6個(gè)結(jié)合配偶體結(jié)合。換句話說，此蛋白質(zhì)復(fù)合物可以是一、二、三、四、五或六價(jià)。為了讓第一、第二與第三支架區(qū)形成三股螺旋卷曲，三個(gè)支架區(qū)的每一個(gè)均包含一個(gè)或多個(gè)三股螺旋重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列包含下列式子的序列:(Xl-X2_X3)n，其中Xl是甘氨酸(Gly)殘基，X2或X3是任何氨基酸殘基，優(yōu)選為亞氨基酸脯氨酸或羥脯氨酸(hydroxproline);以及η大于或等于5。例如,第一、第二或第三支架區(qū)可包含(GPP)ltl或人類補(bǔ)體Clq、膠原凝集素(collectin)或膠原蛋白多肽鏈的一個(gè)或多個(gè)三股螺旋重復(fù)序列。在實(shí)施例中，前述第一、第二與第三融合多肽基本上相同，彼此具有至少75%(例如在75%與100%之間任何數(shù)量，包括75%與100%)的序列同一性。通過三個(gè)相同的融合多肽形成的復(fù)合物為同源三聚體(homotrimer)。上述三個(gè)融合多肽可以是“功能等同物(functionalequivalent)”。“功能等同物”意指常見多肽的多肽衍生物,例如,具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變、插入(insertion)、缺失(deletion)、截短(truncation)的蛋白質(zhì)、其融合蛋白或上述的組合，并且其基本上保持形成三股螺旋的能力以及異源性區(qū)的活性，例如與配體結(jié)合。異源性多肽、核酸或基因可源自不同物種，或者即使它們來自相同物種，它們也從在最初的形式上經(jīng)過基本的修飾。兩個(gè)融合區(qū)或序列彼此是異源的，即使在天然存在的蛋白質(zhì)或核酸中它們也并不相互連接。例如并非是天然存在的人類迷你膠原蛋白(minicollagen)(第XXI型)、膠原凝集素家族蛋白或補(bǔ)體Iq(Clq)—部分的多肽序列對于人類蛋白質(zhì)的區(qū)而言是異源的。本發(fā)明的另一特色是分離的重組融合多肽，其包括(i)用來形成三股螺旋卷曲的支架區(qū)和(ii)框內(nèi)融合至上述支架區(qū)一端的第一異源性區(qū)或框內(nèi)融合至上述支架區(qū)另一端的第二異源性區(qū)。所述支架區(qū)可以包含一個(gè)或多個(gè)前述三股螺旋重復(fù)序列，例如人類Clq或膠原蛋白多肽鏈的重復(fù)序列。異源性區(qū)可包含上述結(jié)合區(qū)之一并且可以通過許多本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知方法例如曬菌體展示篩選(phagedisplayscreening)來獲得。分離的多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物意指基本上無自然相關(guān)的分子，即由干重計(jì)算具有至少75%(即在75%與100%之間的任何數(shù)量，包括75%與100%)的純度的多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物。純度可用任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法，例如通過柱層析(columnchromatography)>聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)或高效液相層析(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析來測量。本發(fā)明的分離多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物可由自然來源分離或用重組DNA技術(shù)制造。本發(fā)明也涉及分離的核酸，此分離的核酸包含編碼上文所述融合多肽的序列或此序列的互補(bǔ)序列。核酸指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、或DNA或RNA的類似物。DNA或RNA的類似物可由核苷酸類似物合成。此核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA?！胺蛛x的核酸”是結(jié)構(gòu)不與任何天然存在的核酸或任何天然存在的基因組核酸片段相同的核酸。因此該用語包含，例如(a)DNA，其具有天然存在的基因組DNA分子的一部分序列，但不與在生物體的基因組中天然存在于其兩側(cè)的編碼序列鄰接；(b)核酸，其以某種方式被引入載體(vector)或原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的基因組中，由此所形成的分子不與任何天然存在的載體或基因組DNA相同；(c)分離的分子，例如cDNA、基因組片段、通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)所產(chǎn)生的片段或限制性片段(restrictionfragment);和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因(即編碼融合蛋白質(zhì)的基因)的一部分。上述核酸可用來表達(dá)本發(fā)明多肽。為此目的，可將上述核酸連接至適合的調(diào)控序列以產(chǎn)生表達(dá)載體。載體是指核酸分子，其具有將另一核酸轉(zhuǎn)移到其連接處的能力。載體具有自主性復(fù)制(autonomousreplication)或整合入宿主DNA的能力。載體的例子包括質(zhì)粒(plasimd)、噬菌粒(cosmid)或病毒載體。本發(fā)明載體包含核酸，其為適合于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該核酸的形式。優(yōu)選所述載體包含與待表達(dá)的核酸序列可操作連接的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，其?！罢{(diào)控序列”包括啟動(dòng)子(promoter)、增強(qiáng)子(enhancer)和其它表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸化信號(hào)(polyadenylationsignal))。調(diào)控序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)和組織特異性調(diào)控和/或可誘導(dǎo)的序列。對表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可依據(jù)下列因素，如對被轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白質(zhì)表達(dá)的程度與諸如此類?？蓪⒈磉_(dá)載體引入宿主細(xì)胞以制造本發(fā)明多肽。包含上述核酸的宿主細(xì)胞也在本發(fā)明范圍內(nèi)。例子包括大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(例如使用果蜆(Drosophila)S2細(xì)胞或桿狀病毒(baculovirus)細(xì)胞)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如小鼠骨髓瘤(Hiyeloma)NSO細(xì)胞)。請參閱，例如Goeddel,(1990)GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymologyl85,AcademicPress,SanDiego,CA。為了制造本發(fā)明的融合多肽，在一定條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)本發(fā)明核酸所編碼的多肽，并從被培養(yǎng)的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化上述多肽?；蛘?，可在體外轉(zhuǎn)錄與翻譯本發(fā)明的核酸，例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列和T7聚合酶。為了制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物，可一定條件下培養(yǎng)包含分別編碼上述第一、第二與第三融合多肽的第一、第二與第三核酸的宿主細(xì)胞，以表達(dá)上述三個(gè)核酸所編碼的多肽并且在所表達(dá)的多肽之間形成三股螺旋卷曲，以及從培養(yǎng)的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化上述蛋白質(zhì)復(fù)合物。優(yōu)選上述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞(eukaryoticcell),其包含使脯氨酸殘基輕基化(hydroxylate)的酶活性。為了讓本發(fā)明上述和其它的目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉優(yōu)選實(shí)施例，并配合所附圖示，作詳細(xì)說明如下:附圖簡述圖1顯示蛋白質(zhì)復(fù)合物，其具有來自人類XXI型膠原蛋白的迷你膠原蛋白三股螺旋卷曲支架。三股螺旋卷曲的六個(gè)末端分別框內(nèi)融合至六個(gè)具有單鏈抗體(scFv)的\與Vh區(qū)的Fv片段區(qū)。圖2A顯示具有三股螺旋卷曲支架的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其三個(gè)N末端分別與三個(gè)單鏈抗體:0KT3(抗-CD3)、528(抗-EGFR)和erb_scFv(抗-EGFR)框內(nèi)融合，而第2B圖顯示該蛋白質(zhì)復(fù)合物的Western印跡的照片。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果蠅S2細(xì)胞的培養(yǎng)基在非還原狀態(tài)下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后以抗XXI型膠原蛋白(3E2)C末端的單克隆抗體作免疫印跡。T:鍵間雙硫鍵三體；Mt:包含鍵間雙硫鍵三體的單體。圖3顯示具有三股螺旋卷曲支架的蛋白質(zhì)復(fù)合物。上述三股螺旋卷曲支架的三個(gè)N末端與三個(gè)0KT3單鏈抗體框內(nèi)融合；三個(gè)C末端與三個(gè)528單鏈抗體框內(nèi)融合。圖4A和4B顯示不同形式抗體的示意圖:圖4A顯示膠原蛋白支架抗體:scFv-Col(左圖)，其包含氨基末端scFv、人類IgG鉸鏈(hinge)區(qū)、膠原蛋白區(qū)(GPP)lt^XXI型膠原蛋白羧基末端NCl區(qū)；NSro-scFV(右圖)，其包含表面活性蛋白D(surfactantproteinD,SPD)、在羧基末端的膠原凝集素和scFv。圖4B由左到右分別顯示免疫球蛋白G(IgG)、嵌合的(scFv-Fc)和單鏈抗體(scFv)，以及它們各自的大致分子量?；疑珔^(qū)顯示Vh與'片段；虛線:鏈間雙硫鍵。主要組件符號(hào)說明101迷你膠原蛋白401鉸鏈區(qū)403(GPP)10的膠原蛋白區(qū)405膠原蛋白XXI型的NCl區(qū)或其它靶向的結(jié)合區(qū)407膠原凝集素的N端區(qū)409膠原凝集素的膠原蛋白樣(collagen-like)區(qū)411膠原凝集素的α螺旋頸部區(qū)域?qū)嵤┓绞奖景l(fā)明是因(至少一部分)意外發(fā)現(xiàn)與人類三股螺旋卷曲支架區(qū)域框內(nèi)融合的異源性蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域保留了結(jié)合活性，并且所得的的融合多肽形成了三股螺旋卷曲。圖1顯示了本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物的例子。如該圖所示，三股螺旋卷曲蛋白質(zhì)復(fù)合物的六個(gè)末端分別與六個(gè)異源性蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)，即單鏈抗體(scFv)的Fv片段框內(nèi)融合。本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物較常用抗體有許多優(yōu)點(diǎn)。一方面而言，當(dāng)上述六個(gè)區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)彼此相同時(shí)，蛋白質(zhì)復(fù)合物可具有2-6個(gè)對結(jié)合配偶體(例如抗原)特異的結(jié)合區(qū)，而常用抗體只具有兩個(gè)這種區(qū)。換句話說，不像常用抗體對于抗原只有二價(jià)，此蛋白質(zhì)復(fù)合物可以是二、三、四、五或六價(jià)的。因而，可將其制造為具有各種比常用抗體高的親和力。因?yàn)檩^高的親和力，所以比起常用抗體而言，它比常用抗體需要較少量的蛋白質(zhì)復(fù)合物及較短的反應(yīng)時(shí)間來達(dá)到期望的目標(biāo)，例如療效(therapeuticeffects),由此降低治療成本并減少副作用(例如，非期望的免疫反應(yīng))。在另一方面，當(dāng)上述六個(gè)區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)互相不同時(shí)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以具有2-6個(gè)對2-6個(gè)不同結(jié)合配偶體特異的結(jié)合區(qū)。將不同特異性的結(jié)合配偶體組合成為一個(gè)單元，具有將多種結(jié)合配偶體集合在一起的能力，因此用在治療、組織重構(gòu)(tissuereconstruction)和在納米水平的活性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(activeproteinmachinery)(例如多亞基酶)的裝配上具有令人滿意的應(yīng)用。為了在人體內(nèi)使用，本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物優(yōu)選為人源(humanorigin)的。例如，其可包含人源化單鏈抗體序列，該序列與人源的螺旋卷曲支架的，如人類Clq、膠原凝集素家族蛋白質(zhì)或膠原蛋白多肽鏈的螺旋卷曲支架框內(nèi)融合。因?yàn)槿祟怌lq與膠原蛋白兩者在血液中都非常穩(wěn)定，所以此蛋白質(zhì)復(fù)合物比起一般治療型鼠源抗體而言更加穩(wěn)定。膠原蛋白是在哺乳類動(dòng)物中存在的最大量的蛋白質(zhì)，其為包含重復(fù)的三聯(lián)體的序列甘氨酸(Gly)-X1-X2的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellularmatrixprotein),這種三聯(lián)體的出現(xiàn)允許三條膠原蛋白多肽鏈U-鏈)折疊成三股螺旋構(gòu)象。在三聯(lián)體的序列甘氨酸-X1-X2中，X2位置的氨基酸常為脯氨酸，為了穩(wěn)定膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，常通過膠原蛋白多肽鏈的翻譯后修飾將脯氨酸4-輕基化(hydroxylated)。缺少脯氨酸輕基化,膠原蛋白的必需的三股螺旋構(gòu)象在低于生理溫度(physiologicaltemperature)時(shí)是熱不穩(wěn)定的(thermallyunstable)(BergandProckop,BiochemBiophysResCommun52:115-120,1973;Rosenbloometal.,ArchBiochemBiophysl58:478-484,1973)。許多具有膠原蛋白三股螺旋區(qū)(collagenousdomain)的膠原蛋白樣蛋白質(zhì)出現(xiàn)于人類血清中，在防護(hù)傳染性生物上扮演先天性免疫系統(tǒng)(innateimmunesystem)的角色。這些包括補(bǔ)體蛋白質(zhì)Clq、膠原凝集素家族蛋白質(zhì)-甘露糖結(jié)合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)、表面活性蛋白(surfactant而這些膠原蛋白樣蛋白質(zhì)共同的結(jié)構(gòu)特征為由膠原蛋白區(qū)的三股螺旋集合構(gòu)成的多聚化(multimeric)蛋白質(zhì)亞基(unit),且三聚體分子互相堆集或鏈間形成二硫鍵交聯(lián)。因此，這些“防御膠原蛋白”分子的結(jié)合區(qū)的功能性親和力通過多聚化(multimerization)而大幅度增加。本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物或多肽可以通過重組技術(shù)獲得?？蓪⒕幋a此復(fù)合物的多肽的核酸引入合適的宿主細(xì)胞中，并且在一定條件下表達(dá)由前述核酸編碼的多肽，以允許表達(dá)該多肽以及在多肽間形成三股螺旋卷曲。為了促進(jìn)三股螺旋卷曲支架的形成，可在宿主細(xì)胞中共表達(dá)(co-express)脯氨酰4_輕化酶(prolyl4_hydroxylase，P4HA),其為在膠原蛋白的生物合成中的關(guān)鍵酶。異源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域可包含抗體或其片段(例如其抗原結(jié)合片段)。在此處所使用“抗體”意指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原結(jié)合部分。其指包括最少一個(gè)優(yōu)選兩個(gè)重(heavy，H)鏈可變區(qū)(Vh)，以及至少一個(gè)優(yōu)選兩個(gè)輕(light，L)鏈可變區(qū)(')的蛋白質(zhì)?？蓪h和\區(qū)更進(jìn)一步細(xì)分為超變區(qū)和較保守的散布區(qū)，前者稱為“互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion)”“(CDR)”區(qū)，后者稱為框架區(qū)(frameworkregion)。已經(jīng)明確定義互補(bǔ)決定區(qū)和框架區(qū)的范圍(參閱Kabatetal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationN0.91-3242，andChothiaetal.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。每個(gè)Vh和Vl由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR組成，從氨基末端到羧基末端的排列順序?yàn)?FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體還可包含重鏈和輕鏈的恒定區(qū)(constantregion)，由此分別形成重鏈和輕鏈的免疫球蛋白鏈。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區(qū)包含結(jié)構(gòu)域CL。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原反應(yīng)的結(jié)合區(qū)?？贵w的恒定區(qū)通常介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞(effectorcell))和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一種組分Clq的結(jié)合。此處使用的“免疫球蛋白”指由一個(gè)或多個(gè)多肽組成、基本上由免疫球蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)。已知的人類免疫球蛋白基因包括K、λ、a(IgAl和IgA2)、y(IgGUIgG2、IgG3和IgG4)、δ和μ的恒定區(qū)基因和無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長免疫球蛋白的“輕鏈”(約25KDa或214個(gè)氨基酸)由在NH2末端的可變區(qū)基因(約110個(gè)氨基酸)和在COOH末端的K或λ恒定區(qū)基因來編碼。而全長免疫球蛋白的“重鏈”(約50KDa或446個(gè)氨基酸)相似地由可變區(qū)基因(約116個(gè)氨基酸)，及其它上述恒定區(qū)基因，例如Y(編碼約330個(gè)氨基酸)來編碼?？贵w的“抗原結(jié)合片段”(或“抗體部分”或“片段”)指全長抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其保留特異性結(jié)合至抗原(例如EGFR或CD3多肽或其片段)的能力?？贵w的抗原結(jié)合片段包括，但不限于:(i)Fab片段，由VL,VH,Cl和Chi結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，包含由二硫鍵在其鉸鏈區(qū)(hingeregion)連結(jié)兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂(singlearm)的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)dAb片段(Wardetal.,(1989)Nature341:544-546),其包含Vh結(jié)構(gòu)域；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及(vii)'或Vh結(jié)構(gòu)域。更進(jìn)一步，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域\和Vh是由各自的基因編碼的，但使用重組方法可將它們連接，通過人工接頭可將它們制備成單鏈蛋白質(zhì)，其中\(zhòng)與Vh區(qū)配對形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(ScFv)，參閱，例如Birdetal.(1988)Science242:423-426;andHustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。此種單鏈抗體也包括在抗體的“抗原結(jié)合片段”范圍內(nèi)。這些抗體片段可用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常見的技術(shù)獲得，并以與對完整抗體相同的方式來篩選應(yīng)用。適當(dāng)?shù)目贵w可以是單克隆抗體。在其它實(shí)施例中，抗體可以重組制備，例如由噬菌體展示或組合方法(combinatorialmethod)來制備。產(chǎn)生抗體的曬菌體展示和組合方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的(參閱，例如Ladneretal.U.S.PatentN0.5,223,409;Kangetal.1nternationalPublicationN0.W092/18619;Doweretal.1nternationalPublicationN0.W091/17271;Winteretal.1nternationalPublicationW092/20791;Marklandetal.1nternationalPublicationN0.W092/15679;Breitlingetal.1nternationalPublicationW093/01288;McCaffertyetal.1nternationalPublicationN0.W092/01047;Garrardetal.1nternationalPublicationN0.W092/09690;Ladneretal.1nternationalPublicationN0.W090/02809;Fuchsetal.(1991)Bio/Techno1gy9:1370-1372;Hayetal.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;Griffthsetal.(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal.(1992)JMolBiol226:889-896;Clacksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)PNAS89:3576-3580;Garradetal.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboometal.(1991)NucAcidResl9:4133-4137;和Barbasetal.(1991)PNAS88:7978-7982)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體是完全人類抗體(例如，在小鼠中制造的抗體，此小鼠經(jīng)基因工程改造來制造源自人類免疫球蛋白序列的抗體)或非人類抗體，例如嚙齒類動(dòng)物(小鼠或大鼠)、山羊、靈長類動(dòng)物(例如猴子)、駱駝(cameloid)的抗體。非人類抗體優(yōu)選為嚙齒類動(dòng)物(小鼠或大鼠)的抗體。制造嚙齒類動(dòng)物抗體的方法已為本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知?？梢酝ㄟ^使用攜帶人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來制造人類單克隆抗體，而不是使用小鼠的系統(tǒng)。使用感興趣的抗原免疫的這些轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞(splenocytes)被用來制造雜交瘤(hybridoma),其分泌對人類蛋白質(zhì)的表位(epitope)具有特異性親和力的人類mAbs(參閱，例如Woodetal.1nternationalApplicationW091/00906,Kucherlapatietal.PCTpublicationW091/10741;Lonbergetal.1nternationalApplicationW092/03918;Kayetal.1nternationalApplication92/03917;Lonberg,N.etal.1994Nature368:856-859;Green,L.L.etal.1994NatureGenet.7:13-21;Morrisonetal.1994Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855;Bruggemanetal.1993YearTmmunol7:33-40;Tuaillonetal.1993PNAS90:3720-3724;Bruggemanetal.1991EurJImmunol21:1323-1326)?？贵w的變異區(qū)或其一部分，例如CDR，可在非人類生物(例如，大鼠或小鼠)中產(chǎn)生。可使用嵌合的、CDR移植的和人源化的抗體。在本發(fā)明中包括在非人類生物(例如，大鼠或小鼠)中產(chǎn)生并經(jīng)過修飾(例如在可變框架(variableframework)或恒定區(qū))以降低在人類的抗原性(antigenicity)的抗體?？捎帽景l(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的重組DNA技術(shù)來制造嵌合抗體(chimericantibody)。例如用限制性酶消化編碼鼠(或其它物種)的單克隆抗體分子的Fe恒定區(qū)基因，將編碼鼠Fe的區(qū)域移除，然后取代為編碼人類Fe恒定區(qū)的基因的等同部分(見，Robinsonetal.,InternationalPatentPublicationPCT/US86/02269;Akira,etal.,EuropeanPatentAppIication184，187;Taniguchi,M.,EuropeanPatentAppIication171，496;Morrisonetal.,EuropeanPatentApplicationl73,494;Neubergeretal.,InternationalApplicationW086/01533;Cabillyetal.U.S.PatentN0.4，816，567;CabiIIyetal.,EuropeanPatentApplicationl25,023;Betteretal.(1988Science240:1041-1043);Liuetal.(1987)PNAS84:3439-3443;Liuetal.,1987,J.1mmunol.139:3521-3526;Sunetal.(1987)PNAS84:214-218;Nishimuraetal.,1987,Cane.Res.47:999-1005;Woodetal.etal(1985)Nature314:446-449;andShawetal.,1988,J.NatlCancerInst.80:1553-1559)。人源化或⑶R移植的抗體中(免疫球蛋白的重或輕鏈的)至少一個(gè)或兩個(gè)但一般為全部三個(gè)接受者(recipient)⑶R被供者⑶R取代。抗體可被非人類⑶R的至少一部分取代或只有CDR中的一些被非人類的CDR取代。只需取代結(jié)合人源化抗體或人源化抗體片段所需數(shù)量的CDR。優(yōu)選的供者為嚙齒類動(dòng)物抗體，例如大鼠或小鼠的抗體，以及接受者為人類框架(framework)或人類共有框架(consensusframework)。一般而言，提供⑶R的免疫球蛋白稱為“供者”以及提供框架的免疫球蛋白稱為“接受者(acceptor)”。在一個(gè)實(shí)施例中，供者免疫球蛋白是非人類(例如大鼠)的。接受者框架是天然存在(例如人類)或共有的框架，或有約85%或更高，優(yōu)選90%、95%、99%或更高同一性的序列。此處所使用的“共有序列(consensussequence)”指在相關(guān)序列的家族中最常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(參閱，例如Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,ffeinheim,Germanyl987)。在蛋白質(zhì)家族中，在共有序列中的每個(gè)位置被此家族在那個(gè)位置最常出現(xiàn)的氨基酸所占據(jù)。若兩個(gè)氨基酸出現(xiàn)的頻率相同，兩者中的任一個(gè)都可包含在共有序列中?！肮灿锌蚣堋敝冈诠灿忻庖咔虻鞍仔蛄兄械目蚣軈^(qū)。可通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法將抗體進(jìn)行人源化。通過取代不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)序列為來自人類Fv可變區(qū)的等同序列，可產(chǎn)生人源化抗體。用于產(chǎn)生人源化抗體的常用方法由Morrison,S.L.，1985，Science229:1202-1207、Oietal.，1986，BioTechniques4:214、Queenetal.US5,585，089、US5,693，761和US5，693，762提供，其內(nèi)容引入本文作為參考。那些方法包括分離、操縱和表達(dá)核酸序列，其中所述核酸序列編碼來自至少一條重鏈或輕鏈之一的免疫球蛋白Fv可變區(qū)的全部或一部分。此種核酸的來源在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，以及例如可從雜交瘤中獲得，其中此雜交瘤產(chǎn)生抗感興趣的多肽或其片段的抗體?？煽寺?clone)重組DNA至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，其中此重組DNA編碼人源化抗體或其片段。也可將人源化抗體融合至支架，在人源化抗體中，特定的氨基酸已被取代、缺失或增加。優(yōu)選的人源化抗體在框架區(qū)中具有氨基酸取代，如為了改善與抗原的結(jié)合。例如人源化抗體具有框架殘基，其與供者的框架殘基或除了接受者的框架殘基之外的其它氨基酸相同。為了產(chǎn)生此種抗體，人源化免疫球蛋白鏈的經(jīng)過選擇的少量受者框架殘基可用對應(yīng)的供者氨基酸取代。優(yōu)選的取代位置包括鄰接于CDR或能與CDR相互作用的氨基酸殘基。從供者選擇氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)描述于US5，585，089中，其內(nèi)容引入本文作為參考。將抗體人源化的其它技術(shù)描述在Padlanetal.EP519596A1中。本發(fā)明也包括核酸，其編碼形成本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物的融合多肽?？蓮氖删w展示文庫篩選出或從表達(dá)上述適合的抗體或抗體衍生物的細(xì)胞株中分離(例如RT-PCR)核酸。可將核酸與表達(dá)載體功能性連接。可使用經(jīng)核酸或載體轉(zhuǎn)化(transformed)的細(xì)胞來制備本發(fā)明的融合多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物。用以制備抗體的有用的細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO或淋巴細(xì)胞(lymphaticcell))?？蓪⒈景l(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物和有療效的部分(therapeuticmoiety)結(jié)合，所述有療效的部分例如細(xì)胞毒素(cytotoxin)、治療劑(therapeuticagent)或放射性離子(radioactiveion)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑(cytotoxicagent)包括任何對細(xì)胞有害的試劑，例子包括紫杉醇(taxol)、細(xì)胞松弛素B(cytochalasinB)、短桿菌素D(gramicidinD)、溴化乙淀(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、鬼臼乙叉式(etoposide)、鬼臼噻吩式(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春喊(vinblastine)、秋水仙喊(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)>柔紅霉素(daunorubicin)、二輕基蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycinD)、l_脫氫睪酮(Ι-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、普蔡洛爾(propranolol)、嘿呤霉素(puromycin)、美登素(maytansinoids)，例如，美登醇(maytansinol)(見，USPatentN0.5,208,020)、CC-1065(見USPatentNos.5，475，092，5，585，499，5，846，545)與其類似物或同源物。治療試劑包括但不限于，抗代謝劑(antimetabolites)(例如,氨甲蝶呤(methotrexate)、6_巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6_硫鳥嘌呤核苷(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿卩密唳氨烯咪胺(5_fluorouracildecarbazine))、燒化劑(alkylatingagents)(例如，氮芥(mechlorethamine)、硫噴妥苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、CC-1065、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)與洛莫司汀(lomustine,CCNU)、eyelothosphamide>白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈服菌素(streptozotocin)、絲裂霉素C(mitomycinC)與順-二氯二氨鉬(cis-dichlorodiamineplatinum(II)(DDP)順鉬(cisplatin)))、蒽環(huán)類(anthracyclines)(例如，柔紅霉素(daunorubicin)(之前稱為道諾霉素(daunomycin)))、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(之前稱為放線菌素)、博來霉素(bleomycin)、光神霉素與氨茴霉素(anthramycin,AMC))以及抗有絲分裂劑(ant1-mitoticagents)(例如，長春新堿)、長春堿、紫杉醇與美登素。放射性離子包括但不限于碘(iodine)、乾(yttrium)與鐠(praseodymium)?？衫镁Y合物(conjugate)來修飾已知的生物反應(yīng)，藥物部分(drugmoiety)不應(yīng)限于常用的化療試劑。例如，藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括，例如毒素，如相思豆毒素(abrin)、蓖麻蛋白A(ricinA)、假單胞菌外毒素(pseudomonasexotoxin)或白喉毒素(diphtheriatoxin);蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor)、α-干擾素(認(rèn)-1nterferon)、β-干擾素(β-1nterferon)、神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor)、血小板衍生的生長因子(plateletderivedgrowthfactor)、組織纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator);或生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(biologicalresponsemodifier),例如，淋巴因子(Iymphokines)、白細(xì)胞介素_1(interleukin-1,“IL-1”)、白細(xì)胞介素_2(interleukin-2,“IL-2”)、白細(xì)胞介素_6(interleukin-6,“11^-6”)、粒細(xì)胞-巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,“GM-CSF，”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,“G-CSF”)或其它生長因子。前述蛋白質(zhì)與綴合物依據(jù)其異源性結(jié)合區(qū)的特異性，可用來治療多種紊亂(disorder)，包括癌癥、炎性疾病(inflammationdisease)、代謝疾病(metabolismdisease)、纖維化疾病(brosisdisease)和心血管疾病(cardiovasculardisease)。因此本發(fā)明以治療此種紊亂為特征，例如，通過把有效量(effectiveamount)的本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物施用給需要的受試者?？纱_定被治療的患者具有以紊亂為特征的情況或是處于此風(fēng)險(xiǎn)中。此方法可單獨(dú)進(jìn)行或與其它藥物或治療聯(lián)合。因?yàn)楸景l(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物具有多特異性的特點(diǎn)，可以用其來連接在一般情況下并不互相結(jié)合的分子或細(xì)胞。此特征特別對于基于細(xì)胞的療法(cell-basedtherapy)有用。在一個(gè)實(shí)施例中，蛋白質(zhì)復(fù)合物中的異源性區(qū)通過與位于細(xì)胞毒性細(xì)胞(cytotoxiccell)上的效應(yīng)抗原(effectorantigen)特異性結(jié)合而能夠活化細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTcell)),而其它異源性區(qū)則特異性結(jié)合至位于將被破壞的病原體細(xì)胞(pathogencell)或惡性細(xì)胞(malignantcell)上的祀向抗原。用這種方式，蛋白質(zhì)復(fù)合物可用來治療因病原體或有害細(xì)胞所導(dǎo)致的紊亂。經(jīng)由本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物與細(xì)胞毒素性細(xì)胞上作為效應(yīng)抗原的CD3抗原結(jié)合，可活化細(xì)胞毒性細(xì)胞。其它淋巴樣細(xì)胞(lymphoidcell)相關(guān)的效應(yīng)抗原包括人類⑶16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、⑶2抗原、⑶28抗原、⑶25抗原、⑶64抗原和⑶89抗原。與這些效應(yīng)抗原結(jié)合會(huì)活化效應(yīng)細(xì)胞，例如，單核細(xì)胞(monocyte)、嗜中性粒細(xì)胞(neutrophilicgranulocyte)和樹突細(xì)胞(dendriticcell)。這些被活化的細(xì)胞之后會(huì)給祀向細(xì)胞施加細(xì)胞毒性或細(xì)胞凋亡作用(apoptoticeffect)。靶向抗原是獨(dú)特地表達(dá)在與疾病情況相關(guān)的靶向細(xì)胞上的抗原，但是它在細(xì)胞健康的情況下不表達(dá)或表達(dá)程度低或是不可檢測。這些與惡性細(xì)胞相關(guān)的靶向抗原的例子包括EpCAM、CCR5、CD19、HER_2neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA,CEA,MUC-1(粘液素(mucin))、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、MUC7、.beta.hCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神經(jīng)節(jié)糖苷CD3(ganglioside⑶3)、9_0_乙酰_GD3、GM2、GloboH、巖藻糖基GMUPolySA、GD2、碳酸野酶(CarboanhydraseIX(MN/CAIX))、CD44v6、SonicHedgehog(Shh)、Wue_l、衆(zhòng)細(xì)胞抗原(PlasmaCellAntigen)、膜結(jié)合(membrane-bound)IgE、黑色素瘤硫酸蛋白多糖(MelanomaChondroitinSulfateProteoglycan(MCSP))、CCR8、TNF-α前體、STEAP、間皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺生殖細(xì)胞抗原(ProstateStemCellAntigen(PSCA))、Ly-6;橋粒核心糖蛋白4(desmoglein4)、E_I丐粘附素新表位(E-cadherinneoepitope)、胎兒乙酸膽喊受體(FetalAcetylcholineReceptor)、CD25、CA19-9標(biāo)志(marker)、CA-125標(biāo)志和第II型繆勒管抑制物質(zhì)受體(MuellerianInhibitorySubstance(MIS)ReceptortypeII)、sTn(唾液酸化Tn抗原(sialylatedTnantigen;TAG-72))、FAP(纖維母細(xì)胞活化抗原(fibroblastactivationantigen))、內(nèi)皮唾(液)酸蛋白(endosialin)、EGFRv111,LG,SAS和CD63?！爸委煛倍x為將組合物施用于患者，其目的為治愈、減輕、緩和、治療、預(yù)防或改善紊亂、紊亂的癥狀、繼發(fā)于紊亂的疾病狀態(tài)或易患疾病的誘因(predisposition)?！坝行Я俊睘槟軌蚶缟鲜鲈诒恢委煹氖茉囌弋a(chǎn)生醫(yī)療滿意結(jié)果的組合物的量。在體內(nèi)途徑，將有療效的組合物(例如，包含本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物的組合物)施用于受試者。一般而言，將復(fù)合物懸浮于可藥用的(pharmaceuticallyacceptable)載體(carrier)(例如生理鹽水)中，將其以口服、靜脈內(nèi)(intravenous)輸注、或皮下(subcutaneous)、肌肉內(nèi)(intramuscular)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、腹腔內(nèi)(intraperitoneal)、直腸內(nèi)(intrarectal)、陰道內(nèi)(intravaginal)、鼻內(nèi)(intranasal)、胃內(nèi)(intragastrical)、氣管內(nèi)(intratracheal)或肺內(nèi)(intrapulmonary)注射或植入的方式施用。所需劑量取決于所選擇的施用途徑；配制劑的性質(zhì)；受試者疾病的性質(zhì)；受試者的體型、體重、表面積、年齡和性別；所施用的其它藥物和主治醫(yī)師的決定。適當(dāng)?shù)膭┝糠秶?.01-100.0mg/kg。基于現(xiàn)有組合物(composition)的多樣化和多種施用途徑有不同功效的觀點(diǎn)，預(yù)期劑量需求是多樣性的。例如，預(yù)期口服施用比靜脈內(nèi)注射施用需要較高的劑量。如本發(fā)明領(lǐng)域公知的，可利用標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序(standardempiricalroutines)來調(diào)整這些劑量水平的多樣性達(dá)到最佳。通過將組合物包裹(encapsulate)在常用的適當(dāng)載體(vehicle)(例如多聚微粒(polymericmicroparticles)或植入裝置(implantabledevices))中，可提高傳送的效率，特別是對于口服傳送而言。本發(fā)明的范圍也包括藥學(xué)組合物，其包含可藥用的載體和有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物。可使用此藥學(xué)組合物來治療上述的紊亂?？伤幱玫妮d體包括溶劑、分散介質(zhì)(dispersionmedium)、包衣(coating)、抗菌劑與抗真菌劑、和等滲透壓劑與延遲吸收(absorptiondelaying)劑?？衫贸Ｓ梅椒▽⑺鼋M合物配制成用于不同施用方式的劑型(dosageform)。可在體內(nèi)和體外評價(jià)本發(fā)明組合物的功效。對于在體內(nèi)的研究，可注射組合物到動(dòng)物(例如，小鼠模型)，以及之后記錄其治療功效。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，可確定適當(dāng)?shù)膭┝糠秶褪┯梅绞?。下面的?shí)施例僅僅是為了舉例說明的目的，絕不是為了從任何角度限制本發(fā)明的其它公開。無需更多細(xì)節(jié)，可以相信本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)本文的公開，最大程度地實(shí)施本發(fā)明。所有引用的出版物都全文引入本文作為參考。實(shí)施例1對M13卩遼菌體展示文庫(phagedisplaylibrary)進(jìn)行篩選以鑒定與EGFR特異性結(jié)合的人類單鏈可變片段(scFv)。鑒定一些克隆(clone)。在通過Western印跡和酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-linkedimmunoassay,ELISA)(以下簡稱ELISA)確認(rèn)后，選出一個(gè)克隆erb_scFv作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。獲得編碼erb_scFv的cDNA,通過標(biāo)準(zhǔn)方法將其連接到表達(dá)載體。erb_SCFv的多肽序列為序列識(shí)別號(hào):1(SEQIDNO:1)，編碼該序列的核苷酸序列為序列識(shí)別號(hào):2(SEQIDNO:2)SEQIDNO:1MetAlaGluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyrAlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerAspIIeGlyAlaSerGlySerAlaThrSerTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIIeSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysSerThrThrThrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlYGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlleThrCysArgAlaSerGlnSerlleSerSerTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSerAlaLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlleSerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAlaAspTyrProThrThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIIeLysArgSEQIDNO:2ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGATATTGGTGCTTCTGGTTCTGCTACATCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTACTACTACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTATGCTGATTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG之后將表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞系果蠅S2(DrosophilaS2)中表達(dá)。純化抗-EGFR的erb_scFv并進(jìn)行Western印跡分析和ELISA，來確認(rèn)其抗EGFR的特異性。進(jìn)行RT-PCR來從雜交瘤細(xì)胞系中獲得cDNA，所述cDNA編碼抗-CD3單克隆抗體0KT3的重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(Vl)。之后，將兩個(gè)cDNA連接以產(chǎn)生編碼0KT3的Vh-'融合蛋白質(zhì)的融合序列。此融合蛋白質(zhì)的序列為序列識(shí)別號(hào):3(SEQIDN0:3)，編碼該序列的cDNA序列為序列識(shí)別號(hào):4(SEQIDNO:4)SEQIDNO:3ValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrArgTyrThrMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIIeGlyTyrlleAsnProSerArgGlyTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrThrAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAlaArgTyrTyrAspAspHisTyrCysLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlYGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleValLeuThrGlnSerProAlalleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysSerGlyThrSerProLysArgTrpIleTyrAspThrSerLysLeuAlaSerGlyValProAlaHisPheArgGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlleSerGlyMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTrpSerSerAsnProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeuLysArgSEQIDNO:4GTCCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTAACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGA`進(jìn)行相同的步驟來獲得編碼抗-EGFR單克隆抗體528的Vh和\的cDNA，和編碼抗-EGFR的抗體528的Vh-V1融合蛋白質(zhì)的融合序列。單克隆抗體528和EGFR在細(xì)胞膜上，例如在人的表皮樣癌(epidermoidcarcinoma)A431細(xì)胞上結(jié)合。528單鏈抗體的多肽序列為序列識(shí)別號(hào):5(SEQIDN0:5)，編碼該序列的cDNA序列為序列識(shí)別號(hào):6(SEQIDN0:6)oSEQIDNO:5ValLysLeuGlnGluSerGlySerGluMetAlaArgProGlyAlaSerValLysLeuProCysLysAlaSerGlyAspThrPheThrSerTyrTrpMetHisTrpValLysGlnArgHisGlyHisGlyProGluTrpIIeGlyAsnlleTyrProGlySerGlyGlyThrAsnTyrAlaGluLysPheLysAsnLysValThrLeuThrValAspArgSerSerArgThrValTyrMetHisLeuSerArgLeuThrSerGluAspPheAlaValTyrTyrCysThrArgSerGlyGlyProTyrPhePheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetThrGlnThrProLeuSerLeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerIIeSerCysArgSerSerGlnAsnlIeValHisAsnAsnGlyIIeThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGlnArgProGlyGlnSerProLysLeuLeuIIeTyrLysValSerAspArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIIeSerArgValGluAIaGluAspLeuGlyIIeTyrTyrCysPheGlnGlySerHisHisProProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluSEQIDNO:6GTCAAGCTGCAGGAGTCAGGGTCTGAGATGGCGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGCCCTGCAAGGCTTCTGGCGACACATTCACCAGTTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCATGGACATGGCCCTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCAGGTAGTGGTGGTACTAACTACGCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGTCACTCTGACTGTAGACAGGTCCTCCCGCACAGTCTACATGCACCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTTTGCGGTCTATTATTGTACAAGATCGGGGGGTCCCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATAATAATGGAATCACCTATTTAGAATGGTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTAGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATCATCCTCCCACGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAA編碼上述抗-EGFRscFv03,0KT3VH-VL和抗-EGFR抗體528Vh_Vl的cDNA分別與人類迷你膠原蛋白XXICDNA框內(nèi)融合，所述cDNA在5’末端包含短鉸鏈序列并在3’末端包含組氨酸標(biāo)簽序列。人類迷你膠原蛋白XXI的多肽及其cDNA序列分別為序列識(shí)別號(hào):7(SEQIDNO:7)和序列識(shí)別號(hào):8(SEQIDNO:8)SEQIDNO:7GlyGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIIeProGlyProProGlyProIleGlyProGluGlyProArgGlyLeuProGlyLeuProGlyArgAspGlyValProGlyLeuValGlyValProGlyArgProGlyValArgGlyLeuLysGlyLeuProGlyArgAsnGlyGluLysGlySerGlnGlyPheGlyTyrProGlyGluGlnGlyProProGlyProProGlyProGluGlyProProGlylleSerLysGluGlyProProGlyAspProGlyLeuProGlyLysAspGlyAspHisGlyLysProGlyIIeGlnGlyGlnProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerValIIeAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSerLeuAspAspSerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGly(注:Pro=脯氨酸或羥基脯氨酸殘基)SEQIDNO:8GGCGGCCGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCGATAGGCCCAGAGGGTCCCAGAGGATTACCTGGTTTGCCAGGAAGAGATGGTGTTCCTGGATTAGTGGGTGTCCCTGGACGTCCAGGTGTCAGAGGATTAAAAGGCCTACCAGGAAGAAATGGGGAAAAAGGGAGCCAAGGGTTTGGGTATCCTGGAGAACAAGGTCCTCCTGGTCCCCCAGGTCCAGAGGGCCCTCCTGGAATAAGCAAAGAAGGTCCTCCAGGAGACCCAGGTCTCCCTGGCAAAGATGGAGACCATGGAAAACCTGGAATCCAAGGGCAACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTATAGTCTAGACGACAGCAGCCATCATCACCATCACCATAGCAGCGGC將產(chǎn)生的三個(gè)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染(co-transfected)到果蜆S2(DrosophilaS2)細(xì)胞中。在殺稻瘟菌素(blasticidin)存在時(shí)培養(yǎng)這些細(xì)胞，以篩選出抗殺稻瘟菌素的細(xì)胞。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并通過Western印跡和ELISA來篩選出有抗EGFR和⑶3的活性的抗體。發(fā)現(xiàn)一些克隆的細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)三股螺旋復(fù)合物。這些三股螺旋復(fù)合物，如人類迷你膠原蛋白XXI是抵抗熱與胃蛋白酶(P印sin)的。更重要的是，它們特異地與EGFR和⑶3結(jié)合。實(shí)施例2在此實(shí)施例中，生成三個(gè)融合多肽:0KT3_scFv_Col、erb_scFv_Col和erb_NSPD-scFvo噬菌體文庫的篩選通過篩選人類單折疊的(singlefold)scFv卩遼菌體展示文庫(TomlinsonI+J;由1.M.TomlinsonandG.Winter,MRCLaboratoryofMolecularBiology,Cambridge,UK友情提供)，來分離erb曬菌粒(phagemid),該erb曬菌粒包含結(jié)合表皮生長因子受體胞夕卜區(qū)(epidermalgrowthfactorreceptorextracellulardomain,EGFR-ECD)的可變區(qū)片段(variablefragment)(scFv)。使用免疫管(immunotube)(Maxisorp;Nunc,Roskilde,Denmark)來進(jìn)行篩選,其中所述免疫管用10μg經(jīng)純化的重組EGF受體(EGFR-ECD;ResearchDiagnostics,Inc.)的胞外區(qū)包被(coated)。根據(jù)制造商使用手冊進(jìn)行封閉(blocking)、淘選(panning)、清洗、洗脫(elution)和被洗脫的卩遼菌粒的再擴(kuò)增(reamplification)。重組質(zhì)體的構(gòu)建從erb噬菌粒將編碼erb的scFv的cDNA通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。通過來自0KT3雜交瘤(ATCC,CRL-8001)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，獲得鼠的IgG2a抗-CD3mAb(OrthoPharmaceuticalCorporation)的·編碼序列。根據(jù)公開的核苷酸序列通過RT-PCR獲得0KT3mAb的\和Vh的CDNA0通過用甘氨酸接頭(glycine-linker)(GGGS)3連接Vh和Vl鏈，來生成erb和0KT3的scFvPCR融合物。為了生成scFv-Col,scFv-Col的編碼區(qū)在N末端(N-terminal)包含scFv核苷酸序列并在C末端(C-terminal)包含合成膠原蛋白支架基因，該膠原蛋白支架基因編碼EPKSCDKTHTCPPCPRSIP(GPP)1(IGICDPSLCFSVIARRDPFRKGPNY的肽序列，其包含人類IgG的鉸鏈區(qū)、膠原蛋白結(jié)構(gòu)域(collageneousdomain)(用下劃線標(biāo)記)和XXI型膠原蛋白的NCl區(qū)。合成的膠原蛋白支架多肽及其cDNA的序列分別為序列識(shí)別號(hào):9(SEQIDNO:9)和序列識(shí)別號(hào):10(SEQIDNO:10)。SEQIDNO:9GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerlleProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerValIIeAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSEQIDNO:10GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCCCCAGGTCCTCCAGGACCCCCAGGGCCCCCAGGCCCCCCCGGGCCGCCTGGACCCCCAGGGCCACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTAT此合成的序列(SEQIDNO:10)通過重疊的PCR以及將兩側(cè)具有NotI和XhoI位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的相同位置來制備。將erb與0KT3的scFv在AscI與NotI位點(diǎn)框內(nèi)克隆到包括上述C末端膠原蛋白支架的構(gòu)建體(construct)中，以分別制備erb_scFv_Col和0KT3_scFv_Col的表達(dá)構(gòu)建體(expressionconstruct)。之后生成erb_NSPD_scFv。NSPD_scFv的編碼區(qū)包含人類表面活性蛋白質(zhì)D(SPD)(膠原凝集素家族的成員)的N末端254個(gè)氨基酸和在C末端的scFv。人類表面活性蛋白質(zhì)D多肽的N末端254個(gè)氨基酸與其cDNA序列分別為序列識(shí)別號(hào):11(SEQIDNO:11)與序列識(shí)別號(hào):12(SEQIDNO:12)SEQIDNO:11MetLeuLeuPheLeuLeuSerAlaLeuValLeuLeuThrGlnProLeuGlyTyrLeuGluAlaGluMetLysThrTyrSerHisArgThrMetProSerAlaCysThrLeuValMetCysSerSerValGluSerGlyLeuProGlYArgAspGlyArgAspGlyArgGluGlyProArgGlyGluLysGlyAspProGlyLeuProGlyAlaAlaGlyGlnAlaGlyMetProGlyGlnAlaGlyProValGlyProLysGlyAspAsnGlySerValGlyGluProGlyProLysGlyAspThrGlyProSerGlyProProGlyProProGlyValProGlyProAlaGlyArgGluGlyProLeuGlyLysGlnGlyAsnlleGlyProGlnGlyLysProGlyProLysGlyGluAlaGlyProLysGlyGluValGlyAlaProGlyMetGlnGlySerAlaGlyAlaArgGlyLeuAlaGlyProLysGlyGluArgGlyValProGlyGluArgGlyValProGlyAsnThrGlyAlaAlaGlySerAlaGlyAlaMetGlyProGlnGlySerProGlyAlaArgGlyProProGlyLeuLysGlyAspLysGlylleProGlyAspLysGlyAlaLysGlyGluSerGlyLeuProAspValAlaSerLeuArgGInGlnValGluAlaLeuGlnGlyGlnValGlnHisLeuGlnAlaAlaPheSerGlnTyrLysLysValGluLeuPheSEQIDNO:12ATGCTGCTCTTCCTCCTCTCTGCACTGGTCCTGCTCACACAGCCCCTGGGCTACCTGGAAGCAGAAATGAAGACCTACTCCCACAGAACAATGCCCAGTGCTTGCACCCTGGTCATGTGTAGCTCAGTGGAGAGTGGCCTGCCTGGTCGCGATGGACGGGATGGGAGAGAGGGCCCTCGGGGCGAGAAGGGGGACCCAGGTTTGCCAGGAGCTGCAGGGCAAGCAGGGATGCCTGGACAAGCTGGCCCAGTTGGGCCCAAAGGGGACAATGGCTCTGTTGGAGAACCTGGACCAAAGGGAGACACTGGGCCAAGTGGACCTCCAGGACCTCCCGGTGTGCCTGGTCCAGCTGGAAGAGAAGGTCCCCTGGGGAAGCAGGGGAACATAGGACCTCAGGGCAAGCCAGGCCCAAAAGGAGAAGCTGGGCCCAAAGGAGAAGTAGGTGCCCCAGGCATGCAGGGCTCGGCAGGGGCAAGAGGCCTCGCAGGCCCTAAGGGAGAGCGAGGTGTCCCTGGTGAGCGTGGAGTCCCTGGAAACACAGGGGCAGCAGGGTCTGCTGGAGCCATGGGTCCCCAGGGAAGTCCAGGTGCCAGGGGACCCCCGGGATTGAAGGGGGACAAAGGCATTCCTGGAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTCCAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCTTACAGGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAAGAAAGTTGAGCTCTTC將N末端SPDcDNA克隆到表達(dá)載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的NheI和AscI位點(diǎn)之間。將erb的scFv框內(nèi)克隆至包含上述N末端STO的構(gòu)建體的AscI和XhoI位點(diǎn)，以制備erb_NSPD-scFv的表達(dá)構(gòu)建體。每個(gè)erb_scFv_Col、erb_NSPD-scFv和0KT3_scFv_Col的開放讀碼框(openreadingframe)包含編碼N末端前導(dǎo)序列(leadersequence)和以分泌、檢測和純化為目的的C末端myc表位/多聚組氨酸(polyhistidine)標(biāo)簽的序列。表一為通過上述表達(dá)構(gòu)建體編碼的多種重組的蛋白質(zhì)/抗體。表1.本研究中使用的多種抗體分子的綜述權(quán)利要求1.重組蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含:第一融合多肽鏈，包含第一支架區(qū)和與該第一支架區(qū)N端框內(nèi)融合的第一異源性區(qū)；第二融合多肽鏈，包含第二支架區(qū)和與該第二支架區(qū)N端框內(nèi)融合的第三異源性區(qū)；以及第三融合多肽鏈，包含第三支架區(qū)和與該第三支架區(qū)N端框內(nèi)融合的第五異源性區(qū)；其中所述支架區(qū)為SEQIDN0:9，且其中所述第一、第二與第三支架區(qū)互相排列以形成三股螺旋卷曲，所述第一、第三、第五異源性區(qū)的氨基酸序列為SEQIDN0:1或者所述第一、第三、第五異源性區(qū)的氨基酸序列為SEQIDN0:3。2.分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求1所述的第一融合多肽鏈的序列。3.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求2所述的核酸，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞且包含使脯氨酸殘基羥基化的酶活性。4.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞。5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中該哺乳動(dòng)物的細(xì)胞為小鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞。6.產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法，包括:在允許表達(dá)由三種核酸編碼的多肽并在它們之間形成三股螺旋卷曲的情況下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞且包含使脯氨酸殘基羥基化的酶活性，該宿主細(xì)胞包含:編碼第一融合多肽鏈的第一核酸，該第一融合多肽鏈包含第一支架區(qū)和與第一支架區(qū)的N端框內(nèi)融合的第一異源性區(qū)域；編碼第二融合多肽鏈的第二核酸，該第二融合多肽鏈包含第二支架區(qū)和與該第二支架區(qū)N端框內(nèi)融合的第三異源性區(qū)；和編碼第三融合多肽鏈的第三核酸，該第三融合多肽鏈包含第三支架區(qū)和與該第三支架區(qū)N端框內(nèi)融合的第五異源性區(qū)；以及從培養(yǎng)的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化該蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述支架區(qū)為SEQIDNO:9，所述第一、第三、第五異源性區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:1或者所述第一、第三、第五異源性區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:3。7.如權(quán)利要求6所述的產(chǎn)生蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法，其中該宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，其包含使脯氨酸殘基羥基化的酶活性。全文摘要本發(fā)明披露了一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包括形成三股螺旋卷曲的融合多肽鏈，每條鏈具有支架區(qū)和異源性區(qū)。本發(fā)明也披露了相關(guān)的分離的融合多肽、核酸、載體、宿主細(xì)胞及制備方法。文檔編號(hào)C07K19/00GK103159857SQ20131005650公開日2013年6月19日申請日期2007年5月21日優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日發(fā)明者周民元,范佳玉,黃娟娟,李秀娟申請人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院