專利名稱：?jiǎn)畏稚⒕奂谆┧狨ルx子交換層析介質(zhì)在磺達(dá)肝癸鈉柱層析純化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物純化領(lǐng)域，具體涉及磺達(dá)肝癸鈉的柱層析純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磺達(dá)肝癸鈉(Fondaparinux sodium)是戍聚糖鈉最小重復(fù)片段的五糖物質(zhì)，它是一種活化凝血因子X a的特異性抑制劑，主要用于血栓栓塞疾病防治，它的應(yīng)用在很大程度上解決了抗凝藥物一直以來困擾醫(yī)師的兩難問題——在抗凝強(qiáng)度和出血風(fēng)險(xiǎn)中找到ー個(gè)平衡支點(diǎn)?；沁_(dá)肝癸鈉由人工合成，一般合成方法都需要經(jīng)歷50個(gè)以上步驟，因此最后的粗品中雜質(zhì)含量復(fù)雜，且磺達(dá)肝癸鈉有效含量較低(一般為60-80%)，經(jīng)過ー步提取到高純度(98%以上)較困難。離子交換層析介質(zhì)是生物分子分離純化中最常用的方法之一，廣泛應(yīng)用于抗生素、核酸、多肽、蛋白質(zhì)、以及天然產(chǎn)物的分離純化。其主要由三部分組成，第一部分是骨架結(jié)構(gòu)，即載體；第二部分是固定在母體結(jié)構(gòu)上的帶電功能基團(tuán)；第三部分是與功能基團(tuán)帶相反電荷的離子對(duì)。與傳統(tǒng)的離子交換樹脂相比，用于生物大分子分離的離子交換層析介質(zhì)除了具備高的離子密度、具有一定的耐壓、耐酸堿性能外，還要求母體結(jié)構(gòu)足夠親水以消除其與生物分子的非特異性吸附，并且要具備均勻的粒徑。目前用于生物大分子分離的介質(zhì)大多數(shù)不具備所有的以上特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有缺陷。J. Hradil 等(Reactive Polymers, 1990，13，43-53)分別使用甲基丙烯酸環(huán)氧丙酷/こニ醇ニ甲基丙烯酸酯共聚物(GMA/EDMA)和甲基丙烯酸羥こ酷/こニ醇ニ甲基丙烯酸酯共聚物(HEMA/EDMA)為基質(zhì)，合成粒徑分別為250-400 μ m和100-200 μ m強(qiáng)陰離子交換樹脂，相比聚苯こ烯/ ニこ烯基苯基質(zhì)，該方法后續(xù)修飾使用的試劑對(duì)環(huán)境的危害較小；但是，其合成的樹脂顆粒較大，不均勻，很難做到高分辨率分離，而且，該基質(zhì)雖然較為親水，但應(yīng)用在生物分子分離上，其親水性還無法滿足要求，限制了其在生物分離上的應(yīng)用。Hongdeng Qiu 等(Journal of Chromatography A, 2006, 1103，265 - 270)使用硅膠為基質(zhì)鍵合上了含強(qiáng)陰基團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑，合成的強(qiáng)陰型離子交換層析介質(zhì)用于小分子的分離純化。該介質(zhì)具備很好的機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)混合物的分離效果較好，但是硅膠基質(zhì)的離子交換層析介質(zhì)不耐堿性，在很大程度上限制了它的應(yīng)用范圍。美國(guó)專利20050020536公開了ー種以瓊脂糖為基質(zhì)的Q Sepharose Fast Flow (GEHealthcare)分離純化磺達(dá)肝癸鈉的方法，該方法以氯化鈉水溶液為流動(dòng)相，得到99%的純 度。但是該方法使用的介質(zhì)為瓊脂糖骨架，其在不同流速下柱體積會(huì)發(fā)生變化，而且相對(duì)聚丙烯酸酯基質(zhì)，其在較高壓力條件下會(huì)發(fā)生變形，這限制了其在高流速分離中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題，提供一種能達(dá)到高純度和高回收率，而且柱層析不會(huì)隨著鹽濃度和流速的變化而發(fā)生變化，層析填料可耐高壓和高流速的層析介質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)在磺達(dá)肝癸鈉柱層析純化中的應(yīng)用，采用單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)為填料的色譜柱進(jìn)行柱層析。優(yōu)選的，用所述單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)作為色譜柱的固定相，將含磺達(dá)肝癸鈉的樣品上樣于該色譜柱上，用鹽的水溶液作為流動(dòng)相洗脫吸附在固定相上的磺達(dá)肝癸鈉。優(yōu)選的，所述鹽的水溶液是NaCl的水溶液。優(yōu)選的，所述單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)是由蘇州納微生物科技有 限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號(hào)為Uni Q-50S。將單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)Uni Q-50S作為填料轉(zhuǎn)入色譜柱成為固定相，把含有待分離或分析含磺達(dá)肝癸鈉的溶液流過該色譜柱，然后用鹽的水溶液作為流動(dòng)相流過色譜柱，洗脫吸附在固定相Uni Q-50S上的待分離或分析的含磺達(dá)肝癸鈉溶液。本發(fā)明的有益效果是單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)Uni Q-50S不但利于以水溶液做流動(dòng)相分離純化磺達(dá)肝癸鈉粗品，達(dá)到高純度和高回收率，而且柱層析不會(huì)隨著鹽濃度和流速的變化而發(fā)生變化，層析填料可耐高壓和高流速，同時(shí)可使用低鹽濃度將吸附在層析柱上的磺達(dá)肝癸鈉洗脫下來。


圖I是實(shí)施例I中使用的蘇州納微生物科技有限公司單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)Uni Q-50S掃描電鏡照片。圖2是實(shí)施例3、實(shí)施例4中使用的填料Uni Q-50S (蘇州納微生物科技有限公司)和 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)的壓力-壓カ曲線。圖3是實(shí)施例I中提純前的磺達(dá)肝癸鈉粗品的HPLC分析圖譜。圖4是實(shí)施例I中提純后的磺達(dá)肝癸鈉的HPLC分析圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附后權(quán)利要求書限定的范圍。實(shí)施例1，
磺達(dá)肝癸鈉的純化
采用26 X 310mm玻璃色譜柱，Uni Q-50S (蘇州納微生物科技有限公司生產(chǎn))為層析填料裝填層析柱，裝柱體積164. 5mL，先用I. 5個(gè)柱體積(CV)的2M NaCl活化色譜柱，然后用
2.OCV超純水以10mL/min的流速平衡色譜柱?；沁_(dá)肝癸鈉粗品(純度70%)用超純水溶解，粗品濃度4mg/mL，上樣體積250mL。上樣后，先用超純水沖洗2. 0BV,然后用O. 3M NaCl洗脫3. 5BV以除去雜質(zhì)，再用O. 44M NaCl洗脫井分管收集洗脫液，最后I. OM NaCl洗脫到無紫外吸收。收集液經(jīng)檢測(cè)，得到色譜純度99%以上的回收率約30%，色譜純度在97%以上的回收率約60%。實(shí)施例2，
磺達(dá)肝癸鈉的純化
米用 26X310mm 玻璃色譜柱，Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare,粒徑范圍45-165微米)為層析填料裝填層析柱，裝柱體積164. 5mL，先用I. 5個(gè)柱體積(CV)的2MNaCl活化色譜柱，然后用2. OCV超純水以10mL/min的流速平衡色譜柱。磺達(dá)肝癸鈉粗品(純度70%)用超純水溶解，粗品濃度4mg/mL，上樣體積250mL。上樣后，先用超純水沖洗2. OBV,然后用O. 36M NaCl洗脫5BV以除去雜質(zhì)，再用O. 6M NaCl洗脫井分管收集洗脫液，最后I. OMNaCl洗脫到無紫外吸收。收集液經(jīng)檢測(cè)，得到色譜純度99%以上的回收率約28%，色譜純度在97%以上的回收率約55%。實(shí)施例3，
填料耐壓性能測(cè)試
采用10 X 220mm玻璃色譜柱，Uni Q-50S (蘇州納微生物科技有限公司)為層析填料，裝柱完畢后用3CV超純水以lmL/min流速平衡色譜柱并測(cè)定色譜柱反壓，以此流速開始，逐漸增加流速，每升高lmL/min流速測(cè)定色譜柱反壓，做成流速-壓カ曲線圖，如圖3所示。實(shí)施例4，
填料耐壓性能測(cè)試
米用 10X220mm 玻璃色譜柱，Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare,粒徑范圍45-165微米)為層析填料，裝柱完畢后用3CV超純水以lmL/min流速平衡色譜柱并測(cè)定色譜柱反壓，以此流速開始，逐漸增加流速，姆升高lmL/min流速測(cè)定色譜柱反壓,做成流速-壓カ曲線圖，如圖3所示。將實(shí)施例一、三和實(shí)施例ニ、四性能進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比結(jié)果見表I。表I介質(zhì)Uni Q-50S和介質(zhì)Q Sepharose Fast Flow結(jié)果比較表
權(quán)利要求
1.單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)在磺達(dá)肝癸鈉柱層析純化中的應(yīng)用，其特征在于，采用單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)為填料的色譜柱進(jìn)行柱層析。
2.如權(quán)利要求I所述的單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)在磺達(dá)肝癸鈉柱層析純化中的應(yīng)用，其特征在于，用所述單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)作為色譜柱的固定相，將含磺達(dá)肝癸鈉的樣品上樣于該色譜柱上，用鹽的水溶液作為流動(dòng)相洗脫吸附在固定相上的磺達(dá)肝癸鈉。
3.如權(quán)利要求2所述的單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)在磺達(dá)肝癸鈉柱層析純化中的應(yīng)用，其特征在于，所述鹽的水溶液是NaCl的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)在磺達(dá)肝癸鈉柱層析純化中的應(yīng)用，采用單分散聚甲基丙烯酸酯離子交換層析介質(zhì)為填料的色譜柱進(jìn)行柱層析。本發(fā)明不但利于以水溶液做流動(dòng)相分離純化磺達(dá)肝癸鈉粗品，達(dá)到高純度和高回收率，而且柱層析不會(huì)隨著鹽濃度和流速的變化而發(fā)生變化，層析填料可耐高壓和高流速，同時(shí)可使用低鹽濃度將吸附在層析柱上的磺達(dá)肝癸鈉洗脫下來。
文檔編號(hào)C07H1/06GK102659859SQ20121010357
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者吳俊成, 林生躍, 江必旺, 肖書霞, 陳榮姬 申請(qǐng)人:蘇州納微生物科技有限公司