專利名稱：：用于純化手足口病免疫球蛋白的瓊脂糖親和介質(zhì)及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種用于純化手足口病免疫球蛋白的瓊脂糖親和介質(zhì)及其制備方法和用途。
背景技術：
：手足口病是由EV71等腸道病毒所引起，因起病之初手、腳部位多有細小而質(zhì)地較硬的滲子和潰瘍性口腔炎癥而得名。該病以嬰幼兒發(fā)病為主。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮滲或皰滲為主要特征。少數(shù)患者可以并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，易發(fā)生死亡。人手足口病免疫球蛋白是以低溫乙醇蛋白分離法或經(jīng)批準的其它分離法提取，并經(jīng)病毒滅活處理的特異性免疫球蛋白，用于防治手足口病。靜脈注射人手足口病免疫球蛋白能有效地抑制炎癥的發(fā)生，對EV71引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染有一定的療效，曾在1998年中國臺灣和2000年澳大利亞的EV71流行中得到廣泛應用。從人血漿中分離免疫球蛋白，經(jīng)典方法是E丄Cohn教授于1946年創(chuàng)立的低溫乙醇沉淀法，通過控制pH值、溫度、蛋白濃度、離子強度和乙醇濃度來逐級沉淀血漿中的不同蛋白質(zhì)。目前，手足口病免疫球蛋白的分離純化就是采用低溫乙醇沉淀法。但是，低溫乙醇沉淀法的分離精度有限，只能獲得多種免疫球蛋白的混合產(chǎn)品，產(chǎn)品的效價較低，常常無法達到治療手足口病的要求。因此，急需發(fā)展一種特異性、高分離精度純化手足口病免疫球蛋白的分離方法，將低溫乙醇沉淀法制備的免疫球蛋白產(chǎn)品進一步純化，提高產(chǎn)品的效價，從而獲得高比活的合格產(chǎn)品。親和層析是利用了生命現(xiàn)象中生物分子之間非常特異的相互作用，進行分離純化的方法。而利用瓊脂糖作為載體，以生物活性分子為配基，利用配基與目標產(chǎn)物的生物學特異性，提純目標產(chǎn)物已廣泛應用于生物產(chǎn)品的純化生產(chǎn)中。自從1967年Axen等人發(fā)表用溴化氰活化多糖凝膠偶聯(lián)肽和蛋白質(zhì)的方法，并成功制備固定化酶后，親和層析在20世紀70年代有了驚人的發(fā)展，目前已得到廣泛應用。例如，陳饅等人(刺桐胰蛋白酶抑制劑親和層析填料的制備及應用，北京理工大學學報，2005，25(2):172)報道了用交聯(lián)瓊脂糖為載體，三聚氯氰為活化劑，刺桐胰蛋白酶抑制劑為配基，制備親和層析介質(zhì)的方法，用制備的親和層析介質(zhì)吸附重組人組織型纖溶酶原激活劑突變體(reteplase,r-PA),解吸附完全，不影響活性。馬學華等人(親和層析法提取純化人心肌肌鈣蛋白I，哈爾濱醫(yī)科大學學報，2008，42(3):258)報道了將兔骨骼肌肌4丐蛋白C(sTnC)與經(jīng)溴化氰活化的Sepharose4B凝膠偶聯(lián)，制成sTnC親和層析介質(zhì)，從人心肌經(jīng)勻漿、離心后的上清液中提純?nèi)诵募〖♀}蛋白I(cTnl)，提純的cTnl可被cTnI單克隆抗體特異性識別。根據(jù)抗體與抗原之間高度特異性可逆結合作用，可以建立相應的親和層析方法，這種親和層析方法具有高收率、高純度、能保持生物大分子天然狀態(tài)等優(yōu)點。制備以手足口病疫苗為配基的手足口病免疫球蛋白親和介質(zhì)，能夠從低比活的血漿組分中特異性的吸附手足口病免疫球蛋白，從而得到合格產(chǎn)品，有效利用血漿資源。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明利用抗原抗體之間能夠特異性相互作用，制備以手足口病疫苗為配基的手足口病免疫球蛋白親和介質(zhì)，能夠從低比活的血漿組分中特異性的吸附手足口病免疫球蛋白。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種用于純化手足口病免疫球蛋白的瓊脂糖親和介質(zhì)。本發(fā)明的另一個目的在于，提供上述瓊脂糖親和介質(zhì)的制備方法及其用途。本發(fā)明的目的是采用以下技術方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種用于純化手足口病免疫球蛋白的瓊脂糖親和介質(zhì)，具有以下結構其中，C^J代表瓊脂糖凝膠；R為-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH20(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH20(CH2)4OCH2CH(OH)CH2-、或-CH2CH(OH)CH20(CH2)20(CH2)(OH)CH2A為手足口病疫苗；O為氧原子。優(yōu)選地，所述瓊脂糖凝膠選自瓊脂糖6FF、瓊脂糖4FF、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖6B和瓊脂糖4B中的一種或多種。另一方面，本發(fā)明提供制備所述瓊脂糖親和介質(zhì)的方法，其是以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，經(jīng)環(huán)氧活化劑活化后，偶聯(lián)作為配基的手足口病疫苗。優(yōu)選地，所述方法包括下述步驟l)瓊脂糖凝膠的活化在瓊脂糖凝膠中分別加入環(huán)氧活化劑、氫氧化鈉溶液及催化劑硼氫化鈉，其中凝膠的質(zhì)量份數(shù)(g)為1份，環(huán)氧活化劑的體積份數(shù)(ml)為13份，氫氧化鈉溶液的體積份數(shù)(ml)為13份，硼氫化鈉的質(zhì)量份數(shù)(mg)為15份，在2060。C下攪拌反應210小時，反應結束后，清洗，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；2)手足口病疫苗的偶聯(lián)將步驟1)所得到的環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠加入反應瓶內(nèi)，加入pH為堿性的手足口病疫苗溶液，其中環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠(g)與手足口病疫苗溶液(ml)的配比為1~1:1~10，在254(TC水浴中振蕩4~24小時；優(yōu)選地，所述手足口病疫苗溶液的pH為8.0~14.0。優(yōu)選地，所述步驟2)還包括封閉處理的步驟將偶聯(lián)手足口病疫苗的瓊脂糖凝膠抽濾，去離子水洗滌，加入pH11.0的0.52mol/L的乙醇胺在2540。C下振蕩反應4~10小時；更優(yōu)選地，經(jīng)封閉處理的凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干。優(yōu)選地，所述瓊脂糖凝膠為選自瓊脂糖6FF、瓊脂糖4FF、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖6B和瓊脂糖4B中的一種或多種。優(yōu)選地，所述環(huán)氧活化劑為環(huán)氧氯丙烷、環(huán)氧溴丙烷、乙二醇雙縮水甘油醚、1,4-丁二醇-二縮水甘油醚、烯丙基縮水甘油醚或一縮二乙二醇雙縮水甘油醚。又一方面，本發(fā)明提供上述瓊脂糖親和介質(zhì)在制備手足口病免疫球蛋白中的用途。再一方面，本發(fā)明提供上述瓊脂糖親和介質(zhì)制備手足口病免疫球蛋白的方法，包括以下步驟1)制備含有手足口病免疫球蛋白血漿樣品；2)使用瓊脂糖親和介質(zhì)純化吸附步驟1)得到的血漿樣品優(yōu)選地，所述吸附條件為pH6.0~8.0的10~50mM中性緩沖液；3)洗脫步驟2)中瓊脂糖親和介質(zhì)吸附的血漿樣品中的免疫球蛋白；優(yōu)選地，所述洗脫條件為pH2.0~5.0的酸性緩沖液。優(yōu)選地，上述方法還包括使用超濾、離子交換層析和/或凝膠過濾層析進一步純化步驟3)中所洗脫的血漿樣品中的免疫球蛋白。綜上所述，本發(fā)明提供了一種制備工藝安全、能夠有效純化手足口病免疫球蛋白并適合大規(guī)模生產(chǎn)的親和介質(zhì)，將低比活的低溫乙醇沉淀組分的比活提高，達到合格產(chǎn)品的要求。本發(fā)明所提供的瓊脂糖親和介質(zhì)，結構式如式I所示，是以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，經(jīng)環(huán)氧活化后與手足口病疫苗偶聯(lián)，制得以手足口病疫苗為配基的瓊脂糖親和介質(zhì)；其中，(^J)代表瓊脂糖凝膠；R為-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH20(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH20(CH2)4OCH2CH(OH)CH2-、或畫CH2CH(OH)CH20(CH2)20(CH2)2OCH2CH(OH)C:H2-;A為手足口病疫苗。本發(fā)明所提供的瓊脂糖親和介質(zhì)的制備方法，還可以釆用以下技術方案來實現(xiàn)1)活化向100.0g瓊脂糖凝膠中加入200ml環(huán)氧活化劑、100ml氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在2060。C下攪拌反應2~10小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠。所述的瓊脂糖凝膠為選自瓊脂糖6FF、瓊脂糖4FF、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖6B或瓊脂糖4B中的一種。所述的環(huán)氧活化劑為環(huán)氧氯丙烷、環(huán)氧溴丙烷、乙二醇雙縮水甘油醚、1,4-丁二醇-二縮水甘油醚、烯丙基縮水甘油醚或一縮二乙二醇雙縮水甘油醚中的一種。所述的氫氧化鈉溶液濃度為0.5~4mol/L。2)偶聯(lián)100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入反應瓶內(nèi)，加入pH調(diào)為堿性的手足口病疫苗溶液，2540。C水浴中振蕩4~24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入1mol/L乙醇胺25-40。C下振蕩反應410小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到手足口病疫苗配基親和介質(zhì)；所述的疫苗溶液pH為8.0~14.0。式I本發(fā)明提供的上述瓊脂糖親和介質(zhì)制備反應式如下(以環(huán)氧活化劑為1,4-丁二醇-二縮水甘油醚為例)(1)活化CH2"ch-CH2-0"(CH2)4—0—CH2-ch-CH2p,oh+//CH2《h-CH2—CKCH2》一0-CH2-ch-CH2p廠。_:V(2)偶聯(lián)CH2~ch-CH2-CKCH2)+-0-CH2—-，oh0—Ah/+ev71疫苗CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2-EV71疫苗Q_OHOH本發(fā)明提供的瓊脂糖親和介質(zhì)可用于純化手足口病免疫球蛋白，純化時手足口病免疫球蛋白的吸附條件為pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液，洗脫條件為pH為2-5的酸性緩沖液。使用原料為(但不局限于)含有手足口病免疫球蛋白的血漿經(jīng)低溫乙醇沉淀或其他方法純化后得到含有手足口病免疫球蛋白的組分。親和層析得到的產(chǎn)品可以通過選用的超濾、離子交換層析或凝膠過濾層析進行進一步純化或精制。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的瓊脂糖親和介質(zhì)及其制備方法及其在純化手足口病免疫球蛋白中的用途，具有以下優(yōu)點(1)瓊脂糖親和介質(zhì)選擇性好，特異性強。作為親和配基的手足口病疫苗，能與手足口病免疫球蛋白特異性結合，能從低比活的原料中選擇性的吸附手足口病免疫球蛋白，從而特異性的純化手足口病免疫球蛋白，得到高比活的產(chǎn)品。(2)瓊脂糖親和介質(zhì)機械強度高、利于工業(yè)放大。本發(fā)明制備親和介質(zhì)的原料即瓊脂糖6FF和瓊脂糖4FF是半剛性瓊脂糖凝膠，這種介質(zhì)具有良好的親水性，與活性蛋白有優(yōu)良的生物相容性，易于保持生物活性，同時具有高流速、高分子排阻極限和良好的機械強度等特點，使用過程中最高流速可達600800cm/小時，因而得到的介質(zhì)機械強度高、通透性好，可以滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。(3)瓊脂糖親和介質(zhì)的制備工藝簡單，易于放大。采用本發(fā)明制備的親和介質(zhì)純化手足口病免疫球蛋白，純化方法筒單易行，分離效果好。以含有手足口病免疫球蛋白的血漿低溫沉淀組分為原料進行親和層析，抗體活性收率30%以上，純化倍數(shù)在100以上。具體實施方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1取洗凈抽干的瓊脂糖6FF凝膠(GEhealthcare公司)100.0g,倒入1L三口燒弁瓦中，加入200ml的1,4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的0.5M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在25。C下攪拌反應IO小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入100mlpH8.0手足口病疫苗(華蘭生物有限公司)溶液，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入1mol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和O.lMpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例2取洗凈抽干的瓊脂糖6FF凝膠(GEhealthcare公司)100.0g,倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1,4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的4M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在60。C下攪拌反應4小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入200mlpH14.0手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入lmol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例3取洗凈抽干的瓊脂糖6FF凝膠(GEhealthcare公司)100.0g，倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的0.5M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在60。C下攪拌反應4小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入500mlpH8.0手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入1mol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例4取洗凈抽干的瓊脂糖6FF凝膠(GEhealthcare公司)100.0g,倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的4M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在25。C下攪拌反應IO小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入1000mlpH14.0手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入lmol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗涂，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例5取洗凈抽干的瓊脂糖4FF凝膠(GEhealthcare公司)100.0g，倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的0.5M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在25。C下攪拌反應10小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入100mlpH8.0手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入lmol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的破傷風疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例6取洗凈抽干的瓊脂糖4FF凝膠(GEhealthcare公司)100.0g，倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的4M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在60。C下攪拌反應4小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入200mlpH14.0手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入1mol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例7取洗凈抽干的瓊脂糖CL-6B凝膠(GEhealthcare公司)100.0g,倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1,4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的0.5M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在25。C下攪拌反應IO小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入500mlpH8.0手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入1mol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例8取洗凈抽干的瓊脂糖CL-4B凝膠(GEhealthcare公司)100.0g,倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml的0.5M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氫化鈉，在25。C下攪拌反應IO小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，力口入1L三口燒瓶內(nèi)，加入1000mlpH8手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入1mol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例9取洗凈抽干的瓊脂糖6B凝膠(GEhealthcare公司)100.0g，倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1,4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml0.5M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氬化鈉，在25。C下攪拌反應IO小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入100mlpH8.0的手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限^^司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入lmol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例10取洗凈抽干的瓊脂糖4B凝膠(GEhealthcare公司)100.0g,倒入1L三口燒瓶中，加入200ml的1，4-丁二醇-二縮水甘油醚、100ml0.5M氫氧化鈉溶液及1.5g硼氬化鈉，在25'C下攪拌反應IO小時，反應結束后，依次用水、乙醇、水清洗并真空抽去溶劑，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；取100g環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠用水洗滌后，抽干，加入1L三口燒瓶內(nèi)，加入1000mlpH8.0手足口病疫苗溶液(華蘭生物有限公司)，37。C水浴中振蕩24小時；抽濾，去離子水洗滌，加入lmol/L乙醇胺37。C下振蕩反應4小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干，即得到本發(fā)明的手足口病疫苗配基親和介質(zhì)，保存于20%乙醇中。實施例11親和層析實驗取實施例1制備好的手足口病免疫球蛋白親和介質(zhì)10ml裝入層析柱(①1.6cmx5cm)內(nèi)。用100ml的BufferA(pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液)平衡后，將含手足口病免疫球蛋白的低溫乙醇法血漿組分(效價1:64)加到柱上，上樣流速lml/min。全部樣品進柱后，用BufferA洗去未被吸收的蛋白，收集穿透峰Po。待穿透峰結束后用BufferB(1M乙酸溶液)洗脫，收集手足口病免疫球蛋白活性峰P!。各組分蛋白濃度和抗體活性分別采用Braford法(參見張龍翔等主編《生化實驗方法和技術》第三章附3)和血清中和法(參見中國藥典2005版附錄IXI);險測。層析過程的抗體活性回收率和純化倍數(shù)分別按下式計算，所得到的結果如表1所示?？贵w活性回收率W)^IIII"幅樣品比活=樣品活性值純化倍數(shù)=樣品蛋白濃度P,峰比活上樣比活<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1、一種用于純化手足口病免疫球蛋白的瓊脂糖親和介質(zhì)，其特征在于，所述瓊脂糖親和介質(zhì)具有以下結構id="icf0001"file="A2009100887190002C1.tif"wi="27"he="8"top="41"left="78"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>其中，id="icf0002"file="A2009100887190002C2.tif"wi="9"he="8"top="49"left="38"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>代表瓊脂糖凝膠；R為-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)CH2O(CH2)4OCH2CH(OH)CH2-、或-CH2CH(OH)CH2O(CH2)2O(CH2)2OCH2CH(OH)CH2-；A為手足口病疫苗；O為氧原子。2、如權利要求1所述的瓊脂糖親和介質(zhì)，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠為選自瓊脂糖6FF、瓊脂糖4FF、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖6B、瓊脂糖4B中的一種或多種。3、制備權利要求1或2所述的瓊脂糖親和介質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法是以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，經(jīng)環(huán)氧活化劑活化后，偶聯(lián)作為配基的手足口病疫苗。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于，該方法包括下述步驟1)瓊脂糖凝膠的活化在瓊脂糖凝膠中分別加入環(huán)氧活化劑、氳氧化鈉溶液及硼氫化鈉，其中凝膠的質(zhì)量份數(shù)(g)為1份，環(huán)氧活化劑的體積份數(shù)(ml)為13份，氫氧化鈉溶液的體積份數(shù)(ml)為13份，硼氬化鈉的質(zhì)量份數(shù)(mg)為15份，在2060。C下攪拌反應2~10小時，清洗，得到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠；2)手足口病疫苗的偶聯(lián)將步驟1)所得到的環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠加入反應瓶內(nèi)，加入pH為堿性的手足口病疫苗溶液，其中環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠(g)與手足口病疫苗溶液(ml)的配比為1~1:1~10，在25~40。C水浴中振蕩4~24小時；優(yōu)選地，所述手足口病疫苗溶液的pH為8.0-14.0。5、如權利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步驟2)還包括封閉的步驟將偶聯(lián)手足口病疫苗的瓊脂糖凝膠抽濾，去離子水洗滌，加入pH11.0的0.5~2mol/L的乙醇胺在2540。C下振蕩反應4~10小時；凝膠依次用去離子水、0.1MpH4.0含0.5MNaCl的乙酸-乙酸鈉緩沖液、去離子水和0.1MpH8.0含0.5MNaCl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液洗滌，水洗后抽干。6、如權利要求3至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠為選自瓊脂糖6FF、瓊脂糖4FF、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖6B、瓊脂糖4B中的一種或多種。7、如權利要求3至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述環(huán)氧活化劑為環(huán)氧氯丙烷、環(huán)氧溴丙烷、乙二醇雙縮水甘油醚、1，4-丁二醇-二縮水甘油醚、烯丙基縮水甘油醚或一縮二乙二醇雙縮水甘油醚。8、權利要求1或2所述的瓊脂糖親和介質(zhì)在制備手足口病免疫球蛋白中的用途。9、權利要求1或2所述的瓊脂糖親和介質(zhì)制備手足口病免疫球蛋白的方法，包括以下步驟1)含有手足口病免疫球蛋白血漿樣品的制備；2)使用瓊脂糖親和介質(zhì)純化吸附步驟1)多得到的血漿樣品優(yōu)選地，所述吸附條件為pH6.08.0的1050mM中性緩沖液；3)洗脫步驟2)中瓊脂糖親和介質(zhì)吸附的血漿樣品中的免疫球蛋白；優(yōu)選地，所述洗脫條件為pH2.0~5.0的酸性緩沖液。10、如權利要求9所述的方法，其特征在于，還包括使用超濾、離子交換層析或凝膠過濾層析進一步純化步驟3)中所洗脫的血漿樣品中的免疫球蛋白。全文摘要本發(fā)明提供一種用于純化手足口病免疫球蛋白的瓊脂糖親和介質(zhì)及其制備方法。該瓊脂糖親和介質(zhì)是以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，經(jīng)環(huán)氧活化劑活化后，偶聯(lián)作為配基的手足口病疫苗，其中的瓊脂糖凝膠選自瓊脂糖6FF、瓊脂糖4FF、瓊脂糖CL-6B、瓊脂糖CL-4B、瓊脂糖6B、瓊脂糖4B中的一種。本發(fā)明所提供的瓊脂糖親和介質(zhì)可用于純化手足口病免疫球蛋白，具有介質(zhì)選擇性好，特異性強；機械強度高、利于工業(yè)放大的優(yōu)點，此外，其制備工藝簡單，易于放大。采用本發(fā)明制備的介質(zhì)純化手足口病免疫球蛋白，純化方法簡單易行，分離效果好。文檔編號C07K16/10GK101602805SQ200910088719公開日2009年12月16日申請日期2009年7月8日優(yōu)先權日2009年7月8日發(fā)明者孔英俊,康安,堅羅,蘇志國,蓓范,馬小偉申請人:中國科學院過程工程研究所;華蘭生物工程股份有限公司