低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，依次分離FⅠ、FⅡ+Ⅲ、FⅢ、FⅡ，在對(duì)FⅡ沉淀超濾、純化時(shí)，依次采用超濾脫醇、巴氏滅活、一次沉淀分離、二次沉淀分離、二次沉淀超濾脫醇的工藝。本發(fā)明在過(guò)濾時(shí)將壓濾機(jī)的溫度控制在較低范圍內(nèi)，在沉淀分離工藝采用了適當(dāng)?shù)碾妼?dǎo)率，提高了免疫球蛋白的收率，在對(duì)免疫球蛋白純化精制時(shí)，進(jìn)行了兩次沉淀分離，兩次沉淀分離均采用了二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，通過(guò)四級(jí)過(guò)濾技術(shù)，去除了制品中的不溶性顆粒，提高了制品的澄清度和收率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及以人血漿為原料制備靜注人免疫球蛋白的方法，更具體的說(shuō)涉及一種采用低溫乙醇法提取靜注人免疫球蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]低溫乙醇法是人血漿蛋白的制備方法之一，該方法是1940年由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的EdwinJ.Cohn教授發(fā)明的，因此又稱(chēng)為“孔氏法”?？资戏ㄗ畛跤脕?lái)分離牛血清白蛋白，隨后應(yīng)用于人血漿分離。低溫乙醇法是以混合血漿為原料，逐級(jí)降低酸度(從PH7.0降到pH4.0)。提高乙醇濃度(從O升到40%)，同時(shí)降低溫度(從2°C降到_2°C)，各種蛋白在不同的條件下以組分(粗制品)的形式分步從溶液中析出，并通過(guò)離心或者過(guò)濾分離出來(lái)。影響蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)因素主要有五個(gè)，即:PH值、溫度、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度和乙醇濃度。由于工藝參數(shù)選擇不合理及分離方法不科學(xué)，導(dǎo)致了現(xiàn)有的低溫乙醇法生產(chǎn)人免疫球蛋白收率較低且純度低。
[0003]專(zhuān)利號(hào)為201110030778.3的發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了 “一種生產(chǎn)靜注人免疫球蛋白的方法”，該發(fā)明的主要工藝如下:以人血漿為原料，首先從血漿中分離出組分I + II +III，再?gòu)慕M分I +11+III沉淀分離組分I +III，再分離組分II，再用層析法純化組分II，之后進(jìn)行病毒滅活，滅活后配制靜注人免疫球蛋白。該方法的組分分離周期略長(zhǎng)、且純度較低，人免疫球蛋白生廣的收率還有待提聞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，在用人血漿為原料制備靜注人免疫球蛋白時(shí)，以提高靜注人免疫球蛋白的收率。
[0005]本發(fā)明所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一、從人血漿中分離F I，得F I上清液；
[0007]步驟二、從F I上清液中分離出F II + III沉淀；
[0008]步驟三、從F II + III沉淀中分離F III沉淀，得FIII上清液；
[0009]步驟四、從F III上清液中分離出F II沉淀；
[0010]步驟五、F II沉淀超濾、純化，包括以下步驟:
[0011]①、超濾脫醇:取重量為上述F II沉淀8~10倍、溫度為2~8°C注射用水將F II沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，調(diào)節(jié)溶液PH值至4.30~4.70 ;
[0012]②、巴氏滅活:將超濾脫醇后的溶液用注射用水調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)含量至17~33g/l，按60~120g/l加入甘氨 酸，調(diào)節(jié)pH值至1.10~7.50，在55~65°C的溫度下加溫9~11小時(shí)進(jìn)行巴氏滅活后，降溫至20~30°C ；
[0013]③、一次沉淀分離:用注射用水調(diào)節(jié)巴氏滅活后的溶液，使溶液中蛋白質(zhì)含量為5.0~15.0g/Ι，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.70~7.20，控制溫度至O~2°C，調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比18~20%，控制溫度至2~6°C，調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.20~1.50ms/cm，攪拌反應(yīng)I~3小時(shí),按每千克蛋白質(zhì)0.08~0.12kg比例分別添加等量的珍珠巖和娃藻土,繼續(xù)反應(yīng)0.5~1.5小時(shí)后,用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾,加壓過(guò)濾時(shí),選用孔徑不超過(guò)0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至5°C以下，過(guò)濾分離出一次沉淀，得一次沉淀上清液；
[0014]④、二次沉淀分離:將一次沉淀上清液溫度控制至-1~_3°C，調(diào)節(jié)pH值至7.10~7.40，乙醇濃度至體積百分比24~26%，控制溶液溫度至-6~_12°C，調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.50-1.90ms/cm,攪拌反應(yīng)I~3小時(shí),用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾,加壓過(guò)濾時(shí),選用孔徑不超過(guò)0.9μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-3°C以下，過(guò)濾分離出二次沉淀；
[0015]⑤、二次沉淀超濾脫醇:取重量為上述二次沉淀5~10倍、溫度為2~8°C的注射用水將二次沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，同時(shí)調(diào)節(jié)PH值至3.40~3.80，超濾脫醇后再調(diào)節(jié)pH值至3.8~4.4。
[0016]步驟六、將步驟五所得二次沉淀溶液按成品規(guī)格配制，使蛋白質(zhì)含量不低于50g/1，加入麥芽糖，使麥芽糖含量為90~110g/l，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大于80 μ g/ml,調(diào)節(jié)pH值至3.8~4.4,實(shí)現(xiàn)制品配制后,進(jìn)行除菌過(guò)濾分裝。
[0017]所述步驟一是將融合后的人血漿的溫度控制在0.0~4.(TC之間，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度至40~65g/l，調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為12.0~14.0ms/cm,調(diào)節(jié)pH值至6.80~7.30，調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比7.0~10.0%，控制溫度至-1.0~-3.(TC，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)選用孔徑不超過(guò)0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-1°C以下，過(guò)濾分離出F I沉淀，得F I上清液。
[0018]所述步驟二是,調(diào)節(jié)F I上清液pH值至5.70~6.30、乙醇濃度至體積百分比18.0~22.0%，控制溫度至-4.0~-6.(TC，按照每16Kg蛋白質(zhì)添加0.5~1.5Kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-3V以下，過(guò)濾分離出F II + III沉淀。
[0019]所述步驟三是，取重量為上述F II + III沉淀8~10倍、溫度為2~8°C的注射用水將F II + III沉淀完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至4.60~5.00，攪拌反應(yīng)I~2小時(shí)后，再將溶液的pH值調(diào)節(jié)至5.00~5.40，再進(jìn)行攪拌反應(yīng)I~2小時(shí)，調(diào)節(jié)溶液電導(dǎo)率為1.20~1.50ms/cm,調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比13~15%,反應(yīng)I~3小時(shí)，按每千克F II + III沉淀添加0.07~0.1kg的比例分別添加等量的珍珠巖和娃藻土,繼續(xù)反應(yīng)0.5~1.5小時(shí),用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-1°C以下，過(guò)濾分離出F III沉淀，取F III上清。
[0020]所述步驟四是，調(diào)節(jié)FIII上清液電導(dǎo)率為6.50~8.50ms/cm、調(diào)節(jié)pH值至7.00~7.40、乙醇濃度至體積百分比24~26%、控制溫度至-6.0~-12.(TC，攪拌反應(yīng)I~3小時(shí)，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-3°C以下，過(guò)濾分離出F II沉淀。
[0021]本發(fā)明所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，從人血漿中依次分離F 1、F II +IILFIILF II，使得提取組分沉淀精益細(xì)化，縮短了組分的分離周期，利于人血漿的綜合利用。通過(guò)控制壓濾機(jī)的溫度避免了制品壓濾過(guò)程升溫而導(dǎo)致蛋白變性，同時(shí)在沉淀分離工藝采用了適當(dāng)?shù)碾妼?dǎo)率，·故提高了免疫球蛋白的收率，免疫球蛋白的收率可達(dá)到5.2g/I以上(現(xiàn)有技術(shù)免疫球蛋白的收率為4.8g/l)。在對(duì)免疫球蛋白純化精制時(shí)，進(jìn)行了兩次沉淀分離，兩次沉淀分離均采用了二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，通過(guò)四級(jí)過(guò)濾，去除了制品中的不溶性顆粒，提高了制品的澄清度。在人免疫球蛋白超濾前后分別進(jìn)行溶液的PH控制，減少和去除人免疫球蛋白中的抗補(bǔ)體活性，提高了人免疫球蛋白的有效性。
[0022]表一:產(chǎn)品的主要質(zhì)量指標(biāo)
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一、從人血漿中分離F I，得F I上清液； 步驟二、從F I上清液中分離出F II +III沉淀； 步驟三、從F II + III沉淀中分離FIII沉淀，得FIII上清液； 步驟四、從FIII上清液中分離出F II沉淀； 步驟五、F II沉淀超濾、純化，包括以下步驟: ①、超濾脫醇:取重量為上述FII沉淀8~10倍、溫度為2~8°C注射用水將 F II沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.30~4.70 ; ②、巴氏滅活:將超濾脫醇后的溶液用注射用水調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)含量至17~33g/l，按60~120g/l加入甘氨酸，調(diào)節(jié)pH值至7.10~7.50，在55~65°C的溫度下加溫9~11小時(shí)進(jìn)行巴氏滅活后，降溫至20~30°C ； ③、一次沉淀分離:用注射用水調(diào)節(jié)巴氏滅活后的溶液，使溶液中蛋白質(zhì)含量為5.0~15.0g/Ι，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.70~7.20，控制溫度至O~2°C，調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比18~20%，控制溫度至2~6°C，調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.20~1.50ms/cm，攪拌反應(yīng)I~3小時(shí)，按每千克蛋白質(zhì)0.08~0.12kg比例分別添加等量的珍珠巖和娃藻土,繼續(xù)反應(yīng)0.5~1.5小時(shí)后，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至5°C以下`，過(guò)濾分離出一次沉淀，得一次沉淀上清液； ④、二次沉淀分離:將一次沉淀上清液溫度控制至-1~_3°C，調(diào)節(jié)pH值至7.10~7.40，乙醇濃度至體積百分比24~26%，控制溶液溫度至-6~_12°C，調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為1.50~1.90ms/cm,攪拌反應(yīng)I~3小時(shí),用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾,加壓過(guò)濾時(shí),選用孔徑不超過(guò)0.9μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-3°C以下，過(guò)濾分離出二次沉淀； ⑤、二次沉淀超濾脫醇:取重量為上述二次沉淀5~10倍、溫度為2~8°C的注射用水將二次沉淀完全溶解，采用二級(jí)澄清除菌過(guò)濾，同時(shí)調(diào)節(jié)PH值至3.40~3.80，超濾脫醇后再調(diào)節(jié)pH值至3.8~4.4。 步驟六、將步驟五所得二次沉淀溶液按成品規(guī)格配制，使蛋白質(zhì)含量不低于50g/l，加入麥芽糖，使麥芽糖含量為90~110g/l，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大于80 μ g/ml,調(diào)節(jié)pH值至3.8~4.4,實(shí)現(xiàn)制品配制后,進(jìn)行除菌過(guò)濾分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特征在于:所述步驟一是將融合后的人血衆(zhòng)的溫度控制在0.0~4.0°C之間,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度至40~65g/l,調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率為12.0~14.0ms/cm，調(diào)節(jié)pH值至6.80~7.30，調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比7.0~10.0%,控制溫度至-1.0~-3.0°C,用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾,加壓過(guò)濾時(shí)選用孔徑不超過(guò)0.9μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-1°C以下，過(guò)濾分離出F I沉淀，得F I上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特征在于:所述步驟二是，調(diào)節(jié)F I上清液pH值至5.70~6.30、乙醇濃度至體積百分比18.0~22.0%，控制溫度至-4.0~-6.(TC，按照每16Kg蛋白質(zhì)添加0.5~1.5Kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至_3°C以下，過(guò)濾分離出
F II +III沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特征在于:所述步驟三是，取重量為上述F II + III沉淀8~10倍、溫度為2~8V的注射用水將F II + III沉淀完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至4.60~5.00，攪拌反應(yīng)I~2小時(shí)后，再將溶液的pH值調(diào)節(jié)至5.00~5.40，再進(jìn)行攪拌反應(yīng)I~2小時(shí)，調(diào)節(jié)溶液電導(dǎo)率為1.20~L 50ms/cm，調(diào)節(jié)乙醇濃度至體積百分比13~15%，反應(yīng)I~3小時(shí)，按每千克F II +III沉淀添加0.07~0.1kg的比例分別添加等量的珍珠巖和硅藻土，繼續(xù)反應(yīng)0.5~1.5小時(shí)，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.7 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-1°C以下，過(guò)濾分離出F III沉淀，取F III上清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述低溫乙醇提取靜注人免疫球蛋白的方法，其特征在于:所述步驟四是，調(diào)節(jié)F III上清液電導(dǎo)率為6.50~8.50ms/cm、調(diào)節(jié)pH值至7.00~7.40、乙醇濃度至體積百分比24~26%、控制溫度至-6.0~-12.(TC，攪拌反應(yīng)I~3小時(shí)，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過(guò)濾，加壓過(guò)濾時(shí)，選用孔徑不超過(guò)0.9 μ m的深層濾板，控制壓濾機(jī)溫度至-3°C以下，過(guò)濾分離出F II沉淀。
【文檔編號(hào)】C07K1/36GK103665100SQ201410003241
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】安康, 張寶獻(xiàn), 張其昌, 王猛, 滕世超, 郭心怡 申請(qǐng)人:華蘭生物工程重慶有限公司