專利名稱：：人或人源化免疫球蛋白在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中增強(qiáng)的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過促進(jìn)正常B細(xì)胞發(fā)育和通過維持?jǐn)y帶有人(或人源化)免疫球蛋白基因座的非人動(dòng)物中人(或人源化)抗體的表達(dá)而改善非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中人(或人源化)免疫球蛋白的表達(dá)的方法。特別地，本發(fā)明涉及同時(shí)表達(dá)編碼人(或人源化)Iga和/或IgP(B細(xì)胞受體的組分)的轉(zhuǎn)基因以及編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因。本方法允許人(或人源化)抗體例如在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的血液、乳液或卵中的顯著表達(dá)。_4]相關(guān)技術(shù)的i兌明抗體是已經(jīng)成功用于治療多種人類疾病和病癥(例如癌癥、過敏性疾病)、預(yù)防移植排斥和宿主抗移植物疾病的一類重要的藥學(xué)產(chǎn)品。獲得自非人動(dòng)物的抗體制劑的主要問題在于非人免疫球蛋白在人類患者中的固有免疫原性。為了降低非人抗體的免疫原性，已表明可以通過將動(dòng)物可變區(qū)(V)外顯子與人類恒定區(qū)(C)外顯子融合而獲得嵌合抗體基因。該嵌合或人源化的抗體具有對(duì)人類最小的免疫原性并且適合用于人類受試者的治療性治療。已經(jīng)研發(fā)了人源化單克隆抗體并且將其用于臨床應(yīng)用。然而，總體上，無論是嵌合、人源化還是人單克隆抗體在治療諸如癌癥或烈性病原體感染等破壞性疾病上的應(yīng)用由于這些疾病的復(fù)雜性、多因子病因?qū)W和適應(yīng)性而受到限制。針對(duì)于單一限定靶標(biāo)的單克隆抗體通常在這些靶標(biāo)改變、進(jìn)化和突變時(shí)失效。例如，惡性腫瘤可獲得對(duì)標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體治療的抗性。這一問題的解決方案是使用具有靶向多個(gè)進(jìn)化靶標(biāo)能力的多克隆抗體。多克隆抗體可以中和細(xì)菌或病毒毒素，并引導(dǎo)免疫應(yīng)答以殺死和消除病原體。因此，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)高效價(jià)、高親和性、人源化多克隆和單克隆抗體的適合方法存在巨大的臨床需求。此外，由于從抗體產(chǎn)量的角度講偏愛在如兔、雞、綿羊和牛等較大型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中生產(chǎn)抗體，因此也高度需要表達(dá)較大量轉(zhuǎn)基因編碼的產(chǎn)物的較大型建立者動(dòng)物的產(chǎn)生。人源化單克隆抗體通常是這樣的人類抗體，其中一些⑶R殘基，以及可能一些FR殘基由來自非人動(dòng)物(如嚙齒類)的抗體的同功位點(diǎn)殘基所取代?；旧峡梢园凑誛inter及其同事的方法(Jones等人，Nature,321:522(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323(1988);Verhoeyen等人，Science,239:1534(1988))，通過用非人動(dòng)物(例如嚙齒類)CDR或CDR序列取代人類單克隆抗體的相應(yīng)序列而進(jìn)行人源化。在動(dòng)物中制造人源化抗體時(shí)遇到的一個(gè)問題是宿主抗體的內(nèi)源性生產(chǎn)高于轉(zhuǎn)基因抗體，而需要抑制該內(nèi)源性抗體的生產(chǎn)。已經(jīng)描述了抗體(嵌合和種系突變鼠中的重鏈連接區(qū)(JH)基因)的純合缺失，導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到該種系突變鼠中將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)人抗體的生產(chǎn)。參見例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362:255(1993)；Bruggemann等人，YearinImmunol.,7:33(1993);2006年6月20日授權(quán)的美國專利No.7，064,244;其公開內(nèi)容在此通過整體引用作為參考。將人免疫球蛋白基因?qū)胄∈蠡蚪M導(dǎo)致這些遺傳改造的小鼠中多樣化的人抗體譜的表達(dá)。Pluschke等人，JournalofImmunologicalMethods215:27-37(1998)已經(jīng)描述了表達(dá)人-鼠嵌合抗體的小鼠的產(chǎn)生。Neuberger等人,Nature338:350-2(1989)；Lonberg等人，Int.Rev.Immunol.13(I):65-93(1995);和Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8(4):455-8(1997);1996年8月授權(quán)的美國專利No.5，545，806；1996年8月授權(quán)的美國專利No.5，545，807和1996年10月授權(quán)的美國專利No.5，569，825中已經(jīng)描述了表達(dá)人免疫球蛋白多肽的小鼠的產(chǎn)生，其公開內(nèi)容在此通過整體引用作為參考。Kuroiwa等人，NatureBiotech20(9):889-894(2002)已經(jīng)描述了表達(dá)人抗體的牛的產(chǎn)生。PCT公開號(hào)No.WO92/03918、WO02/12437，以及美國專利No.5，814，318和5，570，429也已經(jīng)描述了表達(dá)人(或人源化)免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因座(transloci)的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)以及從該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)抗體，其公開內(nèi)容在此明確地通過整體引用作為參考。所獲得的人源化抗體具有對(duì)人最小的免疫原性并且適合用于人類受試者的治療性治療。盡管上面引述的遺傳改造方法導(dǎo)致人免疫球蛋白多肽在遺傳改造小鼠中表達(dá)，但是人免疫球蛋白的表達(dá)水平低于正常水平。這可能由于在免疫球蛋白基因座中免疫球蛋白的有效表達(dá)所需的物種特異性調(diào)控元件。如在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中所顯示的人免疫球蛋白基因中存在的調(diào)控元件在非人動(dòng)物中可能不能適當(dāng)?shù)匕l(fā)揮作用。已經(jīng)描述了若干免疫球蛋白基因中的調(diào)控元件。尤其重要的是重鏈恒定區(qū)下游(3’)的增強(qiáng)子和輕鏈基因內(nèi)部(intronic)的增強(qiáng)子。此外，其它(仍待鑒定的)控制元件可能存在于免疫球蛋白基因中。在小鼠中的研究顯示了膜結(jié)合形式的免疫球蛋白分子的膜和胞質(zhì)尾部分對(duì)于人CyI基因?yàn)榧兒系男∈笱逯腥?鼠嵌合抗體的表達(dá)水平起重要作用。因此，對(duì)于動(dòng)物中異源性免疫球蛋白基因的表達(dá)，需要用通常在動(dòng)物的類似位置中發(fā)現(xiàn)的序列來代替含有增強(qiáng)子元件和編碼跨膜部分的外顯子(Ml外顯子)和胞質(zhì)尾的外顯子(M2外顯子)的序列。這些遺傳改造的動(dòng)物中的人免疫球蛋白表達(dá)也可受到攜帶人或人源化免疫球蛋白基因座的非人的B細(xì)胞發(fā)育的影響。已經(jīng)在小鼠中廣泛地研究了B細(xì)胞受體(BCR)對(duì)B細(xì)胞發(fā)育的影響。然而，還并不清楚人或部分人抗體如何組合以形成功能性BCR，以及是否該BCR將有效地影響表達(dá)人(或人源化)Ig的非人B細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的發(fā)育和存活，其反過來將影響抗體的產(chǎn)量。附圖簡述圖I示出人Iga多肽序列(SEQIDNO:1)與其它非人Iga序列(SEQIDNO:2-6)的氨基酸比對(duì)。圖2示出人IgP多肽序列(SEQIDNO:7)與其它非人IgP序列(SEQIDNO:8-12)的氨基酸比對(duì)。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供編碼BCR的嵌合Iga亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其中該嵌合Iga亞基包括非人Iga多肽序列的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列和跨膜結(jié)構(gòu)域序列；以及與SEQIDNO.I的人Iga的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一性的多肽。第二方面，本發(fā)明提供編碼BCR的嵌合IgP亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其中該嵌合Ig^亞基包括非人IgP多肽序列的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列和跨膜結(jié)構(gòu)域序列；以及與SEQIDNO.:7的人IgP的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一性的多肽。本發(fā)明的某實(shí)施方式中，非人Iga多肽序列的類型包括但不限于牛(SEQIDNO:2)uH(SEQIDNO3)IDNO4);靈長類(SEQIDNO5);*(SEQIDNO6)或其它非人序列。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，非人Ig^多肽序列的類型包括但不限于犬(SEQIDNO:8);大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDN0:10);鼠(SEQIDN0:11);雞(SEQIDNO:12)或其它非人序列。第三方面，非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括(a)編碼SEQIDNO.:1的全長人Iga亞基，或如上所限定的嵌合Iga亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，和/或(b)編碼SEQIDNO.:7的全長人Ig^亞基，或如上所限定的嵌合Ig3亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，和(c)編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其中生成的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物組合以形成人(或人源化)B細(xì)胞受體復(fù)合物。這方面的一個(gè)實(shí)施方式中，充分地降低非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的任何內(nèi)源性Ig產(chǎn)物的表達(dá)，和/或內(nèi)源性Iga和/或內(nèi)源性IgP亞基的表達(dá)。另一個(gè)實(shí)施方式中，非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物選自兔、小鼠、大鼠、豬、綿羊、山羊、鳥類、馬、驢和牛。優(yōu)選實(shí)施方式中，非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是兔。第四方面，本發(fā)明還提供來自上述限定的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分離的人(或人源化)免疫球蛋白，其是抗體或抗體片段。這一方面的某實(shí)施方式中，分離的人(或人源化)免疫球蛋白是多克隆或單克隆抗體，或者是抗體片段。該抗體片段可以來自多克隆或單克隆抗體。另外，可以標(biāo)記該抗體或抗體片段，或者將其與毒素融合以形成免疫毒素，或者與治療劑偶聯(lián)，或者與任何本領(lǐng)域充分定義及使用的異源氨基酸序列融合。一些實(shí)施方式中，該抗體片段是Fe、Fv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段。第五方面，本發(fā)明提供來自上述限定的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分離的B細(xì)胞，其中B細(xì)胞表達(dá)天然的人Iga亞基或嵌合Iga亞基和/或表達(dá)天然的人Ig3亞基或嵌合Ig@亞基，此外還表達(dá)人(或人源化)免疫球蛋白基因座。某些實(shí)施方式中，該B細(xì)胞是永生化的，且在優(yōu)選的實(shí)施方式中其源自兔。第六方面，本發(fā)明提供包含如上所述的抗體或抗體片段的抗體制劑。第七方面，本發(fā)明提供包含與可藥用成分混合的如上所述抗體或抗體片段的藥物組合物。該藥物組合物可以包含單克隆抗體或其片段，或者包含一或多種多克隆抗體或其片段。第八方面，本發(fā)明提供在非人動(dòng)物中生產(chǎn)人(或人源化)抗體的方法，包括(a)將編碼天然人Iga亞基或嵌合Iga亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，和/或編碼天然的人Ig3亞基或嵌合IgP亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人動(dòng)物中并在其中表達(dá)；和6)將編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人動(dòng)物中并在其中表達(dá)；(C)使該動(dòng)物接受抗原刺激；和((1)從該動(dòng)物中分離人(或人源化)抗體。該方面的某實(shí)施方式中，抗體是多克隆或單克隆抗體，或是多克隆或單克隆抗體的片段。此外，該抗體或抗體片段可以被標(biāo)記，或者可以與毒素融合以形成免疫毒素，或者與治療劑偶聯(lián)，或者可以與任何異源性氨基酸序列融合。第九方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)表達(dá)人(或人源化)抗體的非人動(dòng)物的方法，包括(a)將編碼天然人Iga亞基或嵌合Iga亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，和/或編碼天然人Ig3亞基或嵌合IgP亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人動(dòng)物的B細(xì)胞中并在其中表達(dá)jP(b)將編碼人(或人源化)免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人動(dòng)物中并在其中表達(dá)；其中，生成的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物組合以形成人(或人源化)B細(xì)胞受體復(fù)合物。一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)人(或人源化)抗體的非人動(dòng)物是通過基因轉(zhuǎn)換和/或體細(xì)胞高變而產(chǎn)生抗體多樣性的動(dòng)物。優(yōu)選實(shí)施方式中，該動(dòng)物是兔。發(fā)明詳述定義除非另有定義，本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)理解相同的含義。Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第二版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994),以及March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure,第四版，JohnWiley&Sons(NewYork,NY1992)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了許多本申請(qǐng)所使用術(shù)語的總體指導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的，與本文所述那些相似或等效的方法和材料。事實(shí)上，本發(fā)明并不限于所述方法和材料。出于本發(fā)明的目的，在下面限定下述術(shù)語。本文定義的“轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體”指DNA分子，其含有至少一種目的轉(zhuǎn)基因的編碼序列以及該目的轉(zhuǎn)基因在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的靶細(xì)胞中時(shí)間性、細(xì)胞特異性和/或增強(qiáng)的表達(dá)所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列?！癇細(xì)胞”定義為能夠在其生命周期的某階段進(jìn)行免疫球蛋白基因片段重排并表達(dá)免疫球蛋白基因的B譜系細(xì)胞。這些細(xì)胞包括但不限于，早期祖B細(xì)胞、晚期祖B細(xì)胞、大前B細(xì)胞、小前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞、漿細(xì)胞等。本文定義的“B細(xì)胞受體(BCR)復(fù)合物”指B細(xì)胞上表達(dá)的多亞基免疫識(shí)別受體，其包括下述亞基抗原(Ag)受體、膜結(jié)合的免疫球蛋白(mlg)、Iga亞基和Ig3亞基。Wienands等人，EMBOJ.9(2):449-455(1990)，Venkitaraman等人，Nature352:777-781(1991),Herren等人，ImmunologicRes.26(1-3):35-43(2002)已經(jīng)描述了B細(xì)胞受體、其組分及其與五類免疫球蛋白的締合。此外，還有若干已經(jīng)被克隆并測(cè)序的BCR相關(guān)蛋白質(zhì)(BAP)，但它們的功能仍未知，且其作為BCR組分的作用尚存疑問。Adachi等人，EMBOJ15(7):1534-1541(1996)和Schamel等人，PNAS100(17):9861-9866(2003)描述了BCR相關(guān)蛋白質(zhì)?！疤烊籌ga或IgP亞基”指天然存在的Iga或IgP多肽序列，其包括在給定動(dòng)物類型或相關(guān)物種中發(fā)現(xiàn)的Iga或Ig3亞基的天然存在的等位基因。這也指“全長Iga或IgP序列”。Flaswinkel等人，Immunogenetics36(4):266-69(1992)克隆了人Iga多肽序列，其檢索號(hào)為M74721(圖1，SEQIDNO:1)。Mueller等人，Eur.J.Biochem.22，1621-25(1992)克隆了人IgP多肽序列，其檢索號(hào)為M80461(圖2，SEQIDNO:7)。術(shù)語“人(或人源化)”指完全的人序列或含有一或多條人序列的序列。因此，如本文所使用，該術(shù)語包括人和人源化序列?！扒逗螴ga”亞基或蛋白質(zhì)或多肽指來自諸如大鼠、小鼠、人、兔、雞等的動(dòng)物的Iga多肽序列，其中，Iga多肽的一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域由來自另一動(dòng)物或物種的不同Iga多肽的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所代替，或者由來自不同等位基因的Iga類型或來自具有一或多個(gè)氨基酸取代的變體Iga序列或來自與給定Iga序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一性的變體Iga序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所代替。術(shù)語“嵌合Iga”和“人(或人源化)Iga”在整個(gè)說明書中互換使用。圖I也定義了來自一些非人動(dòng)物的Iga多肽序列(SEQIDN0:2_6)。“嵌合IgP”亞基或蛋白質(zhì)或多肽指來自諸如大鼠、小鼠、人、兔、雞等動(dòng)物的Ig^多肽序列，其中，IgP多肽的一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域由來自另一動(dòng)物或物種的不同IgP多肽的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所代替，或者由來自不同等位基因的Ig3類型或來自具有一或多個(gè)氨基酸取代的變體IgP序列或來自與給定IgP序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一丨丨生的變體Ig^序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所代替。術(shù)語“嵌合IgP”和“人(或人源化)IgP”在整個(gè)說明書中互換使用。圖2也定義了來自一些非人動(dòng)物的IgP多肽序列(SEQIDN0:8-12)?！鞍麅?nèi)多肽或結(jié)構(gòu)域”或“胞質(zhì)尾”指給定膜結(jié)合蛋白質(zhì)或亞基的存在于細(xì)胞內(nèi)的那部分多肽序列。通常，蛋白質(zhì)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Iga或IgP亞基的“胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列”指Iga或IgP多肽通常存在于細(xì)胞內(nèi)的多肽序列或其片段。Iga或IgP亞基的“跨膜結(jié)構(gòu)域序列”指Iga或IgP多肽跨越生物膜(例如質(zhì)膜、細(xì)胞器膜或脂雙層)的多肽序列或其片段。本文定義的“跨膜結(jié)構(gòu)域序列”包括天然存在的跨膜多肽，或者可以是非天然存在的共有序列，或它們的片段。“胞外多肽或結(jié)構(gòu)域”指給定膜結(jié)合蛋白質(zhì)或亞基通常存在于細(xì)胞外的那部分多肽序列?！癐ga或IgP的胞外結(jié)構(gòu)域”指Iga或IgP多肽存在于細(xì)胞外的多肽序列或其片段。本文所用的術(shù)語“人(或人源化)免疫球蛋白基因座”包括人免疫球蛋白或Ig基因座或其片段的天然存在的序列，人Ig基因座或其片段的天然存在的序列的簡并形式，以及編碼與由人Ig基因座或其片段天然存在的序列所編碼的多肽基本上相同的多肽序列的合成序列。具體實(shí)施方式中，人Ig基因片段賦予免疫球蛋白分子在人中的非免疫原性。此處，術(shù)語“人(或人源化)或人源化免疫球蛋白(Ig)重和/或輕鏈基因座”或“人或人(或人源化)免疫球蛋白或Ig基因座”可互換使用。本文所用的術(shù)語“人(或人源化)B細(xì)胞受體(BCR)復(fù)合物”指這樣的多亞基BCR復(fù)合物，其中Iga亞基為天然的人Iga亞基或具有如上所述的人或人源化Iga序列的嵌合Iga亞基；和/或另外，其中IgP亞基為天然的人IgP亞基或具有如上所述的人或人源化IgP序列的嵌合IgP亞基；以及另外，膜結(jié)合免疫球蛋白(mlg)是如上所述的人(或人源化)免疫球蛋白。本文所用的術(shù)語“人抗體”和“人免疫球蛋白”指包括完整的人序列的抗體及免疫球蛋白分子。本文所用的術(shù)語“人源化抗體”和“人源化免疫球蛋白”指包括人免疫球蛋白多肽序列(或由人免疫球蛋白基因片段編碼的多肽序列)的至少一部分的免疫球蛋白分子。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白分子可以分離自經(jīng)遺傳改造以產(chǎn)生人源化免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。與由動(dòng)物所制備的或由源自動(dòng)物的細(xì)胞所制備的非人源化免疫球蛋白分子相比，此類人源化免疫球蛋白分子具有對(duì)靈長類動(dòng)物，尤其是人的較小免疫原性。人源化免疫球蛋白或抗體包括通過在基因轉(zhuǎn)換動(dòng)物中的基因轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞高變而進(jìn)一步多樣化的免疫球蛋白(Ig)和抗體。此類人源化Ig或抗體并非“人源”的，這是由于它們并非由人類天然產(chǎn)生(因?yàn)槿祟惒煌ㄟ^基因轉(zhuǎn)換而多樣化其抗體譜)，但是人源化Ig或抗體因?yàn)樗鼈冊(cè)谄浣Y(jié)構(gòu)中具有人Ig序列而對(duì)于人是非免疫原性的。術(shù)語“充分地降低”內(nèi)源Ig產(chǎn)物，和/或Iga和/或IgP亞基表達(dá)指轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中內(nèi)源Ig單獨(dú)生產(chǎn)的程度，或者另外還有內(nèi)源Iga和/或IgP表達(dá)的程度降低優(yōu)選至少約30%-49%，或更優(yōu)選至少約50%-79%，或甚至更優(yōu)選至少約80_89%，或最優(yōu)選約90_100%。術(shù)語“單克隆抗體”用于指由單個(gè)B細(xì)胞克隆合成的抗體分子。術(shù)語“多克隆抗體”指由B細(xì)胞群合成的抗體分子群。具有進(jìn)行基因重排和基因轉(zhuǎn)換能力的“免疫球蛋白(Ig)基因座”在本文也稱為“功能性”Ig基因座，且具有由功能性Ig基因座產(chǎn)生的多樣性的抗體在本文也稱為“功能性”抗體或“功能性”的抗體譜。本文所用的術(shù)語“非人(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物”包括但不限于哺乳動(dòng)物，例如非人靈長類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物(例如小鼠和大鼠)、非嚙齒類哺乳動(dòng)物，例如兔、豬、綿羊、山羊、牛、豬、馬和驢，以及鳥類(例如雞、火雞、鴨、鵝等)。本文使用的術(shù)語“非靈長類動(dòng)物”包括但不限于除靈長類動(dòng)物以外的哺乳動(dòng)物，包括但不限于上面具體列舉的哺乳動(dòng)物。迸述本發(fā)明至少部分基于這樣的認(rèn)識(shí)，即非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的人或人源化免疫球蛋白(包括免疫球蛋白鏈)的生產(chǎn)可以通過在該動(dòng)物的B細(xì)胞中共表達(dá)人或人源化Iga和/或Ig^而顯著增加。據(jù)認(rèn)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞中包括人或人源化Iga和/或IgP重組并提高B細(xì)胞受體蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而增強(qiáng)攜帶該轉(zhuǎn)基因的B細(xì)胞的抗原識(shí)別、B細(xì)胞發(fā)育和存活。在已經(jīng)攜帶了人或人源化Iga和/或IgP轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中共表達(dá)人源化免疫球蛋白將極大地提高人源化免疫球蛋白的生產(chǎn)。另外還希望針對(duì)優(yōu)選內(nèi)源性Ig以及內(nèi)源性Iga和/或IgP都敲除的背景，表達(dá)人或人源化Iga和/或IgP轉(zhuǎn)基因和人源化免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因。B細(xì)胞受體及其相關(guān)蛋白質(zhì)B細(xì)胞受體由膜結(jié)合免疫球蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異源二聚體所組成，該異源二聚體由兩個(gè)稱作Iga和IgP的二硫鍵連接的糖蛋白所組成。此外，已經(jīng)描述了BCR相關(guān)蛋白質(zhì)(BAP)0BCR表達(dá)對(duì)于B細(xì)胞發(fā)育、選擇和存活很重要。這些過程依賴于經(jīng)過Iga/Ig^異源二聚體的BCR信號(hào)。這些分子的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域攜帶含有若干組裝成所謂的免疫受體酪氨酸活化模體(ITAM)的酪氨酸殘基的序列模體，其在BCR引發(fā)下磷酸化。基因靶向?qū)嶒?yàn)顯示了Iga/IgP異源二聚體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐細(xì)胞發(fā)育是至關(guān)重要的。由Iga/IgP異源二聚體轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)參與發(fā)育中的B細(xì)胞的陽性和陰性篩選。膜結(jié)合免疫球蛋白(mlg)分子由兩條重鏈(形成同源二聚體)和兩條輕鏈(每條共價(jià)結(jié)合重鏈之一)組成。重鏈的N-末端攜帶VH結(jié)構(gòu)域，取決于同種型，該結(jié)構(gòu)域后為4(IgM,IgE),3(IgG,IgA)或2(IgD)個(gè)C-結(jié)構(gòu)域。通過VH:VL對(duì)的高變區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，每個(gè)mlg分子具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。mlgM分子與分泌型IgM的不同之處在于分泌型IgM形成具有10個(gè)潛在抗原結(jié)合位點(diǎn)的五聚體。在分泌的US鏈的C-末端部分中的序列控制五聚化。膜結(jié)合Pm鏈沒有這一由22個(gè)氨基酸組成的部分，取而代之，其攜帶由Ml和M2外顯子編碼的48個(gè)C末端氨基酸。序列的Pm特異性部分是整個(gè)IgM分子在進(jìn)化上最保守的部分。其在小鼠、兔和人HlIgM之間幾乎相同，且即使將小鼠與鯊魚的HlIgM相比，該保守性也仍很明顯。當(dāng)將小鼠mlgM的C末端序列與其它mlg同種型的C末端序列相比時(shí)，氨基酸的保守性也很明顯。這一發(fā)現(xiàn)提供了保守的跨膜氨基酸在H鏈同源二聚體中彼此相互作用或與Iga和IgP亞基相互作用的證據(jù)。Iga和Ig3都具有22個(gè)氨基酸跨膜片段，其后為含有若干酪氨酸殘基的約40-70個(gè)氨基酸的C末端胞質(zhì)尾。在N末端，兩種蛋白質(zhì)都攜帶前導(dǎo)肽，其后為含半胱氨酸殘基、色氨酸、以及若干在Ig超家族蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的其它保守氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域。這表明Iga和IgP亞基的胞外部分形成類Ig結(jié)構(gòu)域。除了形成結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸，Iga和Ig3序列還含有其它可能在Iga和Ig3亞基之間形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸。在小鼠和人Iga序列之間的比較顯示所有對(duì)于Ig結(jié)構(gòu)域和鏈間鍵合的信息重要的殘基在兩物種的Iga之間是保守的。然而，這一比較也顯示胞外部分中的序列保守性只達(dá)到約56%，而跨膜和胞質(zhì)尾分別顯示100%和87%的保守性。后者反映了分子C末端部分內(nèi)的殘基的重要性。mlgM分子與Iga/IgP異源二聚體的組裝對(duì)于mlgM的表面表達(dá)是必要的?？梢酝ㄟ^使Pm鏈的跨膜部分突變而消除這一需要。例如，用H-2KK分子的跨膜部分代替Pm鏈的跨膜區(qū)導(dǎo)致mlgM的表面表達(dá)不依賴于Iga/Ig0。這些數(shù)據(jù)表明iim鏈和Iga/Ig^異源二聚體之間的特異相互作用需要Pm跨膜區(qū)。此外，B細(xì)胞具有防止跨膜蛋白質(zhì)復(fù)合物的單個(gè)或不完全組裝的組分轉(zhuǎn)運(yùn)出ER的控制機(jī)制。盡管BCR的跨膜部分可能是形成BCR復(fù)合物所需的最重要結(jié)構(gòu)，但也提示Iga和Ig^的胞外Ig結(jié)構(gòu)域在mlgM分子的結(jié)合上起作用。例如，在不表達(dá)小鼠Iga的小鼠細(xì)胞系J558LPm中，用Iga轉(zhuǎn)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染恢復(fù)了mlgM的表面表達(dá)。引人注意地，用小鼠Iga基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染導(dǎo)致比用人Iga基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染的表達(dá)高10倍。此外，這一數(shù)據(jù)提示Iga的胞外結(jié)構(gòu)域可與mlgM的胞外部分相互作用。另一方面，帶有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠確實(shí)表達(dá)人免疫球蛋白。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中B細(xì)胞發(fā)育、B細(xì)胞存活或人(或人源化)mlgM的表達(dá)是否受到攜帶人(或人源化)mlgM基因的B細(xì)胞中人Iga和/或人Ig^的共表達(dá)的影響仍舊不清楚。此外，已經(jīng)克隆并測(cè)序了若干BCR相關(guān)蛋白質(zhì)(BAP)，但其功能仍舊未知。盡管這些蛋白質(zhì)與BCR相關(guān)，但它們作為BCR組分的作用尚存疑問。然而，BAP的普遍表達(dá)以及強(qiáng)的進(jìn)化保守性提示它們一定起重要作用，可能在普遍的細(xì)胞過程中發(fā)揮作用且已提出了若干假設(shè)功能。例如，這些蛋白質(zhì)可參與BCR偶聯(lián)到細(xì)胞骨架，或者參與控制囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。最后，提出了它們作為分子伴侶起作用，幫助跨膜蛋白質(zhì)的折疊和組裝。相關(guān)文獻(xiàn)Wienands等人，EMBOJ.9(2)449~455(1990),Venkitaraman等人，Nature352777-781(1991)，Herren等人，ImmunologicRes.26(1-3):35-43(2002)描述了B細(xì)胞受體、其組分以及其與五類免疫球蛋白的相關(guān)性。Adachi等人，EMBOJ15(7):1534-1541(1996)和Schamel等人，PNAS100(17)=9861-9866(2003)描述了BCR締合的蛋白質(zhì)。Reth,AnnualReviewsofImmunology10:97-121(1992),Kraus等人，Cell117(6):787-800(2004),Sayegh等人，ImmunologicalReviews175:187-200(2000),Reichlin等人，JournalofExperimentalMedicine193(1):13-23(2001),Pike等人，JournalofImmunology172:2210-2218(2004),Pelanda等人，JournalofImmunology169:865-872(2002)描述了B細(xì)胞受體對(duì)B細(xì)胞發(fā)育和存活的影響。Cronin等人，J.Immunology161252-259(1998)，Muller等人，PNAS97(15):8451-8454(2000)，Cragg等人，Blood1003068-3076(2002)，Wang等人，J.Immunology171:6381-6388(2003)，F(xiàn)uentes-Panand等人，J.Immunology174:1245-1252(2005)描述了BCR信號(hào)調(diào)控及其對(duì)B細(xì)胞發(fā)育及凋亡的影響。上面引用文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此通過整體引用作為參考。因此，本發(fā)明涉及用于在B細(xì)胞中，尤其是在能夠產(chǎn)生多樣化的人(或人源化)抗體譜的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞中共表達(dá)人(或人源化)Iga和/或人(或人源化)IgP以提高在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中B細(xì)胞存活的方法。動(dòng)物的類型包括較大型非人動(dòng)物，像兔、鳥、雞、綿羊、山羊、牛、豬、馬和驢。當(dāng)這些動(dòng)物表達(dá)Ig轉(zhuǎn)基因座，由于其較大的體型，其抗體產(chǎn)量也將是較大的。因此，本發(fā)明旨在產(chǎn)生較大的建立者動(dòng)物，其通過增強(qiáng)的B細(xì)胞發(fā)育和存活生產(chǎn)較高量的人(或人源化)免疫球蛋白。因此，本發(fā)明涉及編碼全長人Iga和IgP多肽的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，或編碼嵌合或人源化Iga和嵌合或人源化IgP多肽的嵌合轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，這將在下面進(jìn)一步限定?！熬幋a人Iga和/或IgP多肽的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體”分別指天然的、全長人Iga和/或Ig0DNA序列，以及編碼Iga或Ig0的功能性等效多肽的任何變體，密碼子優(yōu)化的DNA序列，但其根據(jù)密碼子的簡并性而具有不同的DNA序列。這一概念將在下面進(jìn)一步詳細(xì)討論。SEQIDN01(圖I)定義了天然的、全長人Iga多肽序列。SEQIDNO7(圖I)定義了天然的、全長人IgP多肽序列。本文還涉及“編碼嵌合或人(或人源化)Iga的核酸分子或轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體”?！扒逗螴ga”亞基或蛋白質(zhì)或多肽指來自動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、人、兔、雞等)的Iga多肽序列，其中Iga多肽的一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域由來自另一動(dòng)物或物種的不同Iga多肽的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所替換，或由來自不同等位的Iga類型、或來自具有一或多個(gè)氨基酸取代的變體Iga序列、或來自與給定Iga序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一丨丨生的變體Iga序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所替換。術(shù)語“嵌合Iga”和“人(或人源化)Iga”在本說明書通篇中互換使用。從其可以獲得胞內(nèi)和/或跨膜結(jié)構(gòu)域序列的非人Iga多肽序列例如包括但不限于牛(SEQIDNO:2);鼠(SEQIDNO:3);犬(SEQIDNO:4);靈長類(SEQIDNO:5);兔(SEQIDNO:6)或其它非人序列。本文還涉及“編碼嵌合或人(或人源化)Ig3的核酸分子或轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體”?！扒逗螴gP”亞基或蛋白質(zhì)或多肽指來自動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、人、兔、雞等)的Ig^多肽序列，其中IgP多肽的一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域由來自另一動(dòng)物或物種的不同IgP多肽的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所替換，或由來自不同等位的Ig3類型、或來自具有一或多個(gè)氨基酸取代的變體Ig^序列、或來自與給定IgP序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一丨丨生的變體Ig@序列的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所替換。術(shù)語“嵌合IgP”和“人(或人源化)IgP”在本說明書通篇中互換使用。從其可以獲得胞內(nèi)和/或跨膜結(jié)構(gòu)域序列的非人IgP多肽序列例如包括但不限于犬(SEQIDNO:8);大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDN0:10);鼠(SEQIDN0:11);雞(SEQIDNO:12)或其它非人序列。因此，簡言之，嵌合Iga或IgP轉(zhuǎn)基因由I)分別編碼人Iga或IgP的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和2)分別編碼來自宿主轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的Iga或IgP的跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列所組成。再一方面，本發(fā)明還涉及編碼人(或人源化)免疫球蛋白或基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，如之前遞交的于2003年I月23日公開的美國公開No.2003-0017534,以及于2006年2月2日公開的美國公開No.2006-0026696的美國申請(qǐng)所描述的，所述申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過整體引用作為參考。其中公開的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、其產(chǎn)生的B細(xì)胞或細(xì)胞系，以及相關(guān)方法也形成本發(fā)明的一方面。上述提及方面的替代的方法中，本發(fā)明還涉及編碼人(或人源化)免疫球蛋白或Ig鏈或基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，如1996年8月授權(quán)的美國專利No.5，545，806；1996年8月授權(quán)的美國專利No.5，545，807以及1996年10月授權(quán)的美國專利No.5，569，825，2006年6月20日授權(quán)的美國專利No.7,064,244;或PCT公開No.WO92/03918,WO02/12437，和美國專利No.5,814,318及5，570,429中所述；也參見Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA,90:2551(1993);Jakobovits等人，Nature,362:255(1993);Bruggemann等人，YearinImmunol.,7:33(1993);Pluschke等人，JournalofImmunologicalMethods215:27-37(1998)；Neuberger等人，Nature338:350-2(1989)；Lonberg等人，Int.Rev.Immunol.13(I):65-93(1995);和Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8(4):455-8(1997)；以及Kuroiwa等人,NatureBiotech20(9):889-894(2002),其公開內(nèi)容在此通過整體引用作為參考。其中公開的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、其產(chǎn)生的B細(xì)胞或細(xì)胞系，以及相關(guān)方法也形成本發(fā)明的一方面?？赏ㄟ^包括前核的微注射、轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)移克隆、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、睪丸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等多種技術(shù)將轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物基因組。一個(gè)實(shí)施方式中，通過免疫特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞中優(yōu)選表達(dá)人Iga和/或IgP基因。此人Iga或IgP基因的表達(dá)優(yōu)選僅在B細(xì)胞中發(fā)生，導(dǎo)致非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的增強(qiáng)的B細(xì)胞發(fā)育和存活?！癇細(xì)胞特異性啟動(dòng)子”指任何B細(xì)胞特異性基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列，和/或其變體或基因改造的部分，它們通?？刂艬細(xì)胞中表達(dá)的基因的表達(dá)，其實(shí)例包括但不限于⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、⑶23、⑶24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b(也稱作829或化3)、mb_l(也稱作Iga)、酪氨酸激酶blk，VpreB，免疫球蛋白重鏈，免疫球蛋白K輕鏈，免疫球蛋白\輕鏈，免疫球蛋白J鏈等的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。優(yōu)選實(shí)施方式中，⑶79a、⑶79b或K輕鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)人Iga和/或IgP基因的B細(xì)胞特異性表達(dá)。又一個(gè)實(shí)施方式中，包括編碼人Iga和/或IgP基因的核酸分子的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體與包括外源免疫球蛋白或免疫球蛋白(Ig)鏈轉(zhuǎn)基因基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體共表達(dá)。該實(shí)施方式中，Ig轉(zhuǎn)基因基因座和人Iga和/或IgP轉(zhuǎn)基因都可存在于相同的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體或兩種不同的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中。后者中，兩種轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體可同時(shí)或按順序?qū)敕侨宿D(zhuǎn)基因動(dòng)物中。根據(jù)本發(fā)明，本文包括Iga或IgP的人全長或只是胞外結(jié)構(gòu)域的變體。這指允許遺傳密碼子簡并性的核酸序列，編碼包括功能性等效殘基的氨基酸取代和/或增強(qiáng)胞外結(jié)構(gòu)域的功能性的突變的多肽序列的核酸序列?！鞍饨Y(jié)構(gòu)域的功能性”包括但不限于形成能夠進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的BCR。對(duì)于允許遺傳密碼子簡并性，本發(fā)明包括與人Iga和人IgP的胞外多肽序列具有至少約70%、更通常約80-85%，優(yōu)選至少約90%和最優(yōu)選約95%序列同一性的序列。術(shù)語生物功能等效性是本領(lǐng)域充分知曉的且進(jìn)一步在本文中詳細(xì)定義。因此，在氨基酸水平具有約70%至約80%;或更優(yōu)選約81%至約90%;或甚至更優(yōu)選約91%至約99%同一性的序列，只要保留了蛋白質(zhì)的生物活性，就被認(rèn)為是與人Iga和IgP功能等效的。本文使用的術(shù)語功能等效的密碼子指編碼相同氨基酸的密碼子(例如精氨酸或絲氨酸的六種密碼子)，且也指編碼生物學(xué)等效的氨基酸的密碼子。下面是基于改變蛋白質(zhì)的氨基酸以產(chǎn)生等效的，或者甚至是改良的第二代分子的討論。例如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可由其它氨基酸取代而不明顯喪失與諸如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)的相互結(jié)合能力。由于正是蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)限定該蛋白質(zhì)的生物功能性活性，可以在蛋白質(zhì)序列及在其實(shí)質(zhì)的DNA編碼序列中進(jìn)行某些氨基酸取代，然而還產(chǎn)生具有類似特性的蛋白質(zhì)。因此考慮可對(duì)基因的DNA序列進(jìn)行多種改變而不明顯喪失其生物學(xué)利用性或活性，如下所述。進(jìn)行該改變時(shí)，也可考慮氨基酸的親水性指數(shù)(hydropathicindex)。氨基酸的親水性指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)功能中的重要性是本領(lǐng)域普遍知曉的(Kyte&Doolittle,1982)。氨基酸的相關(guān)親水特性對(duì)生成的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)起作用是可接受的，其反過來限定蛋白質(zhì)與其它分子，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。本領(lǐng)域還知曉可以基于親水性而有效地進(jìn)行類似氨基酸的取代。引入本文作為參考的美國專利No.4，554，101說明了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性(受其相鄰氨基酸的親水性所控制)與該蛋白質(zhì)的生物特性相關(guān)。如在美國專利No.4，554，101中所詳述的將下面的親水值指定給氨基酸殘基精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+-.I);谷氨酸(+3.0.+'I);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5.+'I);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。應(yīng)理解氨基酸可以由具有相似親水值的另一種氨基酸所取代而仍舊產(chǎn)生生物學(xué)等效的及免疫學(xué)等效的蛋白質(zhì)。此類改變中，優(yōu)選親水值在+-.2之內(nèi)，尤其優(yōu)選在+_.I之內(nèi)，甚至尤其更優(yōu)選在+_.0.5之內(nèi)的氨基酸的取代。如本文所概述，氨基酸取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]多種前述特性的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。制備本發(fā)明多肽的另一個(gè)實(shí)施方式是使用肽模擬物。模擬物是模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組件的含肽分子(Johnson1993)。使用肽模擬物的基本原理在于存在的蛋白質(zhì)的肽主鏈主要以促進(jìn)分子相互作用(例如抗體和抗原的那些相互作用)的方式定向氨基酸側(cè)鏈。期望肽模擬物允許類似于天然分子的相互作用。這些原理可與上面概述的原理聯(lián)合用于遺傳改造具有人Iga或Ig3的多種天然特征且特性改變并改良的第二代分子。因此，多種編碼人Iga或IgP以及人Iga或IgP的功能性等效多肽的核酸序列變體在本發(fā)明中是有用的。含有目的基因的轉(zhuǎn)基因載體可導(dǎo)入受體細(xì)胞然后通過隨機(jī)整合或靶向整合而整合到受體細(xì)胞的基因組中。對(duì)于隨機(jī)整合，可以通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含有人Iga或IgP的轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入動(dòng)物受體細(xì)胞中。例如，轉(zhuǎn)基因載體可以直接注射到受精卵母細(xì)胞的前核中。也可以在卵母細(xì)胞受精前通過轉(zhuǎn)基因載體與精子共孵育而導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因載體。可以由受精的卵母細(xì)胞發(fā)育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另一種導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因載體的方法是通過轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞并隨后將該經(jīng)遺傳修飾的胚胎干細(xì)胞注射到發(fā)育胚中。或者，可以將轉(zhuǎn)基因載體(裸露的或與促進(jìn)試劑組合)直接注射到發(fā)育的胚中。最終，由該胚產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其含有整合在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一些體細(xì)胞基因組中的人(或人源化)Ig轉(zhuǎn)基因。具體實(shí)施方式中，含有人Iga或IgP的轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合到源自內(nèi)源性Iga或Ig^受損表達(dá)的動(dòng)物品系的受體細(xì)胞(例如受精卵母細(xì)胞或發(fā)育胚)的基因組中。該動(dòng)物品系的應(yīng)用允許從人(或人源化)轉(zhuǎn)基因Ig基因座上優(yōu)先表達(dá)免疫球蛋白分子?；蛘撸哂腥?或人源化)Iga和/或IgP轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以與內(nèi)源性Iga和/或IgP受損表達(dá)的動(dòng)物品系交配?？梢垣@得受損的Iga和/或IgP及人(或人源化)Iga和/或Ig^的純合后代?；蛘?，可使用反義技術(shù)、細(xì)胞內(nèi)抗Iga和/或IgP表達(dá)等來抑制或降低內(nèi)源性Iga和/或IgP的表達(dá)。一個(gè)實(shí)施方式中，選擇用于敲除宿主動(dòng)物Iga和/或Ig^的內(nèi)源性生產(chǎn)的方法是RNA干擾(RNAi)法，其將雙鏈RNA(dsRNA)或更優(yōu)選，短的或小干擾RNA雙鏈(SiRNA)導(dǎo)入具有胞內(nèi)宿主動(dòng)物Iga和/或IgP核酸序列的B細(xì)胞中。這可以使用市售可得的試劑盒而實(shí)現(xiàn)，包括但不限于來自Invitrogen公司的BlockiT或StealthRNA試劑盒。對(duì)于靶向整合，可以將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入適合的動(dòng)物受體細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞或已經(jīng)分化的體細(xì)胞。此后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(參見例如，Kuroiwa等人,NatureGenetics,2004年6月6日)選擇通過同源重組而整合到動(dòng)物基因組且代替了相應(yīng)的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。經(jīng)選擇的細(xì)胞然后可與去核的核轉(zhuǎn)移單元細(xì)胞(例如卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞)融合，其是全能的且能夠形成功能性新生兒。按照成熟的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行融合。也可以通過使用注射移液管的顯微手術(shù)進(jìn)行卵母細(xì)胞的核去除及核轉(zhuǎn)移(參見例如，Wakayama等人,Nature(1998)394:369)。然后在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生成的卵細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移到同步化的受體中以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?；蛘?，可以將經(jīng)選擇的遺傳修飾的細(xì)胞注射到發(fā)育的胚中，該胚隨后發(fā)育成嵌合動(dòng)物。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以通過下述方法制造能夠生產(chǎn)人(或人源化)Iga和/或Ig^的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將本文上述的一或多種重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，所述載體之一攜帶人Iga和/或IgP基因片段，該片段相連于與內(nèi)源性Iga和/或IgP基因片段的側(cè)翼序列同源的5’和3’側(cè)翼序列，然后選擇通過同源重組使其內(nèi)源性Iga和/或IgP基因片段由人Iga和/或IgP基因片段代替的細(xì)胞，并從所選的遺傳修飾的受體細(xì)胞得到動(dòng)物。與轉(zhuǎn)基因載體的靶向插入類似，適合在本方法中用作受體細(xì)胞的細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞或已經(jīng)分化的體細(xì)胞?？梢酝ㄟ^諸如轉(zhuǎn)染的任何可行方法將攜帶人Iga和/或Ige基因片段的重組載體導(dǎo)入該受體細(xì)胞。此后，可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法選擇通過同源重組由人Iga和/或IgP基因片段代替了相應(yīng)的內(nèi)源性Iga和/或IgP基因片段的細(xì)胞。這些遺傳修飾的細(xì)胞可以在用于克隆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的核轉(zhuǎn)移過程中用作核供體細(xì)胞。或者，可以將經(jīng)選擇的遺傳修飾的胚胎干細(xì)胞注射到發(fā)育胚中，該胚隨后發(fā)育成嵌合動(dòng)物。具體實(shí)施方式中，可通過直接將轉(zhuǎn)基因注射到胚中或間接地將它們注射到受孕母體或產(chǎn)蛋母雞中而將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入胚胎期的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中。由任意前述方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物形成本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在其基因組中至少具有一個(gè)(即一或多個(gè))人(或人源化)Iga和/或IgP基因，可以由該基因生產(chǎn)功能性人(或人源化)Iga和/或IgP蛋白質(zhì)。此外，優(yōu)選在針對(duì)于內(nèi)源性Ig以及內(nèi)源性Iga和/或IgP敲除的任一或更優(yōu)選兩者的敲除背景下，表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，即人或人源化Iga和/或IgP轉(zhuǎn)基因和人源化免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因。從而，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠在具有充分地降低內(nèi)源性Ig表達(dá)和更優(yōu)選也充分地降低內(nèi)源性Iga和/或Ig3的背景下，重排人(或人源化)Ig基因座并有效表達(dá)功能性人(或人源化)抗體譜。這一上下文中，“充分地”指僅僅是內(nèi)源性Ig表達(dá)或還有內(nèi)源性Iga和/或IgP表達(dá)的內(nèi)源性生產(chǎn)的程度降低優(yōu)選至少約30-49%，或更優(yōu)選至少約50-79%，或甚至更優(yōu)選至少約80-89%，或最優(yōu)選約90_100%。本發(fā)明提供表達(dá)一或多種人(或人源化)Ig基因座和人(或人源化)Igd和/或Ig^的轉(zhuǎn)基因兔，其能夠使人(或人源化)Ig基因座進(jìn)行重排和基因轉(zhuǎn)換，并且表達(dá)功能性人(或人源化)抗體譜。優(yōu)選這些兔還不產(chǎn)生大量的功能性內(nèi)源兔免疫球蛋白或功能性內(nèi)源兔Iga和/或Ig^。本發(fā)明還提供其它表達(dá)一或多種人(或人源化)Ig基因座和人(或人源化)Iga和/或IgP的大型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括但不限于鳥類、嚙齒類和家畜像牛、豬、綿羊、山羊、驢、馬等。而且優(yōu)選，這些動(dòng)物還不產(chǎn)生大量的功能性內(nèi)源免疫球蛋白或功能性內(nèi)源Iga和/或Ig^。從而，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠使人(或人源化)Ig基因座重排并以提高的產(chǎn)量有效表達(dá)功能性人(或人源化)抗體譜。本發(fā)明還涉及分離自上述不同類型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞，其表達(dá)人(或人源化)Iga和/或Ig3基因和人(或人源化)免疫球蛋白基因座。此外，可以使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知且使用的常規(guī)方法，包括但不限于使用病毒轉(zhuǎn)化等來使此類B細(xì)胞永生化?？乖庖邔?dǎo)致在所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生抗相同抗原的人(或人源化)抗體。盡管本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及具有人(或人源化)Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，應(yīng)理解具有靈長類動(dòng)物源化的Ig基因座和靈長類動(dòng)物源化的多克隆抗血清的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也在本發(fā)明的精神內(nèi)。與人(或人源化)多克隆抗血清組成類似，靈長類動(dòng)物源化的多克隆抗血清組成可能在人類個(gè)體中具有降低的免疫原性。一旦制造了能夠產(chǎn)生多樣化的人(或人源化)免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(如下進(jìn)一步提出)，可以通過用抗原免疫該動(dòng)物而容易地獲得抗該抗原的人(或人源化)免疫球蛋白和人(或人源化)抗體制劑。多種抗原可以用于免疫轉(zhuǎn)基因宿主動(dòng)物。該抗原包括微生物，例如活的、減毒的或死的病毒和單細(xì)胞生物(例如細(xì)菌和真菌)、微生物片段，或分離自該微生物的抗原分子。用于免疫動(dòng)物的優(yōu)選細(xì)菌抗原包括來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的純化的抗原，例如5型和8型莢膜多糖、毒力因子的重組型，例如a-毒素、粘附素結(jié)合蛋白、膠原結(jié)合蛋白和纖連蛋白結(jié)合蛋白。優(yōu)選的細(xì)菌抗原還包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單抱菌(Pseudomonasaeruginosa)、腸球菌(enterococcus)、腸桿菌屬(enterobacter)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的減毒型或來自這些細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液?？梢杂糜诿庖叩钠渌?xì)菌抗原包括來自銅綠假單孢菌、腸球菌、腸桿菌屬和肺炎克雷伯氏菌的純化的脂多糖(LPS)、莢膜抗原、莢膜多糖和/或外膜蛋白質(zhì)的重組型、纖連蛋白連接蛋白，內(nèi)毒素和外毒素。用于制備抗真菌抗體的優(yōu)選抗原包括真菌的減毒型或其外膜蛋白質(zhì)，該真菌包括但不限于白假絲酵母(Candidaalbicans)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)和新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)。用于免疫以產(chǎn)生抗病毒抗體的優(yōu)選抗原包括病毒的被膜蛋白質(zhì)和減毒型，該病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(尤其是F-蛋白)，丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、EBV和HSV。可以通過用分離的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系的腫瘤相關(guān)抗原免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而產(chǎn)生用于治療癌癥的治療性抗體，腫瘤相關(guān)抗原包括但不限于Her-2-neu抗原(其抗體用于治療乳腺癌);⑶19、⑶20、⑶22和⑶53抗原(其抗體用于治療B細(xì)胞淋巴瘤)，(3)前列腺特異的膜抗原(PMSA)(其抗體用于治療前列腺癌)，和17-1A分子(其抗體用于治療結(jié)腸癌)?？梢岳没虿焕米魟?，通過任何便捷的方式將抗原施用于轉(zhuǎn)基因宿主動(dòng)物，并且可以按照預(yù)定的安排將抗原施用于轉(zhuǎn)基因宿主動(dòng)物。免疫后，可以將來自經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血清或乳液分級(jí)分離用于純化抗原特異的藥物級(jí)多克隆抗體。轉(zhuǎn)基因鳥類的情況下，也可以通過分級(jí)分離卵黃而制備抗體?？赏ㄟ^色譜(親和、離子交換、凝膠過濾等)，用諸如硫酸銨的鹽，諸如乙醇的有機(jī)溶劑或諸如聚乙二醇的聚合物選擇性沉淀來獲得濃縮的、純化的免疫球蛋白級(jí)分。經(jīng)分級(jí)分離的人(或人源化)抗體可溶解或稀釋在適于人靜脈內(nèi)給藥的無毒性、無致熱原的介質(zhì)中，例如滅菌的緩沖生理鹽水。用于給藥的抗體制劑通常特征為具有濃度為0.I至100mg/ml,更通常I至IOmg/ml的免疫球蛋白?？贵w制劑可含有多種同種型的免疫球蛋白?；蛘?，抗體制劑可僅含有一種同種型的抗體，或若干經(jīng)選擇的同種型的抗體。為了制造人(或人源化)單克隆抗體，從已排除其表達(dá)動(dòng)物內(nèi)源性免疫球蛋白的B細(xì)胞的已免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離脾細(xì)胞。分離的脾細(xì)胞或者用于與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞融合以生產(chǎn)雜交瘤，或通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)克隆編碼抗體的cDNA并在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)。制造多克隆抗體的方法在本領(lǐng)域是成熟的。參見例如，歐洲專利申請(qǐng)0583980A1(“MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits，，)、美國專利No.4，977，081(“StableRabbit-mouseHybridomasAndSecretionProductsThereof”)、W097/16537(“StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereof”)和EP049105761(^HybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinG”)，其公開內(nèi)容在此通過引用作為參考。Andris-Widhopf等人，“Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay，，，JImmunolMethods242:159(2000)和Burton,D.R.,“Phagedisplay”，Immunotechnology1:87(1995)描述了由克隆的cDNA分子體外生產(chǎn)單克隆抗體，其公開內(nèi)容在此通過引用作為參考。多數(shù)情況下，抗體制劑由沒有(例如通過化學(xué)品或酶)修飾的免疫球蛋白組成，即由動(dòng)物所制備的沒有額外修飾的人(或人源化)抗體組成?；蛘?，可對(duì)免疫球蛋白級(jí)分進(jìn)行處理，例如酶消化(例如用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖溶酶、糖苷酶、核酶等)、加熱等和/或進(jìn)一步分級(jí)分離以產(chǎn)生“抗體片段”。本發(fā)明還包括藥物組合物或抗體制劑,其包括由上面限定的方法所獲得的抗體或其片段。本文所用的術(shù)語“可藥用成分”或“制劑”旨在涵蓋包括特定量的所主張的活性成分，即人(或人源化)抗體或抗體片段，以及任何直接或間接由該特定量的特定活性成分的組合得到的產(chǎn)品。該術(shù)語旨在涵蓋包括該活性成分和組成載體的惰性成分的產(chǎn)品，以及直接或間接從任何兩種或更多種成分的組合、絡(luò)合或聚集得到的、或由一種或多種成分的分解得到的、或由一種或多種成分的反應(yīng)或相互作用的其他類型得到的產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的“藥物組合物”涵蓋由混合任何本發(fā)明的活性化合物和可藥用載體而制造的任何組合物。術(shù)語“給藥”和/或“給予”化合物應(yīng)理解為指向需要治療的個(gè)體提供任何配方的任何本發(fā)明的活性化合物。用于給予本發(fā)明化合物的藥物組合物可方便地以劑量單位形式存在且可通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法制備。適合使用的方法和載體是現(xiàn)有技術(shù)中充分描述的那些，且例如，見Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro等人編，第20版(2000),當(dāng)然，免疫學(xué)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將容易地理解其它方法是已知的且適于制備本發(fā)明的組合物。所有的方法包括使活性成分與組成一或多種輔助成分的載體組合的步驟。一般地，通過使活性成分均一，并立即與液體載體或細(xì)粉碎的固體載體或與兩者組合，然后(必要時(shí))將該產(chǎn)品成型為期望的制劑而制備藥物組合物。該藥物組合物中包括上面討論過的，足以對(duì)疾病的病程或癥狀產(chǎn)生期望效果的有效量的活性成分。此外，美國專利No.6，706，289描述了用于控釋、緩釋抗體分子的配方，其方法在此通過引用作為參考。因此，轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體、包括該轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的載體以及使用上面描述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是本發(fā)明的實(shí)施方式。通過下述實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例I、用人Iga和Ig|3轉(zhuǎn)染兔B細(xì)胞系為了證明人Iga和IgP對(duì)人mlgM在兔B細(xì)胞中表達(dá)的影響，用編碼人Iga或Ig^或人mlgM的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。將人Iga和人IgP和人mlgM編碼基因克隆入表達(dá)載體中。用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染永生化的兔B細(xì)胞系并將該細(xì)胞在含有用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體的新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用對(duì)人mlgM和人Iga和/或IgP特異的抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗性細(xì)胞。編碼人mlgM的表達(dá)載體對(duì)兔B細(xì)胞的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致人mlgM的低細(xì)胞表面表達(dá)。人Iga和/或IgP的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致人mlgM的高細(xì)胞表面表達(dá)。這證明人Iga和/或IgP對(duì)于人(或人源化)的或嵌合mlgM的高細(xì)胞表面表達(dá)是必要且足夠的。實(shí)施例2、使用人Iga和Ig|3轉(zhuǎn)染源自仟何動(dòng)物的B細(xì)胞系為了證明人Iga和IgP對(duì)源自動(dòng)物的B細(xì)胞中人mlgM的表達(dá)的影響，用編碼人Iga或IgP或人mlgM的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染源自雞(DT40)、牛和豬的B細(xì)胞。用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染永生化的B細(xì)胞系并將該細(xì)胞在含有用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體的新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用對(duì)人mlgM和人Iga和/或IgP特異的抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗性細(xì)胞。編碼人mlgM的表達(dá)載體對(duì)兔B細(xì)胞的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致人mlgM的低細(xì)胞表面表達(dá)。人Iga和/或IgP的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致人mlgM的高細(xì)胞表面表達(dá)。這證明人Iga和/或Ig^對(duì)于人(或人源化)的或嵌合mlgM的高細(xì)胞表面表達(dá)是必要且足夠的。實(shí)施例3、表達(dá)人源化免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因兔，其同時(shí)表達(dá)人Iga和/或Igg或不表達(dá)人Iga和/或Igg按Fan等人(Pathol.Int.49:583-594，1999)所述產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因兔。簡言之，使用標(biāo)準(zhǔn)方法使雌兔超排卵并與雄兔交配。從輸卵管收集前核期的受精卵并將其置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，如補(bǔ)充了20%胎牛血清的Dulbecco氏磷酸緩沖鹽水。在一對(duì)操作手的輔助下，將外源DNA(例如含有人(或人源化)免疫球蛋白基因座或人Iga或人IgP的表達(dá)載體)微注射到前核中。將形態(tài)學(xué)上存活的受精卵轉(zhuǎn)移到假孕兔的輸卵管中。通過注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)假孕。約0.1-1%的經(jīng)注射的受精卵發(fā)育成活的轉(zhuǎn)基因兔。通過PCR和FISH確認(rèn)基因組中的轉(zhuǎn)基因整合。使用ELISA檢測(cè)法來測(cè)定轉(zhuǎn)基因建立者兔的血清中含人IgG和/或人K輕鏈抗原決定簇的抗體的存在。通過流式細(xì)胞術(shù)分析B細(xì)胞表面的抗體表達(dá)。具有編碼人(或人源化)免疫球蛋白重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因兔表達(dá)I-IOiig/ml的人IgM。幼齡動(dòng)物(6-9周)表達(dá)100_4000iig/ml的人IgM。然而,人IgG的表達(dá)迅速降至IO-IOOiig/ml的水平。對(duì)外周血中B細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示存在小量的人mlgM+細(xì)胞群(1-2%)。幼齡兔的闌尾中含有至多10%的人mlgM+細(xì)胞，而其隨著年齡迅速消失。編碼人Iga和/或IgP的轉(zhuǎn)基因的導(dǎo)入導(dǎo)致血清中表達(dá)100-2000iig/ml的人(或人源化)IgM且穩(wěn)定表達(dá)2000-12000ug/ml的人(或人源化)IgG。闌尾30-70%的淋巴細(xì)胞是人(或人源化)mlgM+。外周血中，相等量的B細(xì)胞表達(dá)兔和人(或人源化)mlgM或mlgG。本公開通篇引用的所有參考文獻(xiàn)以及其中引用的所有文獻(xiàn)在此明確地通過引用作為參考。雖然通過參考某些實(shí)施方式來說明本發(fā)明，但其并不限于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可輕易得到并進(jìn)行多種修改而本質(zhì)上不改變本發(fā)明的工作方式。本文主張的發(fā)明范圍特別旨在包括所有這些修改。權(quán)利要求1.一種編碼BCR的嵌合Iga亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，所述嵌合Iga亞基包括(a)非人Iga多肽序列的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列和跨膜結(jié)構(gòu)域序列；以及(b)與SEQIDNO.:1的人Iga的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一性的多肽。2.一種編碼BCR的嵌合IgP亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，所述嵌合IgP亞基包括(a)非人IgP亞基的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列和跨膜結(jié)構(gòu)域序列；以及(b)與SEQIDNO.:7的人IgP的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少85%序列同一性的多肽。3.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其中所述非人Iga多肽序列包括牛(SEQIDNO2)；鼠類(SEQIDNO:3);犬(SEQIDNO:4);靈長類(SEQIDNO:5);兔(SEQIDNO:6)或其它非人序列。4.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其中所述非人IgP多肽序列包括犬(SEQIDNO8)；大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDNO:10);鼠類(SEQIDNO:ll);雞(SEQIDNO:12)或其它非人序列。5.一種非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括(a)編碼SEQIDNO.1的全長人Iga亞基，或權(quán)利要求I的嵌合Iga亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體；和/或(b)編碼SEQIDNO.:7的全長人IgP亞基，或權(quán)利要求2的嵌合IgP亞基的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體；和(c)編碼人或人源化免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體；其中生成的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物組合以形成人或人源化B細(xì)胞受體復(fù)合物。6.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中充分地降低非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的任何內(nèi)源性Ig產(chǎn)物和/或Iga和/或IgP亞基的表達(dá)。7.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物選自兔、小鼠、大鼠、豬、綿羊、山羊、鳥類、馬、驢和牛。8.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其是兔。9.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中通過B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞中表達(dá)所述Iga和/或IgP基因。10.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述Iga或IgP基因的表達(dá)僅在B細(xì)胞中發(fā)生。11.權(quán)利要求9的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子是⑶19、⑶20、⑶21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-l、CD79b(也稱作B29或IgP)、mb_l(也稱作Iga)、酪氨酸激酶blk，VpreB，免疫球蛋白重鏈，免疫球蛋白k輕鏈，免疫球蛋白\輕鏈，免疫球蛋白J鏈的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。12.權(quán)利要求9的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子是CD79a、CD79b或K輕鏈啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。13.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體共表達(dá)。14.權(quán)利要求13的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體存在于相同的載體或兩種不同的載體中。15.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體通過隨機(jī)整合而整合到受體細(xì)胞的基因組中。16.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體通過靶向整合而整合到受體細(xì)胞的基因組中。17.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體位于一或多種重組載體中而導(dǎo)入受體細(xì)胞，所述載體之一攜帶人Iga和/或IgP基因片段，該片段相連于與內(nèi)源性Iga和/或IgP基因片段的側(cè)翼序列同源的5’和3’側(cè)翼序列，然后選擇通過同源重組使其內(nèi)源性Iga和/或IgP基因片段由人Iga和/或IgP基因片段代替的細(xì)胞，并從所選的遺傳修飾的受體細(xì)胞得到動(dòng)物。18.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中通過直接將轉(zhuǎn)基因注射到胚中或間接地將它們注射到受孕母體中而將所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入胚胎期的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中。19.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中在針對(duì)于內(nèi)源性Ig以及內(nèi)源性Iga和/或Ig^敲除的任一或更多，優(yōu)選兩者的敲除背景下，表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。20.權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有充分地降低的內(nèi)源性Ig表達(dá)和更優(yōu)選也充分地降低的內(nèi)源性Iga和/或IgP表達(dá)。21.來自權(quán)利要求5的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述人或人源化免疫球蛋白是抗體或抗體片段。22.權(quán)利要求21的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體是多克隆或單克隆抗體。23.權(quán)利要求21的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體片段是多克隆抗體或單克隆抗體的片段。24.權(quán)利要求21的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體或抗體片段被標(biāo)記。25.權(quán)利要求21的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體或抗體片段與毒素融合以形成免疫毒素，或者與治療劑偶聯(lián)。26.權(quán)利要求21的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體或抗體片段與異源氨基酸序列融合。27.權(quán)利要求23的分離的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗體片段是Fe、Fv,Fab、Fab，或F(ab’)2片段。全文摘要本發(fā)明描述了具有人(或人源化)免疫球蛋白基因座和編碼人(或人源化)Igα和/或Igβ序列的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。尤其是具有轉(zhuǎn)基因重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因座的能夠產(chǎn)生多樣化的人(或人源化)抗體譜的動(dòng)物，其Ig和/或內(nèi)源性Igα和/或Igβ序列的內(nèi)源性生產(chǎn)受到抑制。同時(shí)表達(dá)人(或人源化)免疫球蛋白和人(或人源化)Igα和/或Igβ使得正常B細(xì)胞發(fā)育、人(或人源化)抗體親和力成熟以及高效表達(dá)。文檔編號(hào)C07K16/00GK102719444SQ201210166840公開日2012年10月10日申請(qǐng)日期2007年8月29日優(yōu)先權(quán)日2006年9月1日發(fā)明者R·比洛申請(qǐng)人:人類多細(xì)胞株治療學(xué)公司