速生水生植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GeNRT2.1及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及速生水生植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GeNRT2.1及其 編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氮素是植物生長發(fā)育所必須的基本營養(yǎng)元素，在植物生長發(fā)育和形態(tài)建成中起著 重要作用，其對(duì)作物的生命活動(dòng)和產(chǎn)量形成也具有重要意義。硝酸鹽(NOf)是作物主要的氮 源之一，硝酸鹽供應(yīng)量不足會(huì)嚴(yán)重抑制作物的生長發(fā)育。生理學(xué)研究表明，植物從土壤中吸 收N0廠需有一整套高-和低-親和力NOf轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)參加，NOf的進(jìn)入由跨質(zhì)膜的H+梯度驅(qū)動(dòng)。 有些N〇3-轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是組成型表達(dá)，有的則受N〇3-誘導(dǎo)，且隨著N〇3-的同化呈負(fù)反饋調(diào)控
[0003] 矮珍珠是一種常見的透骨草科水生植物。在水中蔓延生長，生長迅速，根系發(fā)達(dá)， 茂密濃郁。在適宜的環(huán)境條件下快速蓬勃生長。僅僅用兩天能夠長成一對(duì)葉。
[0004] 在過去幾十年中，多形漢遜酵母(]^118611111&口〇15〇]10印11&，又稱？；[(311丨&&1^118七&)已 經(jīng)成為一種公認(rèn)的模式生物。廣泛應(yīng)用于研究甲醇代謝、硝酸鹽吸收機(jī)制等。在多形漢遜酵 母中，所有與硝酸鹽代謝相關(guān)的基因緊密地排列成基因簇，總長1040bp的DNA片段中大約 92 %為編碼DNA。多形漢遜酵母可以同化硝酸鹽并把硝酸鹽作為唯一氮源，它只有一個(gè)高親 和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（nitrate transporters，Ynt 1)，可以轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽但是不能轉(zhuǎn)運(yùn)氯酸 鹽。YNT1結(jié)構(gòu)上屬于NNP(nitrate-nitrite porter)家族并且受到硝酸鹽和亞硝酸鹽的誘 導(dǎo)。漢遜酵母基因 YNT 1、YNR 1和YN11分別編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、硝酸鹽還原酶(n i tr a t e reductase)，亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase)，它們的表達(dá)受硝酸鹽和亞硝酸鹽誘導(dǎo) 并受按鹽和谷氨酸抑致。YNT 1缺失突變(又yntl)可以導(dǎo)致菌株在硝酸鹽濃度低于500iM的 條件下不能轉(zhuǎn)運(yùn)或生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：
[0007] a)氣基酸序列是序列表中序列5所不的蛋白質(zhì)；
[0008] b)在序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0009] c)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0010] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列5所不的蛋白質(zhì)的氣基末端或 羧基末端連接上如表7所示的標(biāo)簽。
[0011] 表7、標(biāo)簽的序列
[0012]

[0013] 上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不 超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0015] 上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列4所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端 連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。
[0017] 本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：
[0018] A1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；
[0019] A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0020] A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；
[0021] A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0022] A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；
[0023] A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0024] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[0025] A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0026] A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0027] A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0028] All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0029 ] A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0030]上述生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0031] 1)其編碼序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
[0032] 2)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA 分子或基因組DNA分子；
[0033] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子 或基因組DNA分子。
[0034] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件 進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％ )表示，其可以 用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0036] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0037]上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并 洗膜2次，每次5min，又于Ο . 5 X SSC，Ο . 1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 %SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0038] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料的新用途。
[0039] 本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽中的應(yīng)用。
[0040] 本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在培育具有轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽功能的 轉(zhuǎn)基因酵母中的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能提高的轉(zhuǎn)基因酵母的方 法。
[0042] 本發(fā)明提供的培育硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能提高的轉(zhuǎn)基因酵母的方法包括將上述蛋白質(zhì) 的編碼基因?qū)胧荏w酵母中，得到轉(zhuǎn)基因酵母的步驟;所述轉(zhuǎn)基因酵母的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能 高于所述受體酵母。
[0043]上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?所示的DNA分子。
[0044] 上述方法中，所述上述蛋白質(zhì)的編碼基因是通過重組載體pYNR_GeNRT2.1導(dǎo)入受 體酵母的；
[0045] 所述重組載體pYNR-GeNRT2.1為將序列表中序列4所示的DNA分子插入pYNR-EX載 體的spel和sal I酶切位點(diǎn)間，且保持pYNR-EX載體的其他序列不變得到的載體。
[0046] 上述方法中，所述受體酵母為Aynt-Leu雙突變多形漢遜酵母。
[0047]本發(fā)明從矮珍珠中克隆了一個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因 GeNRT2.1，并將該基因 導(dǎo)入Aynt-Leu雙突變多形漢遜酵母中，得到轉(zhuǎn)GeNRT2.1酵母。通過試驗(yàn)證明：GeNRT2.1蛋 白具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，能提高植物的氮素利用效率，使植物快速生長。
【附圖說明】
[0048]圖1為高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(GeNRT2.1)的克隆。
[0049] 圖2為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的3'RACE。
[0050] 圖3為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的5'RACE。
[0051 ] 圖4為pYNR-GeNRT2 · 1穿梭載體的雙酶切驗(yàn)證。
[0052] 圖5為轉(zhuǎn)基因酵母Aynt-GeNRT2.1的PCR驗(yàn)證。
[0053] 圖6為GeNRT2.1基因功能的驗(yàn)證。
[0054]圖7為GeNRT2.1的硝酸鹽吸收速率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0056] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057] 下述實(shí)施例中的矮珍珠在文獻(xiàn) "Donald H.Les，Introduction of Glossostogma (Phrymaceae)to North America:a taxonomic and ecological overview，2006" 中公開 過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得。
[0058] 下述實(shí)施例中的Aynt-Leu雙突變多形漢遜酵母在文獻(xiàn)"Yuse Martin， Functional characterization of the Arabidopsis thaliana nitrate transporter CHLlin the yeast Hansenula polymorpha，2008"中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生 物技術(shù)研究所獲得。
[0059] 下述實(shí)施例中的野生型酵母(WT)為多形漢遜酵母Hansenula pol