微流體測定裝置及其制造和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于確定分析物是否存在于樣品中的微流體裝置。該微流體裝置包含聚合介質(zhì)，所述聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的微流體裝置的方法、使用本發(fā)明的微流體裝置的系統(tǒng)和套件、以及生產(chǎn)本發(fā)明的微流體裝置的方法。
【專利說明】微流體測定裝置及其制造和使用方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 根據(jù)35 1].5.(：.§119(6)，本申請要求2013年10月22日提交的美國臨時(shí)申請如.61/ 894,316的申請日的優(yōu)先權(quán)，以引用的方式將該臨時(shí)申請的公開內(nèi)容并入本文中。
[0003] 政府支持的引用
[0004]本發(fā)明是在國家科學(xué)基金會(huì)授予的基金號(hào)1056035的政府支持下做出的。政府對 本發(fā)明孚有一定的權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005] 分析物檢測試驗(yàn)或配體-結(jié)合試驗(yàn)是測量樣品中的大分子的濃度或存在的生物化 學(xué)測試。例如，免疫測定依賴于抗原和針對所述抗原的抗體之間的特異性識(shí)別。在一些示例 中，通過特異性地結(jié)合至分析物(例如，感興趣的抗原）的試劑(例如，抗體)對該分析物進(jìn)行 檢測。在其它示例中，方案是相反的；分析物是抗體，并且將該抗體的抗原用作結(jié)合試劑。例 如，可基于對抗HCV免疫球蛋白G的檢測，使用免疫測定、免疫印跡測定和免疫色譜法對丙型 肝炎病毒(HCV)感染進(jìn)行鑒別。然而，由于其費(fèi)時(shí)費(fèi)力、多階段的方案，確認(rèn)性診斷目前被移 交至中心實(shí)驗(yàn)室。對感染即時(shí)檢驗(yàn)確認(rèn)的能力將對感染性疾病(如丙型肝炎(HCV)和HIV)的 治療效力產(chǎn)生積極影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了用于確定分析物是否存在于樣品中的微流體裝置。該微流體裝置包 含聚合介質(zhì)，所述聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第一分析物的第 一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià) 結(jié)合捕獲構(gòu)件）。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的微流體裝置的方法、使用本發(fā)明的微流體裝 置的系統(tǒng)和套件、以及生產(chǎn)本發(fā)明的微流體裝置的方法。
[0007] 本公開的方面包括微流體裝置，該微流體裝置包含聚合介質(zhì)，該聚合介質(zhì)包含第 一分析物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析 物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件）。
[0008] 在一些實(shí)施方式中，該微流體裝置包含流動(dòng)路徑(flow path)以及流動(dòng)路徑中的 聚合介質(zhì)。該聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第一共 價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià)結(jié)合 捕獲構(gòu)件）。
[0009] 在一些實(shí)施方式中，第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件和第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件是不同的。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件和第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件是相同的， 并且該微流體裝置進(jìn)一步包含處于第一分析物檢測域和第二分析物檢測域之間的間隔域。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)包含聚丙烯酰胺凝膠。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件通過接頭基團(tuán)共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)。 在一些實(shí)施方式中，第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件通過接頭基團(tuán)共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)。在一些實(shí) 施方式中，接頭基團(tuán)包含二苯甲酮官能團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，接頭基團(tuán)包括N-(3-[ (4-苯 甲酰基苯基）甲酰胺基]丙基）甲基丙烯酰胺。在一些實(shí)施方式中，接頭基團(tuán)包括3-苯甲酰 基-N-[3-(2-甲基-丙烯?；被?-丙基]-苯甲酰胺。在一些實(shí)施方式中，接頭基團(tuán)包含間 隔基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，間隔基團(tuán)包含&_〇5烷基基團(tuán)。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，第一捕獲構(gòu)件包含抗原。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，第二捕獲構(gòu)件包含抗原。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，微流體裝置包含兩種以上的聚合介質(zhì)。各聚合介質(zhì)包含第一 分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物 檢測域(包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件）。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，微流體裝置包含兩個(gè)以上的流動(dòng)路徑，各流動(dòng)路徑包含聚合 介質(zhì)。聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第一共價(jià)結(jié)合 捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu) 件)。
[0017] 本公開的方面包括確定分析物是否存在于樣品中的方法。該方法包括將樣品引入 包含聚合介質(zhì)的微流體裝置中。聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第 一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第二分析 物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件）。該方法還包括以足以使樣品中的組分移動(dòng)通過聚合介質(zhì)的 方式，向聚合介質(zhì)施加定向電場，以及從一個(gè)或多個(gè)第一分析物檢測域和第二分析物檢測 域中獲得信號(hào)，以確定分析物是否存在于樣品中。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，第一捕獲構(gòu)件包含第一抗原以及第一分析物，該第一分析物 包含特異性地結(jié)合至所述第一抗原的第一特異性結(jié)合構(gòu)件(例如，第一抗體）。在一些實(shí)施 方式中，第一特異性結(jié)合構(gòu)件包含熒光標(biāo)記。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，第二捕獲構(gòu)件包含第二抗原以及第二分析物，該第二分析物 包含特異性地結(jié)合至所述第二抗原的第二特異性結(jié)合構(gòu)件(例如，第二抗體）。在一些實(shí)施 方式中，第二特異性結(jié)合構(gòu)件包含熒光標(biāo)記。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在將樣品引入微流體裝置中之后，將標(biāo) 記引入微流體裝置中。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記包含特異性地結(jié)合至第一分析物的二級 特異性結(jié)合構(gòu)件(例如，二級抗體）。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記包含特異性地結(jié)合至第二分析 物的二級特異性結(jié)合構(gòu)件(例如，二級抗體）。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記包含熒光部分。
[0021 ]在一些實(shí)施方式中，樣品包括血液或血液制品。
[0022] 本公開的方面包括用于確定分析物是否存在于樣品中的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含微流體 裝置，所述微流體裝置含有聚合介質(zhì)和檢測器。該聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(包含特 異性地結(jié)合至第一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(包含特異性地 結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件）。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)包含微流體裝置，所述微流體裝置包含流動(dòng)路徑、流動(dòng) 路徑中的聚合介質(zhì)和檢測器。該聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第 一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第二分析 物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件）。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)進(jìn)一步包含被配置用于引導(dǎo)流體通過微流體裝置的一 個(gè)或多個(gè)微流體部件。
[0025] 本公開的方面包括包含微流體裝置的套件，所述微流體裝置包含聚合介質(zhì)以及被 配置用于容納該微流體裝置的包裝。該聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(包含特異性地結(jié) 合至第一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(包含特異性地結(jié)合至第 二分析物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件）。
[0026] 在一些實(shí)施方式中，套件包含微流體裝置，該微流體裝置包含流動(dòng)路徑、流動(dòng)路徑 中的聚合介質(zhì)、以及被配置用于容納該微流體裝置的包裝。該聚合介質(zhì)包含第一分析物檢 測域(包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(包 含特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件）。
[0027] 本公開的方面包括生產(chǎn)微流體測定裝置的方法。該方法包括:生產(chǎn)聚合介質(zhì)，該聚 合介質(zhì)包含在施用所施加的刺激時(shí)共價(jià)結(jié)合至捕獲構(gòu)件的官能團(tuán)；向聚合介質(zhì)中引入特異 性地結(jié)合至第一分析物的第一捕獲構(gòu)件;將聚合介質(zhì)的第一區(qū)域曝露至所施加的刺激，以 產(chǎn)生包含共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的第一捕獲構(gòu)件的第一分析物檢測域;向聚合介質(zhì)中引入特 異性地結(jié)合至第二分析物的第二捕獲構(gòu)件；以及將聚合介質(zhì)的第二區(qū)域曝露至所施加的刺 激，以產(chǎn)生包含共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的第二捕獲構(gòu)件的第二分析物檢測域，從而生產(chǎn)微流 體測定裝置。
[0028] 在一些實(shí)例中，該方法包括:在流動(dòng)路徑中產(chǎn)生聚合介質(zhì)，其中，聚合介質(zhì)包含在 施用所施加的刺激時(shí)共價(jià)結(jié)合至捕獲構(gòu)件的官能團(tuán)；向流動(dòng)路徑中引入特異性地結(jié)合至第 一分析物的第一捕獲構(gòu)件;將流動(dòng)路徑的第一區(qū)域曝露至所施加的刺激，以產(chǎn)生包含共價(jià) 結(jié)合至聚合介質(zhì)的第一捕獲構(gòu)件的第一分析物檢測域;向流動(dòng)路徑中引入特異性地結(jié)合至 第二分析物的第二捕獲構(gòu)件；以及將流動(dòng)路徑的第二區(qū)域曝露至所施加的刺激，以產(chǎn)生包 含共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的第二捕獲構(gòu)件的第二分析物檢測域，從而生產(chǎn)微流體測定裝置。
【附圖說明】
[0029] 圖1(版塊A)示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式的光致圖案化條形碼裝置的示意圖。圖 1(版塊B)示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式，用作聚丙烯酰胺凝膠前體的具有二苯甲酮部分的 甲基丙烯酰胺部分。圖1(版塊C)示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式，用作樣品中一級抗體的捕 獲構(gòu)件的共價(jià)結(jié)合(固定化的)抗原的示意圖?？墒褂枚壙贵w對所捕獲的一級抗體進(jìn)行標(biāo) 記。
[0030] 圖2(版塊A)示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式，在三個(gè)圖案化周期中使用三種不同的 熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)在微流體通道中制造5-帶圖案的工藝的步驟。圖2(版塊B)示出了三個(gè)圖案 化周期的各自的電泳圖。
[0031] 圖3(版塊A)示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式，使用BSA和抗-BSA抗體作為抗體-抗原 對的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的熒光圖像。圖3(版塊B)示出了圖3(版塊A)所示的實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)的電泳圖。圖3 (版塊C)示出了圖案化的BSA帶處的感興趣的等效區(qū)域(ROIs)與圖3(版塊A)的底部所示的 非靶標(biāo)蛋白帶之間的比較。圖3(版塊C)中的插圖示出了信噪比（SNR)在加載期間內(nèi)的曲線 圖。
[0032]圖4(版塊A-版塊D)示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式，表明光致圖案化蛋白質(zhì)帶選擇 性地從加載的樣品中捕獲抗體的實(shí)驗(yàn)。圖4(版塊A)示出了用于測試抗體捕獲的圖案的示意 圖。AF488-0VA和UV為陰性對照帶。未標(biāo)記的BSA為靶抗原。圖4 (版塊B)示出了光致圖案化后 的微通道的電泳圖和熒光圖像。僅對AF488-0VA進(jìn)行檢測。圖4(版塊C)示出了一級抗體探測 和洗脫后的圖像。在光致圖案化的BSA位置處對信號(hào)進(jìn)行檢測。圖4(版塊D)示出了在二級印 跡和洗脫后的圖像。在光致圖案化的BSA位置處出現(xiàn)了清楚的信號(hào)。虛線表示來自3個(gè)通道 的平均信號(hào)，并且綠色（陰影區(qū)域)表示高于和低于平均值1S.D.。
[0033] 圖5(版塊A)示出了根據(jù)本公開的實(shí)施方式，在被配置用于檢測人血清樣品中的 HCV抗體的裝置中的HCV診斷帶布局的示意圖。圖5(版塊B)示出了在五個(gè)帶全部圖案化后拍 攝的熒光圖像。圖5(版塊C)示出了來自針對四個(gè)不同的人血清樣品進(jìn)行的四個(gè)同步測定的 結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明提供了用于確定分析物是否存在于樣品中的微流體裝置。該微流體裝置包 含聚合介質(zhì)，所述聚合介質(zhì)包含第一分析物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第一分析物的第 一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件)和第二分析物檢測域(具有特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共價(jià) 結(jié)合捕獲構(gòu)件）。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的微流體裝置的方法、使用本發(fā)明的微流體裝 置的系統(tǒng)和套件、以及生產(chǎn)本發(fā)明的微流體裝置的方法。
[0035] 以下，首先對本發(fā)明的微流體裝置進(jìn)行更詳細(xì)的描述。還公開了對流體樣品中的 分析物進(jìn)行檢測的方法，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的微流體裝置在該方法中的用途。另外，本發(fā)明還描 述了包含本發(fā)明微流體裝置的系統(tǒng)和套件。
[0036]微流體裝置
[0037] 本公開的實(shí)施方式包括微流體裝置。"微流體裝置"是被配置用于對在幾何學(xué)上被 束縛為小尺度(例如，亞毫米）的流體進(jìn)行控制和操縱的裝置。微流體裝置的實(shí)施方式包含 流動(dòng)路徑和聚合介質(zhì)。將聚合介質(zhì)布置在微流體裝置的流動(dòng)路徑的至少部分中。例如，聚合 介質(zhì)可存在于微流體裝置的流動(dòng)路徑的基本上整個(gè)的長度中。在一些實(shí)施方式中，聚合介 質(zhì)包含特異性地結(jié)合至樣品中的感興趣的分析物的共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件。當(dāng)樣品穿過微流體 裝置的流動(dòng)路徑時(shí)，捕獲構(gòu)件可特異性結(jié)合地至樣品中的分析物。然后，可對特異性結(jié)合的 分析物進(jìn)行檢測。
[0038] 在一些實(shí)例中，聚合介質(zhì)由包含聚合介質(zhì)的微流體裝置的區(qū)域限定。例如，如上所 示，微流體裝置可包含其中存在聚合介質(zhì)的流動(dòng)路徑。在一些示例中，流動(dòng)路徑為細(xì)長的流 動(dòng)路徑。該細(xì)長的流動(dòng)路徑可包含如上所述的聚合介質(zhì)。例如，微流體裝置可包含細(xì)長的流 動(dòng)路徑，其中，所述細(xì)長的流動(dòng)路徑為通道(例如，微流體通道）。該通道可包含聚合介質(zhì)。聚 合介質(zhì)可包含在通道中，從而使得當(dāng)樣品流動(dòng)通過通道時(shí)，使待分析其中是否存在分析物 的樣品穿過聚合介質(zhì)。在一些實(shí)例中，該細(xì)長的流動(dòng)路徑的長度大于細(xì)長的流動(dòng)路徑的寬 度，例如，該細(xì)長的流動(dòng)路徑的長度比起細(xì)長的流動(dòng)路徑的寬度大2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、 25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍或200倍以上。
[0039]聚合介質(zhì)
[0040]在一些實(shí)施方式中，微流體裝置包含聚合介質(zhì)。聚合介質(zhì)可存在于如上所述的微 流體裝置的流動(dòng)路徑中。在一些示例中，聚合介質(zhì)為存在于微流體裝置的流動(dòng)路徑中的連 續(xù)聚合介質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，對聚合介質(zhì)進(jìn)行配置，以當(dāng)樣品穿過聚合介質(zhì)時(shí)，與樣品 中的一個(gè)或多個(gè)成分結(jié)合。例如，聚合介質(zhì)可包含捕獲構(gòu)件。在一些示例中，對聚合介質(zhì)的 捕獲構(gòu)件進(jìn)行配置，以當(dāng)樣品穿過聚合介質(zhì)時(shí)，與樣品中的成分(例如，感興趣的分析物)特 異性結(jié)合。
[0041] 捕獲構(gòu)件可存在于聚合介質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中，例如，聚合介質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)、 或2個(gè)以上、或3個(gè)以上、或4個(gè)以上、或5個(gè)以上、或6個(gè)以上、或7個(gè)以上、或8個(gè)以上、或9個(gè)以 上、或10個(gè)以上不同的區(qū)域中。在一些實(shí)例中，包含捕獲構(gòu)件的聚合介質(zhì)的區(qū)域被稱為"分 析物檢測域"或"帶"。"分析物檢測域"或"帶"是指捕獲構(gòu)件定位在其中的（如共價(jià)結(jié)合至聚 合介質(zhì)）聚合介質(zhì)的不同的可檢測區(qū)域。在一些實(shí)例中，可對聚合介質(zhì)進(jìn)行配置，以具有對 捕獲構(gòu)件而言的兩個(gè)以上的分離的分析物檢測域或帶。各分析物檢測域可包含單一類型的 捕獲構(gòu)件。在一些示例中，不同的分析物檢測域可包含相同的捕獲構(gòu)件，從而使分析物檢測 域特異性地結(jié)合至樣品中的相同的分析物。例如，聚合介質(zhì)可包含第一分析物檢測域和第 二分析物檢測域，其中，第一分析物檢測域和第二分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至分析 物的捕獲構(gòu)件。在一些示例中，不同的分析物檢測域可包含不同的捕獲構(gòu)件，從而使不同的 分析物檢測域特異性地結(jié)合至樣品中的感興趣的不同分析物。如上所示，多個(gè)分析物檢測 域可存在于單個(gè)流動(dòng)路徑中（例如，單個(gè)聚合介質(zhì)中）。因此，可在單個(gè)流動(dòng)路徑中（例如，單 個(gè)聚合介質(zhì)中）對各自由不同的分析物檢測域特異性地結(jié)合的多個(gè)不同的分析物進(jìn)行檢 測。例如，聚合介質(zhì)可包含具有第一捕獲構(gòu)件(特異性地結(jié)合至第一分析物）的第一分析物 檢測域、以及具有第二捕獲構(gòu)件(特異性地結(jié)合至第二分析物）的第二分析物檢測域。如同 所期望的，可包含存在于另外的分析物檢測域中的另外的捕獲構(gòu)件。
[0042] 在一些實(shí)施方式中，分析物檢測域的長度小于聚合介質(zhì)的總長度。在一些實(shí)例中， 分析物檢測域的長度范圍為 1〇Μ?-1000μηι，例如 10μηι-900μηι、或 10μηι-800μηι、或 10μηι-700μηι、 或 10μηι-600μηι、或 10μηι-500μηι、或 10μηι-400μηι、或 10μηι-300μηι、或 10μηι-200μηι、或 ΙΟμπι-100μ m、或25μηι-100μηι、或50μηι-100μηι。在一些實(shí)施方式中，分析物檢測域的長度為100μπι。如下文 中更詳細(xì)描述的，分析物檢測域的寬度和深度可與聚合介質(zhì)和/或微流體通道的寬度和深 度相同。
[0043] 在一些實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)間隔域。間隔域可以是不包含大量 捕獲構(gòu)件的聚合介質(zhì)的區(qū)域。例如，間隔域可基本上不包含捕獲構(gòu)件。在一些示例中，間隔 域不包含共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的捕獲構(gòu)件。間隔域可存在于與分析物檢測域相鄰的聚合介 質(zhì)中。例如，間隔域可與分析物檢測域相鄰或可存在于兩個(gè)分析物檢測域之間。間隔域可與 相鄰的分析物檢測域流體連通。在一些示例中，間隔域和分析物檢測域存在于連續(xù)的聚合 介質(zhì)中。例如，聚合介質(zhì)可包含第一分析物檢測域和第二分析物檢測域以及處于第一分析 物檢測域和第二分析物檢測域之間的間隔域，其中，第一分析物檢測域和第二分析物檢測 域包含特異性地結(jié)合至分析物的捕獲構(gòu)件。在其它的實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)包含具有第一 捕獲構(gòu)件(特異性地結(jié)合至第一分析物）的第一分析物檢測域、具有第二捕獲構(gòu)件(特異性 地結(jié)合至第二分析物）的第二分析物檢測域、以及處于第一分析物檢測域和第二分析物檢 測域之間的間隔域。
[0044] 聚合介質(zhì)可包含一個(gè)或多個(gè)對照區(qū)域，例如，陰性對照區(qū)域和/或陽性對照區(qū)域。 例如，陰性對照區(qū)域可以是如下的聚合介質(zhì)的區(qū)域:不包含捕獲構(gòu)件或包含沒有被樣品中 的感興趣的分析物特異性結(jié)合的部分(例如，抗原）。在一些實(shí)例中，陰性對照區(qū)域可促進(jìn)樣 品中的分析物與非靶標(biāo)部分的交叉反應(yīng)性(例如，樣品中的分析物與陰性對照部分的非特 異性結(jié)合)的檢測。在一些示例中，聚合介質(zhì)包含陽性對照區(qū)域，其中，陽性對照區(qū)域包含與 樣品中的多種不同的分析物結(jié)合的部分(例如，抗原）。例如，陽性對照區(qū)域可包含與樣品中 的廣泛的分析物結(jié)合的捕獲構(gòu)件，例如，并非僅對一種分析物具有特異性、而是與樣品中的 多種不同的分析物結(jié)合的捕獲構(gòu)件。與多種分析物結(jié)合的捕獲構(gòu)件的實(shí)例是蛋白質(zhì)L，蛋白 質(zhì)L與多種不同抗體種類的抗體結(jié)合，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。在一些示例中，陽性對 照區(qū)域可促進(jìn)加載在聚合介質(zhì)上的充足樣品的檢測。
[0045] 在一些實(shí)施方式中，捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)。換句話說，聚合介質(zhì)可包含共 價(jià)結(jié)合的捕獲構(gòu)件，例如包含對聚合介質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)共價(jià)結(jié)合的捕獲構(gòu)件。在一些實(shí)例 中，捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至支撐物(例如，聚合介質(zhì)），例如交聯(lián)至支撐物或與支撐物共聚。捕 獲構(gòu)件和支撐物之間的共價(jià)鍵包括涉及活性基團(tuán)的共價(jià)鍵，例如但不限于如下:戊二醛，其 利用雙官能接頭戊二醛以與捕獲構(gòu)件和支撐物的氨基/酰胺基基團(tuán)形成共價(jià)鍵；甲基丙烯 酸縮水甘油酯，其利用縮水甘油基官能團(tuán)（即，環(huán)氧官能團(tuán)）以共價(jià)地結(jié)合至捕獲構(gòu)件并利 用甲基丙烯酸酯基團(tuán)結(jié)合至支撐物;4-硝基苯基甲基丙烯酸酯，其可用來酰化捕獲構(gòu)件的 胺基基團(tuán)以共價(jià)結(jié)合至支撐物;N-羥基琥泊酰亞胺丙稀酸酯(NHS-acrylate)，其利用N-輕 基琥珀酰亞胺基團(tuán)與捕獲構(gòu)件上的氨基基相互作用以并入支撐物中。例如，聚合介質(zhì)可包 含具有第一共價(jià)結(jié)合的捕獲構(gòu)件(特異性地結(jié)合至第一分析物)的第一分析物檢測域、以及 具有第二共價(jià)結(jié)合的捕獲構(gòu)件(特異性地結(jié)合至第二分析物)的第二分析物檢測域。
[0046] 在一些實(shí)施方式中，支撐物(例如，聚合介質(zhì))包含共價(jià)結(jié)合的捕獲構(gòu)件，其中，在 聚合介質(zhì)的制造過程中，聚合介質(zhì)與捕獲構(gòu)件之間的共價(jià)鍵在施用所施加的刺激時(shí)形成。 例如，所施加的刺激可包括電磁輻射(例如，光）。在一些示例中，光是紫外(UV)光。在一些實(shí) 例中，用于使捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的光的波長為10nm-400nm、例如50nm-400nm、包 括100nm-400nm、或150nm-400nm、或200nm-400nm、或250nm-400nm、或300nm-400nm、或 325nm_375nm、或350nm_365nm。在一些不例中，光的波長為350nm_365nm。
[0047] 在一些示例中，聚合介質(zhì)包含在制造聚合介質(zhì)期間共價(jià)結(jié)合至捕獲構(gòu)件的官能 團(tuán)。例如，捕獲構(gòu)件可以是蛋白質(zhì)、肽，例如抗原、抗體或其片段等。聚合介質(zhì)上的官能團(tuán)可 包括在施用所施加的刺激(例如，如上所述的電磁輻射(例如，光））時(shí)被活化的官能團(tuán)。就這 方面而言，在一些實(shí)例中，官能團(tuán)是可光活化的官能團(tuán)。在施用光時(shí)，可光活化的官能團(tuán)可 形成反應(yīng)性物質(zhì)（例如自由基烷基中間體），該反應(yīng)性物質(zhì)能與捕獲構(gòu)件形成共價(jià)鍵。在施 用所施加的刺激(例如光)時(shí)，可共價(jià)結(jié)合至捕獲構(gòu)件的官能團(tuán)的實(shí)例包括但不限于二苯甲 酮基團(tuán)等。一旦被所施加的刺激活化，官能團(tuán)可結(jié)合至捕獲構(gòu)件，從而在聚合介質(zhì)和捕獲構(gòu) 件之間形成共價(jià)鍵。例如，該官能團(tuán)可在官能團(tuán)和捕獲構(gòu)件之間形成碳-碳鍵，從而使捕獲 構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)。
[0048] 在一些實(shí)施方式中，官能團(tuán)與聚合介質(zhì)共聚。在聚合介質(zhì)的產(chǎn)生過程中，官能團(tuán)可 與聚合介質(zhì)共聚。例如，官能團(tuán)可包含連接到聚合介質(zhì)的接頭基團(tuán)。換句話說，捕獲構(gòu)件可 通過接頭基團(tuán)共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)。接頭基團(tuán)可包含如上所述的與捕獲構(gòu)件形成共價(jià)鍵的 官能團(tuán)。接頭基團(tuán)可在接頭基團(tuán)的第一端與官能團(tuán)連接，且接頭基團(tuán)的第二端可結(jié)合至聚 合介質(zhì)，從而間接地使官能團(tuán)結(jié)合至聚合介質(zhì)。在一些實(shí)例中，結(jié)合至聚合介質(zhì)的接頭基團(tuán) 的第二端包含共聚單體，例如但不限于丙烯酰胺共聚單體等。在一些實(shí)施方式中，接頭基團(tuán) 的第二端包含甲基丙烯酰胺共聚單體。在一些示例中，官能團(tuán)（例如，在接頭基團(tuán)的第一端 的官能團(tuán)）是二苯甲酮官能團(tuán)，且接頭基團(tuán)包含共聚單體(例如，在接頭基團(tuán)的第二端），例 如丙烯酰胺共聚單體。例如，接頭基團(tuán)（例如，包含官能團(tuán)和共聚單體)可以是N-(3-[(4-苯 甲?；交┘柞０坊鵠丙基）甲基丙烯酰胺(也稱為BPM或BPMAC)或3-苯甲酰基-N-[3-(2-甲基-丙烯?；被?-丙基]-苯甲酰胺(BP-APMA);以下示出了各接頭基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。如上所 述，接頭基團(tuán)可具有連接在第一端的官能團(tuán)、以及結(jié)合至聚合介質(zhì)的接頭基團(tuán)的第二端。在 一些實(shí)例中，接頭基團(tuán)包含間隔基團(tuán)，例如處于接頭基團(tuán)的第一端和第二端之間的間隔基 團(tuán)（例如，在官能團(tuán)和共聚單體之間的接頭基團(tuán)的中央部分的間隔基團(tuán)）。在一些示例中，在 接頭基團(tuán)的第一端和第二端之間的接頭基團(tuán)的間隔基團(tuán)包括脂肪族基團(tuán)，例如但不限于 Cl-IQ烷基基團(tuán)。在一些不例中，接頭基團(tuán)的間隔基團(tuán)包括低級烷基基團(tuán)（例如，Cl-6烷基基 團(tuán)、或C1-S烷基基團(tuán)、或烷基基團(tuán)、或Cp 3烷基基團(tuán)、或Cp2烷基基團(tuán)）。例如，接頭基團(tuán)的間 隔基團(tuán)可包括丙基基團(tuán)。
[0049]
[0050] N-(3_[(4-苯甲?；交┘柞０坊鵠丙基）甲基丙烯酰胺
[0051]
[0052] 3-苯甲?；?N-[3_(2-甲基-丙烯?；被?_丙基]-苯甲酰胺
[0053]捕獲構(gòu)件可以是特異地結(jié)合至感興趣的另一結(jié)合構(gòu)件的任何分子，例如，被靶向 的蛋白質(zhì)或核酸序列或生物大分子(例如，感興趣的分析物）。捕獲構(gòu)件和其特異性結(jié)合配 偶體之間的特異性結(jié)合可在捕獲構(gòu)件和其特異性結(jié)合配偶體之間形成穩(wěn)定的接合。"穩(wěn)定 接合"是指一個(gè)部分在標(biāo)準(zhǔn)條件下接合至或以其它方式結(jié)合至另一部分或結(jié)構(gòu)。在一些實(shí) 例中，穩(wěn)定接合創(chuàng)建了在捕獲構(gòu)件和其特異性結(jié)合配偶體之間的鍵，該鍵可包括共價(jià)鍵和 非共價(jià)相互作用，例如但不限于離子鍵、疏水相互作用、氫鍵、范德華力（例如，London分散 力）、偶極相互作用等。在一些實(shí)施方式中，在結(jié)合復(fù)合物中的捕獲構(gòu)件和其特異性結(jié)合配 偶體之間的親和性的特征在于Kd(離解常數(shù))為HT 5M以下、HT6M以下、例如HT7M以下、包括 HT8M以下、例如HT9M以下、10-1()Μ以下、HT11M以下、HT 12M以下、HT13M以下、HT14M以下、HT 15M以下、包括KT16M以下。"親和性"是指結(jié)合強(qiáng)度，增大的結(jié)合親和性與較低的Kd相關(guān)。 [0054]取決于分析物的性質(zhì)，捕獲構(gòu)件可以是但不限于(a)用于檢測特異性的抗-抗原抗 體的抗原；（b)針對用于檢測蛋白質(zhì)和肽的肽分析物的表位的抗體；（c)任何識(shí)別分子，如特 異性結(jié)合對的成員。例如，合適的特異性結(jié)合對包括但不限于:受體/配體對的成員；受體的 配體-結(jié)合部分;抗體/抗原對的成員;抗體的抗原-結(jié)合片段;半抗原;凝集素/糖對的成員； 酶/底物對的成員；生物素/親和素;生物素/鏈霉親和素;地高辛/抗地高辛藥;DNA或RNA適 體結(jié)合對的成員;肽適體結(jié)合對的成員等。
[0055]在一些實(shí)施方式中，捕獲構(gòu)件包含抗原。捕獲構(gòu)件抗原可特異性地結(jié)合至樣品中 的感興趣的分析物，例如樣品中感興趣的抗體或其片段。在一些實(shí)施方式中，捕獲構(gòu)件包含 抗體。在一些實(shí)施方式中，捕獲構(gòu)件包含抗體片段。捕獲構(gòu)件抗體可特異性結(jié)合至樣品中的 感興趣的分析物，例如樣品中的感興趣的抗原。在一些示例中，如上所述捕獲構(gòu)件特異性地 結(jié)合至支撐物(例如，聚合介質(zhì)）。支撐物-結(jié)合的結(jié)合構(gòu)件可被配置成特異地結(jié)合至感興趣 的分析物。就這方面而言，感興趣的分析物與支撐物-結(jié)合的捕獲構(gòu)件的特異結(jié)合可間接地 將感興趣的分析物結(jié)合至所述支撐物。感興趣的分析物與支撐物的結(jié)合可使分析物與支撐 物穩(wěn)定地接合，并由此促進(jìn)感興趣的分析物的檢測。
[0056]在一些實(shí)施方式中，兩個(gè)以上的不同捕獲構(gòu)件穩(wěn)定地與聚合介質(zhì)接合，以提供包 括不同捕獲構(gòu)件的不同的檢測域。所述兩個(gè)以上的不同捕獲構(gòu)件可特異地結(jié)合至相同或不 同的分析物。在一些示例中，所述兩個(gè)以上的不同捕獲構(gòu)件可特異地結(jié)合至不同的分析物。 例如，所述兩個(gè)以上的不同捕獲構(gòu)件可包含特異性地結(jié)合至樣品中的不同抗體(或其片段） 的不同抗原。在其它情況中，所述兩個(gè)以上的不同的捕獲構(gòu)件可特異地結(jié)合至相同的分析 物。例如，可將兩個(gè)以上的不同的捕獲構(gòu)件抗原用于檢測抗體對不同抗原的交叉反應(yīng)性。 [0057]在一些實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)包含聚合物，如聚合凝膠。聚合凝膠可以是適用于凝 膠電泳的凝膠。聚合凝膠可包括但不限于聚丙烯酰胺凝膠(例如，甲基丙烯酰胺凝膠）、瓊脂 凝膠等?？苫诙喾N因素對聚合介質(zhì)進(jìn)行表征，例如但不限于孔徑、總聚合物含量(例如，總 的丙烯酰胺含量）、交聯(lián)劑濃度等。例如，聚合介質(zhì)可具有取決于如下的孔徑:聚合介質(zhì)的總 聚合物含量、和/或聚合介質(zhì)中的交聯(lián)劑濃度。在一些示例中，聚合介質(zhì)可包括具有1%-20%、例如2%-15%、包括2%-10%的總的丙烯酰胺含量T(T =丙烯酰胺和雙聚丙烯酰胺單 體的總濃度)的聚丙烯酰胺凝膠。在一些實(shí)例中，聚合介質(zhì)的總的丙烯酰胺含量為4%。
[0058] 在一些實(shí)施方式中，對聚合介質(zhì)進(jìn)行配置，以使其從前體部分形成。例如，聚合介 質(zhì)可以是從凝膠前體(例如，聚丙烯酰胺凝膠前體，如聚丙烯酰胺單體)形成的凝膠(例如， 聚丙烯酰胺凝膠）?？蓪η绑w部分進(jìn)行配置，以使其反應(yīng)形成聚合介質(zhì)。例如，可對凝膠前體 進(jìn)行配置，以使其彼此反應(yīng)而形成聚丙烯酰胺凝膠聚合介質(zhì)?？赏ㄟ^任何合適的方案(例如 但不限于化學(xué)活化、光致活化等)對凝膠前體之間的反應(yīng)進(jìn)行活化。在一些實(shí)施方式中，對 凝膠前體進(jìn)行配置，以使其在化學(xué)上活化，例如通過使凝膠前體與活化劑(例如但不限于過 氧化物）接觸。在一些實(shí)施方式中，對凝膠前體進(jìn)行配置，以使其通過光活化（即，光致活 化），例如通過使凝膠前體與光接觸。光可具有適合用于使聚合介質(zhì)的形成得以活化的任何 波長，且在一些實(shí)例中，光可具有與可見光譜中的藍(lán)光相關(guān)的波長。在一些實(shí)例中，相較于 用于活化官能團(tuán)（用于使捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)）的光，用于使聚合介質(zhì)的聚合得以 活化的光具有不同的波長。例如，用于使聚合介質(zhì)的形成得以活化的光可具有如下波長： 400nm-500nm、例如410nm-490nm、包括 420nm-480nm、或430nm-480nm、或440nm-480nm、或 450nm-480nm、或460nm-480nm、或465nm_475nm。在一些不例中，用于使聚合介質(zhì)的形成得以 活化的光具有465nm-475nm的波長。在一些實(shí)例中，用于使聚合介質(zhì)的形成得活化的光具有 470nm的波長。
[0059] 在一些實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)包含緩沖液。緩沖液可以是用于凝膠電泳的任何合 適的緩沖液。在一些實(shí)施方式中，緩沖液為Tris緩沖液。在一些實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)包含 緩沖液，例如Tris-甘氨酸緩沖液(TG緩沖液）。例如，緩沖液可包含Tris和甘氨酸的混合物。
[0060] 聚合介質(zhì)的方面包括具有方向軸的聚合介質(zhì)。在一些實(shí)例中，將方向軸以樣品穿 過聚合介質(zhì)時(shí)的樣品行進(jìn)的方向進(jìn)行定向。在一些實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)的方向軸與聚合 介質(zhì)的長度對齊。在這些實(shí)施方式中，樣品沿聚合介質(zhì)的長度穿過聚合介質(zhì)。在一些示例 中，聚合介質(zhì)的長度大于聚合介質(zhì)的寬度，例如為聚合介質(zhì)的寬度的2倍、3倍、4倍、5倍、10 倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍或200倍以上。
[0061 ]在一些實(shí)施方式中，對微流體裝置進(jìn)行配置，以引導(dǎo)樣品通過聚合介質(zhì)。在一些實(shí) 例中，對微流體裝置進(jìn)行配置，以使樣品接受流動(dòng)場。"流動(dòng)場"是指如下區(qū)域，其中，組成部 分以基本上相同的方向穿過該區(qū)域。例如，流動(dòng)場可包含如下區(qū)域，其中，移動(dòng)的組成部分 以基本上相同的方向運(yùn)動(dòng)通過介質(zhì)的區(qū)域。流動(dòng)場可包含介質(zhì)，如聚合介質(zhì)，其中，組成部 分(如緩沖液、分析物、試劑等）以基本上相同的方向運(yùn)動(dòng)穿過介質(zhì)。流動(dòng)場可通過施加的電 場、壓力差、電滲透等來誘導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，流動(dòng)場是定向的。例如，流動(dòng)場可與聚合 介質(zhì)的流動(dòng)路徑的方向軸對齊?？蓪α鲃?dòng)場進(jìn)行配置，以引導(dǎo)樣品或分析物沿聚合介質(zhì)的 流動(dòng)路徑穿過聚合介質(zhì)。
[0062] 電場可促進(jìn)樣品移動(dòng)通過微流體裝置(例如，將樣品從微流體裝置的一端電動(dòng)轉(zhuǎn) 移至微流體裝置的另一端）。例如，可對電場進(jìn)行配置，以引導(dǎo)樣品中的分析物通過微流體 裝置的聚合介質(zhì)。可對電場進(jìn)行配置，以基于分析物的物理性質(zhì)促進(jìn)樣品中的分析物的移 動(dòng)。例如，可對電場進(jìn)行配置，以基于分析物的電荷(例如，荷質(zhì)比）、等電點(diǎn)等促進(jìn)樣品中的 分析物的移動(dòng)。在一些實(shí)例中，對電場進(jìn)行配置，以基于分析物的電荷促進(jìn)樣品中的分析物 的移動(dòng)。在一些示例中，對電場進(jìn)行配置，以基于分析物的等電點(diǎn)促進(jìn)樣品中的分析物的移 動(dòng)。
[0063] 在一些實(shí)施方式中，電場可以是定向的。例如，電場可與聚合介質(zhì)的流動(dòng)路徑的方 向軸對齊?？蓪﹄妶鲞M(jìn)行配置，以沿聚合介質(zhì)的流動(dòng)路徑引導(dǎo)樣品或分析物通過聚合介質(zhì)。
[0064] 在一些實(shí)施方式中，微流體裝置包含被配置用于產(chǎn)生電場的一個(gè)或多個(gè)電場發(fā)生 器?？蓪﹄妶霭l(fā)生器進(jìn)行配置，以向微流體裝置的多個(gè)區(qū)域(例如，聚合介質(zhì))施加電場。對 電場發(fā)生器進(jìn)行配置，以通過微流體裝置中的聚合介質(zhì)電動(dòng)地轉(zhuǎn)移樣品中的分析物和部 分。在一些實(shí)例中，電場發(fā)生器可靠近微流體裝置，如布置在微流體裝置上。在一些示例中， 電場發(fā)生器位于距微流體裝置一段距離。例如，可將電場發(fā)生器并入用于檢測分析物的系 統(tǒng)中，下面將更詳細(xì)地描述該系統(tǒng)。
[0065] 微流體裝置可包含一個(gè)或多個(gè)通道。如上所述，聚合介質(zhì)可存在于通道中。在一些 實(shí)例中，通道是微流體通道。微流體通道的一個(gè)或多個(gè)尺寸(例如，寬度和/或深度)可處于 微米范圍內(nèi)（例如，1μπι-1000μπι)。微流體通道的實(shí)施方式可由與微流體裝置相容且與在微 流體裝置中使用的聚合介質(zhì)、捕獲構(gòu)件、樣品、緩沖液、試劑等相容的任何合適的材料制成。 在一些示例中，微流體通道由相對于本發(fā)明微流體裝置和方法中使用的聚合介質(zhì)、捕獲構(gòu) 件、樣品、緩沖液、試劑等非活性(例如，不降解或不反應(yīng)）的材料制成。例如，微流體通道可 由如下材料制成，例如但不限于玻璃、石英、聚合物、彈性體、紙、它們的組合等。
[0066] 在一些實(shí)施方式中，微流體通道的長度為0 · 5mm-5mm、例如0 · 5mm-3mm、包括Imm-2_。在一些實(shí)例中，微流體通道的長度為1.2_。在一些實(shí)施方式中，微流體通道的寬度為1 μηι-500μηι、例如5μηι-300μηι、包括10μηι-200μηι、例如50μηι-150μηι。在一些示例中，微流體通道 的寬度為90μηι。在一些實(shí)施方式中，微流體通道的深度為1μηι-200μηι、例如5μηι-100μηι、包括 10μηι-50μηι。在一些示例中，微流體通道的深度為20μηι。
[0067] 在一些實(shí)例中，微流體裝置包含一個(gè)或多個(gè)樣品輸入儲(chǔ)存器?？蓪悠份斎雰?chǔ)存 器進(jìn)行配置，以使得能夠?qū)悠芬胛⒘黧w裝置中。樣品輸入儲(chǔ)存器可與聚合介質(zhì)流體連 通(例如，與含有聚合介質(zhì)的微流體通道流體連通）。在一些實(shí)例中，樣品輸入儲(chǔ)存器與聚合 介質(zhì)的上游端流體連通。樣品輸入儲(chǔ)存器可進(jìn)一步包含被配置用于防止流體從樣品輸入儲(chǔ) 存器中流出的結(jié)構(gòu)。例如，樣品輸入儲(chǔ)存器可包括蓋、閥門、密封件等，所述蓋、閥門、密封件 等例如可被刺穿或打開以允許將樣品引入微流體裝置，然后被重新密封或關(guān)閉以基本上防 止流體(包括樣品和/或緩沖液)從樣品輸入儲(chǔ)存器流出。在一些實(shí)施方式中，樣品輸入儲(chǔ)存 器呈圓柱形孔的形狀。還可以是其它形狀，例如但不限于正方形孔、矩形孔等。在一些實(shí)例 中，樣品輸入儲(chǔ)存器的直徑為0.5mm-5mm、例如1_-5_、或或1_-3_。在一些實(shí)例 中，樣品輸入儲(chǔ)存器的直徑為2mm。在一些實(shí)例中，樣品輸入儲(chǔ)存器的深度為0. lmm-5mm、例 如0.5mm-5mm、或0.5mm-4mm、或0.5mm-3mm、或0.5mm-2mm。在一些實(shí)例中，樣品輸入儲(chǔ)存器的 深度為1mm 〇
[0068] 在一些實(shí)施方式中，聚合物凝膠的寬度為0·1μπι-500μπι、例如0·2μπι-250μπι、包括 0 · 5μηι-150μηι、或 1μηι-100μηι、或 10μηι-100μηι、或 25μηι-100μηι、或 50μηι-100μηι。在一些不例中， 聚合物凝膠的寬度為90μηι。在一些實(shí)例中，聚合物凝膠的長度為0.5mm-5mm、例如0.5mm-3mm、包括lmm-2mm。在一些實(shí)例中，聚合物凝膠的長度為1.2mm。在一些實(shí)施方式中，聚合物 凝膠的深度為1μL?-200μπ?、例如5μL?-1 ΟΟμL?、包括10μL?-50μπ?。在一些示例中，聚合物凝膠的深 度為20μηι。
[0069] 在一些實(shí)施方式中，微流體裝置的寬度為10cm-lmm、例如5cm-5mm、包括lcm_5mm。 在一些實(shí)例中，微流體裝置的長度為100cm-lmm、例如50cm-lmm、包括10cm-5mm、或lcm-5mm。 在一些方面中，微流體裝置的面積為1000cm 2以下、例如IOOcm2以下、包括50cm2以下、例如 IOcm2以下、或5cm2以下、或3cm2以下、或Icm2以下、或0.5cm 2以下、或0.25cm2以下、或0.1 cm2 以下。
[0070] 在一些實(shí)施方式中，微流體裝置基本上是透明的。"透明"是指物質(zhì)使得可見光能 夠穿過該物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，透明的微流體裝置促進(jìn)結(jié)合至聚合介質(zhì)的分析物(例如 包含或標(biāo)記有可檢測標(biāo)記(如熒光標(biāo)記)的分析物)的檢測。在一些示例中，微流體裝置基本 上是不透明的。"不透明"是指物質(zhì)基本上阻止可見光通過該物質(zhì)。在一些實(shí)例中，不透明的 微流體裝置可促進(jìn)分析對光敏感的分析物，例如在光的存在下反應(yīng)或降解的分析物。
[0071] 在一些方面，在細(xì)長的流動(dòng)路徑中提供聚合介質(zhì)。在這些實(shí)施方式中，微流體裝置 包含諸如微流體通道的通道。通道可包含如上所述的聚合介質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)長的 流動(dòng)路徑包含由細(xì)長的流動(dòng)路徑的側(cè)面所限定的內(nèi)部體積。例如，細(xì)長的流動(dòng)路徑可以是 可對該通道的內(nèi)部體積進(jìn)行限定的通道(例如，微流體通道）。在一些實(shí)例中，在細(xì)長的流動(dòng) 路徑的內(nèi)部體積中提供聚合介質(zhì)。例如，可在細(xì)長的流動(dòng)路徑的功能區(qū)域的基本上整個(gè)的 內(nèi)部體積中提供聚合介質(zhì)。細(xì)長的流動(dòng)路徑的功能區(qū)域是如下區(qū)域:該區(qū)域用于樣品成分 的分析和檢測、且不包含細(xì)長的流動(dòng)路徑的其它區(qū)域(例如樣品加載區(qū)域、緩沖液儲(chǔ)存器、 微流體的流體導(dǎo)管）。如上所述，可在細(xì)長的流動(dòng)路徑的功能區(qū)域的基本上整個(gè)的內(nèi)部體積 中提供聚合介質(zhì)，從而使聚合介質(zhì)基本上填充細(xì)長的流動(dòng)路徑的內(nèi)部體積的寬度。在這些 實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)基本上填充了細(xì)長的流動(dòng)路徑的內(nèi)部體積，從而使在不包含聚合介 質(zhì)的內(nèi)部體積中不存在明顯的空隙。例如，在這些實(shí)施方式中，聚合介質(zhì)不是細(xì)長的流動(dòng)路 徑的內(nèi)部表面上的涂層，相反地，聚合介質(zhì)基本上填充了細(xì)長的流動(dòng)路徑的內(nèi)部體積?；?上占據(jù)了細(xì)長的流動(dòng)路徑的整個(gè)體積的聚合介質(zhì)可對如上所述的聚合介質(zhì)上的捕獲構(gòu)件 的固定提供增高的表面積。
[0072]在一些實(shí)施方式中，微流體裝置不包含含有聚合介質(zhì)的通道。在這些實(shí)施方式中， 可將聚合介質(zhì)提供作為底物上的獨(dú)立的聚合介質(zhì)。"獨(dú)立的"是指聚合介質(zhì)與底物接合，例 如設(shè)置在底物的表面上。例如，可將聚合介質(zhì)設(shè)置在底物的表面上，從而使僅聚合介質(zhì)的一 個(gè)表面(例如，底部表面)與底物的表面接觸。在這些實(shí)例中，聚合介質(zhì)的側(cè)面(例如，從聚合 介質(zhì)的底部向上延伸的聚合介質(zhì)的側(cè)面)可不與底物、或周圍的腔室(例如，微流體腔室)接 觸。類似地，聚合介質(zhì)的頂部表面可不與底物、或周圍腔室(例如，微流體腔室）（如果存在的 話)接觸。在一些實(shí)例中，可將獨(dú)立的聚合介質(zhì)設(shè)置在底物的表面上，并由周圍環(huán)境包圍。例 如，聚合介質(zhì)可具有與底物接觸的底部表面，其中，聚合介質(zhì)的側(cè)面和聚合介質(zhì)的頂部表面 曝露至周圍環(huán)境。在一些實(shí)施方式中，可將獨(dú)立的聚合介質(zhì)設(shè)置在底物的表面上，并定位在 環(huán)境腔室的內(nèi)部，從而使獨(dú)立的聚合介質(zhì)通過環(huán)境腔室內(nèi)部提供的環(huán)境包圍。在一些實(shí)例 中，聚合介質(zhì)可具有與底物接觸的底部表面，其中，聚合介質(zhì)的側(cè)面和聚合介質(zhì)的頂部表面 曝露至環(huán)境腔室內(nèi)部的環(huán)境。例如，比起環(huán)境條件，環(huán)境腔室可包含具有更高濕度的環(huán)境 (例如，測定環(huán)境）。具有更高濕度的測定環(huán)境可促進(jìn)降低流體從聚合介質(zhì)(例如，緩沖液等） 中的蒸發(fā)。在一些實(shí)施方式中，將獨(dú)立的聚合介質(zhì)設(shè)置在底物的表面上，其中，底物不會(huì)在 聚合介質(zhì)的周圍形成通道、槽或凹陷。在2014年5月6日提交的美國申請No. 14/271,309中對 獨(dú)立聚合介質(zhì)的另外的方面進(jìn)行了描述，以引用的方式將該申請的公開內(nèi)容并入本文中。 [00 73] 方法
[0074] 本發(fā)明方法的實(shí)施方式旨在測定分析物是否存在于樣品中。在該方法的一些實(shí)施 方式中，可對樣品中的一種或多種分析物進(jìn)行檢測。該方法包括將流體樣品引入包含如上 所述的聚合介質(zhì)的微流體裝置中。將流體樣品引入微流體裝置中可包括使樣品與聚合介質(zhì) 接觸。在一些實(shí)例中，可將樣品加入到與如上所述的聚合介質(zhì)流體連通的樣品儲(chǔ)存器中。在 一些實(shí)例中，在聚合介質(zhì)是如上所述的獨(dú)立的聚合介質(zhì)的情況中，可將樣品直接施加至聚 合介質(zhì)。例如，可將樣品施加至聚合介質(zhì)的頂部表面。在將樣品施加至聚合介質(zhì)的頂部表面 后，可允許樣品擴(kuò)散到聚合介質(zhì)中。在樣品充分?jǐn)U散到聚合介質(zhì)中后，可例如使用洗滌緩沖 液將存在于聚合介質(zhì)的表面上的多余樣品沖洗掉。
[0075] 本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括使樣品成分移動(dòng)通過聚合介質(zhì)。在一些示例中，通過凝 膠電泳產(chǎn)生樣品的移動(dòng)。在一些示例中，通過聚合介質(zhì)中的等電聚焦產(chǎn)生樣品的移動(dòng)。在一 些實(shí)施方式中，使樣品成分移動(dòng)通過聚合介質(zhì)包括以足以使樣品的組分移動(dòng)通過聚合介質(zhì) 的方式，向聚合介質(zhì)施加定向的電場。在一些實(shí)施方式中，通過如上所述的被動(dòng)擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)樣 品移動(dòng)通過聚合介質(zhì)。樣品可包含不同的可檢測分析物，其中，各分析物結(jié)合至聚合介質(zhì)中 的不同的捕獲構(gòu)件。
[0076] 當(dāng)樣品中的成分移動(dòng)通過聚合介質(zhì)時(shí)，感興趣的特異性分析物可被聚合介質(zhì)中的 捕獲構(gòu)件特異性地結(jié)合。例如，如本文所述，捕獲構(gòu)件可包含抗原，并且當(dāng)樣品中的成分移 動(dòng)通過聚合介質(zhì)時(shí)，由于特異性結(jié)合相互作用，感興趣的特異性抗體(或其片段)可結(jié)合至 抗原并被固定在聚合介質(zhì)中。在一些示例中，隨后可對經(jīng)固定的分析物進(jìn)行檢測。例如，該 方法可包括從分析物檢測域（即，包含捕獲構(gòu)件的聚合介質(zhì)的區(qū)域)獲得信號(hào)，以確定感興 趣的分析物是否結(jié)合至分析物檢測域中的聚合介質(zhì)，并因此存在于樣品中。
[0077] 在一些實(shí)施方式中，該方法包括確定感興趣的分析物是否存在于樣品中，例如，確 定樣品中的一種或多種感興趣的分析物存在或不存在。在一些實(shí)例中，對微流體裝置進(jìn)行 配置，以檢測樣品中的一種或多種分析物的存在。在該方法的一些實(shí)施方式中，可對樣品中 的一種或多種分析物的存在進(jìn)行定性或定量確定。定性確定包括其中向使用者提供關(guān)于樣 品中的分析物的存在的簡單的是/否結(jié)果的確定。定量確定包括半定量確定和精細(xì)尺度結(jié) 果，其中，半定量測定向使用者提供關(guān)于樣品中的分析物的量的粗略尺度結(jié)果（例如，低、 中、高）（例如，樣品中的感興趣的分析物的低濃度、中濃度或高濃度)和精細(xì)尺度結(jié)果，精細(xì) 尺度結(jié)果向使用者提供了分析物的濃度測量。
[0078] 在一些實(shí)施方式中，所述方法包括評價(jià)聚合介質(zhì)的分析物或感興趣的分析物(例 如，感興趣的兩個(gè)以上的分析物）的存在。例如，所述方法可包括對結(jié)合至聚合介質(zhì)的感興 趣的分析物進(jìn)行檢測。感興趣的分析物與聚合介質(zhì)的可檢測結(jié)合表明樣品中的感興趣的分 析物的存在?？蓪⒋┻^聚合介質(zhì)且未結(jié)合至聚合介質(zhì)中的捕獲構(gòu)件的不感興趣的部分沖洗 掉或轉(zhuǎn)移至二級分析裝置，例如但不限于UV光譜儀、IR光譜儀、質(zhì)譜儀、HPLC、親和力測定裝 置等。
[0079] 在一些實(shí)例中，感興趣的分析物包括可檢測標(biāo)記?？蓹z測標(biāo)記可包括但不限于熒 光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、多色試劑、酶聯(lián)試劑、親和素-鏈霉親和素相關(guān)的檢測試 劑、放射性標(biāo)記、金顆粒、磁性標(biāo)記等。在一些實(shí)例中，該標(biāo)記共價(jià)結(jié)合至感興趣的分析物。 例如，在微流體裝置中進(jìn)行分析之前，可將樣品與結(jié)合至感興趣的一種或多種分析物的可 檢測標(biāo)記相接觸。
[0080] 在一些實(shí)施方式中，對感興趣的分析物進(jìn)行檢測包括使感興趣的分析物與被配置 為特異性地結(jié)合至感興趣的分析物的標(biāo)記(例如，特異性地結(jié)合至感興趣的分析物的二級 特異性結(jié)合構(gòu)件，如二級抗體)接觸。例如，對感興趣的分析物進(jìn)行檢測可包括使感興趣的 分析物與特異性地結(jié)合至感興趣的分析物的二級特異性結(jié)合構(gòu)件接觸。在一些實(shí)例中，標(biāo) 記可包括可檢測標(biāo)記，例如但不限于熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、多色試劑、酶聯(lián)試 劑、親和素-鏈霉親和素相關(guān)的檢測試劑、放射性標(biāo)記、金顆粒、磁性標(biāo)記等。
[0081] 在一些實(shí)施方式中，所述方法包括增強(qiáng)來自感興趣的標(biāo)記分析物的可檢測信號(hào)。 例如，增強(qiáng)來自感興趣的標(biāo)記分析物的可檢測信號(hào)可包括使感興趣的標(biāo)記分析物與被配置 用于特異性地結(jié)合至感興趣的標(biāo)記分析物的二級標(biāo)記接觸。在一些實(shí)例中，二級標(biāo)記是特 異性地結(jié)合至感興趣的標(biāo)記分析物的二級特異性結(jié)合構(gòu)件，如二級抗體。就這方面而言，增 強(qiáng)來自感興趣的標(biāo)記分析物的可檢測信號(hào)可包括使感興趣的標(biāo)記分析物與被配置用于特 異性地結(jié)合至感興趣的標(biāo)記分析物的二級特異性結(jié)合構(gòu)件接觸。如上所述的兩個(gè)以上的可 檢測標(biāo)記的使用可通過改善信噪比來促進(jìn)感興趣的分析物的檢測。
[0082] 二級標(biāo)記可以是特異性地結(jié)合至被靶向的蛋白質(zhì)或核酸序列或生物大分子（例 如，感興趣的分析物）的任何分子。取決于分析物的性質(zhì)，標(biāo)記可以是但不限于:針對肽分析 物的表位的抗體(例如，抗體或其片段）；或任何識(shí)別分子，如特異性結(jié)合對的成員。例如，合 適的特異性結(jié)合對包括但不限于:受體/配體對的成員；受體的配體-結(jié)合部分;抗體/抗原 對的成員；抗體的抗原-結(jié)合片段;半抗原；凝集素/碳水化合物對的成員；酶/底物對的成 員；生物素/親和素；生物素/鏈霉親和素;地高辛/抗地高辛藥;DNA或RNA適體結(jié)合對的成 員；肽適體結(jié)合對的成員等。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記包括二級抗體。二級抗體可特異性地 結(jié)合至感興趣的分析物。
[0083] 在一些實(shí)施方式中，二級標(biāo)記包括可檢測標(biāo)記?？蓹z測標(biāo)記包括可使用方法和系 統(tǒng)進(jìn)行檢測的任何合適的標(biāo)記，可檢測標(biāo)記可包括但不限于熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光 標(biāo)記、多色試劑、酶連試劑、親和素-鏈霉親和素相關(guān)的檢測試劑、放射性標(biāo)記、金顆粒、磁性 標(biāo)記等。在一些實(shí)施方式中，二級標(biāo)記包括與可檢測標(biāo)記接合的二級抗體。例如，二級標(biāo)記 可包含特異性地結(jié)合至感興趣的標(biāo)記分析物的標(biāo)記抗體(例如，熒光標(biāo)記的抗體）。
[0084] 在一些實(shí)施方式中，可對感興趣的分析物進(jìn)行鑒定，使得可隨后對感興趣的分析 物的存在進(jìn)行檢測。例如，所述方法可包括評價(jià)聚合介質(zhì)的兩種以上的分析物的存在。分析 物可通過本文中描述的任何方法鑒定。例如，如上所述可采用標(biāo)記試劑，如包括可檢測標(biāo)記 的分析物特異性結(jié)合構(gòu)件。在一些實(shí)施方式中，可檢測標(biāo)記是熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記是通過熒 光檢測器可檢測的標(biāo)記部分。例如，熒光標(biāo)記與感興趣的分析物的結(jié)合可使得感興趣的分 析物通過熒光檢測器檢測。熒光標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于在接觸試劑時(shí)發(fā)熒光的熒光分 子、當(dāng)用電磁輻射(例如，UV、可見光、X-射線等)照射時(shí)發(fā)熒光的熒光分子等。
[0085] 合適的熒光分子(熒光團(tuán)）包括但不限于熒光素、異硫氰酸熒光素、羧基熒光素的 琥珀酰亞胺酯、熒光素的琥珀酰亞胺酯、熒光素二氯代三嗪的5-異構(gòu)體、籠鎖羧基熒光素-丙氨酸 _氨甲酰、俄勒閃綠488(0regon Green 488)、俄勒閃綠514(0regon Green 514);焚 光黃、吖啶橙、羅丹明、四甲基羅丹明、德克薩斯紅、碘化丙啶、JC-1(5,5'，6,6'_四氯-1，Γ， 3,3'_四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物）、四溴羅丹明123、羅丹明6G、TMRM(四甲基羅丹明甲 基酯）、TMRE(四甲基羅丹明乙基酯）、tetramethylrosamine、羅丹明B和4-dimethylaminotetramethylrosamine、綠色焚光蛋白、藍(lán)移的綠色焚光蛋白、青移的（cyan-shifted)綠色焚光蛋白、紅移的(red-shifted)綠色焚光蛋白、黃移的(yellow-shifted)綠 色焚光蛋白、4-乙酰胺基-4'-異硫氰酸基均二苯代乙稀-2，2'二磺酸（4-3〇6七3111丨(1〇-4'-isothiocyanatostilbene-2，2'disulfonic acid);卩丫 啶及衍生物，如卩丫啶、卩丫啶異硫氛酸 酯；5-(2氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS); 4-氨基-N-[3-乙烯基磺?；交鵠萘二甲酰 亞胺-3,5-二磺酸酯;N-(4-苯胺-1-萘基)順丁烯二酰亞胺;鄰氨基苯甲酰胺;4,4_二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a二氮雜-5-引達(dá)省-3-丙酸B0DIPY(4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a，4a diaza-5-indacene-3-propionic acid BODIPY);級耳關(guān)藍(lán)（cascade blue)； 亮黃(Brilliant Yellow);香豆素及衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素 120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151);花青染料;焰紅染料((^ &11〇以1^);4'，6-二 脒基-2-苯基吲哚(DAPI); 5 '，5" -二溴鄰苯三酚-磺酞（溴鄰苯三酚紅）；7-二乙基氨基-3-(4'_異硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素；二亞乙基三胺五乙酸酯;4,4'_二異硫氰酸基二氫-均二苯代乙烯-2，2 ' -二磺酸;4，4 ' -二異硫氰酸基均二苯代乙烯-2，2 ' -二磺酸;5-(二甲基 氨基)萘-1-磺酰氯(DNS，二甲氨基萘磺酰氯）；4_二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-異硫氰酸酯 (DABITC);伊紅及衍生物:伊紅、伊紅異硫氰酸酯；赤蘚紅及衍生物:赤蘚紅B、赤蘚紅、異硫 氰酸酯；乙錠(ethidium);熒光素及衍生物:5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6_二氯三嗪-2-基） 氨基-熒光素(DTAF)、2'，7'_二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基熒光素(J0E)、熒光素、熒光素異 硫氰酸酯、QFITC、（XRITC);熒光胺；IR144; IR1446;孔雀石綠異硫氰酸酯；4-甲基傘形酮鄰 甲酸釀（4_me thy Iumbe 11 i-feroneortho ere so lphthale in);硝基酪氨酸；副薔薇苯胺；苯 酚紅;B-藻紅蛋白；鄰苯二甲醛;花及衍生物:芘、花丁酸酯、琥珀酰亞胺基1-芘;丁酸酯量子 點(diǎn)；活性紅4(Reactive Red 4)(Cibacron?亮紅3B-A)羅丹明及衍生物:6-羧基-X-羅丹明 (ROX)、6_羧基羅丹明（R6G)、麗絲胺羅丹明B磺酰氯羅丹明（Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅 丹明X異硫氰酸酯、磺基羅丹明B、磺基羅丹明101、磺基羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩 斯紅）；N，N，N'，N'_四甲基-6-羧基羅丹明（TAMRA);四甲基羅丹明；四甲基羅丹明異硫氰酸 酯（TRITC);核黃素；5-(2'_氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-(4'_二甲基氨基苯基偶 氮）苯甲酸（DABCYL)、玫紅酸；CAL Fluor Orange 560;鋱螯合物衍生物；Cy 3;Cy 5;Cy 5.5;Cy 7;IRD 700;IRD 800;La Jolla Blue;釀花青（phthalo cyanine);以及萘花青 (naphthalo cyanine)、香豆素及相關(guān)染料、氧雜蒽染料（例如對甲氨基酸、試鹵靈、二胺 (bimanes)、吖啶、異吲哚、二甲氨基萘磺酰染料）、氨基鄰苯二甲酰肼(例如魯米諾以及異魯 米諾衍生物）、氨基鄰苯二甲酰亞胺、氨基萘二甲酰亞胺、氨基苯并呋喃、氨基喹啉、二氰基 氫醌、熒光銪和鋱絡(luò)合物、它們的組合等。合適的熒光蛋白和顯色蛋白包括但不限于綠色熒 光蛋白（GFP)(包括但不限于:源自多管水母(Aequoria victoria)的GFP或其衍生物，例如 "人化的"衍生物，如增強(qiáng)的6??^1111&11〇6(16??) ;來自其它物種如海腎（1^1^11& reniformis)、Renilla mulleri或Ptilosarcus guernyi的GFP; "人化的"重組GFP(hrGFP); 來自珊瑚蟲的種的多種熒光和著色蛋白的任一者;它們的組合等）。
[0086] 在一些實(shí)施方式中，該方法包括樣品中的分析物的一重(unipl ex)分析。"一重分 析"是指對樣品進(jìn)行分析以檢測樣品中的一種分析物的存在。例如，樣品可包含感興趣的分 析物與不感興趣的其它分子實(shí)體的混合物。在一些示例中，所述方法包括樣品的一重分析 以確定樣品混合物中的感興趣的分析物的存在。
[0087] -些實(shí)施方式包括樣品中的兩種以上的分析物的多重(mutiplex)分析。"多重分 析"是指確定兩種以上的不同分析物的存在，其中該兩種以上的分析物彼此不同。例如，分 析物可包含在其分子量、尺寸、電荷(例如荷質(zhì)比）、等電點(diǎn)等方面的可檢測的區(qū)別。在一些 實(shí)例中，分析物的數(shù)量大于2種，例如4種以上、6種以上、8種以上等、上至20種以上，例如50 種以上、包括100種以上的不同的分析物。在一些實(shí)施方式中，該方法包括感興趣的2種-100 種不同的分析物(例如2種-50種不同的分析物、包括2種-20種不同的分析物、或2種-10種不 同的分析物)的多重分析。
[0088] 在一些實(shí)施方式中，多重分析還包括兩種以上的不同的可檢測標(biāo)記的使用。兩種 以上的不同的可檢測標(biāo)記可特異性地結(jié)合至相同或不同的分析物。在一些示例中，兩種以 上的不同的可檢測標(biāo)記可特異性地結(jié)合至相同的分析物。例如，兩種以上的不同的可檢測 標(biāo)記可包括對相同分析物上的不同表位具有特異性的不同抗體。使用對相同分析物具有特 異性的兩種以上的可檢測標(biāo)記可通過改善信噪比來促進(jìn)分析物的檢測。在其它情況下，兩 種以上的不同的可檢測標(biāo)記可特異性地結(jié)合至不同的分析物。例如，兩種以上的可檢測標(biāo) 記可包含對不同分析物上的表位具有特異性的不同抗體。使用對不同分析物各自具有特異 性的兩種以上可檢測標(biāo)記可促進(jìn)單次分析的樣品中的兩種以上的各自分析物的檢測。
[0089] 在一些實(shí)施方式中，方法為自動(dòng)化的方法。就這方面而言，該方法可包括在將樣品 引入微流體裝置之后，使用者與微流體裝置及系統(tǒng)的相互作用最小化。例如，引導(dǎo)樣品穿過 聚合介質(zhì)的步驟可通過微流體裝置和系統(tǒng)進(jìn)行，從而使使用者無需手動(dòng)進(jìn)行這些步驟。在 一些示例中，自動(dòng)化的方法可促進(jìn)縮短總的分析時(shí)間。例如，該方法的實(shí)施方式可在120min 以內(nèi)、或90min以內(nèi)、或60min以內(nèi)、例如45min以內(nèi)、或30min以內(nèi)、例如20min以內(nèi)、包括 15min以內(nèi)、或IOmin以內(nèi)、或5min以內(nèi)進(jìn)行。
[0090] 可用本發(fā)明方法進(jìn)行分析的樣品可包括簡單樣品和復(fù)雜樣品。簡單樣品是包括感 興趣的分析物的樣品，并且可包括或可不包括非感興趣的一種或多種分子實(shí)體，其中這些 非感興趣分子實(shí)體的數(shù)量可以是低的，例如10以下、5以下等。簡單樣品可包括已經(jīng)過一些 方式處理(例如，從樣品除去潛在干擾分子實(shí)體）的初始生物樣品或其它樣品。"復(fù)雜樣品" 是指可具有或可不具有感興趣的分析物而且還包括非感興趣的許多不同蛋白質(zhì)和其它分 子的樣品。在一些實(shí)例中，在本發(fā)明方法中分析的復(fù)雜樣品是如下樣品:所述樣品包括在分 子結(jié)構(gòu)或物理性質(zhì)(例如，分子量、大小、電荷、等電點(diǎn)等)方面彼此不同的10個(gè)以上、如20個(gè) 以上、包括100個(gè)以上、例如IO 3個(gè)以上、IO4個(gè)以上(如15，000、20，000或25,000以上）的不同 的分子實(shí)體。
[0091] 在一些實(shí)施方式中，感興趣的樣品是生物樣品，例如但不限于尿液、血液、血清、血 漿、唾液、精液、前列腺液、乳頭抽吸液、淚液、汗液、糞便、頰拭子(cheek swabs)、腦脊髓液、 細(xì)胞裂解物樣品、羊水、胃腸液、活檢組織(例如由激光捕獲顯微切割(LCM)獲得的樣品）等。 在一些實(shí)例中，感興趣的樣品是血液制品，例如，全血、血清、血衆(zhòng)等。樣品可以是生物樣品 或可以使用成功提取DNA、RNA、蛋白質(zhì)和肽的常規(guī)方法從源自人類、動(dòng)物、植物、真菌、酵母 菌、細(xì)菌、組織培養(yǎng)物、病毒培養(yǎng)物及其組合的生物樣品中提取。在一些實(shí)施方式中，樣品為 流體樣品，例如處于流體中的分析物溶液。流體可以是水性流體，例如但不限于水、緩沖液 等。
[0092] 如上所述，能夠在本發(fā)明的方法中進(jìn)行測定的樣品可包括感興趣的一種或多種分 析物?？蓹z測的分析物的實(shí)例包括但不限于具有修飾或不具有修飾的蛋白質(zhì)和肽，例如抗 體、雙抗體、Fab片段、DNA或RNA結(jié)合蛋白、磷酸化蛋白質(zhì)（磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)）、肽適體、表 位、它們的組合等。
[0093] 在一些實(shí)施方式中，對所述方法進(jìn)行配置，以檢測樣品中的感興趣的成分，其中樣 品容量較小。例如，可對所述方法進(jìn)行配置，以檢測樣品中的感興趣的成分，其中樣品容量 在Iml以下、例如750μ1以下、包括500μ1以下、或250μ1以下、或100μΙ以下、或75μ1以下、或50 μL以下、或40μ1以下、或30μ1以下、或20μ1以下、或10μ1以下、或5μ1以下、或ΙμL以下、或 750nl以下、或500nl以下、或250nl以下、或IOOnl以下、或75nl以下、或50nl以下、或25nl以 下、或IOnl以下、或5nl以下、或Inl以下。在一些實(shí)例中，對所述方法進(jìn)行配置，以檢測樣品 中的感興趣的成分，其中樣品量為IOOnl以下。
[0094] 在一些實(shí)施方式中，所述方法包括在引導(dǎo)樣品通過分離介質(zhì)之前，對樣品進(jìn)行濃 縮、稀釋或緩沖液交換。濃縮樣品可包括在使樣品與聚合介質(zhì)接觸之前，使樣品與濃縮介質(zhì) 接觸。濃縮介質(zhì)可包括小孔徑聚合凝膠、膜(例如尺寸排除膜）、它們的組合等。在使樣品與 聚合介質(zhì)接觸之前濃縮樣品可促進(jìn)降低分析中使用的濃縮樣品的量和/或可促進(jìn)降低總分 析時(shí)間。稀釋樣品可包括在使樣品與聚合介質(zhì)接觸之前使樣品與另外的緩沖液接觸。對樣 品進(jìn)行緩沖液交換可包括在使樣品與聚合介質(zhì)接觸之前使樣品與緩沖液交換介質(zhì)接觸。緩 沖液交換介質(zhì)可包括與樣品緩沖液不同的緩沖液。緩沖液交換介質(zhì)可包括但不限于分子 篩、多孔樹脂等。
[0095] 在一些實(shí)施方式中，所述方法不包括封閉步驟。就這方面而言，本公開的方法可不 包括在檢測感興趣的分析物之前使聚合介質(zhì)與封閉劑接觸的步驟。在一些示例中，不需要 將分析物與聚合介質(zhì)的非特異性結(jié)合最小化的封閉步驟。例如，封閉步驟可以不是必須的， 因?yàn)楦信d趣的分析物(例如，抗體)僅特異性地結(jié)合至包含與該感興趣的分析物結(jié)合的特異 性捕獲構(gòu)件(例如，抗原）的聚合介質(zhì)的區(qū)域。
[0096] 在一些實(shí)施方式中，所述方法包括可在所述方法中的其它步驟之前、期間和之后 的不同時(shí)間進(jìn)行可選的洗滌步驟。例如，可在捕獲構(gòu)件結(jié)合至聚合介質(zhì)之后、使樣品與聚合 介質(zhì)接觸之后、使聚合介質(zhì)結(jié)合的感興趣的分析物與二級標(biāo)記接觸之后等，進(jìn)行洗滌步驟。
[0097] 所述方法的實(shí)施方式還可包括釋放結(jié)合至聚合介質(zhì)的分析物。該釋放可包括使結(jié) 合的分析物與釋放劑接觸。可對釋放劑進(jìn)行配置，以中斷分析物與聚合介質(zhì)之間的結(jié)合作 用。在一些示例中，釋放劑為中斷分析物與聚合介質(zhì)的捕獲構(gòu)件之間的結(jié)合作用使捕獲構(gòu) 件釋放分析物的試劑、緩沖液等。在從聚合介質(zhì)中釋放分析物之后，所述方法可包括將分析 物轉(zhuǎn)移出聚合介質(zhì)。例如，所述方法可包括將來自聚合介質(zhì)下游的被釋放的分析物引導(dǎo)用 于使用二級分析裝置的二級分析，所述二級分析裝置例如但不限于UV光譜儀和IR光譜儀、 質(zhì)譜儀、HPLC、親和性測定裝置、如上所述的第二微流體裝置等。
[0098] 所述方法的實(shí)施方式的方面還包括生產(chǎn)聚合介質(zhì)的方法。生產(chǎn)聚合介質(zhì)的方法可 包括提供隨后形成聚合介質(zhì)的前體部分。例如，生產(chǎn)聚合介質(zhì)的方法可包括在微流體裝置 的流動(dòng)路徑中提供前體部分。在一些實(shí)例中，流動(dòng)路徑被前體部分(例如，凝膠前體，如聚丙 烯酰胺凝膠前體)填充。在一些示例中，所述方法包括對前體部分進(jìn)行活化，以形成聚合介 質(zhì)。例如，對聚合介質(zhì)前體部分進(jìn)行活化可包括通過使前體部分與活化劑(例如但不限于過 氧化物)接觸，對前體部分在化學(xué)上進(jìn)行活化。在一些示例中，對前體部分進(jìn)行活化包括通 過使前體部分與光接觸，對前體部分進(jìn)行光致活化。如上所述，用于使聚合介質(zhì)的形成得以 活化的光可具有可見光譜中的藍(lán)光的波長。例如，用于使聚合介質(zhì)的形成得以活化的光可 具有如下波長：400nm-500nm、例如410nm-490nm、包括 420nm-480nm、或430nm-480nm、或 440nm-480nm、或450nm-480nm、或460nm-480nm、或465nm_475nm。在一些不例中，用于使聚合 介質(zhì)的形成得以活化的光的波長可為465nm-475nm。在一些實(shí)例中，用于使聚合介質(zhì)的形成 得以活化的光的波長可為470nm。在一些實(shí)施方式中，用于使聚合介質(zhì)的形成得以活化的光 的波長與如上所述的用于使捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的光的波長不同。
[0099] 在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)微流體測定裝置的方法包括在如上所述的流動(dòng)路徑中生 成聚合介質(zhì)。如本文所述，聚合介質(zhì)可包括具有在施用所施加的刺激時(shí)共價(jià)結(jié)合至捕獲構(gòu) 件的官能團(tuán)的不同的分析物檢測域。所述方法還包括：向聚合介質(zhì)中引入特異性地結(jié)合至 感興趣的分析物的捕獲構(gòu)件;將聚合介質(zhì)的區(qū)域曝露至所施加的刺激，以產(chǎn)生包含共價(jià)結(jié) 合至聚合介質(zhì)的捕獲構(gòu)件的分析物檢測域。例如，所述方法可包括：向聚合介質(zhì)中引入特異 性地結(jié)合至第一分析物的第一捕獲構(gòu)件；以及將聚合介質(zhì)的第一區(qū)域曝露至所施加的刺 激，以產(chǎn)生包含共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的第一捕獲構(gòu)件的第一分析物檢測域。所述方法的實(shí) 施方式還包括：向聚合介質(zhì)中引入特異性地結(jié)合至第二分析物的第二捕獲構(gòu)件；以及將聚 合介質(zhì)的第二區(qū)域曝露至所施加的刺激，以產(chǎn)生包含共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)的第二捕獲構(gòu)件 的第二分析物檢測域。在這一方式中，可在單個(gè)聚合介質(zhì)中產(chǎn)生多個(gè)分析物檢測域。
[0100] 在一些實(shí)施方式中，可通過使捕獲構(gòu)件與聚合介質(zhì)接觸，將捕獲構(gòu)件施加至聚合 介質(zhì)。在一些實(shí)例中，可將捕獲構(gòu)件添加到如上所述的與聚合介質(zhì)流體連通的儲(chǔ)存器中（例 如，可將本文所述的樣品儲(chǔ)存器用于將捕獲構(gòu)件引入聚合介質(zhì)）。在一些實(shí)例中，在聚合介 質(zhì)是如上所述的獨(dú)立的聚合介質(zhì)的情況中，可將捕獲構(gòu)件直接施加至聚合介質(zhì)。例如，可將 捕獲構(gòu)件施加至聚合介質(zhì)的頂部表面。在將捕獲構(gòu)件施加至聚合介質(zhì)的頂部表面后，可允 許捕獲構(gòu)件擴(kuò)散到聚合介質(zhì)中。在捕獲構(gòu)件充分?jǐn)U散到聚合介質(zhì)中后，可例如使用洗滌緩 沖液將存在于聚合介質(zhì)的表面上的多余的捕獲構(gòu)件沖洗掉。
[0101] 在一些實(shí)例中，所述方法進(jìn)一步包括使捕獲構(gòu)件移動(dòng)通過聚合介質(zhì)。在一些示例 中，捕獲構(gòu)件的移動(dòng)通過電泳產(chǎn)生，例如，以足以使捕獲構(gòu)件移動(dòng)通過聚合介質(zhì)的方式，向 聚合介質(zhì)施加定向的電場。在一些實(shí)施方式中，通過如上所述的被動(dòng)擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)捕獲構(gòu)件移 動(dòng)通過聚合介質(zhì)。一旦實(shí)現(xiàn)捕獲構(gòu)件充分移動(dòng)進(jìn)入聚合介質(zhì)中（例如，進(jìn)入期望的分析物檢 測域），可將聚合介質(zhì)曝露至所施加的刺激，以使捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至如本文所述的聚合介 質(zhì)。所施加的刺激可以是電磁輻射(例如光、如UV光）。就這方面而言，所述方法可包括將聚 合介質(zhì)曝露至所施加的穿過掩模(例如，光掩模)的刺激。光掩?？勺柚构馀c聚合介質(zhì)的一 些區(qū)域接觸，同時(shí)允許一些區(qū)域(例如，分析物檢測域)曝露至光，因此，使捕獲構(gòu)件僅在期 望的分析物檢測域共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)。
[0102] 在捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至分析物檢測域中的聚合介質(zhì)之后，例如通過使洗滌緩沖液 流動(dòng)穿過聚合介質(zhì)、和/或使洗滌緩沖液流過聚合介質(zhì)，可將未結(jié)合的捕獲構(gòu)件從聚合介質(zhì) 沖洗掉?？上蛉缟纤龅木酆辖橘|(zhì)施加另外的捕獲構(gòu)件(例如，不同于第一捕獲構(gòu)件的捕獲 構(gòu)件），以形成區(qū)別于第一分析物檢測域的另一分析物檢測域?？砂凑掌谕麑θ缦虏襟E進(jìn)行 重復(fù)，以在聚合介質(zhì)中產(chǎn)生多個(gè)不同的分析物檢測域:將捕獲構(gòu)件引入聚合介質(zhì);將聚合介 質(zhì)曝露至所施加的刺激，以使捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)；以及從聚合介質(zhì)將未結(jié)合的 捕獲構(gòu)件沖洗掉。
[0103] 在其它實(shí)施方式中，可將捕獲構(gòu)件的混合物基本上同時(shí)地引入聚合介質(zhì)中。例如， 可分別獲得兩個(gè)以上的捕獲構(gòu)件(例如，兩個(gè)以上的不同的捕獲構(gòu)件），然后混合在一起。然 后可將捕獲構(gòu)件的混合物施加至聚合介質(zhì)，以產(chǎn)生不同的分析物檢測域。例如，可通過將混 合物加入到與聚合介質(zhì)流體連通的儲(chǔ)存器、或通過將混合物施加至如上所述的獨(dú)立的聚合 介質(zhì)的頂部表面，將捕獲構(gòu)件的混合物施加至聚合介質(zhì)。然后，例如通過凝膠電泳、等電聚 焦等，可在聚合介質(zhì)中將捕獲構(gòu)件的混合物分離，從而使得在聚合介質(zhì)中產(chǎn)生不同捕獲構(gòu) 件的不同的帶。可將聚合介質(zhì)曝露至所施加的刺激(例如光、如UV光)下，以使捕獲構(gòu)件的帶 共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)，從而產(chǎn)生不同的分析物檢測域。在一些實(shí)施方式中，因?yàn)椴东@構(gòu)件已 經(jīng)在聚合介質(zhì)中分離成捕獲構(gòu)件的不同的帶，使聚合介質(zhì)曝露至所施加的刺激可在不使用 光掩模的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)例中，發(fā)現(xiàn)了如上所述的捕獲構(gòu)件的混合物在多重ELISA測 定方案中的用途。
[0104] 在其它實(shí)施方式中，捕獲構(gòu)件的混合物可作為混合物獲得，例如，捕獲構(gòu)件的變體 的混合物(例如，抗原變體的混合物）。例如通過將混合物加入與聚合介質(zhì)流體連通的儲(chǔ)存 器、或通過將混合物施加至獨(dú)立的聚合介質(zhì)的頂部表面，可將捕獲構(gòu)件的混合物施加至如 上所述的聚合介質(zhì)。如上所述，例如通過凝膠電泳、等電聚焦等，然后可在聚合介質(zhì)中將捕 獲構(gòu)件的混合物分離，從而在聚合介質(zhì)中產(chǎn)生不同捕獲構(gòu)件的不同的帶。可將聚合介質(zhì)曝 露至所施加的刺激(例如光、如UV光），以使捕獲構(gòu)件的帶共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)，以產(chǎn)生不同 的分析物檢測域。在一些實(shí)施方式中，因?yàn)椴东@構(gòu)件已經(jīng)在聚合介質(zhì)中被分離成捕獲構(gòu)件 的不同的帶，使聚合介質(zhì)曝露至所施加的刺激可不使用光掩模而進(jìn)行。在一些實(shí)例中，發(fā)現(xiàn) 了如上所述的捕獲構(gòu)件的混合物在蛋白質(zhì)印跡測定方案中的用途。
[0105] 系統(tǒng)
[0106] -些實(shí)施方式的方面包括用于確定分析物是否存在于樣品中的系統(tǒng)。在一些實(shí)例 中，該系統(tǒng)包含本文所述的微流體裝置。在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)還包含檢測器。在一些 示例中，檢測器是被配置用于對可檢測標(biāo)記進(jìn)行檢測的檢測器。檢測器可包括被配置用于 對在試驗(yàn)中使用的可檢測標(biāo)記進(jìn)行檢測的任何類型的檢測器。如上所述，可檢測標(biāo)記可以 是熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、多色試劑、酶聯(lián)試劑、親和素-鏈霉親和素相關(guān)的檢 測試劑、放射性標(biāo)記、金顆粒、磁性標(biāo)記等。在一些實(shí)例中，可檢測標(biāo)記是熒光標(biāo)記。在這些 實(shí)例中，可對檢測器進(jìn)行配置，以使熒光標(biāo)記與電磁輻射(例如可見光、UV、X_射線等)接觸， 所述電磁輻射激發(fā)熒光標(biāo)記并使熒光標(biāo)記發(fā)射可檢測的電磁輻射(例如，可見光等）?？赏?過檢測器對發(fā)射的電磁輻射進(jìn)行檢測，以確定結(jié)合至分離介質(zhì)的經(jīng)標(biāo)記的分析物的存在。
[0107] 在一些實(shí)例中，可對檢測器進(jìn)行配置，以檢測來自如上所述的熒光標(biāo)記的發(fā)射物。 在一些示例中，檢測器包括光電倍增管(PMT)、電荷耦合裝置(CCD)、加強(qiáng)的電荷耦合裝置 (KXD)、互補(bǔ)金屬-氧化物-半導(dǎo)體(CMOS)傳感器、目視比色讀出器、光電二極管等。
[0108] 所述系統(tǒng)還可包含電磁輻射的源（即，電磁輻射源）。在一些示例中，電磁輻射源是 光源。例如，光源可包括可見光源、UV光源、紅外光源等。在一些實(shí)例中，電磁輻射源包括諸 如UV光源的光源。如上所述，電磁輻射源可用于向微流體裝置中的聚合介質(zhì)前體部分施加 電磁輻射，以產(chǎn)生聚合介質(zhì)。如上所述，電磁輻射源可用于向微流體裝置中的聚合介質(zhì)施加 電磁輻射，以在聚合介質(zhì)的制造過程中使捕獲構(gòu)件共價(jià)結(jié)合至聚合介質(zhì)。
[0109] 本公開的系統(tǒng)可按照期望包含多種其它部件。例如，系統(tǒng)可包含流體處理部件、例 如微流體流體處理部件?？蓪α黧w處理部件進(jìn)行配置，以引導(dǎo)一種或多種流體通過微流體 裝置。在一些實(shí)例中，對流體處理部件進(jìn)行配置以引導(dǎo)流體，例如但不限于流體樣品、緩沖 液(例如電泳緩沖液、洗滌緩沖液、釋放緩沖液等)等。在一些實(shí)施方式中，對微流體流體處 理部件進(jìn)行配置，以向微流體裝置的聚合介質(zhì)遞送流體，從而使流體與聚合介質(zhì)接觸。流體 處理部件可包括微流體栗。在一些示例中，可對微流體栗進(jìn)行配置，以用于壓力驅(qū)動(dòng)的微流 體處理以及按照路線使流體通過本文公開的微流體裝置和系統(tǒng)。在一些實(shí)例中，對微流體 流體處理部件進(jìn)行配置，以遞送小體積的流體，例如Iml以下、例如500μ1以下、包括100μΙ以 下、例如50μ1以下、或25μ1以下、或10μ1以下、或5μ1以下、或ΙμL以下。
[0110] 在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含一個(gè)或多個(gè)電場發(fā)生器。可對電場發(fā)生器進(jìn)行配置， 以向微流體裝置的多個(gè)區(qū)域施加電場?？蓪ο到y(tǒng)進(jìn)行配置，以施加電場，從而使樣品電動(dòng)地 轉(zhuǎn)移穿過微流體裝置。例如，可對電場發(fā)生器進(jìn)行配置，以對聚合介質(zhì)施加電場。在一些示 例中，施加的電場可與聚合介質(zhì)的方向軸對齊。就這方面而言，可對施加的電場進(jìn)行配置， 以將樣品中的分析物和組分電動(dòng)地轉(zhuǎn)移穿過聚合介質(zhì)。在一些實(shí)例中，可對電場發(fā)生器進(jìn) 行配置，以施加具有 l〇V/cm-1000V/cm、例如 100V/cm-800V/cm、包括 200V/cm-800V/cm、或 400V/cm-800V/cm的強(qiáng)度的電場。
[0111] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的系統(tǒng)為生物芯片（例如生物傳感器芯片）。"生物芯 片"或"生物傳感器芯片"是指包含底物表面的微流體系統(tǒng)，該微流體系統(tǒng)在底物表面上呈 現(xiàn)出兩個(gè)以上的不同的微流體裝置。在一些實(shí)施方式中，微流體系統(tǒng)包含具有微流體裝置 陣列的底物表面。
[0112] "陣列"包括可尋址區(qū)域(例如空間上可尋址的區(qū)域）的任何二維或基本上二維（以 及三維）的排列。當(dāng)陣列具有位于陣列上的特定的預(yù)定位置處(例如"地址"）的多個(gè)裝置時(shí)， 該陣列是"可尋址的"。陣列特征(例如裝置)可被其間的間隔分隔開。任何給定的底物可攜 帶設(shè)置在底物正面上的一個(gè)、兩個(gè)、四個(gè)以上的陣列。根據(jù)用途，陣列的任一者或全部可彼 此相同或不同，并且各自可包含多個(gè)不同的微流體裝置。陣列可包含1個(gè)或多個(gè)、包括2個(gè)以 上、4個(gè)以上、8個(gè)以上、10個(gè)以上、25個(gè)以上、50個(gè)以上、或100個(gè)以上的微流體裝置。在一些 實(shí)施方式中，微流體裝置可布置成面積在IOOcm 2以下、50cm2以下、或25cm2以下、IOcm2以下、 5cm 2以下、例如I cm2以下、包括50mm2以下、20mm2以下、例如IOmm 2以下、或甚至更小的陣列。例 如，微流體裝置的尺寸可為IOmm X IOmm-200 mm X 200mm、包括100mm X IOOmm以下、例如50mm X 50mm以下、例如25_X 25mm以下、或IOmmX IOmm以下、或5mmX 5mm以下、例如ImmX Imm以 下。
[0113] 微流體裝置的陣列可被布置用于樣品的多重分析。例如，可串聯(lián)地布置多個(gè)微流 體裝置，以便可在串聯(lián)的微流體裝置中針對多種不同分析物的存在對樣品進(jìn)行分析。在一 些實(shí)施方式中，可平行地布置多個(gè)微流體裝置，以便可基本上同時(shí)分析兩種以上的樣品。 [0114]系統(tǒng)的方面包括微流體裝置，可對微流體裝置進(jìn)行配置，以消耗最小量的樣品同 時(shí)仍產(chǎn)生可檢測的結(jié)果。例如，可對系統(tǒng)進(jìn)行配置，以使用100μΙ以下、例如75μ1以下、包括 50μ1以下、或25μ1以下、或10μ1以下、例如5μ1以下、2μ1以下、ΙμL以下的樣品體積，同時(shí)仍然 產(chǎn)生可檢測的結(jié)果。在一些實(shí)施方式中，對系統(tǒng)進(jìn)行配置，以具有InM以下、例如500ρΜ以下、 包括IOOpM以下、例如IpM以下、或500fM以下、或250fM以下、例如IOOfM以下、包括50fM以下、 或25fM以下、或IOfM以下的檢測靈敏度。在一些實(shí)例中，對系統(tǒng)進(jìn)行配置，以能夠檢測濃度 在lμg/ml以下、例如500ng/ml以下、包括100ng/ml以下、例如10ng/ml以下、或5ng/ml以下、 例如lng/ml以下、或0· lng/ml以下、或0.01ng/ml以下、包括lpg/ml以下的分析物。在一些實(shí) 施方式中，系統(tǒng)具有10-18Μ-10Μ、例如10_ 15M-10_3M、包括KT12M-KT6M的動(dòng)態(tài)范圍。
[0115] 在一些示例中，對系統(tǒng)進(jìn)行配置，以具有如下的信噪比（SNR): 10以上、例如15以 上、包括20以上、或30以上、或40以上、或50以上、或60以上、或70以上、或80以上、或90以上、 或100以上、或150以上、或200以上、或500以上、或1,000以上、或2,000以上、或3,000以上、 或4,000以上、或5,000以上、或6,000以上、或7,000以上、或8,000以上、或9,000以上、或10， 000以上。在一些示例中，可實(shí)現(xiàn)的信噪比取決于在測定中使用的檢測方法。例如，在一些實(shí) 施方式中，將感興趣的分析物直接用可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在這些實(shí)施方式中，信噪比可以 是10以上、例如15以上、包括20以上、或30以上、或40以上、或50以上、或60以上、或70以上、 或80以上、或90以上、或100以上、或150以上、或200以上。在其它的實(shí)施方式中，將感興趣的 分析物首先用一級標(biāo)記(例如，一抗)進(jìn)行標(biāo)記，然后將一級標(biāo)記用二級標(biāo)記(例如，二抗)進(jìn) 行標(biāo)記。在這些實(shí)施方式中，信噪比可為100以上、例如150以上、包括200以上、或500以上、 或1,000以上、或2,000以上、或3,000以上、或4,000以上、或5,000以上、或6，000以上、或7， 000以上、或8,000以上、或9,000以上、或10,000以上。
[0116] 在一些實(shí)施方式中，微流體裝置在1°C-100°C、例如5°C-75°C、包括10°C-50°C、或 20 °C -40 °C的溫度下運(yùn)行。在一些實(shí)例中，微流體裝置在35 °C -40 °C的溫度下運(yùn)行。
[0117] 實(shí)用性
[0118]就能夠用于識(shí)別病原體、免疫反應(yīng)或生化試劑的存在的測定平臺(tái)的制造而言，發(fā) 現(xiàn)了本公開的裝置、系統(tǒng)和方法的實(shí)施方式在對聚合介質(zhì)內(nèi)的捕獲構(gòu)件進(jìn)行精確光致圖案 化中的用途。在微流體裝置內(nèi)限定不同區(qū)域的能力充當(dāng)了多種分析平臺(tái)的基礎(chǔ)?？蓪⒉煌?的、非均質(zhì)的區(qū)域用于進(jìn)行多重測定和實(shí)驗(yàn)。可將捕獲構(gòu)件的局部圖案化用于生產(chǎn)生物分 析裝置。
[0119] 發(fā)現(xiàn)了本公開的裝置、系統(tǒng)和方法在感興趣的分析物的檢測中的用途，所述感興 趣的分析物例如蛋白質(zhì)、肽(例如，抗體或其片段）、核酸等。在一些示例中，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的 裝置、系統(tǒng)和方法在蛋白質(zhì)或肽的檢測中的用途，例如但不限于抗體或其片段。
[0120] 在一些實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在樣品中的蛋白質(zhì)或其它 生物分子的檢測中的用途。所述方法可包括對樣品中的一組生物標(biāo)記(例如，兩種以上的不 同的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記)進(jìn)行檢測。例如，所述方法可用于生物樣品中的兩種以上的疾病生物 標(biāo)記的快速、臨床檢測，例如，可用于受試者中的病狀的診斷、或用于受試者中的病狀的持 續(xù)管理或治療等。另外，本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法可發(fā)現(xiàn)在樣品中的分析物檢測的方案中 的應(yīng)用，例如但不限于蛋白印跡等。
[0121] 在一些實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在生物標(biāo)記的檢測中的用 途。在一些示例中，本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法可用于檢測特定生物標(biāo)記的存在或不存在， 以及在血液、血漿、血清或其它體液或分泌物（例如但不限于尿液、血液、血清、血漿、唾液、 精液、前列腺液、乳頭抽吸液、淚液、汗液、糞便、頰拭子、腦脊髓液、細(xì)胞裂解物樣品、羊水、 胃腸液、活檢組織等）中的特定生物標(biāo)記的濃度的升高或降低。在一些實(shí)例中，本發(fā)明的裝 置、系統(tǒng)和方法可用于檢測特定生物標(biāo)記的存在或不存在，并可用于檢測血液制品（例如， 全血、血清、血漿等）中的特定生物標(biāo)記的濃度的升高或降低。
[0122] 生物標(biāo)記的存在或不存在或者生物標(biāo)記的濃度的明顯變化可用于診斷個(gè)體中的 疾病風(fēng)險(xiǎn)、疾病存在或者用于個(gè)體中的疾病的定制治療。例如，特定生物標(biāo)記或生物標(biāo)記組 的存在可影響給予至個(gè)體的藥物治療或給藥方案的選擇。在潛在的藥物療法的評價(jià)中，可 使用生物標(biāo)記作為天然指標(biāo)(如存活或不可逆發(fā)病）的替代物。如果治療改變了與改善的健 康有直接聯(lián)系的生物標(biāo)記，則生物標(biāo)記能夠用作評價(jià)特定治療或給藥方案的臨床益處的替 代性指標(biāo)。因此，通過本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法促進(jìn)了基于在個(gè)體中檢測的特定生物標(biāo)記 或生物標(biāo)記組的個(gè)性化診斷和治療。此外，如上所述，本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)的高靈敏度促進(jìn) 與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記的早期檢測。由于在單個(gè)芯片上檢測多種生物標(biāo)記的能力以及靈敏 度、可量測性和易于使用，發(fā)現(xiàn)了本文公開的微流體裝置、系統(tǒng)和方法在便攜式和即時(shí)檢測 (point-of-care)或快速診斷(near-patient)的分子診斷學(xué)中的用途。
[0123] 在一些實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在檢測疾病或疾病狀態(tài)的 生物標(biāo)記中的用途。在一些實(shí)例中，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在檢測生物標(biāo)記中的 用途，該生物標(biāo)記用于表征細(xì)胞信號(hào)通路以及藥物發(fā)現(xiàn)和疫苗開發(fā)的細(xì)胞內(nèi)通訊。例如，本 發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法可用于檢測和/或定量患病的、健康的或良性樣品中生物標(biāo)記的 量。在一些實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在檢測傳染性疾病或疾病狀態(tài)的 生物標(biāo)記中的用途。在一些示例中，生物標(biāo)記可以是分子生物標(biāo)記，例如但不限于蛋白質(zhì)、 核酸、糖類、小分子等。
[0124] 發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在診斷測定中的用途，例如但不限于如下：如上 所述的檢測和/或定量生物標(biāo)記;篩查測定，其中對于無癥狀受試者以定期間隔測試樣品； 預(yù)后測定，其中，將生物標(biāo)記的存在和/或量用于預(yù)測可能的病程;分層測定，其中可預(yù)測受 試者對不同藥物治療的響應(yīng);功效測定，其中監(jiān)測藥物治療的功效等。
[0125] 還發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在驗(yàn)證測定中的用途。例如，可使用驗(yàn)證測定 來驗(yàn)證或證實(shí)潛在的疾病生物標(biāo)記是疾病在多種個(gè)體中存在或不存在的可靠指標(biāo)。本發(fā)明 的裝置、系統(tǒng)和方法的短的測定時(shí)間能夠促進(jìn)在最短的時(shí)間量里增高篩查多個(gè)樣品的通 量。例如，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法在親和試劑的篩查中的用途?？蓪绫疚?所述的聚合介質(zhì)的高通量微流體裝置用于對生物標(biāo)記的同工型特異性的親和試劑進(jìn)行選 擇，所述特異性的親和試劑例如特異性的單克隆抗體?？蓪⒋祟愒噭┯糜诖嬖谟谂R床蛋白 質(zhì)樣品中的疾病-特異性生物標(biāo)記同工型的ELISA測定。在一些示例中，可串聯(lián)地對試劑進(jìn) 行篩查、或?qū)υ噭┑母叨忍禺愋越Y(jié)合的多重(平行)能力進(jìn)行篩查。
[0126] 在一些實(shí)例中，本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法可在不需要用于實(shí)施的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的 情況下使用。與同等的分析研究實(shí)驗(yàn)室設(shè)備相比，本發(fā)明的裝置和系統(tǒng)以便攜式手持系統(tǒng) 提供了相當(dāng)?shù)姆治鲮`敏度。在一些示例中，重量和操作成本比起典型的固定實(shí)驗(yàn)室設(shè)備更 低。本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置可被集成到單一儀器中，從而使測定的所有步驟(包括感興趣的分 析物的分離、轉(zhuǎn)移、標(biāo)記和檢測)可通過單一的儀器進(jìn)行。例如，在一些示例中，不存在用于 感興趣的分析物的分離、轉(zhuǎn)移、標(biāo)記和檢測的獨(dú)立儀器。另外，本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置可由未 進(jìn)行檢測樣品中的一種或多種分析物的醫(yī)療培訓(xùn)的人員在非處方家庭測試的家庭環(huán)境中 使用。本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置還可在臨床環(huán)境(例如病床邊）用于快速診斷、或者用于由于成 本或其它原因而未提供固定的研究實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的環(huán)境中。
[0127] 套件
[0128] 本公開的方面另外包括具有本文詳細(xì)描述的微流體裝置的套件。套件的實(shí)施方式 還包含被配置用于容納微流體裝置的包裝。包裝可以是密封的包裝。例如，在一些實(shí)施方式 中，套件包含被配置用于維持微流體裝置的無菌性的密封的包裝。可對密封的包裝進(jìn)行密 封，從而使得基本上沒有外部污染物(例如，灰塵、微生物(例如，真菌、細(xì)菌、病毒、芽胞形式 等）、液體、氣體等)能夠進(jìn)入密封的包裝。例如，可對密封的包裝進(jìn)行密封，從而使包裝是水 密和/或氣密的。
[0129] 套件可進(jìn)一步包含緩沖液。例如，套件可包含例如電泳緩沖液、樣品緩沖液等的緩 沖液。套件可進(jìn)一步包含另外的試劑，例如但不限于脫模劑、變性劑、重折疊劑、洗滌劑、可 檢測的標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、多色試劑、酶聯(lián)試劑、親和素-鏈霉親 和素相關(guān)的檢測試劑、放射性標(biāo)記、金顆粒、磁性標(biāo)記等)等。
[0130]除了以上組分之外，本發(fā)明的套件可進(jìn)一步包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的說明。這 些說明能以多種形式存在于本發(fā)明的套件中，在套件中可存在一種或多種所述形式。這些 說明可存在的一種形式是作為處于套件的包裝或包裝插入物等中的在合適的介質(zhì)或底物 上的印刷信息，例如印有信息的一張或多張紙。另一方式可以是計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，例如在其 上記錄或存儲(chǔ)有信息的磁盤、CD、DVD、藍(lán)光光碟、計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)器等。還可存在的另一種 方式為可經(jīng)由互聯(lián)網(wǎng)加以使用以在遠(yuǎn)離的站點(diǎn)獲取信息的網(wǎng)址。在套件中可存在任何適當(dāng) 的方式。
[0131]如從以上提供的公開中可理解，本發(fā)明的實(shí)施方式具有廣泛的應(yīng)用。因此，本文示 出實(shí)施例是為了說明的目的，并不打算解釋為對本發(fā)明的任何形式的限定。本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員將會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到能夠進(jìn)行改變或修改以產(chǎn)生本質(zhì)上相似的結(jié)果的多種非重要參 數(shù)。因此，提出以下實(shí)施例是為了向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制造和使用本發(fā)明的完 整的公開和描述，而并不打算限定發(fā)明人所認(rèn)為的他們的發(fā)明的范圍，也并不打算表示以 下實(shí)驗(yàn)是所進(jìn)行的全部或僅有的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)做出了努力以保證所使用的數(shù)值(例如，量、溫 度等)的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)當(dāng)考慮一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)為重量份數(shù)，分子 量為重均分子量，溫度為攝氏度，以及壓力為大氣壓或接近大氣壓。
[0132] 實(shí)施例
[0133] 實(shí)施例1 [0134] 簡介
[0135] 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)生微流體通道，其可在不需要額外的接頭分子的單一步驟中完成蛋 白質(zhì)三維光捕獲。還進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證使用BSA/抗-BSA抗體對的光致圖案化的蛋白質(zhì)選擇 性地捕獲抗體的能力。還進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以展示基于本公開的實(shí)施方式的HCV診斷裝置，并顯示 出能夠?qū)θ搜暹M(jìn)行測定以肯定地識(shí)別HCV+人類患者血清樣品的裝置。
[0136] 將光致活化的可接受量(volume-accessible)的凝膠(LAVA凝膠)用作官能化的基 質(zhì)以用于測定。通過將N-(3-[ (4-苯甲?；交┘柞０坊鵠丙基）甲基丙烯酰胺(BPMAC)并 入聚丙烯酰胺(PA)凝膠基質(zhì)產(chǎn)生的LAVA凝膠生成了具有光可活化的共價(jià)捕獲能力的PA凝 膠。當(dāng)通過UV照射時(shí)，活化的凝膠在鄰近BPMAC的二苯甲酮基團(tuán)處共價(jià)連接至靶標(biāo)。例如，當(dāng) 用作進(jìn)行蛋白質(zhì)分離(例如，等電聚焦）的基質(zhì)時(shí)，所述基質(zhì)使得分離的蛋白質(zhì)能夠通過光 捕獲保持在適當(dāng)位置。這使得免疫印跡步驟能夠在原位進(jìn)行，而不需要轉(zhuǎn)移步驟(例如，轉(zhuǎn) 移以分離印跡膜）。
[0137] LAVA凝膠基質(zhì)是可光致圖案化的底物，并用于三維捕獲蛋白帶的制造。LAVA凝膠 作為底物的用途使得能夠?qū)⒐獠东@化學(xué)作用(photocapture chemistry)直接并入底物中， 并由此避免了在其它圖案化方法中需要的任何修飾步驟。另外，蛋白質(zhì)與PA凝膠之間存在 最小化的非特異性相互作用，并因此不需要任何封閉步驟。這與BPMAC并入凝膠基質(zhì)結(jié)合， 簡化了底物的制備。與需要對捕獲部分進(jìn)行接枝或預(yù)圖案化的方法不同，LAVA凝膠的使用 將光致圖案化簡化至單一步驟的工藝。當(dāng)與通道表面固定技術(shù)相比時(shí)，聚丙烯酰胺凝膠作 為納米多孔基質(zhì)的用途還產(chǎn)生了顯著更高的有效捕獲表面積。例如，與毛細(xì)管的內(nèi)表面相 比，LAVA凝膠在捕獲效率方面提供了至少兩個(gè)數(shù)量級的增長。最后，無論納米多孔基質(zhì)是否 存在，電動(dòng)轉(zhuǎn)移的使用克服了存在于諸如致密整料的底物中的流體阻力。這使得系統(tǒng)中的 短擴(kuò)散距離能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的有效光捕捉以及與引入樣品的后續(xù)反應(yīng)。
[0138] 還將LAVA凝膠用作光致圖案化底物，以制造能夠測定人血清并且能夠識(shí)別HCV+患 者血清樣品的微流體多重HCV診斷裝置。發(fā)現(xiàn)了本公開的聚合LAVA凝膠介質(zhì)在用于微流體 裝置(在生物分析工具領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用）中制造復(fù)雜圖案的穩(wěn)健和簡便方法中的用途。
[0139] 化學(xué)品和試劑
[0140] 30 % (w/v) (29:1)丙烯酰胺/雙丙烯酰胺的水溶液、冰醋酸、過硫酸銨(APS)、N， N，N '，N 四甲基乙二胺(TEMED)、甲醇、3_(三甲氧基硅基)_丙基甲基丙烯酸酯和氫氧化 鈉(NaOH)購自Sigma-Aldrich(St .Louis，M0) <^-(3-[ (4-苯甲?；交┘柞０坊鵠丙基）甲 基丙稀酰胺（BPMAC)從PharmAgra實(shí)驗(yàn)室（Brevard，NC)獲得。AlexaFluor 488(AF488)和 AlexaFluor 555(AF555 )標(biāo)記卵白蛋白（OVA)和牛血清白蛋白（BSA)購自Life Technologies(Carlsbad，CA) qFITC-標(biāo)記的抗-BSA抗體購自MyBiosource有限公司（San 0168〇,04)。丙型肝炎病毒（!1(^)陽性血清、4?488綴合的!1(^核（。22?)、奶3(。33(3)和奶4 (clOOp)抗原由Norvartis Diagnostics(Emeryvilie，CA)提供。HCV陰性人血清購自 SeraCare Life Sciences(OceansideAA)c3AlexaFluor 568(AF568)綴合的二級羊抗人抗 體購自Life Technologies(Carlsbad，CA)。在引入至芯片中之前，將所有抗原、抗體和血清 樣品稀釋至I X Tris-甘氨酸緩沖液中。I X Tris-甘氨酸緩沖液以10 X的濃度購自Bio-Rad (Hercules，CA)〇
[0141] 數(shù)據(jù)獲取、控制和圖案化儀器
[0142] 使用Peltier-cooled CCD相機(jī)CoolSNAP HQ2(Roper Scientific，Trenton，NJ)通 過10\物鏡在01}^118]^-50倒置焚光顯微鏡(015〇1^)118 1]34,061^1'\%1167，？4)上獲取圖 像。除非另有指明，綠色熒光通道(AlexFluor 488)和紅色熒光通道(AlexaFluor 568)的曝 光時(shí)間分別為 150ms和300ms。使用Metamorph軟件（來自Molecular Devices(Sunnyvale， CA))控制的X-cite Exacte照射系統(tǒng)（來自Lumen Dynamics(Mississauga，加拿大））提供照 射。使用11^86】（來自1'11!1(861:116 8(^，]\?))進(jìn)行圖像分析。將定制可編程的高壓電力供給 (HVPS)用于電泳控制（鉑電極直接插入樣品儲(chǔ)存器孔中）。用于光致圖案化的UV由 Hamamatsu Lightningcure LC5單元（Bridgewater，NJ)通過Lumatec 380系列的液芯光導(dǎo) 管(Deisenhofen，德國）提供。使用Universal Laser PLS6MW(具有30W的光纖激光器墨盒） (Scottsdale，AZ)從50μηι厚的不銹鋼板進(jìn)行激光切割并在內(nèi)部產(chǎn)生光掩膜設(shè)計(jì)。
[0143] 微流體芯片的制備
[0144] 在內(nèi)部進(jìn)行芯片設(shè)計(jì)并由Caliper Life Sciences(Hopkinton，MA)進(jìn)行制造。使 用標(biāo)準(zhǔn)濕法刻蝕法和鉆孔法，接著使用熱粘合法。各裝置包含三個(gè)1.2mm長、90μπι寬和20μπι 深的平行微流體通道，該微流體通道與用作樣品儲(chǔ)存器的直徑2mm、深I(lǐng)mm的孔連接。各芯片 包含4個(gè)裝置，各裝置具有3個(gè)通道。
[0145] 在引入聚丙烯酰胺凝膠前體溶液之前，用丙烯酸酯封端的自組裝單層對玻璃通道 表面進(jìn)行官能化。將I X TG的前體溶液、4 % wt/vo 1的總丙烯酰胺(4 % T)(具有總計(jì)2.6 %的 作為交聯(lián)劑的雙丙烯酰胺（2.6 % C)以及1.6nM的BPMAC)混合，并用超聲和真空進(jìn)行脫氣。 BPMAC產(chǎn)生了具有光可活化捕獲能力的聚丙烯酰胺凝膠。在引入裝置中之前，向前體溶液中 加入0.08%(wt/vol)的APS和0.08%(vol/vol)的TEMED以引發(fā)聚合。在15min的聚合之后， 用IXTG緩沖液對孔沖洗兩次，然后用IXTris-甘氨酸(TG)緩沖液填充，并貯存在4 °C下的 濕潤有蓋培養(yǎng)皿中。在對孔進(jìn)行清洗之前，通過檢查多余的前體溶液來確認(rèn)凝膠化。
[0146] 條形碼測定物的制造
[0147] 在芯片制備完成之后，進(jìn)行微流體通道內(nèi)的蛋白質(zhì)帶(條形碼）的光致圖案化。在 移液入樣品孔（~6μ1)之前，將待固定的蛋白質(zhì)（標(biāo)記或未標(biāo)記的）稀釋至IXTG緩沖液中。 然后通過在樣品和槽孔之間施加200V的電偏壓，使樣品以電泳的方式加載到微流體通道 中。將條形碼蛋白加載兩分鐘，將蛋白質(zhì)均勻地加載至通道中所需的時(shí)間是憑經(jīng)驗(yàn)得出的。 在加載之后，將光掩模置于通道的頂部，并將光導(dǎo)管直接置于掩模中的開口的頂部。隨后， 在通過儀器接口控制的20 %光闌開口處，施加五秒的UV照射。在照射之后，用I X TG緩沖液 對孔各自清洗三次，并施加500V的反向偏壓五分鐘，從而以電泳的方式洗脫未固定的蛋白 質(zhì)。通過熒光成像對成功的蛋白質(zhì)帶圖案化進(jìn)行確認(rèn)。
[0148] HCV診斷測定的操作
[0149] 在將血清樣品移液至芯片上之前，用I XTG緩沖液對樣品儲(chǔ)存器清洗三次。將血清 樣品以電動(dòng)的方式引入微流體通道中以進(jìn)行測定。在200V的偏壓下，連續(xù)引入稀釋的血清 樣品（1:40) 15分鐘，接著在200V的反向偏壓下，進(jìn)行電泳洗脫步驟20分鐘。通過在200V的偏 壓下引入熒光標(biāo)記的抗-人抗體10分鐘，接著在200V下洗脫額外的10分鐘，進(jìn)行捕獲的人 抗-HCV抗體的免疫探測。然后，作為熒光圖像捕獲印跡結(jié)果。
[0150]結(jié)果和討論
[0151] 用于微流體夾心測定的光致圖案化條形碼
[0152] 將本文所描述的條形碼測定平臺(tái)用于單個(gè)LAVA凝膠填充的微流體通道中。圖1(版 ±夬八)示出了光致圖案化的條形碼裝置的示意圖。紅色(較暗陰影)部分表示在其中蛋白質(zhì)被 固定的區(qū)域，而藍(lán)色(較亮陰影)區(qū)域表示沒有固定的蛋白質(zhì)的區(qū)域。圖1的放大的示意插圖 (版塊A)示出了圖案化帶的邊緣。在放大圖中可以看出，聚丙酰胺凝膠的整個(gè)體積被連接至 聚丙酰胺凝膠基質(zhì)（細(xì)線）中的BPMAC官能化。然而，蛋白質(zhì)被定位至選定的區(qū)域，并通過與 BPMAC綴合而固定到凝膠基質(zhì)上。如上所討論的，BPMAC為聚丙酰胺凝膠提供了光捕獲能力。 在前體溶液自由基聚合成水凝膠狀態(tài)的過程中，BPMAC的甲基丙烯酸部分（圖1(版塊B))使 得分子能夠交聯(lián)至聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)中。然后通過UV光對二苯甲酮基團(tuán)進(jìn)行活化，以與 在形成凝膠后引入的附近的靶標(biāo)形成共價(jià)鍵。如圖1所示(版塊C)，使用光捕獲化學(xué)作用以 創(chuàng)建微流體夾心測定。使用BPMC通過光致圖案化將抗原固定在聚丙烯酰胺凝膠中。以電泳 的方式將作為分析靶標(biāo)的未標(biāo)記的一級抗體引入裝置中。固定的抗原通過特異性的抗體/ 抗原相互作用捕獲所引入的一級抗體。在一些實(shí)例中，隨后引入標(biāo)記的二級抗體，以對所捕 獲的一級抗體的存在進(jìn)行確認(rèn)。
[0153] 通過光致圖案化產(chǎn)生復(fù)雜圖案
[0154] 對于條形碼圖案的制造，當(dāng)施加 UV光時(shí)，引入凝膠-填充通道的蛋白質(zhì)通過二苯甲 酮化學(xué)作用在選定的區(qū)域共價(jià)連接至基質(zhì)。選擇性地將UV僅施加至通道的部分以固定蛋白 質(zhì)的能力使得能夠?qū)y定物進(jìn)行制造而無需封閉步驟，從而簡化了制造過程。未活化的 LAVA凝膠與所引入的蛋白質(zhì)之間的相互作用最小化，避免了對非圖案化區(qū)域進(jìn)行鈍化的需 要。各圖案化周期被分為三個(gè)步驟并可進(jìn)行重復(fù)，以在微流體通道內(nèi)創(chuàng)建復(fù)雜的圖案。所述 步驟包括加載、圖案化以及洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)。圖2(版塊A)闡明了在三個(gè)圖案化周期中， 使用三個(gè)不同的熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)對5-帶圖案進(jìn)行制造的過程。在第一周期期間，首先將 AF555標(biāo)記的OVA以電泳的方式加載到通道中，并將光掩模置于芯片的頂部并施加 UV照射。 除了兩條細(xì)縫，光掩模阻擋了來自芯片的所有UV，使得位于未掩蔽區(qū)域下方的LAVA凝膠的 兩個(gè)狹窄的區(qū)域的活化。將AF555標(biāo)記的OVA固定在曝露位點(diǎn)處的凝膠基質(zhì)中。隨后的電泳 洗脫顯示捕獲的蛋白質(zhì)的兩條熒光帶（圖2(版塊A)，周期1)。然后將加載-圖案化-洗滌的過 程重復(fù)兩次（用不同的掩模），以形成AF488-標(biāo)記的OVA的單個(gè)帶的圖案（圖2(版塊A，周期 2)，隨后形成AF488-標(biāo)記的BSA的兩個(gè)帶（圖2(版塊A)，周期3)，對于三種蛋白質(zhì)共計(jì)五條 帶。圖2(版塊A)中示出了圖案化的帶以及疊加的復(fù)合圖像。圖2(版塊B)中示出了三個(gè)圖案 化周期的各自的電泳圖?？梢钥闯觯谥芷?和周期3之間，圖案化的帶之間的區(qū)域中的熒光 信號(hào)基本上沒有變化，表明在未曝露區(qū)域的凝膠中沒有殘余的熒光蛋白質(zhì)保留。
[0155] 處于圖案化帶的中央的熒光信號(hào)發(fā)生衰減，這是熒光染料在強(qiáng)UV曝露下光致漂白 的結(jié)果，而不是由于圖案化帶的邊緣的更高固定效率。例如，基于制造商說明，離開光導(dǎo)管 的光的強(qiáng)度分布在中央處較高，而朝向邊緣處較低。這表明任何光致漂白作用在中央比在 邊緣更顯著。另外，免疫探測結(jié)果表明在中央比在邊緣固定了更多蛋白質(zhì)。就這方面而言， 相較于可能具有光致漂白的固定的蛋白質(zhì)上的熒光標(biāo)記，可將免疫探測用于局部蛋白質(zhì)含 量的定量。這與在各照射帶中央處具有更高的UV曝露的觀點(diǎn)是一致的。
[0156] 使用圖案化的誘餌蛋白質(zhì)捕獲抗體
[0157] 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證明該裝置能夠使用圖案化的蛋白質(zhì)捕獲構(gòu)件從樣品溶液中捕獲抗 體。為了驗(yàn)證該平臺(tái)作為診斷裝置的能力，使用BSA和抗-BSA抗體作為抗體-抗原對進(jìn)行初 始表征研究。圖3(版塊A)的頂部圖像示出了單個(gè)光致圖案化的AF488標(biāo)記的BSA帶。以電泳 的方式加載AF568標(biāo)記的抗BSA抗體的稀溶液（~700pM)，并隨時(shí)間對圖案化蛋白質(zhì)帶位置 處的熒光信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測。圖3(版塊A)中央的三個(gè)圖像(版塊A)示出了在抗體加載的開始(t = Omin)、進(jìn)入抗體加載的15分鐘、以及在抗體加載階段結(jié)束時(shí)（30分鐘）拍攝的熒光圖像。 箭頭表示當(dāng)前取向中從右至左的加載方向。圖3(版塊A)的底部圖像示出了在抗體加載階段 結(jié)束時(shí)(例如，t = 30min)，在固定的非靶標(biāo)抗原的位點(diǎn)處拍攝的圖像。在整個(gè)加載階段，整 個(gè)通道包含貫穿通道的均勻分布的抗體溶液。然而，隨著抗體濃度的加載，來自熒光標(biāo)記的 抗體的信號(hào)低于背景噪聲的信號(hào)。然而，當(dāng)抗體移動(dòng)穿過圖案化的蛋白質(zhì)帶時(shí)，抗體通過特 異性的抗體/抗原相互作用被捕獲。這有效地增加了標(biāo)記抗體在圖案化的蛋白質(zhì)帶處的局 部濃度。隨著更多抗體被捕獲，可檢測的信號(hào)隨時(shí)間出現(xiàn)。在這種情況下，由于從右至左對 抗體溶液進(jìn)行加載，信號(hào)開始在圖案化帶的右側(cè)積累。如圖3(版塊B)所示，可通過電泳圖而 可視化。圖3(版塊B)中的曲線示出了圖3(版塊A)中所示的三個(gè)中央圖像的相應(yīng)電泳圖。明 顯的峰隨著時(shí)間進(jìn)程而不斷增加，表明抗體在圖案化的BSA帶處特異性累積。
[0158] 通過在圖案化的BSA帶位置處獲取特異性的ROK感興趣的區(qū)域），并在抗體加載階 段繪制隨時(shí)間變化的信號(hào)水平，對抗體的累積進(jìn)行監(jiān)測。圖3(版塊C)示出了如在圖3(版塊 A)的底部示出的、在圖案化的BSA帶處與在非靶標(biāo)蛋白質(zhì)帶處的等效ROI之間的比較。圖3 (版塊C)中的實(shí)線表示在BSA帶處記錄的信號(hào)，虛線表示在非靶標(biāo)蛋白帶處聚集的信號(hào)。垂 直線表明來自單個(gè)裝置內(nèi)的三個(gè)平行通道的各時(shí)間點(diǎn)(n = 3)的測量信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在非 靶標(biāo)位點(diǎn)，信號(hào)在整個(gè)三十分鐘的加載期間保持恒定，然而，信號(hào)在BSA帶處隨時(shí)間穩(wěn)定地 增加。對整個(gè)三十分鐘范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)(具有0.9829的r-平方值)進(jìn)行指數(shù)擬合。這與在前沿 的抗體捕獲行為一致。也就是說，隨著更多抗體被結(jié)合，剩余的可用位點(diǎn)的數(shù)量減少，減慢 了更多抗體在該區(qū)域積累的速率。這被觀察為隨時(shí)間的曲線的斜率降低。依據(jù)信噪比（SNR) 對捕獲的抗體信號(hào)的顯著性進(jìn)行評價(jià)。將SNR定義為BSA+信號(hào)和BSA-信號(hào)之間的差值除以 BSA-信號(hào)的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3(版塊C)中的插圖示出了在抗體加載期間的SNR的曲線圖。在 10分鐘之后，SNR大于5，且SNR在抗體加載期間的剩余時(shí)間內(nèi)保持在5以上。
[0159] 微流體條形碼格式中的夾心測定
[0160] 為了對本文公開的裝置中的夾心測定的性能進(jìn)行評價(jià)，在微流體通道中制造了 3-帶測試圖案。這三個(gè)圖案化的帶是:AF488綴合的0VA、無蛋白質(zhì)固定僅用UV照射的帶、以及 未標(biāo)記的BSA的帶(參見圖4(版塊A))。將前兩個(gè)帶用作兩個(gè)陰性對照。OVA作為非靶標(biāo)抗原， UV-活化的帶為"空白"凝膠，以確保存在的任何信號(hào)均非來自抗體和凝膠之間的非特異性 相互作用。從左到右按順序依次對帶進(jìn)行圖案化。圖4(版塊B)示出了在對三個(gè)帶進(jìn)行圖案 化之后，單個(gè)微通道的圖像。由于其它兩個(gè)帶沒有熒光，只有一個(gè)帶(AF488-0VA)是可見的。 電泳圖示出了來自三個(gè)平行通道的平均信號(hào)值(虛線），圍繞虛線的陰影表示平均信號(hào)的一 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。如圍繞電泳圖中可見虛線的最小陰影所示，由于UV照射同時(shí)進(jìn)行，光致圖案化 在三個(gè)通道之間產(chǎn)生一致的蛋白質(zhì)固定。在圖案化之后，以電泳的方式從右至左在5分鐘內(nèi) 引入71.5nM的羊一級FITC-標(biāo)記的抗-BSA抗體，接著電泳洗脫10分鐘。然后，拍攝微通道的 熒光圖像，以驗(yàn)證抗體捕獲。如在圖4(版塊C)中可以看出，在BSA圖案化的位置處檢測到了 特異性的熒光帶，而無 BSA的位置處未顯示信號(hào)。此外，AF488-0VA帶處的熒光信號(hào)中不存在 變化，表明在非靶標(biāo)的抗原位置處沒有顯著的交叉反應(yīng)性。電泳圖示出了具有最小可視陰 影面積(標(biāo)準(zhǔn)偏差）的三個(gè)技術(shù)重復(fù)（techni cal trip I i cates)之間的一致性，表明了緊密 分布。為了完成夾心測定，在10分鐘內(nèi)，將71.5nM的AF568-標(biāo)記的山羊-抗-綿羊二級抗體從 右到左加載到裝置中，接著進(jìn)行10分鐘的洗脫。圖4(版塊D)示出了免疫印跡結(jié)果。相較于 BSA帶位置處的基線，二級抗體產(chǎn)生了顯著的信號(hào)增加。此外，相較于僅UV的帶，BSA帶處的 集成熒光的SNR增加了~25(對于一級探測）至>100(對于二級探針）。在相同尺寸的ROI內(nèi)， 對于AF488-0VA(非靶標(biāo)抗原)處的二級信號(hào)，SNR僅為~6.8。結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)了所述裝置在對 加載到裝置的樣品中的抗體進(jìn)行特異性捕獲和鑒定中的用途。
[0161] 用人血清樣品進(jìn)行的HCV診斷
[0162] 在驗(yàn)證了可將所述裝置用于捕獲和識(shí)別抗體之后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以對具有圖案化HCV 抗原的人血清進(jìn)行檢查。就HCV診斷測定而言，使用包括以下的五個(gè)帶圖案來驗(yàn)證血清的成 功加載:三個(gè)AF488-標(biāo)記的HCV抗原、一個(gè)陰性對照(OVA)、以及一個(gè)用蛋白質(zhì)L圖案化的陽 性對照帶。圖5(版塊A)示出了HCV診斷帶布局的示意圖。三個(gè)使用的HCV抗原為ClOOp(來自 NS4-膜結(jié)合蛋白的肽）、c22p(來自核心蛋白的肽)和c33c(病毒蛋白NS3-病毒蛋白酶）。從左 到右按順序?qū)нM(jìn)行圖案化。圖5(版塊B)示出了在對全部五個(gè)帶圖案化后，拍攝的熒光圖 像。在微通道的左側(cè)檢測到了三個(gè)HCV抗原，而未對陰性對照和陽性對照進(jìn)行標(biāo)記且未被檢 測出。
[0163] 將人血清樣品以1:40的比例稀釋至I X TriS-甘氨酸緩沖液中，并以電泳的方式在 15分鐘內(nèi)加載到圖案化的微通道中，接著用I XTG緩沖液洗脫20分鐘。每個(gè)三重復(fù)測定所消 耗的人血清的體積為約150nl。在洗脫之后，通過10分鐘內(nèi)引入71.5nM的AF568-標(biāo)記的抗-人二級抗體，接著進(jìn)行10分鐘的洗脫，進(jìn)行免疫印跡。
[0164] 微流體芯片格式促進(jìn)每個(gè)芯片進(jìn)行四個(gè)同時(shí)測定，對于各測定而言技術(shù)三重復(fù)。 圖5(版塊C)示出了來自在四個(gè)不同的人血清樣品上進(jìn)行的四個(gè)同時(shí)測定的結(jié)果。四個(gè)樣品 中的一個(gè)來自HCV-個(gè)體，其它三個(gè)樣品來自已知的HCV+患者。陽性對照（蛋白質(zhì)L)顯示出全 部四個(gè)樣品的信號(hào)，表明血清已成功加載到全部四個(gè)裝置中。在各自的四個(gè)情況下，陰性對 照帶(OVA)未顯示出信號(hào)。就HCV抗原帶而言，HCV-血清(血清#4)未顯示出顯著的信號(hào)，這表 明與HCV抗原無反應(yīng)性。HCV+血清顯示梯度的探測結(jié)果。血清#1針對clOOp和c33c顯示出高 反應(yīng)性，針對c22p未顯示出反應(yīng)性。血清#2針對clOOp和c33c顯示出低響應(yīng)，針對c22p無反 應(yīng)性。血清#3針對clOOp和c22c顯示出低響應(yīng)，針對c33c顯示出相對更高的響應(yīng)。由于使用 重組免疫印跡測定(RIBA)診斷裝置的研究已示出，并非所有的HCV+患者對基于抗體的診斷 測試顯示陽性響應(yīng)，HCV+血清可能對HCV抗原顯示不同的響應(yīng)。
[0165] 歸納總結(jié)
[0166] 將官能化的聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)(LAVA凝膠）用于對微流體裝置中的復(fù)雜圖案進(jìn) 行光致圖案化。快速地產(chǎn)生高度可重復(fù)的三維固定的蛋白質(zhì)圖案。在不需要接枝、預(yù)圖案化 或封閉步驟的情況下，在單個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)的圖案化。使用包含微流體裝置的 官能化的聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)以創(chuàng)建多重測定平臺(tái)，該平臺(tái)使用圖案化的固定的抗原蛋白 質(zhì)對來自樣品的特異性抗體進(jìn)行檢測。將所述裝置用作能夠?qū)碜韵♂尩娜祟惢颊哐宓?人抗-HCV抗體進(jìn)行檢測的多重微流體HCV診斷工具。除了診斷平臺(tái)的制造之外，由于可將制 造方法用于多輪圖案化，發(fā)現(xiàn)了使用官能化的聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的光致圖案化在其它復(fù) 雜幾何圖形中的用途。發(fā)現(xiàn)了本文公開的裝置、系統(tǒng)和方法在諸如底物-酶或信號(hào)-受體相 互作用的測定的應(yīng)用中的用途。產(chǎn)生任意圖案的能力還促進(jìn)更多的復(fù)雜多級測定的創(chuàng)建， 否則，由于冗長和復(fù)雜的多步驟制造方案，這些復(fù)雜多級測定是被抑制的。
[0167] 雖然為了清楚理解的目的已經(jīng)通過說明和實(shí)施例的方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了前述 實(shí)施方式，但是在本公開的教導(dǎo)下，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明顯的是，在不脫離所附權(quán)利 要求書的精神和范圍的情況下，可對其進(jìn)行一些變化和修改。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用術(shù)語僅 用于描述【具體實(shí)施方式】的目的，并不是為了限定，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅通過所附權(quán)利要求 書限定。
[0168] 在提供了取值范圍的情況下，應(yīng)理解的是，在范圍的上下限與在該所述范圍內(nèi)的 任何其它所述值或中央值之間的各中央值(除非上下文中明確地另有所指，否則直至下限 單位的十分之一)被涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。這些更小的范圍的上限和下限可被獨(dú)立地包含在更 小的范圍內(nèi)并且被涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，受到在所述范圍內(nèi)的任何明確排除的端值的影響。在 所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)端值時(shí)，排除一個(gè)或兩個(gè)所含端值的范圍也包括在本公開的實(shí)施 方式內(nèi)。
[0169] 以引用的方式將本申請文件中引用的所有公開和專利并入本文中（如同各單獨(dú)的 公開或?qū)＠驯痪唧w且單獨(dú)地指明以引用的方式并入），并以引用的方式并入本文中，從而 公開和描述與所引用的公開相關(guān)的方法和/或材料。任何公開的引用是為了其在本提交曰 之前的公開內(nèi)容，并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為承認(rèn)了本發(fā)明無權(quán)憑借在先的發(fā)明而先于此類公 開。此外，所提供的公開的日期可能與實(shí)際【公開日】期不同，這可能需要單獨(dú)確認(rèn)。
[0170]應(yīng)注意的是，除非上下文中明確地另有指明，否則本說明書和所附的權(quán)利要求中 使用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"該/所述"包括復(fù)數(shù)的指代物。進(jìn)一步應(yīng)注意的是，權(quán)利 要求可能被撰寫為排除任何可選要素。就這方面而言，這一陳述旨在充當(dāng)如下的在先基礎(chǔ)： 使用與權(quán)利要求要素的敘述有關(guān)的如"只"和"僅"等排他性術(shù)語或者使用"否定的"限制。 [0171]在閱讀本公開時(shí)，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本文中描述和示出的各 個(gè)實(shí)施方式各自具有離散的組件和特征，在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，這些離 散的組件和特征可容易地與任何其它的多個(gè)實(shí)施方式的特征分離或者組合。能夠以記載的 事件的順序或者以任何邏輯上可行的其它順序?qū)嵤┤魏斡涊d的方法。
[0172]因此，前文僅描述了本發(fā)明的原理。顯而易見的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到雖然 未在本文中明確地描述或示出、但是體現(xiàn)了本發(fā)明的原理并且包括在其精神和范圍內(nèi)的多 種布置。此外，本文敘述的所有實(shí)施例和條件性語言原則上是為了幫助讀者理解本發(fā)明的 原理和發(fā)明人為促進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)做出貢獻(xiàn)的概念，并應(yīng)當(dāng)解釋為不對這些特定敘述的實(shí)施例 和條件進(jìn)行限定。此外，本文中敘述本發(fā)明的原理、方面和實(shí)施方式以及其特定實(shí)施例的所 有聲明是為了涵蓋其結(jié)構(gòu)和功能等同物。另外，其用意是，這些等同物包括目前已知的等同 物和未來開發(fā)的等同物，即，開發(fā)的執(zhí)行相同功能的任何元件，而不論結(jié)構(gòu)如何。因此，本發(fā) 明的范圍不應(yīng)被限定為本文示出和描述的示例性實(shí)施方式。而是，本發(fā)明的范圍和精神通 過所附權(quán)利要求書體現(xiàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種微流體裝置，所述微流體裝置包含聚合介質(zhì)，所述聚合介質(zhì)包含： 第一分析物檢測域，所述第一分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第一共 價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件；以及 第二分析物檢測域，所述第二分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第二共 價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件。2. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件和第二共價(jià)結(jié)合 捕獲構(gòu)件是不同的。3. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件和第二共價(jià)結(jié)合 捕獲構(gòu)件是相同的，并且所述微流體裝置進(jìn)一步包含處于所述第一分析物檢測域和第二分 析物檢測域之間的間隔域。4. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述聚合介質(zhì)包含聚丙烯酰胺凝膠。5. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述第一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件通過接頭基團(tuán)共 價(jià)結(jié)合至所述聚合介質(zhì)。6. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述第二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件通過接頭基團(tuán)共 價(jià)結(jié)合至所述聚合介質(zhì)。7. 如權(quán)利要求5或6所述的微流體裝置，其中，所述接頭基團(tuán)包含二苯甲酮官能團(tuán)。8. 如權(quán)利要求5或6所述的微流體裝置，其中，所述接頭基團(tuán)包含N-(3-[(4-苯甲?；?基）甲酰胺基]丙基）甲基丙烯酰胺或3-苯甲酰基-N-[3-(2-甲基-丙烯?；被?-丙基]-苯 甲酰胺。9. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述第一捕獲構(gòu)件包含抗原。10. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述第二捕獲構(gòu)件包含抗原。11. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述微流體裝置包含兩種以上的聚合介質(zhì)， 各聚合介質(zhì)包含： (a) 第一分析物檢測域，所述第一分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第 一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件；以及 (b) 第二分析物檢測域，所述第二分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第 二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件。12. -種確定分析物是否存在于樣品中的方法，所述方法包括： (a) 將樣品引入包含聚合介質(zhì)的微流體裝置中，其中，所述聚合介質(zhì)包含： (i) 第一分析物檢測域，所述第一分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第 一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件；以及 (ii) 第二分析物檢測域，所述第二分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第 二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件； (b) 以足以使所述樣品中的組分移動(dòng)通過所述聚合介質(zhì)的方式，向所述聚合介質(zhì)施加 定向電場；以及 (c) 從一個(gè)或多個(gè)所述第一分析物檢測域和所述第二分析物檢測域獲得信號(hào)，以測定 分析物是否存在于樣品中。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述第一捕獲構(gòu)件包含第一抗原，并且所述第一 分析物包含特異性地結(jié)合至所述第一抗原的第一特異性結(jié)合構(gòu)件。14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述第二捕獲構(gòu)件包含第二抗原，并且所述第二 分析物包含特異性地結(jié)合至所述第二抗原的第二特異性結(jié)合構(gòu)件。15. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述第一特異性結(jié)合構(gòu)件包含熒光標(biāo)記。16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述第二特異性結(jié)合構(gòu)件包含熒光標(biāo)記。17. 如權(quán)利要求12所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在將所述樣品引入所述微流體裝 置之后，向所述微流體裝置中引入標(biāo)記。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述標(biāo)記包含特異性地結(jié)合至所述第一分析物的 二級特異性結(jié)合構(gòu)件。19. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述標(biāo)記包含特異性地結(jié)合至所述第二分析物的 二級特異性結(jié)合構(gòu)件。20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述標(biāo)記包含熒光部分。21. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述樣品包括血液或血液制品。22. -種用于確定分析物是否存在于樣品中的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含： (a) 微流體裝置，所述微流體裝置包含聚合介質(zhì)，所述聚合介質(zhì)包含： (i) 第一分析物檢測域，所述第一分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第 一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件；以及 (ii) 第二分析物檢測域，所述第二分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第 二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件；以及 (b) 檢測器。23. 如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包含被配置為引導(dǎo)流體通過所述微流 體裝置的一種或多種微流體部件。24. -種套件，所述套件包含： (a) 微流體裝置，所述微流體裝置包含聚合介質(zhì)，所述聚合介質(zhì)包含： (i) 第一分析物檢測域，所述第一分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第一分析物的第 一共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件；以及 (ii) 第二分析物檢測域，所述第二分析物檢測域包含特異性地結(jié)合至第二分析物的第 二共價(jià)結(jié)合捕獲構(gòu)件； (b) 包裝，所述包裝被配置用于容納所述微流體裝置。25. -種生產(chǎn)微流體測定裝置的方法，所述方法包括： 生產(chǎn)聚合介質(zhì)，所述聚合介質(zhì)包含在施用所施加的刺激時(shí)共價(jià)結(jié)合至捕獲構(gòu)件的官能 團(tuán)； 向所述聚合介質(zhì)中引入特異性地結(jié)合至第一分析物的第一捕獲構(gòu)件； 將所述聚合介質(zhì)的第一區(qū)域曝露至所施加的刺激，以產(chǎn)生包含共價(jià)結(jié)合至所述聚合介 質(zhì)的所述第一捕獲構(gòu)件的第一分析物檢測域； 向所述聚合介質(zhì)中引入特異性地結(jié)合至第二分析物的第二捕獲構(gòu)件；以及 將所述聚合介質(zhì)的第二區(qū)域曝露至所施加的刺激，以產(chǎn)生包含共價(jià)結(jié)合至所述聚合介 質(zhì)的所述第二捕獲構(gòu)件的第二分析物檢測域， 從而生產(chǎn)所述微流體測定裝置。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK105849563SQ201480069950
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年10月21日
【發(fā)明人】艾米·E·赫爾, 羅伯特·林
【申請人】加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)