專利名稱：來(lái)源于擬南芥的與耐逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來(lái)源于擬南芥的與耐脫落酸、干旱和高鹽等耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在培育耐脫落酸、干旱和高鹽等耐逆性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、降低作物產(chǎn)量的重要因素之一，而植物激素脫落酸(ABA)是一種脅迫信號(hào)，在植株的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)植物受到干旱等的脅迫時(shí)，ABA能作為一種初始內(nèi)源信號(hào)，使植物產(chǎn)生氣孔關(guān)閉或使某些基因的表達(dá)發(fā)生改變等引起一系列適應(yīng)性反應(yīng)，從而有效減緩干旱脅迫條件下植株葉片相對(duì)含水量的下降，提高植株的抗旱性。
研究表明，許多控制干旱的基因同樣被ABA誘導(dǎo)，而這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域大多含有一個(gè)保守的ABA作用元(ABARE)，但還有另外一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有1-2個(gè)不被ABA作用的脫水反應(yīng)元(DRE)。有趣的是，RD22基因啟動(dòng)子區(qū)域中的DRE同樣也被ABA作用，但它并沒(méi)有典型的ABRE一致序列，分析表明，該基因啟動(dòng)子中有一段同時(shí)含有MYC和MYB識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列，共67bp，可能是ABA和脫水反應(yīng)所誘導(dǎo)的區(qū)域。因此，在干旱脅迫條件下，植物體中存在著多種調(diào)節(jié)形式。截止目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種ABA負(fù)調(diào)控因子(如ABI1、ABI2、ROP10、ERA1、CBL9和CIPK3等)和ABA正調(diào)控因子(如ABI3、ABI4和ABI5等)。
MYB型轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)含有保守的MYB區(qū)域的蛋白家族。Jin等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MYB結(jié)構(gòu)域是一段序列特異性結(jié)合DNA區(qū)域，約由52個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，根據(jù)MYB區(qū)域的重復(fù)序列多少將該類型轉(zhuǎn)錄因子劃分為三個(gè)亞家族，分別為MYB 1R(含有一個(gè)重復(fù)序列)、MYB 2R(含有兩個(gè)重復(fù)序列)和R2R3 MYB(含有三個(gè)重復(fù)序列)型轉(zhuǎn)錄因子(Jin，H.and Martin，C.Multifunctionality and diversity within the plantMYB-gene family.Plant Mol Biol.1999，41577-585)。其中，擬南芥中約有125個(gè)R2R3 MYB型基因，是植物中最大的MYB型基因家族，該型基因?qū)χ参锏亩未x和細(xì)胞凋亡具有重要作用，然而目前只有極少數(shù)R2R3 MYB型基因被發(fā)現(xiàn)。Paz-Ares等在一種高桿谷類禾草(Zea mays)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)籽粒糊粉層中花青素(Anthocyanins)合成的必需基因C1，是已報(bào)道最早的R2R3 MYB型基因(Paz-Ares J，Ghosal D，WienandU et al.The regulatory C1 locus of Zea mays encodes a protein with homologyto myb oncogene products and with structural similarities to transcriptionalactivators.EMBO J，1987，63553-3558)。此后，在不同植物中又相繼有多種該類型的基因被發(fā)現(xiàn)，如AtMYB0/GL1、AtMYB66/WER、AtMYB75/PAP1、AtMYB90/PAP2、AtMYB33、AtMYB60、AtMYB61、AtMYB65和AtMYB101等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來(lái)源于擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明所提供的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)，名稱為DRM，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO1由285個(gè)氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第3-116位氨基酸殘基為保守的MYB序列，是編碼基因DRM的功能保守域。
所述取代、缺失或添加的氨基酸殘基的具體數(shù)目取決于DRM的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述“取代”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述“缺失”是指氨基酸序列的改變，其中分別缺少一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述“添加”是指氨基酸序列的改變，相對(duì)天然分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
編碼本發(fā)明來(lái)源于擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因(DRM)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物耐逆性功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由858個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5’端第1-858位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
所述編碼擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM的啟動(dòng)子(pDRM)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動(dòng)所述編碼擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)錄功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO3由1608個(gè)堿基組成。
含有本發(fā)明基因和/或啟動(dòng)子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增本發(fā)明基因和/或啟動(dòng)子中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼所述擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物耐逆性獲得提高。
在上述提高植物耐逆性的方法中，編碼本發(fā)明擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測(cè)試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
編碼本發(fā)明擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM或其同源序列可通過(guò)含有DRM或其同源序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBin系列載體(如pBinPlus、pBin19等)、pBI系列載體(如pBI 101等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pUC系列載體或pBluescript系列載體等。
使用編碼本發(fā)明擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型(ABA、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動(dòng)子；所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子，玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻actin1啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可為根特異性表達(dá)啟動(dòng)子、葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子、維管特異性表達(dá)啟動(dòng)子、種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng)子，如2S1啟動(dòng)子(GenBank號(hào)NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank號(hào)M64633.1，GI349405)啟動(dòng)子等；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受低溫、干旱、ABA、乙烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
其中，以pBinPlus為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有編碼本發(fā)明擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM的植物表達(dá)載體為pBinPlus-DRM。
攜帶有編碼本發(fā)明擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
此外，通過(guò)將轉(zhuǎn)化有編碼本發(fā)明擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因DRM或與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對(duì)該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性進(jìn)一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁包括無(wú)性繁殖和/或種子繁殖。
本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物同樣適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官既可來(lái)源于黃瓜、番茄、楊樹(shù)、苜宿、煙草、油菜、棉花、大豆、桉樹(shù)、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物，也可來(lái)源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。
本發(fā)明提供了一個(gè)來(lái)源于擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子DRM及其編碼基因。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化擬南芥可顯著提高擬南芥對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受性，以及對(duì)ABA的敏感性，且對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的正常生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性狀沒(méi)有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C(jī)制的研究，以及提高植物的耐旱、耐鹽等耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為經(jīng)干旱、NaCl和ABA脅迫處理的擬南芥的根系中DRM表達(dá)情況的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖2為pDRM:GUS轉(zhuǎn)基因株系不同組織的化學(xué)染色結(jié)果圖3為DRM植物表達(dá)載體pBinPlus-DRM的部分結(jié)構(gòu)示意4為DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的早期苗對(duì)ABA敏感度檢測(cè)結(jié)果圖5為DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株后期主根的生長(zhǎng)對(duì)ABA敏感度檢測(cè)結(jié)果圖6為DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性檢測(cè)結(jié)果圖7為DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及測(cè)序工作分別由北京奧科和北京諾塞基因組研究中心有限公司完成。
實(shí)施例1、擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因DRM的篩選及其cDNA的獲得將擬南芥生態(tài)型Columbia(Col-0)的種子在4℃下春化3-5d后，在超凈臺(tái)上用70％酒精處理2-3min，然后用無(wú)菌水洗1次(1-2min)，再將種子用15％次氯酸鈉處理15min，并用無(wú)菌水洗5-6次，每次充分振蕩混勻，最后將種子懸浮在0.1％的瓊脂中，并均勻地播撒在含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用封口膜將培養(yǎng)皿封好，置于23℃下，在24h連續(xù)光照的培養(yǎng)間生長(zhǎng)。
待經(jīng)上述擬南芥材料生長(zhǎng)兩周后，取幼苗，加液氮研磨后，用RNA提取試劑盒(QIAGEN)并按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取葉片的總RNA。取5μg葉片總RNA，用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄其cDNA，再以該cDNA為模板，在引物P1(上游引物)5’-ATGGGAAGAGCTCCATGCTGTG-3’和P2(下游引物)5’-CTAGAGCCCGGCTAAGAGATC-3’的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因(命名為DRM)。其中，50μl反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液5μl，上、下游引物(20μM)各1μl，dNTPs(2.5mM each)2μl，ExTaq酶0.25μl，模板cDNA2μl，并加重蒸水38.75μl使總體積達(dá)50μl。反應(yīng)條件為先94℃變性3min；然后94℃1min，52℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了858bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化該目的片段后將其與載體pGEM-T easy相連，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，得到攜帶目的片段的重組載體，命名為pGEM-T-DRM，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該基因具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，由858個(gè)堿基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列，將該基因的編碼蛋白命名為DRM。
實(shí)施例2、擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因DRM在非生物脅迫下的表達(dá)特征一、檢測(cè)擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因DRM在非生物脅迫下的表達(dá)特征對(duì)擬南芥生態(tài)型Columbia分別進(jìn)行干旱、NaCl、ABA處理，以分析實(shí)施例1獲得的擬南芥DRM在非生物脅迫下的表達(dá)情況，具體方法為將擬南芥Columbia的種子種在盆中，生長(zhǎng)2星期后，對(duì)幼苗分別進(jìn)行下述脅迫處理干旱處理將擬南芥幼苗從土中取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，分別在光照條件下干旱培養(yǎng)0小時(shí)(對(duì)照)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)后取樣。
鹽處理將擬南芥幼苗的根系置于150mM NaCl溶液中，分別在光照條件下培養(yǎng)0小時(shí)(對(duì)照)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)后取樣。
ABA處理將擬南芥幼苗的根系置于20μM ABA中，分別在光照條件下培養(yǎng)0小時(shí)(對(duì)照)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)后取樣。
將收集的經(jīng)不同脅迫處理的根系樣品在液氮中速凍，用Trizol試劑提取總RNA，用RT-PCR法分析DRM基因的表達(dá)水平，所用引物為P1和P2。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，在ABA，NaCl和干旱脅迫下，DRM的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高；其中，經(jīng)ABA，NaCl脅迫處理1小時(shí)，DRM表達(dá)量即顯著增高，經(jīng)脅迫處理后6小時(shí)后，DRM表達(dá)量達(dá)到最高，之后有所下降；在干旱脅迫下，在3小時(shí)DRM表達(dá)量達(dá)到最高，之后有所下降。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明基因DRM的表達(dá)受干旱、NaCl和ABA等逆境脅迫誘導(dǎo)。
二、檢測(cè)擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因DRM在不同組織中的表達(dá)水平1、DRM啟動(dòng)子的擴(kuò)增根據(jù)擬南芥的基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增DRM基因啟動(dòng)子的特異引物F2(上游引物)5’-GTCGGTACCTGTTGACCAGAAACTTTGAAC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Kpn I識(shí)別位點(diǎn))和R2(下游引物)5’-CTGAAGCTTCTC TTTGATTTGTGATTGCTG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))，然后提取Columbia生態(tài)型擬南芥的基因組DNA并以此為模板，在引物F2和R2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增DRM基因的啟動(dòng)子片段并在序列的兩端分別添加限制性內(nèi)切酶Kpn I和Hind III識(shí)別位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增體系為DNA 2μl(約10ng)，10×ExTaq緩沖液2.5μl，dNTPs(2.5mM)2.0μl，引物F2(10μM)0.5μl，引物R2(10μM)0.5μl，ExTaq(5u/μl，購(gòu)自TaKaRa公司)0.2μl，H2O 17.3μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)橄?4℃預(yù)變性5min；然后94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小約1.6kb的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化該目的片段，將其連接到pMD18-T(購(gòu)自TaKaRa公司)載體中，得到攜帶DRM基因啟動(dòng)子的重組載體，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列正確的DRM基因啟動(dòng)子片段，具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，由1608個(gè)堿基組成，將該啟動(dòng)子命名為pDRM。
2、含有pDRM和GUS基因的載體pDRM:GUS的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Hind III雙酶切步驟一獲得的攜帶DRM基因啟動(dòng)子的重組載體，回收并純化1.6kb的啟動(dòng)子片段，再將其與經(jīng)同樣雙酶切的載體pJIT166m(http://www.pgreen.ac.uk)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，經(jīng)菌落PCR鑒定，得到插入序列及位置均正確的攜帶DRM基因啟動(dòng)子的重組載體，將其命名為pDRM:GUS。
3、pDRM:GUS轉(zhuǎn)基因植株純合系的獲得將pDRM:GUS轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用擴(kuò)增啟動(dòng)子的引物F2和R2進(jìn)行菌落PCR鑒定，經(jīng)擴(kuò)增得到大小為1.6kb DNA片段的為陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量培養(yǎng)，通過(guò)蘸花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，當(dāng)代收獲的為T0代轉(zhuǎn)基因種子。將T0代轉(zhuǎn)基因種子在撒播于含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS(Murashige Skoog)固體培養(yǎng)基(同時(shí)含有50μg/mL羧芐青霉素，以防止農(nóng)桿菌污染)上，得到T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，成熟后得到T1代種子。再將T1代種子播種在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株成熟后得到T2代種子。最后，將T2代種子播種在含有50μg/mL卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，全部為綠苗的株系為pDRM:GUS轉(zhuǎn)基因純合系，其所獲得的種子為T3代。
4、擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因DRM在不同組織中的表達(dá)水平的組織化學(xué)染色結(jié)果利用步驟3獲得的DRM的啟動(dòng)子與報(bào)告基因GUS融合的轉(zhuǎn)基因純合植株來(lái)檢測(cè)DRM在不同組織中的表達(dá)情況，對(duì)萌發(fā)后不同生長(zhǎng)時(shí)期(0-50天)的T3代幼苗和不同組織(葉、根、花、莢)進(jìn)行化學(xué)染色如圖2(a萌發(fā)后2天的幼苗中表達(dá)情況，b萌發(fā)后5天的幼苗中表達(dá)情況，c萌發(fā)后10天的幼苗中表達(dá)情況，d7周后花中的表達(dá)情況，e氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)情況)所示，其中，在萌發(fā)2天的幼苗中DRM有很強(qiáng)的表達(dá)，在4天和7天的幼苗中的葉片和根的維管束組織以及葉片中氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中DRM的表達(dá)水平也很強(qiáng)，此外，在花的萼片、花瓣、花絲和柱頭中DRM表達(dá)也很強(qiáng)，在莢中也有表達(dá)。
實(shí)施例3、DRM編碼蛋白的功能鑒定用下述轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)DRM對(duì)植物的影響，具體過(guò)程包括以下步驟一、利用35S強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建DRM基因過(guò)表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I對(duì)步驟一獲得的攜帶有DRM基因的重組載體pGEM-T-DRM進(jìn)行雙酶切，回收并純化858bp的DRM基因片段，將其與經(jīng)同樣酶雙酶切的載體pJIT163(http://www.pgreen.ac.uk)連接，得到含有DRM和GFP編碼區(qū)的重組載體，然后用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I對(duì)該重組載體進(jìn)行雙酶切，再將其與經(jīng)相同酶雙酶切的植物表達(dá)載體pBinPlus(Van Engelen，F(xiàn).A.，Molthoff，J.W.，Conner，A.J.，Nap，J.P.，Pereira，A.and Stiekema，W.J.1995.pBINPLUSan improvedplant transformation vector based on pBIN19.Transgenic Res.4，288-290)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定，得到含有DRM和GFP編碼序列的植物表達(dá)載體，將其命名為pBinPlus-DRM，其部分結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3。
二、DRM轉(zhuǎn)基因植株純合系的獲得將pBinPlus-DRM轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用擴(kuò)增DRM的引物P1和P2進(jìn)行菌落PCR鑒定，經(jīng)擴(kuò)增得到大小為858bp DNA片段的為陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量培養(yǎng)，通過(guò)蘸花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)3代篩選獲得2個(gè)DRM基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合系(OE-1、OE-2)。
三、DRM編碼蛋白的功能分析對(duì)步驟二篩選出兩個(gè)DRM表達(dá)量較高的株系OE-1和OE-2進(jìn)行功能分析，具體方法如下1、DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的早期苗對(duì)ABA敏感度檢測(cè)將野生型擬南芥和步驟二獲得的DRM過(guò)表達(dá)株系(OE-1和OE-2)分別播在不含ABA的MS培養(yǎng)基和含有1μM ABA的MS培養(yǎng)基上，8天后觀察早期苗生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4所示(WT野生型植株；OE-1過(guò)表達(dá)DRM基因株系；OE-2過(guò)表達(dá)DRM基因株系)，在含1μM ABA的MS培養(yǎng)基上，與野生型植株相比，DRM過(guò)表達(dá)株系的生長(zhǎng)明顯受到更多地抑制，而在不含ABA的MS培養(yǎng)基上，DRM過(guò)表達(dá)株系和野生型植株地生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差別。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)野生型植株在早期苗生長(zhǎng)上對(duì)ABA更加敏感。
2、DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株后期主根的生長(zhǎng)對(duì)ABA敏感度檢測(cè)將野生型擬南芥和步驟二獲得的DRM過(guò)表達(dá)株系(OE-1和OE-2)先播在不含ABA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4天，然后移到含有10μM ABA的MS培養(yǎng)基上，3天后觀察主根的延伸情況，結(jié)果如圖5所示(WT野生型植株；OE過(guò)表達(dá)DRM基因株系)，DRM過(guò)表達(dá)株系主根的延伸速度明顯比野生型植株慢。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明擬南芥中DRM表達(dá)量的升高增加了ABA對(duì)后期主根伸長(zhǎng)抑制的敏感性。
3、DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性檢測(cè)對(duì)步驟二獲得的DRM過(guò)表達(dá)株系(OE-1和OE-2)和野生型植株進(jìn)行干旱處理，方法為將在蛭石中生長(zhǎng)6周的DRM過(guò)表達(dá)株系(OE-1和OE-2)苗和野生型植株苗持續(xù)16天不澆水，觀察植株生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖6中的圖A所示(WT野生型植株；OE-1過(guò)表達(dá)DRM基因株系；OE-2過(guò)表達(dá)DRM基因株系)，大部分野生型植株的葉片都已經(jīng)變黃、變干，而兩個(gè)DRM過(guò)表達(dá)株系仍保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。同時(shí)也對(duì)生長(zhǎng)4周的DRM過(guò)表達(dá)株系(OE-1和OE-2)苗和野生型苗進(jìn)行了失水復(fù)水實(shí)驗(yàn)，在DRM過(guò)表達(dá)株系苗和野生型苗的干旱程度達(dá)到差不多一致時(shí)復(fù)水，一周后，對(duì)植株進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6中的圖B所示(WT野生型植株；OE-1過(guò)表達(dá)DRM基因株系；OE-2過(guò)表達(dá)DRM基因株系)，可以看到DRM過(guò)表達(dá)株系恢復(fù)的比野生型植株快。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DRM過(guò)表達(dá)提高了擬南芥的抗旱性。
4、DRM過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性檢測(cè)將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4天的DRM過(guò)表達(dá)株系(OE-1和OE-2)和野生型植株的苗移到含有200mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，3天后對(duì)植株生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖7所示(WT野生型植株；OE過(guò)表達(dá)DRM基因株系)，大部分DRM過(guò)表達(dá)株系的葉片仍保持為綠色，而野生型植株的葉片都已經(jīng)變白。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型相比，DRM過(guò)表達(dá)株系的耐鹽性得到顯著提高。
序列表<160>3<210>1<211>285<212>PRT<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Lys Arg Gly Pro1 5 10 15Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Ile Leu Val Ser Phe Ile Leu Asn His20 25 30Gly His Ser Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Gln Ala Gly Leu Leu Arg35 40 45Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Lys Pro Asp50 55 60Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Lys Glu Glu Glu Asp Ala Ile Ile Ser65 70 75 80Leu His Gln Ile Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Ala Lys Leu85 90 95Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu100 105 110Lys Lys Arg Leu Glu Asp Tyr Gln Pro Ala Lys Pro Lys Thr Ser Asn115 120 125Lys Lys Lys Gly Thr Lys Pro Lys Ser Glu Ser Val Ile Thr Ser Ser130 135 140Asn Ser Thr Arg Ser Glu Ser Glu Leu Ala Asp Ser Ser Asn Pro Ser145 150 155 160Gly Glu Ser Leu Phe Ser Thr Ser Pro Ser Thr Ser Glu Val Ser Ser165 170 175
Met Thr Leu Ile Ser His Asp Gly Tyr Ser Asn Glu Ile Asn Met Asp180 185 190Asn Lys Pro Gly Asp Ile Ser Thr Ile Asp Gln Glu Cys Val Ser Phe195 200 205Glu Thr Phe Gly Ala Asp Ile Asp Glu Ser Phe Trp Lys Glu Thr Leu210 215 220Tyr Ser Gln Asp Glu His Asn Tyr Val Ser Asn Asp Leu Glu Val Ala225 230 235 240Gly Leu Val Glu Ile Gln Gln Glu Phe Gln Asn Leu Gly Ser Ala Asn245 250 255Asn Glu Met Ile Phe Asp Ser Glu Met Asp Phe Trp Phe Asp Val Leu260 265 270Ala Arg Thr Gly Gly Glu Gln Asp Leu Leu Ala Gly Leu275 280 285<210>2<211>858<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2atgggaagag ctccatgctg tgagaagatg gggttgaaga gaggaccatg gacacctgaa 60gaagatcaaa tcttggtctc ttttatcctc aaccatggac atagtaactg gcgagccctc120cctaagcaag ctggtctttt gagatgtgga aaaagctgta gacttaggtg gatgaactat180ttaaagcctg atattaaacg tggcaatttc accaaagaag aggaagatgc tatcatcagc240ttacaccaaa tacttggcaa tagatggtca gcgattgcag caaaactgcc tggaagaacc300gataacgaga tcaagaacgt atggcacact cacttgaaga agagactcga agattatcaa360ccagctaaac ctaagaccag caacaaaaag aagggtacta aaccaaaatc tgaatccgta420ataacgagct cgaacagtac tagaagcgaa tcggagctag cagattcatc aaacccttct480ggagaaagct tattttcgac atcgccttcg acaagtgagg tttcttcgat gacactcata540agccacgacg gctatagcaa cgagattaat atggataaca aaccgggaga tatcagtact600atcgatcaag aatgtgtttc tttcgaaact tttggtgcgg atatcgatga aagcttctgg660
aaagagacac tgtatagcca agatgaacac aactacgtat cgaatgacct agaagtggct720ggtttagttg agatacaaca agagtttcaa aacttgggct ccgctaataa tgagatgatt780tttgacagtg agatggactt ttggttcgat gtattggcta gaaccggcgg ggaacaagat840ctcttagccg ggctctag 858<210>3<211>1608<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3ttcagtcttt tgttgaccag aaactttgaa caatagagtt ctattttaac aaatactaac 60aaaatacaga agaagggtaa agttttaggt tgaaacttaa aagggtgcga tacgtgtgaa120cgcgttggtc aacaaatact atcacgagct gttctctttc ccgcggacag atattgattt180tttcgtgttc tatttttgga ttttgtggct ggtgtaataa taatattaaa gcatatatac240tagtataaaa ctggtaattt ttcgtagagg attgttttct caaagcccaa acagtagttg300caaatttgta ataaccagat tttgaagtaa aataaaatgg tgaggaaatt ttagaataat360ttatttatca aaaaaaaact ttagaatatg ttacatattt ggtagttata gtattgtatc420aaatacacat attaatcgaa ttgtttgata aaatggaagt aaattatttt tgactgaact480atgtagcaca tatttatttt atatgaatct caaaatcatt tatataattt atgaaaaagt540tagttttttt tctattcgat acgttaacaa ttaattatga ccaataaatt gttttaaggc600attcagcagt ctaaaaataa agactgaaaa tggcgtcata ataaacgtaa atgcagtaaa660tattattccc tctatttttg aatatttgta gtttaaaatt tttgcacaca aattaagaaa720acatacaaat ctcatttaat ttatctcttt cttataaaaa tattattaat tacaattaat780ccaaccaata aaaaaatatg atataaaata taattggtta aaaactatta aacacattta840attttgcata gaaaagtgaa aacaacactt atagtaaaaa aaataaaaaa tctttaaatt900acacttaatt agaaatagaa agaatacaaa acgtacggat gttgttaacc taaacacgat960tactaccgag actaaagatg tctaagttta atactaagaa aagtaaaaca atttttcgag 1020cagatatatg aatagtgatt ttttgggtca acacataatc cacccaacgt tgatttttgt 1080ttgtcgttta caatctctaa aacgtttatt ttctaagaaa tatacgtgtg ggctcatttt 1140aatgcccttc gtgcgtctac ccgacgactt tgtttactcg aaactatatc acacactaca 1200ccacatattt caacatcaca ctgtatacac acatttatat atacatgcag accgattatt 1260
ataataatat tttctccggt ccctaaaaca tatatatcat tcattcccac atgagatata1320atattatgta aaacatactt ttgactatgt tgccaataat caaaaagaca tctctctctc1380tctctctcac atcctatttt ccaagaagct caccaatgct tttgaattct cccacatgtc1440ttttgacaat tttagtataa atactcaaac cccttagtca gtcattctca tgttcatcaa1500cagcatttga tctcaagctc ataggaattt gatctccaca ttatatcttg atcatcacca1560caagaaaaac atttcaactt cttttatcag caatcacaaa tcaaagag 1608
權(quán)利要求
1.來(lái)自擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性功能的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物耐逆性功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求2或3所述基因的啟動(dòng)子，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動(dòng)所述擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3MYB型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的轉(zhuǎn)錄功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
6.含有權(quán)利要求4所述啟動(dòng)子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
7.一種提高植物耐旱性的方法，是將權(quán)利要求2或3所述編碼擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因或與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物耐旱性獲得提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述編碼擬南芥與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子的基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列通過(guò)含有該基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pBin系列載體、pBI系列載體、pCAMBIA系列載體、per8、pX6、pUC系列載體或pBluescript系列載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體為pBinPlus-DRM。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)來(lái)源于擬南芥的與耐逆性相關(guān)的R2R3 MYB型轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在培育耐脫落酸、高鹽和干旱等耐逆性提高的植物中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)錄因子是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C(jī)制的研究，以及提高植物的耐旱、耐鹽等耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101050461SQ20071006508
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日
發(fā)明者王道文, 丁振華, 陳鋒, 秦?zé)ň? 劉昕 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所