一種小麥wrky轉(zhuǎn)錄因子基因及其在改變擬南芥根系發(fā)育中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供一種小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，還涉及了該基因在改變擬南芥根系發(fā)育中的應(yīng)用，該小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。轉(zhuǎn)化所述基因的擬南芥根系有明顯表型改變，該基因參與了植物的發(fā)育過(guò)程。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因及其在改變擬南芥根系發(fā)育中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因及其在改變擬南芥根系發(fā)育中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，其穩(wěn)產(chǎn)豐產(chǎn)事關(guān)國(guó)家糧食安全，圍繞小麥開(kāi)展的研究也比較全面。根系固植小麥于土壤，可提供生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分和水分，是進(jìn)行小麥生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)答逆境脅迫等全部生物學(xué)活動(dòng)的基礎(chǔ)。但與模式作物相比，目前對(duì)小麥根系發(fā)育的機(jī)理研究還很薄弱，鑒定的調(diào)控基因很少，因而，很難采取遺傳操作的方法來(lái)改良小麥的根系性狀。轉(zhuǎn)錄因子控制著基因的表達(dá)，對(duì)小麥根系的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控發(fā)揮重要作用。其中WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族在多種組織中廣泛存在，參與眾多代謝過(guò)程的調(diào)控，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程也具有非常重要的作用，它們參與了對(duì)表皮毛的形態(tài)建成和果皮中單寧的合成、果實(shí)的成熟、胚的發(fā)育、衰老、休眠和根細(xì)胞的成熟等發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。但有關(guān)小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物根系發(fā)育調(diào)控的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因及其在改變擬南芥根系發(fā)育中的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明通過(guò)電子克隆法分離了具有完整開(kāi)放閱讀框的小麥WRKY家族基因，根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物。采用RT-PCR的方法，獲得了 TaWRKY72-b基因，并且構(gòu)建了可誘導(dǎo)的超表達(dá)載體，利用模式植物擬南芥進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因的功能鑒定。
[0005]本發(fā)明的具體技術(shù)方案是:一種小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0006]所述WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因根據(jù)水稻0sWRKY72基因的序列，通過(guò)同源序列比對(duì)，擴(kuò)增，測(cè)序等分子生物學(xué)操作獲得，命名為T(mén)aWRKY72-b。[0007]所述WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因連接到超表達(dá)載體上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。該超表達(dá)載體中的p0p6/LhGR系統(tǒng)下游為⑶S基因，上游為Gateway元件。p0p6/LhGR系統(tǒng)在地塞米松誘導(dǎo)后，p0p6雙向啟動(dòng)子可同時(shí)表達(dá)⑶S基因和Gateway元件中的TaWRKY72-b基因，因此通過(guò)⑶S染色可以很方便的監(jiān)測(cè)目的基因的表達(dá)情況。同時(shí)，此載體可以通過(guò)外源的化學(xué)誘導(dǎo)物地塞米松來(lái)控制目的基因的表達(dá)，具有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
[0008]本發(fā)明克隆了一種小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY72_b，構(gòu)建可誘導(dǎo)的TaffRKY72-b超表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，該轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的根系發(fā)育受到抑制，植株生長(zhǎng)停滯，表明該基因的超量表達(dá)，通過(guò)影響其上下游基因的表達(dá)從而抑制擬南芥根系的形成?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1是含有本發(fā)明序列表中序列I基因TaWRKY72_b的表達(dá)載體；
[0010]圖2是轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定圖；
[0011]圖3是誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株的根系發(fā)育情況對(duì)比；
[0012]圖4是誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株的根系發(fā)育情況的顯微圖像對(duì)比，其中A為擬南芥根系表型，B代表側(cè)根的顯微圖像，C代表主根的顯微圖像，WT為野生型擬南芥對(duì)照植株，72b (4A)和72b (4C)為兩種轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0014]一、小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY72_b的獲得
[0015]1.總RNA的提取:以小麥揚(yáng)麥158葉片作為提取材料，采用TIANGEN試劑盒，操作步驟如試劑盒說(shuō)明所示。得到RNA溶液用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，-80°C低溫保存。
[0016]2.cDNA 的合成:cDNA 的合成使用 Invitrogen 的 SuperScript? III First-StrandSynthesis System for RT-PCR,首先取0.5ml滅菌微量離心管，分別加入以下成分:總RNAll μ L ；01igo(dT) I μ L ；10mM dNTPl μ L，混勻，輕甩離心管，使溶液集中至底部，將混合液65°C溫浴5min，然后迅速置于冰上lmin，再在上述離心管中加入下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):5 X First-strand Buffer4 μ L, 0.1M DTTl μ L, Recombinant RNase Inhibitorl μ L,SuperScript? III RTl μ L,輕輕混勻，短暫離心收集至管底,50°C溫浴50min, 70°C, 15min,將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-20°C保存。
[0017]用小麥β -Actin檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 4min，35個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?50C 30s, 600C 30s, 72°C 30s，最后72°C 5min。I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0018]3.TaffRKY72-b 基因的分離
[0019]以水稻相應(yīng)基因的全長(zhǎng)序列為基礎(chǔ)到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì)EST庫(kù)進(jìn)行BLANSTN查詢(xún)，將搜索到的一些部分高度相似且重疊的小麥ESTs進(jìn)行序列拼接，組合成序列較長(zhǎng)的復(fù)合EST，再以此為查詢(xún)序列重復(fù)進(jìn)行BLASTN搜索、聚類(lèi)、拼接直至無(wú)法進(jìn)行，以達(dá)到最有效延伸。利用BLASTX驗(yàn)證該拼接片段是否符合預(yù)測(cè)。根據(jù)符合預(yù)測(cè)的拼接片段設(shè)計(jì)特異性 PCR 弓丨物，TaWRKY72-b F:5’-ATGGAGAATTACCCCATTCTC-3’ ；TaffRKY72-bR:5’ -TCATTGAAACATGTGTTGGTT-3’。以步驟 2 中合成的 cDNA 為模板，TaffRKY72-b F、TaffRKY72-b R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為:反應(yīng)總體系50 μ L，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IuL, 5 Xphushion HF bufferlO μ L, 10mmol /T, dNTPsl μ L, IOmM Primer Fl μ L, IOmM Primer尺14 1^，卩1111810110嫩聚合酶0.5 4 1^(1(1!12035.5 4 1^ PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?98°C lmin，35 個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?8°C 10s，47°C 20s, 72°C 30s，最后72°C IOmin。其中PCR擴(kuò)增選用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶。電泳完畢在紫外線燈下切下目的條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化(Takara公司，北京)。將純化后的cDNA克隆到pGEM_T easy載體(Promega公司)上,并送至北京博邁德測(cè)序,獲得如序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0020]二、TaffRKY72-b轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得[0021]1.帶有AttB位點(diǎn)的基因序列的擴(kuò)增
[0022]以通過(guò)測(cè)序鑒定的質(zhì)粒為模板，以AttB-TaWRKY72_b F:
[0023]5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGAGAATTACCCCATTCTC-3,AttB-TaffRKY72-b R:
[0024]5， -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTGAAACATGTGTTGGTT-3，
[0025]為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為:反應(yīng)總體系包括質(zhì)粒模板1.5yL，
5Xphushion HFbufferlO μ L, 10mmol/L dNTPsl μ L, IOmM 基因特異引物各 2.5 μ L, phusionDNA聚合酶0.5μ L，ddH2032 y L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?98°C 30s，35個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?8°C 10s，60°C 30s, 72°C lmin，最后72°C 5min。50 μ I全部點(diǎn)樣，瓊脂糖電泳后回收PCR產(chǎn)物。
[0026]2.入門(mén)載體的構(gòu)建
[0027]利用得到的AttB-TaWRKY72-b 產(chǎn)物和 pDONR(amp)進(jìn)行 BP 反應(yīng)，TaWRKY72_b 基因編碼序列將pDONR(amp)載體上的ccdB位點(diǎn)置換，構(gòu)建成氨芐青霉素抗性的入門(mén)載體。將BP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5ci后，用氨芐青霉素進(jìn)行篩選。將轉(zhuǎn)化所得的菌斑搖菌提質(zhì)粒，保存進(jìn)行菌落PCR鑒定，pDONR (amp)載體上游有T7引物和TaWRKY72_b R引物，以轉(zhuǎn)化所得質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。BP反應(yīng)體系包括PCR產(chǎn)物I μ L, pDONR (amp) vector I μ L, BP clone II enzymeluL和 dd H2Ol μ L。
[0028]3.表達(dá)載體 Expression clone 的構(gòu)建
[0029]如圖1所示，將鑒定正確的質(zhì)粒連接到pKIGW表達(dá)載體上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化和酶切檢測(cè)，將鑒定正確的菌液送到華大基因公司測(cè)序。LR反應(yīng)體系包括BP質(zhì)粒2 μ L，pKIGWvector I μ L, LR clone II enzyme I μ L 和 dd H2Ol μ L0
[0030]4.Expression clone的電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0031]I)取50 μ L的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，加入2 μ L已構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，輕柔混勻，冰上放置半小時(shí)；
[0032]2)將I)中的混合物轉(zhuǎn)入電擊杯中，電擊杯提前預(yù)冷；
[0033]3)用細(xì)胞融合儀進(jìn)行電擊；
[0034]4)電擊結(jié)束后立即加入不含抗生素的SOC培養(yǎng)基中，混勻后移入2mL離心管中，28°C下震蕩培養(yǎng)2h ；
[0035]5)8000rpm，離心5min，棄上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大觀霉素、慶大霉素的固體LB平板上，28°C下倒置，培養(yǎng)2天。挑取培養(yǎng)基上的單菌落，作菌落PCR篩選單克隆。將鑒定正確的單克隆，液氮速凍，-80 V保存以備用。
[0036]5.用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥植株
[0037]將活化后的囷液取ImL接種于200mL含有卡那霉素、大觀霉素、慶大霉素的液體LB培養(yǎng)基中，28°C，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.8~0.9。將上述菌液5000rpm離心8min，用5% (w/v)蔗糖溶液懸浮菌體，使OD6tltl = 0.8~0.9。將懸浮完菌體的蔗糖溶液中加入終濃度為0.02%的Silwet L-77，將擬南芥花序浸入加了 Silwet L-77的蔗糖溶液中浸泡lmin。之后把擬南芥用塑料袋套好，密封培養(yǎng)16-24小時(shí)后按常規(guī)方法培育植株到結(jié)實(shí)，收獲Ttl代種子。
[0038]6.轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選
[0039]轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株(Ttl代)收獲的種子用l/2MS+75mg/L kanamycin平板篩選，10天后挑選T1代陽(yáng)性植株轉(zhuǎn)移到土中,PCR鑒定并收種子。T2代株系kanamycin抗性,3:1分離的被認(rèn)為是單基因插入株系，抗性植株轉(zhuǎn)移到土中培養(yǎng)并收種子。T3R株系中kanamycin抗性不再分離的為單基因插入純合株系，用作進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。
[0040]三.轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定
[0041]用SIGMA公司的Extract-N-Amp? Plant PCR Kits試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鑒定，步驟如下:
[0042]1.DNA提取:取0.5-0.7cm葉片組織到2ml離心管中，加入100 μ L ExtractionSolution, 95°C保持 IOmin,加入 100 μ L Dilution Solution 混勻，2°C -8°C儲(chǔ)存以備用；
[0043]2.PCR 擴(kuò)增:PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括 ddH204 μ L、Extract-N-Amp PCRReadymixlO μ L、IOmM Primer Fl μ L、IOmM Primer Rl μ L、Leaf disk extract4 μ L ；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 °C 3min，30 個(gè)循環(huán)包括 94°C lmin,60 °C lmin, 72 °C lmin30sec，然后72°C IOmin0如圖2所示，PCR分子鑒定有擴(kuò)增條帶的為轉(zhuǎn)基因植株。
[0044]四.轉(zhuǎn)基因植物的表型鑒定
[0045]將純合體擬南芥轉(zhuǎn)基因種子和野生型(Col-O)種子同時(shí)種植在含有地塞米松(DEX)的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)兩周后觀察轉(zhuǎn)基因植株與野生型的變化，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的根系發(fā)育受到了抑制，植株生長(zhǎng)停滯。由圖4擬南芥?zhèn)雀椭鞲娘@微圖像也可以看出，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)誘導(dǎo)后根系發(fā)育受到影響，圖B和C可見(jiàn)側(cè)根和主根的根毛差別不大。說(shuō)明該基因的超量表達(dá)，通過(guò)影響其上下游基因的表達(dá)抑制擬南芥根系的形成。為了查明是側(cè)根的發(fā)育受到影響，還是所有根系的發(fā)育均出現(xiàn)問(wèn)題，我們對(duì)側(cè)根數(shù)，主根長(zhǎng)度等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如表1所示，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)地塞米松(DEX)誘導(dǎo)后，主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)量都有明顯減少，與未誘導(dǎo)植株有極顯著差異，但是兩者比值與未誘導(dǎo)植株及野生型無(wú)差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株只在根系的長(zhǎng)度上明顯減少，對(duì)側(cè)根的密度并無(wú)影響，該基因的超量表達(dá)影響了轉(zhuǎn)基因植株根系的長(zhǎng)度。
[0046]表1根系發(fā)育的統(tǒng)計(jì)分析
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于:該基因序列與水稻OsWRKY72基因有很高的同源性，對(duì)其進(jìn)行克隆測(cè)序，經(jīng)基因工程操作，使其受控于化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求1或2所述的小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在改變擬南芥根系發(fā)育中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:將所述小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因連接到超表達(dá)載體上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104004773SQ201410277033
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】謝曉東, 丁博, 李明, 王俊斌, 陳帥君, 白子彧 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院