擬南芥MYB家族轉(zhuǎn)錄因子AtMYB17基因、編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為擬南芥MYB家族轉(zhuǎn)錄因子AtMYB17基因、編碼序列及其應(yīng)用。具體包括基因AtMYB17的克隆、含有該基因的表達(dá)載體構(gòu)建、基因AtMYB17基因器官表達(dá)模式，不同激素、不同脅迫處理后AtMYB17的表達(dá)量的變化。本發(fā)明還公開了基因AtMYB17在擬南芥中過表達(dá)后，可以改變擬南芥對鹽敏感程度。該基因AtMYB17可用于植物品種改良。
【專利說明】擬南芥MYB家族轉(zhuǎn)錄因子/1故防/7基因、編碼序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種在擬南芥中表達(dá)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子AtMYB17基因編碼序列及其應(yīng)用。具體包括:MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸編碼序列和啟動子序列的克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建，對擬南芥此基因內(nèi)源的不同器官、組織的空間表達(dá)模式，高低溫、PEG、高鹽脅迫以及植物激素處理后的表達(dá)模式變化進(jìn)行分析鑒定，以及轉(zhuǎn)化此基因于擬南芥內(nèi)，進(jìn)行分子鑒定和脅迫實(shí)驗(yàn)，檢測其基因表達(dá)量變化及抗性改變等。
【背景技術(shù)】
[0002]MYB是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，大多數(shù)植物的MY B以在其N端含有一段約51-52個氨基組成的MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣?，MYB蛋白的分類主要是根據(jù)這個高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域通常是由至多4個氨基酸殘基序列的重復(fù)(R)組成，每一個都形成3個α -螺旋，每一個重復(fù)的第二個和第三個螺旋形成一個帶有3個有規(guī)律的間隔色氨酸殘基(或疏水的)的螺旋一轉(zhuǎn)角一螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)，形成一個3 D (HTH)疏水核心結(jié)構(gòu)，對維持HTH的構(gòu)型有極為重要的意義。
[0003]MYB基因家族在不同的物種中存在結(jié)構(gòu)和序列上的差異，甚至同一物種中的MYB家族也發(fā)生了多個分支。楊樹與陸地棉水稻和擬南芥的部分MYB序列高度同源，但是擬南芥的MYB家族序列卻發(fā)生很大的變化，產(chǎn)生多個分支，具有了多樣的功能。根據(jù)相鄰的MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目MYB轉(zhuǎn)錄因子可簡單分成4個亞類，包括只含有一個R結(jié)構(gòu)域的，R2R3結(jié)構(gòu)域的，R1R2R3結(jié)構(gòu)域的，四個類似R1/R2結(jié)構(gòu)域的。
[0004]MYB轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能很廣泛，MYB在擬南芥中已經(jīng)有很多報道。主要集中于次生代謝調(diào)節(jié)、抗逆性的研究等 ，具有廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。主要包括，植物初生和次生代謝的調(diào)控；控制細(xì)胞的成長和分化；調(diào)控植物體對生物和非生物脅迫反應(yīng)；參與植物生長過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)的正調(diào)控因子，但是也有一部分是負(fù)調(diào)控因子。目前除了擬南芥，大豆、棉花、玉米、栽培稻、矮牽牛、葡萄、白楊和蘋果中都有報導(dǎo)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提出一種新的擬南芥基因，還提供該擬南芥基因的蛋白編碼序列，并提供該擬南芥基因的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明通過克隆擬南芥中MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因沒77，對其時空表達(dá)模式及脅迫響應(yīng)方式進(jìn)行確定，結(jié)果顯示該基因在花和果莢中高表達(dá)，在根、莖、葉中表達(dá)量較低。AtMYB17的表達(dá)在GA、ABA、ACC、NAA處理后變化不明顯。鹽脅迫處理3、6、12h后，AtMYB17的表達(dá)量上升；在PEG、高溫處理后的表達(dá)量并沒有變化，在冷處理I天后表達(dá)量反而有所下調(diào)。將轉(zhuǎn)入擬南芥后，觀察到轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫敏感性下降，該結(jié)果表明基因在鹽脅迫的適應(yīng)過程中起作用，這為研究擬南芥非生物脅迫響應(yīng)打下基礎(chǔ)，從而為通過提高擬南芥的脅迫耐受性，進(jìn)而提高農(nóng)作物的非生物脅迫抗性并最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量提高提供基因來源與技術(shù)支持。
[0007]本發(fā)明首先從擬南芥中克隆出一種新的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為J tMYBl 7 ；為具有特定序列的DNA分子，其中基因組長1737bp，核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0008]本發(fā)明還提供這種擬南芥蛋白編碼序列，該序列編碼299個氨基酸殘基，分子量33.288kDa，等電點(diǎn)為6.757，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0009]本發(fā)明還提供用于調(diào)取獲得擬南芥樣品中基因的一對核苷酸引物。該引物根據(jù)基因設(shè)計，使用此對引物對擬南芥樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增可獲得長1.737kbp的基因片段。具體的引物序列為:
Forward Primer:5' AGCTGGAGAACACTTCCTAAAC 3’ (SEQ ID N0.3)
Reverse Primer:5' GGGATCAAGACCCATAGATAAA3’ (SEQ ID N0.4)。
[0010]本發(fā)明還提供檢測擬南芥基因在不同器官表達(dá)模式的方法，即利用所述基因的核苷酸序列作為設(shè)計引物的保守區(qū)段，調(diào)取其序列的引物序列:
Forward Primer:5’AGCACCAGCATCAGCA3’ (SEQ ID N0.5)
Reverse Primer:5’CATTACCTCTCTTTTCCCC3’ (SEQ ID N0.6)。
[0011]對擬南芥cDNA樣品進(jìn)行Real-timePCR，然后檢測該基因在花、果莢、莖、葉、根中的表達(dá)；樣品為擬南芥的RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA ;其步驟如下:
(1)提取擬南芥各器官的總RNA(Trizol，市售)；
(2)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)`將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)SEQID N0.1序列，設(shè)計SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6引物，進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。
[0012]本發(fā)明還提供檢測擬南芥基因在高鹽、高低溫、PEG脅迫以及激素處理下的表達(dá)模式變化的方法，即將擬南芥進(jìn)行高鹽、低溫、干旱脅迫以及激素處理后，提取擬南芥苗中的RNA;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQ ID N0.5與SEQ IDN0.6，進(jìn)行定量PCR檢測。其步驟如下:
(1)將兩周大的擬南芥苗置于300mM氯化鈉溶液中，23°C培養(yǎng)2d以進(jìn)行高鹽脅迫處理；置于水中，4°C培養(yǎng)Id以進(jìn)行低溫處理；置于ΙΟμΜ ΝΑΑ、50μΜ ΑΒΑ、10μΜ ΟΑ,ΙΟμΜ -ACC中，23°(:分別培養(yǎng)241!以進(jìn)行激素處理；置于309?^6中，23°(:培養(yǎng)2(1以進(jìn)行干旱脅迫處理；置于水中，23° C培養(yǎng)2d作為對照；
(2)提取前述處理的擬南芥苗的葉和根中的總RNA(Trizol，市售)；
(3)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)SEQID N0.1序列，設(shè)計SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6引物，進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。
[0013]本發(fā)明還提供檢測轉(zhuǎn)入外源基因的擬南芥與野生型擬南芥對鹽脅迫敏感程度改變的方法，其步驟如下:
(1)轉(zhuǎn)基因株系與野生型的種子經(jīng)70%酒精消毒處理，無菌水清洗，置于無菌操作臺晾干后，將種子MS培養(yǎng)基上，同時置于22°C培養(yǎng)室培養(yǎng)；
(2)觀察統(tǒng)計每天實(shí)驗(yàn)組與對照組的發(fā)芽率和生根率情況，并在第6天時，觀察并測量轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系的株高、最長根長、鮮重、地上部分鮮重以及地下部分鮮重，并分別做比較。
[0014]本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已經(jīng)知道的各種載體，如市售的載體以及質(zhì)粒。[0015]可見，本發(fā)明提供的擬南芥基因Ji#7S77可用于植物品種改良，如用于改善擬南芥抗低溫、干旱脅迫、激素脅迫的等性能，從而應(yīng)用于擬南芥等農(nóng)作物，提高其產(chǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1擬南芥擬南芥不同器官中的表達(dá)譜分析。
[0017]圖2不同激素處理后J 7的表達(dá)譜分析。
[0018]圖3不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)譜分析。其中CK為對照，處理后的數(shù)字代表處理時間，單位是小時。例如ΑΒΑ3表示ABA處理了 3h。
[0019]圖4奶477突變體以及過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子鑒定WT為野生型，mybl7為突變體，3#、4#為過表達(dá)株系3號和4號。
[0020]圖5 WT和奶477突變體在不同濃度NaCl處理下的表型。數(shù)字代表濃度，單位是
mMo
[0021]圖6 WT和奶突變體在不同濃度NaCl處理下的存活率。數(shù)字代表濃度，單位是mM。
[0022]圖7 WT和過表達(dá)株系在不同濃度NaCl處理下的表型。數(shù)字代表濃度，單位是mM?！揪唧w實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。如Sambrook 等分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述條件，或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說明。
[0024]實(shí)施例1擬南芥基因A tMYBl 7的克隆
1.擬南芥Col生態(tài)型在培養(yǎng)室中培養(yǎng):生長條件為光周期16h /8h (L/D)，22°C。
[0025]2.基因組DNA提取。取100毫克左右新鮮的擬南芥植物組織材料，液氮充分研磨。iJP 600 μ I CTAB提取液，65°C放置25 min。加等體積酚氯仿異戊醇，去蛋白，12000rpm離心IOmin后上清轉(zhuǎn)移至新的離心管,加等體積異丙醇,充分混勻，室溫放置10 min, 12000rpm離心IOmin,棄上清,用75%乙醇I ml洗漆沉淀,重復(fù)一次。室溫干燥5_10 min,溶于100 μ I去離子水中。
[0026]3.基因的克隆。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中擬南芥的基因序列設(shè)計引物，以擬南芥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，獲得基因全長，具體序列信息參見SEQ ID N0.1。
[0027]實(shí)施例2擬南芥J7基因器官表達(dá)模式分析
分別提取擬南芥花、果莢、莖、蓮座葉、莖生葉、根等中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測(圖1)。結(jié)果顯示，該基因在花和果莢中表達(dá)量最高，莖、葉和根中表達(dá)量較少。
[0028]實(shí)施例3擬南芥基因價7在高低溫、PEG、高鹽脅迫以及植物激素處理下的表達(dá)模式分析
對兩周大的擬南芥幼苗分別進(jìn)行ΙΟμΜ ΚΤ、10μΜ 6_ΒΑ、10μΜ ΙΑΑ、5μΜ 6Α,50μΜ ΑΒΑ、ΙΟμΜ ΚΤ、100μΜ JA、4°C低溫分別處理 24h，10%PEG、200 μ M NaCl 處理 ld、4d，并同無處理的對照組一起，分別提取葉中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，不同激素處理，目標(biāo)基因7不受ABA、GA、ACC、NAA等激素的誘導(dǎo)(圖2)。NaCl處理3h后即被誘導(dǎo)，隨后表達(dá)量開始下降，24h后，表達(dá)量恢復(fù)CK水平。低溫處理后表達(dá)量逐漸下降，PEG和高溫處理不影響的表達(dá)(圖3)。
[0029]實(shí)施例4突變體以及過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子鑒定
分別提取J四個株系3#、4#、5#、6#以及野生型WT對照組中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測(圖4)，結(jié)果顯示，3#和4#中J?#7沒77基因表達(dá)量比野生型明顯要高，之后即選用3#和4#兩個株系作為實(shí)驗(yàn)材料。
[0030]實(shí)施例5 WT和奶42 7突變體在不同濃度NaCl處理下的表型
將種子經(jīng)消毒處理后，播到1/2 MSO平板上，春化2天，待幼苗長到4天后，將廣奶幼苗移栽到含有不同濃度NaCl的1/2 MSO平板上(圖5)，14天后拍照，結(jié)果顯示突變體比野生型耐鹽。
[0031]實(shí)施例6 WT和奶7突變體在不同濃度NaCl處理下的存活率
將種子經(jīng)消毒處理后，播到1/2 MSO平板上，春化2天，待幼苗長到4天后，將廣幼苗移栽到含有不同高濃度NaCl的1/2 MSO平板上(圖6)，5天后拍照，結(jié)果顯示突變體比野生型耐鹽。
[0032]實(shí)施例7轉(zhuǎn)入基因的擬南芥對高NaCl敏感的改變
J價7轉(zhuǎn)基因株系3#和4#`以及野生型WT的種子經(jīng)消毒液處理，無菌水清洗，置于無菌操作臺晾干后，將其轉(zhuǎn)移至添加不同濃度NaCl以及未添加NaCl的MS培養(yǎng)基上，同時置于23°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，14天后拍照；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)3#和4#兩個株系的耐鹽性情況均比WT高(圖7)。
[0033]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，為從擬南芥中克隆出的基因，記為全長1737bp，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.一種如權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白質(zhì)分子，其特征在于，該序列編碼299個氨基酸殘基，氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3.一對用于調(diào)取獲得擬南芥樣品中基因的引物序列，其特征在于，根據(jù)核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示基因X?#7價7設(shè)計，序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
4.一種檢測擬南芥基因價7mRNA表達(dá)模式的方法，其特征在于利用SEQ ID N0.1所示基因的核苷酸序列作為設(shè)計探針引物的保守區(qū)段，調(diào)取其序列的引物序列:SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，對擬南芥cDNA樣品進(jìn)行Real-time PCR，然后檢測該基因在花、莖、葉、根中的表達(dá)；樣品擬南芥的RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA ;其步驟如下: 提取擬南芥不同器官的總RNA ;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;利用引物SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6，進(jìn)行定量 PCR 檢測。
5.一種檢測擬南芥在高低溫、PEG、高鹽脅迫以及植物激素處理后，基因Ji#7S77表達(dá)含量變化的方法，其特征在于具體步驟為:將擬南芥進(jìn)行高低溫、PEG、高鹽脅迫以及植物激素處理后，提取擬南芥的總RNA ;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;利用引物SEQID N0.5和SEQ ID N0.6，進(jìn)行定量PCR檢測。
6.一種檢測擬南芥在轉(zhuǎn)入基因后 ，擬南芥中表達(dá)含量變化的方法，其特征在于具體步驟為:提取轉(zhuǎn)入核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示的擬南芥基因和野生型對照組擬南芥的總RNA ;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物SEQID N0.5和SEQ ID N0.6，進(jìn)行定量PCR檢測。
7.一種核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示的擬南芥基因在植物品種改良中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103695438SQ201310685847
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】明鳳, 盧松沖, 張璇, 奚丹丹 申請人:復(fù)旦大學(xué)