一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，特別涉及一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法。該方法以環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株為生產(chǎn)菌種，其特征為，將HG12菌株的液體種子接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵，制得發(fā)酵液，將發(fā)酵液過濾，收集濾出液；向濾出液中接種酒香酵母菌株的液體種子，發(fā)酵，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液；將發(fā)酵液過濾，收集濾出液，向濾出液中加入萃取劑，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的萃取液，將萃取液真空蒸發(fā)，制得4-乙基愈創(chuàng)木酚。本發(fā)明可以實現(xiàn)4-乙基愈創(chuàng)木酚生產(chǎn)的連續(xù)化、規(guī)?；徊⑶?-乙基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)工藝簡便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，極具工業(yè)化應用前景。
【專利說明】一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法
[0001](一)【技術領域】
本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，特別涉及一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法。
[0002](二)【背景技術】
4-乙基愈創(chuàng)木酹(4-Ethylguaiacol,簡稱4-EG)又名2-甲氧基-4-乙基苯酹,分子式為 C9H12O2，分子量為 152.19Da，密度為 1.067X 103kg/m3，熔點為 15°C，沸點為 234_236°C。4-EG為無色至淡黃色的油狀液體，具有溫暖的辛香口味，屬醬香型香料，是醬油的主要香味成分，也是醬香型白酒的一種重要風味物質，它不僅賦予產(chǎn)品特定的風格和口感，而且具有清除自由基的功能，可抗衰老及預防眾多疾病的發(fā)生。目前4-乙基愈創(chuàng)木酚已廣泛應用于醬油、酒類、飲料、食品、香精、飼料等行業(yè)以及醫(yī)藥、香料和染料等產(chǎn)品的合成，具有廣闊的市場前景。
[0003]4-乙基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)方法有植物提取法和化學合成法。植物提取法是從各種含有4-EG的植物中提取得到，如中國專利文獻CN 102659534A (申請?zhí)?01210105766.7)公開了一種從稻草生物油 中提取4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，具體步驟如下:1)將稻草生物油堿洗，過濾，取濾液備用；2)在濾液中加入酸，進行酸化處理；3)采用有機溶劑萃取，得到油相產(chǎn)物；4)油相產(chǎn)物經(jīng)減壓蒸餾，除去有機溶劑，得到粗產(chǎn)品；5)粗產(chǎn)品減壓蒸餾，得到4-乙基愈創(chuàng)木酚。但由于植物中的4-EG含量較低，導致提取工藝成本較高而難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
[0004]化學合成法是生產(chǎn)4-EG的常用方法，如陳恩治(香料香精化妝品，2010.3)在進行4-乙基愈創(chuàng)木酚的合成研究時，以香莢蘭乙酮為原料，采用改良的還原法合成了 4-乙基愈創(chuàng)木酚，得率為72%。如中國專利文獻CN 1631862A (申請?zhí)?00310122614.9)公開了一種4-乙基愈創(chuàng)木酚的合成方法，其工藝包括以固體酸為催化劑，在加熱、加酸條件下，由愈創(chuàng)木酚和乙烯反應制得4-乙基愈創(chuàng)木酚，反應溫度為30-200°C，反應壓力為20-100kg/cm3，催化劑的用量為愈創(chuàng)木酚重量的1-10%重量百分數(shù)，反應產(chǎn)物經(jīng)提取后精餾得產(chǎn)品。但化學合成法普遍存在較嚴峻的環(huán)保問題，反應條件一般較劇烈，對生產(chǎn)設備要求較高，生產(chǎn)工藝復雜，產(chǎn)品收率低；并且由于產(chǎn)品中含有原料、副產(chǎn)物、溶劑等物質的殘留物，因此該方法得到的4-EG不能直接應用到食品中。
[0005]隨著人們對綠色產(chǎn)品要求的日益提高，利用生物工程技術生產(chǎn)4-EG的方法具有產(chǎn)品綠色天然、安全可靠、反應條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點而受到人們的重視。與植物提取法和化學合成法相比，生物技術法具有原料來源廣泛、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品收率高、生產(chǎn)成本低、易于實現(xiàn)工業(yè)化的特點，是一種經(jīng)濟有效和極有產(chǎn)業(yè)化前景的4-乙基愈創(chuàng)木酚生產(chǎn)方法。
[0006]生物技術法是通過培養(yǎng)微生物細胞生產(chǎn)4-EG的方法。許多微生物能夠利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質產(chǎn)生4-乙基愈創(chuàng)木酚，但由于這些微生物細胞內(nèi)的相關酶活性較低，產(chǎn)生的4-EG含量較低(一般在2.0-5.0mg/L),因而不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0007](三)
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術的不足，提供了一種產(chǎn)率高、成本低、可規(guī)?；a(chǎn)的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法。
[0008]本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的:
一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，以菌種保藏編號為CGMCC N0.8044的環(huán)狀芽孢桿菌{Bacillus circulans) HG12菌株為生產(chǎn)菌種,包括如下步驟:
(1)將環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株的液體種子按體積比為3-5%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37-40°C、160-200r/min下，發(fā)酵36_60h，制得發(fā)酵液，將發(fā)酵液用微孔濾膜過濾，收集濾出液，調(diào)PH值為5.0-6.0，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的濾出液；
(2)向濾出液中接種體積比為5-10%接種量的酒香酵母菌株的液體種子，在28-30°C下，發(fā)酵12-36h，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液；
(3)將發(fā)酵液用微孔濾膜過濾，收集濾出液，向濾出液中加入萃取劑，混合均勻，靜置分相，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的萃取液，將萃取液真空蒸發(fā)，制得4-乙基愈創(chuàng)木酚。
[0009]本發(fā)明涉及的環(huán)狀芽孢桿菌(MaciIIus circulans) HG12菌株是從中國白酒廠生產(chǎn)醬香型白酒用的高溫大曲中分離，并經(jīng)過紫外線誘變篩選獲得，已于2013年8月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號為CGMCC N0.8044。
[0010]本發(fā)明的環(huán)狀芽孢桿菌(ifeci77i/5.HG12菌株的微生物學特征是:菌落呈乳白色、有褶皺、無光澤、表面不光滑；菌體呈桿狀、直或接近直、單個或成鏈狀，細胞大小約為(0.6-1.0) MmX (1.8-3.8) Mm，產(chǎn)芽孢、孢囊膨大、芽孢橢圓形、芽孢中生到端生；革蘭氏陽性、兼性厭氧、有機化能異養(yǎng)菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖產(chǎn)酸，V-P反應陰性，接觸酶陽性，硝酸鹽還原陽性，可水解酪`白、明膠和淀粉，不利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，在培養(yǎng)溫度為55°C下生長；可發(fā)酵小麥麩皮、小麥、大麥、高粱的一種或幾種組合制成的液體培養(yǎng)基和固態(tài)培養(yǎng)基，產(chǎn)生明顯的醬香香氣。
[0011]本發(fā)明的更優(yōu)方案為:
步驟(1)中，環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株的液體種子的制備步驟為，取蒸餾水lOOOmL，加入葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、NaCl 5.0g，混合均勻，調(diào)溶液的pH值為7.0，將溶液在121°C下、滅菌20min，制得液體種子培養(yǎng)基；從試管斜面上挑取1_2環(huán)環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株接種到液體種子培養(yǎng)基中，在35-40°C、120-160r/min下，培養(yǎng)12_16h，制得活化后的液體種子。
[0012]步驟(1)中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備步驟為，取小麥麩皮300g，加水1000mL,混合均勻，于100 °C下、蒸煮10_20min,調(diào)pH值為6.0-6.5,121 °C下、滅菌30min,降溫至35-40°C，加入木聚糖酶和阿魏酸酯酶，保溫20-24h，制得液體發(fā)酵培養(yǎng)基；木聚糖酶的用量為20.0U/g麩皮，阿魏酸酯酶的用量為10.0U/g麩皮。
[0013]步驟(2)中，酒香酵母菌株的液體種子的制備步驟為，取蒸餾水lOOOmL，加入葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、酵母膏10.0g、KH2PO4 2.0g、MgSO4 1.0g，混合均勻，調(diào)溶液的pH值為6.0，將溶液在121°C下、滅菌20min，制得液體種子培養(yǎng)基；從試管斜面上挑取1_2環(huán)酒香酵母菌株接種到液體種子培養(yǎng)基中，在28-30°C、100-200r/min下，培養(yǎng)20_24h，制得活化后的液體種子。
[0014]步驟(2)中，酒香酵母菌株為間型酒香酵母(Brettanomyces intermedius)CICC32929、酒香酵母屬(Brettanomyces sp.) CICC31575 或異型酒香酵母(Brettanomycesanomalus)CICC32915,以上菌株均保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，可以通過購買的方式獲得。
[0015]步驟(1)和(3)中，微孔濾膜的工作壓力均為0.05-0.1MPa，微孔濾膜的孔徑均為
0.2-0.6Mm0
[0016]步驟(3)中，萃取劑為乙酸丁酯或乙酸戊酯，其用量為濾出液體積百分比的20-30%ο
[0017]本發(fā)明使用的環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株來源于醬香型白酒高溫大曲并經(jīng)過紫外線誘變選育獲得；HG12菌株含有高活性阿魏酸脫羧酶，能將發(fā)酵液中的阿魏酸脫羧生成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚且生成率高；HG12菌株發(fā)酵性能優(yōu)良，其發(fā)酵液中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的濃度高。
[0018]本發(fā)明使用的酒香酵母細胞內(nèi)含有乙烯基愈創(chuàng)木酚還原酶，能將環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株產(chǎn)生的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚轉化成4-乙基愈創(chuàng)木酚且轉化率達95%以上，其發(fā)酵產(chǎn)物4-乙基愈創(chuàng)木酚符合相關食品安全法規(guī)，安全無毒害，屬于綠色安全食品。
[0019]本發(fā)明米用小麥麩皮為原料,小麥麩皮中含有豐富的阿魏酸，在高溫蒸煮以及木聚糖酶和阿魏酸酯酶的共同作用下，其含有的阿魏酸能全部釋放到發(fā)酵液中，為4-乙基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)提供了天然原料；小麥麩皮營養(yǎng)豐富，含有25-30%的淀粉、15%左右的蛋白質以及多種微量元素，能充分 滿足HG12菌株和酒香酵母菌株的生長要求；小麥麩皮來源廣泛、價格低廉，用其為原料發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)成本低。
[0020]本發(fā)明可以實現(xiàn)4-乙基愈創(chuàng)木酚生產(chǎn)的連續(xù)化、規(guī)模化；并且4-乙基愈創(chuàng)木酚的生產(chǎn)工藝簡便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，極具工業(yè)化應用前景。
[0021](四)【具體實施方式】
下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行具體描述或作進一步說明，目的在于更好地理解本發(fā)明的方法，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下的實施例。
[0022]本發(fā)明中4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的測定步驟如下:
精密稱取4-乙基愈創(chuàng)木酚標準品25mg，用1%冰乙酸溶解并定容到25mL，制得濃度為
1.0mg/mL的標準母液。用1%冰乙酸將標準母液稀釋，制得4-乙基愈創(chuàng)木酚質量體積濃度依次為0.02,0.2、1.0,2.0,4.0Pg/mL的標準溶液。將上述標準溶液分別用0.22Mm的有機濾膜過濾，過濾液分別用高效液相色譜儀(購自上海天普分析儀器有限公司)進樣測定，以峰面積(Y)為縱坐標、濃度值(X，Pg/mL)為橫坐標，制作4-乙基愈創(chuàng)木酚標準溶液的標準曲線。根據(jù)標準曲線獲得該曲線的回歸方程為:y=3.862x+8.416 (R2=0.9996)，其中:y為峰面積，X為4-乙基愈創(chuàng)木酚的質量濃度(Pg/mL)，R2為相關系數(shù)。峰面積Y的變化與4-乙基愈創(chuàng)木酚的質量濃度成線性關系，其擬合度達0.9996。
[0023]發(fā)酵液中4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的測定:將含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液在8000r/min下、離心20min,取上清液,用0.22Mm的水性濾膜過濾,將過濾液稀釋成質量濃度為0.01-4.0Pg/mL的樣品溶液，用高效液相色譜儀進樣測定，得到樣品溶液的峰面積，根據(jù)回歸方程計算出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的濃度。
[0024]高效液相色譜儀的測定條件為:C18色譜柱(Agilent HC-C18, 250mmX4mm, 5Mm),流動相為水:甲醇:磷酸=540:450:10 (v/v/v)，流速為lmL/min，進樣量為15μ?，操作溫度為30°C。熒光檢測器條件為激發(fā)波長270nm、發(fā)射波長315nm。
[0025]原料來源:小麥麩皮市售，4-乙基愈創(chuàng)木酚標準品購自美國Sigma公司，冰乙酸購自天津市科密歐化學試劑有限公司，乙酸丁酯、乙酸戊酯均購自上海譜振生物科技有限公司，阿魏酸酯酶購自愛爾蘭Megazyme公司，木聚糖酶購自諾維信公司。
[0026]實施例1-6所用的環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株的液體種子的制備步驟為:取蒸餾水1000mL,加入葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、NaCl 5.0g，混合均勻，調(diào)溶液的pH值為7.0，將溶液在121°C下、滅菌20min，制得液體種子培養(yǎng)基。從試管斜面上挑取I環(huán)環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株接種到液體種子培養(yǎng)基中，在37°C、150r/min下，培養(yǎng)14h，制得活化后的液體種子。
[0027]實施例1-6所用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備步驟為:取小麥麩皮300g，加水1000mL,混合均勻，于100°C下、蒸煮15min,調(diào)pH值為6.0,121°C下、滅菌30min。降溫至40°C,加入6000U的木聚糖酶和3000U的阿魏酸酯酶，保溫24h，制得液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0028]實施例1-6所用的酒香酵母菌株的液體種子的制備步驟為:取蒸餾水lOOOmL，加入葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、酵母膏10.0g、KH2P04 2.0g、MgS04 lg，混合均勻，調(diào)溶液的pH值為6.0，將溶液在121°C下、滅菌20min，制得液體種子培養(yǎng)基。從試管斜面上挑取2環(huán)酒香酵母菌株接入液體種子培養(yǎng)基中，在28°C、150r/min下，培養(yǎng)24h，制得活化后的液體種子。
[0029]實施例1
一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，包括如下步驟:
(I)將環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株的液體種子按體積比為5%的接種量接種到200mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在40°C、200r/min下，發(fā)酵60h，制得發(fā)酵液。將發(fā)酵液在0.1MPa壓力下用孔徑為0.2Mffl的微孔濾膜過濾除菌，收集濾出液，調(diào)pH值為5.0,制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的濾出液。`
[0030](2)向步驟(1)制得的濾出液中按體積比為10%的接種量接種酒香酵母的液體種子，在30°C下，發(fā)酵36h，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液。
[0031](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵液在0.05MPa壓力下用孔徑為0.6Mm的微孔濾膜過濾除菌，收集濾出液，向濾出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量為濾出液體積百分比的30%(v/v)，混合均勻，靜置分相，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的萃取液，將萃取液在100°C、667Pa下蒸發(fā)，制得4-乙基愈創(chuàng)木酚0.232g。
[0032]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量為1.16g/L。
[0033]步驟(2)中，所述的酒香酵母(Brettanomyces)菌株為間型酒香酵母(Brettanomyces intermedius) CICC32929 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保存)。
[0034]實施例2
如實施例1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(1)中，將環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株的液體種子按體積比為3%的接種量接種到200mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、160r/min下，發(fā)酵36h，調(diào)濾出液的ph為6.0。
[0035]步驟(2)中，向步驟(1)制得的濾出液中按體積比為5%的接種量接種酒香酵母的液體種子，在28°C下，發(fā)酵12h。
[0036]步驟(3)中，向制得的濾出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量為濾出液體積百分比的 20% (ν/ν) ο
[0037]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量為1.01g/L。
[0038]在此條件下制得4-乙基愈創(chuàng)木酚0.202g。
[0039]實施例3
如實施例1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(2)中，所述的酒香酵母(Brettanomyces)菌株為酒香酵母屬(Brettanomycessp.)CICC31575 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保存)。
[0040]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量為1.15g/L。
[0041]在此條件下制得4-乙基愈創(chuàng)木酚0.230g。
[0042]實施例4
如實施例2所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(2)中，所述的酒香酵母(Brettanomyces)菌株為酒香酵母屬(Brettanomycessp.)CICC31575 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保存)。
[0043]經(jīng)檢測發(fā)酵液中 4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量為1.04g/L。
[0044]在此條件下制得4-乙基愈創(chuàng)木酚0.208g。
[0045]實施例5
如實施例1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(2)中，所述的酒香酵母(Brettanomyces)菌株為異型酒香酵母(Brettanomycesanomalus) CICC32915 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保存)。
[0046]經(jīng)檢測發(fā)酵液中4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量為1.12g/L。
[0047]在此條件下制得4-乙基愈創(chuàng)木酚0.224g。
[0048]實施例6
如實施例1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，不同之處在于:
步驟(3)中，向制得的濾出液中加入乙酸戊酯，乙酸戊酯的用量為濾出液體積百分比的25% (v/v)。
[0049]制得4-乙烯基愈創(chuàng)木酚0.228g。
【權利要求】
1.一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，以菌種保藏編號為CGMCCN0.8044的環(huán)狀芽孢桿菌心circulans) HG12菌株為生產(chǎn)菌種，其特征為，包括如下步驟:(I)將環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株的液體種子按體積比為3-5%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37-40°C、160-200r/min下，發(fā)酵36-60h，制得發(fā)酵液，將發(fā)酵液用微孔濾膜過濾，收集濾出液，調(diào)pH值為5.0-6.0，制得含有4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的濾出液；(2)向濾出液中接種體積比為5-10%接種量的酒香酵母菌株的液體種子，在28-30°C下，發(fā)酵12-36h，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的發(fā)酵液；(3)將發(fā)酵液用微孔濾膜過濾，收集濾出液，向濾出液中加入萃取劑，混合均勻，靜置分相，制得含有4-乙基愈創(chuàng)木酚的萃取液，將萃取液真空蒸發(fā)，制得4-乙基愈創(chuàng)木酚。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(1)中，環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株的液體種子的制備步驟為，取蒸餾水lOOOmL，加入葡萄糖l0.0g、蛋白胨l0.0g、牛肉膏10.0g、NaCl 5.0g，混合均勻，調(diào)溶液的pH值為7.0，將溶液在121°C下、滅菌20min，制得液體種子培養(yǎng)基；從試管斜面上挑取1_2環(huán)環(huán)狀芽孢桿菌HG12菌株接種到液體種子培養(yǎng)基中，在35-40°C、120-160r/min下，培養(yǎng)12_16h，制得活化后的液體種子。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(1)中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備步驟為，取小麥麩皮300g，加水1000mL,混合均勻，于100°C下、蒸煮 10-20min，調(diào) pH 值為 6.0-6.5，121°C下、滅菌 30min，降溫至 35_40°C，加入木聚糖酶和阿魏酸酯酶，保溫20-24h，制得液體發(fā)酵培養(yǎng)基；木聚糖酶的用量為20.0U/g麩皮，阿魏酸酯酶的用量為10.0U/g麩皮。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(2)中，酒香酵母 菌株的液體種子的制備步驟為，取蒸餾水lOOOmL，加入葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、酵母膏10.0g、KH2PO4 2.0g、MgSO4 1.0g，混合均勻，調(diào)溶液的pH值為6.0，將溶液在121°C下、滅菌20min，制得液體種子培養(yǎng)基；從試管斜面上挑取1-2環(huán)酒香酵母菌株接種到液體種子培養(yǎng)基中，在28-30°C、100-200r/min下，培養(yǎng)20_24h，制得活化后的液體種子。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(2)中，酒香酵母菌株為間型酒香酵母CICC32929、酒香酵母屬CICC31575或異型酒香酵母 CICC32915。
6.根據(jù)權利要求1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(1)和(3)中，微孔濾膜的工作壓力均為0.05-0.1MPa，微孔濾膜的孔徑均為0.2-0.6I^n0
7.根據(jù)權利要求1所述的利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的方法，其特征在于:步驟(3)中，萃取劑為乙酸丁酯或乙酸戊酯，其用量為濾出液體積百分比的20-30%。
【文檔編號】C12R1/09GK103805639SQ201310685675
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權日:2013年12月16日
【發(fā)明者】董永勝, 馬蕾, 崔云前, 段元良 申請人:齊魯工業(yè)大學