一種小麥wrky轉錄因子基因及其在擬南芥應答高溫脅迫中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程領域，提供一種小麥WRKY轉錄因子基因，還涉及了該基因在擬南芥應答高溫脅迫中的應用，該小麥WRKY轉錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。轉化所述基因的擬南芥植株在高溫等逆境脅迫時有明顯表型改變，該基因參與了植物的抗逆防御信號轉導的響應過程，為小麥的遺傳改良提供了優(yōu)良的基因資源。
【專利說明】-種小麥WRKY轉錄因子基因及其在擬南芥應答高溫脅迫 中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領域，尤其是涉及一種小麥WRKY轉錄因子基因及其在 擬南芥應答高溫脅迫中的應用。

【背景技術】
[0002] 小麥是我國第二大口糧作物，其穩(wěn)產豐產是確保國家糧食安全的重要基礎。我國 大部分麥區(qū)在小麥的籽粒灌漿期經(jīng)常出現(xiàn)30°C以上的高溫，嚴重影響了小麥的產量和品 質；另外，在我國北方和長江中下游麥區(qū)也常發(fā)生"高溫逼熟"災害。高溫脅迫造成小麥的 生長發(fā)育紊亂，甚至干枯死苗，是限制我國小麥產量的主要自然災害之一。轉錄因子在植物 基因表達中發(fā)揮中心調控作用，其中WRKY轉錄因子廣泛參與植物對生物和非生物逆境脅 迫應答反應。但有關小麥WRKY轉錄因子參與調控耐熱應答的機制目前知之甚少。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種小麥WRKY轉錄因子基因及其在擬南芥應答高溫脅迫中 的應用。
[0004] 本發(fā)明利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列，查找與水稻W(wǎng)RKY基因 CDNA同源的小麥 EST片段，將部分重疊且高度同源的小麥EST進行序列拼裝，組合成具有WRKY結構域和 完整0RF的cDNA序列，根據(jù)這些序列設計特異性PCR引物，采用RT-PCR的方法，獲得了 TaWRKY71基因，并且構建了可誘導的超表達載體，利用模式植物擬南芥進行了轉基因的功 能鑒定。
[0005] 本發(fā)明的具體技術方案是：一種小麥WRKY轉錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0006] 所述WRKY轉錄因子基因根據(jù)水稻0SWRKY71基因的序列，通過同源序列比對，擴 增，連接，轉化，篩選、測序等分子生物學操作獲得，命名為TaWRKY71。
[0007] 所述WRKY轉錄因子基因連接到超表達載體上，通過農桿菌介導轉化的方法，獲得 轉基因擬南芥植株。
[0008] 所述超表達載體為pKIGW-TaWRKY71。該載體中p0p6/LhGR系統(tǒng)的下游為⑶S基 因，上游為Gateway元件。p0p6/LhGR系統(tǒng)在地塞米松誘導后，p0p6雙向啟動子可同時表達 ⑶S基因和Gateway元件中的TaWRKY71基因，因此通過⑶S染色可以很方便的監(jiān)測目的基 因的表達情況。同時，此載體可以通過外源的化學誘導物地塞米松來控制目的基因的表達， 具有著獨特的優(yōu)勢。
[0009] 本發(fā)明克隆了一種小麥WRKY轉錄因子基因 TaWRKY71，構建可誘導的TaWRKY71超 表達載體，用農桿菌介導轉化，獲得轉基因擬南芥植株，該轉基因擬南芥植株對高溫脅迫的 抗性明顯下降，大多死亡，說明該基因參與了植物的熱調控網(wǎng)絡，為小麥的遺傳改良提供優(yōu) 良的基因資源。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是含有本發(fā)明序列表中序列1基因 TaWRKY71的表達載體pKIGW-TaWRKY71 ;
[0011] 圖2是含有本發(fā)明序列表中序列1基因 TaWRKY71的擬南芥；
[0012] 圖3是轉基因植株的分子鑒定圖；
[0013] 圖4是轉基因擬南芥與野生型植株經(jīng)高溫脅迫后的生長情況比較。

【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0015] 一、小麥WRKY轉錄因子基因 TaWRKY71的獲得
[0016] 1.總RNA的提?。阂孕←湏P麥158葉片作為試驗材料，采用TIANGEN試劑盒，操作 步驟如試劑盒說明所示，得到RNA溶液后，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量，-80°C保 存。
[0017] 2. cDNA 的合成：cDNA 的合成使用 Invitrogen 的 Superscript? III First-Strand Synthesis System for RT-PCR，具體步驟如下：
[0018] 1)取0. 5ml滅菌微量離心管，分別加入以下成分：總RNA11 μ L，01igo(dT) 1 μ L和 10mM dNTPl μ L。混勻，輕甩離心管，使溶液集中至底部；
[0019] 2)離心管置于水浴鍋內，65°C保溫5min ;
[0020] 3)迅速取出置于冰上冷卻lmin以上，將離心管輕微離心；
[0021] 4)在上述離心管中加入下列反轉錄反應液：5XFirst_strand Buffer4y L，0. 1M DTT1 μ L, Recombinant RNase Inhibitorl μ L, Superscript? III RT1 μ L ；
[0022] 5)輕微震蕩混勻后短暫離心；
[0023] 6)50°C保溫 50min ;
[0024] 7) 7〇°C保溫 Ιδπ?η，_2〇°C保存。
[0025] 用小麥β -Actin檢測反轉錄產物；PCR擴增程序為：94°C 4min，35個循環(huán)的程序 為95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s，最后72°C 5min ;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0026] 3. TaWRKY71 基因的分離
[0027] 以水稻相應基因的全長序列為基礎到NCBI數(shù)據(jù)庫上對EST庫進行BLANSTN查詢， 將搜索到的一些部分高度相似且重疊的小麥ESTs進行序列拼接，組合成序列較長的復合 EST，再以此為查詢序列重復進行BLASTN搜索、聚類、拼接直至無法進行，以達到最有效延 伸。利用BLASTX驗證該拼接片段是否符合預測。根據(jù)符合預測的拼接片段設計特異性PCR 引物，TaWRKY71-a F :5' -ATGGATCCATGGGTCAGCAGC-3' ；TaWRKY71-a
[0028] R :5' -ATTGATGTCCCTGGTCGGCGATA-3'。以步驟 2 中合成的 cDNA 為模板，TaWRKY71-a F、TaWRKY71-a R為引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為：反應總體系50μ 1，包括反轉錄產 物，5 Xphushion HF bufferlO μ L, 10mmol/L dNTPsl μ L, lOmM Primer FI μ L, lOmM Primer R1 μ L，Phusion DNA 聚合酶 0· 5 μ L，dd H2035. 5 μ L。PCR 擴增程序：98°C lmin，35 個循環(huán)的 程序為 98°C 10s，47°C 20s，72°C 30s，最后 72°C 10min。
[0029] 4. PCR產物的加 A連接
[0030] 利用Phusion DNA聚合酶產生的克隆片段為平末端，在進行ΤΑ克隆之前，用另 一種聚合酶Taq酶在平末端PCR產物末端進行加 A。加入PCR回收產物10 μ L、5XTaq bufferlyL、10mM dATPO. lyL、Taq 酶 0· lyL，72°C保持 15 分鐘，取出 2yL 加 A 后的 PCR 回收產物加入2 X T4連接酶緩沖液5 μ L、pGEM-T easy載體（50ng/ μ L) 1 μ L、T4DNA連接酶 (3U/ μ L) 1 μ L 連接到 pGEM-T easy 載體上，pGEM-T easy 載體購自 Promega 公司。
[0031] 5.連接產物的轉化
[0032] 1)從_80°C冰箱中取出1管（50 μ L)感受態(tài)細胞，置冰上；
[0033] 2)用預冷的無菌吸頭向管中加入2 μ L連接反應物，輕輕搖勻，置冰上30分鐘；
[0034] 3) 42 °C水浴熱激60秒，迅速置冰上5分鐘；
[0035] 4)向離心管中加入S0C液體培養(yǎng)基，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)lh ;
[0036] 5)室溫下8000rpm離心5分鐘，棄掉上清液，將剩余上清液重新懸浮菌體，用涂布 器將其均勻涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分鐘；
[0037] 6)倒置平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜，待出現(xiàn)明顯單菌落時拿出；
[0038] 7)放入4 °C冰箱數(shù)小時，使藍白斑顏色分明。
[0039] 6.重組質粒的PCR鑒定
[0040] 所用的pGEM-T載體的插入片段上游有T7引物，下游有SP6引物和M13引物，所以 可以用這三個啟動子序列做引物對插入片段進行特異性擴增，對重組質粒進行鑒定，鑒定 程序如下：PCR 擴增體系包括 lOXbuffer (含 MgCl2) 1 μ L，dNTP10mmol/L0· 2μ L，T7 和 SP6 引物OOng/yL)各0. 5yL，Taq酶0. lyL，模板為轉化后的白色菌斑。反應條件為：94°C， 10min ;35 個循環(huán)：94°C，30s ;56°C，30s ;72°C，2min ;72°C延伸 5min。最后，PCR擴增產物用 1 %瓊脂糖電泳檢測，選擇合適大小的陽性克隆測序，獲得如序列表中SEQ ID NO: 1所示的核 苷酸序列。測序在北京博邁德基因測序部完成。
[0041] 二、TaWRKY71轉基因擬南芥的獲得
[0042] 表達載體的構建：根據(jù)TaWRKY71基因的0RF序列，將Gateway技術中的AttB位點 加入原始引物序列，從陽性克隆的質粒中擴增出0RF片段，用于構建表達載體。
[0043] 1.帶有AttB位點的基因序列的擴增
[0044] 以通過測序鑒定的質粒為模板AttB-TaWRKY71F，AttB-TaWRKY71R為引物進行PCR 擴增。PCR擴增體系為：反應總體系包括質粒模板1. 5μ L，5Xphushion HF bufferlOy L， 10mmol/L dNTPsl μ L，10mM 基因特異弓丨物各 2· 5 μ L，phusion DNA 聚合酶 0· 5 μ L，dd 4〇32以1^。？0?擴增程序：981：3〇8,35個循環(huán)的程序為981：1〇8,6〇1：3〇8,721：11^11，最后 72°C 5min。50yL全部點樣，瓊脂糖電泳后回收PCR產物。
[0045] 2.入門載體的構建
[0046] 利用得到的AttB_TaWRKY71產物和pDONR(amp)進行BP反應，TaWRKY71基因編碼 序列將pDONR(amp)載體上的ccdB位點置換，構建成氨芐青霉素抗性的入門載體。將BP反 應產物經(jīng)轉化大腸桿菌菌株DH5ci后，用氨芐青霉素進行篩選。將轉化所得的菌斑搖菌提 質粒，保存進行菌落PCR鑒定，pDONR (amp)載體上游有T7引物和TaWRKY71-R引物，以轉化 所得質粒為模板進行PCR鑒定。對陽性克隆進行測序。BP反應體系包括PCR產物1 μ L， pDONR(amp) vectorl μ L，BP clone II enzymel μ L 和 dd Η201 μ L。
[0047] 3·表達載體的構建
[0048] 如圖1所示，將鑒定正確的質粒連接到pKIGW表達載體上，進行轉化和酶切檢 測，將鑒定正確的菌液送到華大基因公司測序。LR反應體系包括BP質粒2 μ L，pKIGW vectorl μ L, LR clone II enzymel μ L 和 dd Η201 μ L〇
[0049] 4.重組質粒pKIGW_TaWRKY71農桿菌的電擊轉化
[0050] 1)取50 μ L·的農桿菌感受態(tài)細胞于冰上融化，力口入2 μ L·已構建好的質粒DNA，輕 柔混勻，冰上放置半小時；
[0051] 2)將1)中的混合物轉入電擊杯中，電擊杯提前預冷；
[0052] 3)用細胞融合儀進行電擊；
[0053] 4)電擊結束后立即加入不含抗生素的S0C培養(yǎng)基中，混勻后移入2mL離心管中， 28°C下震蕩培養(yǎng)2h ;
[0054] 5)8000rpm，離心5min，棄上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大觀霉素、慶大霉素 的固體LB平板上，28 °C下倒置，培養(yǎng)2天。
[0055] 5. PCR驗證和菌種保存
[0056] 挑取培養(yǎng)基上的單菌落，作菌落PCR篩選單克隆。將鑒定正確的單克隆，液氮速 凍，-80°C保存以備用。
[0057] 6.將活化后的囷液取lmL接種于200mL含有卡那霉素、大觀霉素、慶大霉素的液體 LB培養(yǎng)基中，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0.8?0.9。
[0058] 將上述菌液5000rpm離心8min，用5% (w/v)鹿糖溶液懸浮菌體，使0D_ = 0. 8? 0. 9。將懸浮完菌體的蔗糖溶液中加入終濃度為0. 02%的Silwet L-77,將擬南芥花序浸入 加了 Silwet L-77的蔗糖溶液中浸泡lmin。把擬南芥用塑料袋套好，密封培養(yǎng)16-24小時 后按常規(guī)方法培育植株到結實，收獲L代種子。
[0059] 7.擬南芥TQ代種子篩選
[0060] 1)將干燥2周后的L代種子先用75%酒精消毒1分鐘，再用無菌水沖洗三遍。最 后用無菌的槍頭將消毒后的種子點播在1/2MS選擇培養(yǎng)板（75mg/L卡那霉素）上；
[0061] 2)4°C春化兩天后置于22°C、16h光照條件下，10d后觀察其子葉和根的發(fā)育狀況， 挑選轉化體，如圖2所示，轉化體表現(xiàn)為真葉健康呈深綠色，根長至培養(yǎng)基里。轉入外源基 因的植株能在含有卡那霉素的抗性培養(yǎng)基上生長，而非轉基因植株則不能正常生長。l〇d 后，把生長正常的擬南芥幼苗移栽到土中。當植株長到8?10葉時，提取幼嫩葉片基因組 DNA，進行PCR鑒定；通過鑒定的植株分單株收獲種子。
[0062] 三、轉基因擬南芥的PCR分子鑒定
[0063] 用SIGMA公司的Extract-N-Amp? Plant PCR Kits試劑盒對轉基因擬南芥進行鑒 定，步驟如下：
[0064] 1. DNA提?。喝?· 5-0. 7cm葉片組織到2ml離心管中，加入100 μ L Extraction Solution，95°C保持 10min，加入 100 μ L Dilution Solution 混勻，2°C -8°C儲存以備用；
[0065] 2. PCR 擴增：PCR 擴增反應體系包括 ddH204 μ L、Extract-N-Amp PCR ReadymixlO μ L、lOmM Primer FI μ L、lOmM Primer R1 μ L、Leaf disk extract4 μ L ;PCR 擴 增反應程序為：94°C 3min，30 個循環(huán)包括 94°C lmin、60°C lmin、72°C lmin30sec，然后 72°C 10min。如圖3所示，PCR分子鑒定有擴增條帶的為轉基因植株。
[0066] 四、TaWRKY71轉基因擬南芥T1代植株的耐高溫性鑒定
[0067] 將純合體擬南芥轉基因種子和野生型（Col-Ο)種子同時種植在含有化學誘導物 地塞米松（DEX)的培養(yǎng)基中，生長一周后將其轉入40°C的高溫中處理10h，處理后，轉移培 養(yǎng)皿到正常的生長條件下，培養(yǎng)2d后觀察轉基因植株與野生型的變化。如圖4所示，可以 發(fā)現(xiàn)，轉基因擬南芥對高溫脅迫極端敏感，與野生型擬南芥植株相比，轉基因植株對高溫脅 迫的抗性明顯下降，大多死亡，說明該基因參與了植物的熱調控網(wǎng)絡。
[0068] 以上對本發(fā)明的一個實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發(fā)明的較佳實施 例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進 等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內。
[0001] SEQUENCE LISTING <110>天津農學院 <120> -種小麥WRKY轉錄因子基因及其在擬南芥應答高溫脅迫中的應用 <130 2013 <160> 1 <170> Patent In version 3.3 <210> 1 <211> 1068 <212> DNA <213> 小麥（Triticum aestivum) <400> 1 algglaccat ggglcagcag ccagccttcg clgagcctlg acclgcacgl cggcclcccg 60 ccgatggggc acccgcacag ccaccaccag gcggcgccga tgglcgcgcl ggccaagccc 120 aaggtcclcg tegaggagaa cttcalgcag clcaagaagg accctgaggt tgcggttctt 180 gagteggage tacagcgggt cagcgaggag aaccggcggc Lgggcgagat gctcagggag 240 glggcclcca aglacgagac cctgcagggc cagttcaccg acatggtcac ggccggcgcc 300 cacgccggcg gcaataacca ciacaacaac cagccglcct ccgcgtcgga gggcggglcg 360 glglcgccgl egaggaageg caagagcgag gagagcaacg gcacgccacc gccgtcgcac 420
[0002] cagcagcagc agcagcacla cgccggcggc ctcgcglacg cggcggcgcc ggaccaggcg 480 gagtgcacgt ccggcgagcc gtgcaagcgc atccgggagg aglgcaaacc cglcatctcc 540 aagcgctacg iccacgccga ccccgccgac ctcagcclgg tggtgaagga cgggtaccaa 600 tggcgcaagt acgggcagaa ggtgaccaag gacaacccci gccccagagc ctacltccgg 660 Igciccticg cccccggctg ccccgtcaag aagaaggigc agaggagcgc cgaggacaag 720 accataclcg tggcgacgta cgagggcgag cacaaccaca gccagccccc gtcgtcgcag 780 ccgcagcagc agaacgacgg ctccggcgcg ggcaagaacg ccgggaagcc accccaggcg 840 ccggccacgc clcaccaccc gcagcagcat cagcagcagc acaagcagga agcgccagcg 900 glagccglca gcggcgaglc cgccgccgcg gaatccgaga tgalccglcg gaacctggcg 960 gagcagalgg ccalgacgct gacgagggac cccagctica aggcggcgcl cgtcaccgcc 1020 clclccggcc ggatcclcga gclatcgccg accagggaca Ucaaiga 1068
【權利要求】
1. 一種小麥WRKY轉錄因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述的小麥WRKY轉錄因子基因，其特征在于：該基因序列與水稻 0sWRKY71基因有很高的同源性，對其進行克隆測序，經(jīng)基因工程操作，使其受控于化學誘導 型啟動子。
3. 權利要求1或2所述的小麥WRKY轉錄因子基因在擬南芥應答高溫脅迫中的應用。
4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于：將所述小麥WRKY轉錄因子基因連接到超 表達載體上，通過農桿菌介導轉化，得到轉基因擬南芥植株。
【文檔編號】A01H5/00GK104046634SQ201410276223
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權日:2014年6月19日
【發(fā)明者】謝曉東, 丁博, 王俊斌, 李明, 陳帥君, 郭雨 申請人:天津農學院