棲異地克雷伯氏菌在麻瘋樹餅粕發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棲異地克雷伯氏菌在麻瘋樹餅粕發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用，以及麻瘋樹餅粕的發(fā)酵脫毒方法，包括如下步驟：(1)取棲異地克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)LY-1，活化，得到種子液；(2)取麻瘋樹餅粕，加水，混勻，接種步驟(1)制備的種子液，其中，接種量為麻瘋樹餅粕的20％～100％(v/w)，初始加水量為麻瘋樹餅粕的50％～150％(v/w)；(3)在溫度為27℃～47℃的條件下發(fā)酵24～72小時(shí)，即可。本發(fā)明方法提高了麻瘋樹餅粕中佛波酯的降解率，縮短發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)不破壞餅粕的營養(yǎng)成分，方法簡便，成本低廉，具有良好的市場應(yīng)用前景。
【專利說明】棲異地克雷伯氏菌在麻瘋樹餅粕發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種棲異地克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola)在麻瘋樹餅柏發(fā)酵 脫毒中的應(yīng)用，屬于發(fā)酵領(lǐng)域。 【背景技術(shù)】
[0002] 麻瘋樹（Jatrophacurcas L.)是世界公認(rèn)的最有可能成為未來替代化石能源的具 有巨大開發(fā)潛力的樹種，利用麻瘋樹油加工生產(chǎn)的生物柴油在各項(xiàng)性能指標(biāo)上接近甚至超 過國家"〇"號(hào)柴油以及國家生物柴油標(biāo)準(zhǔn)，因此以麻瘋樹果生產(chǎn)生物柴油已經(jīng)成為現(xiàn)在研 究生產(chǎn)生物柴油的一個(gè)活躍方向。麻瘋樹餅柏（Jatrophacurcas seed cake, JCSC)是生物 柴油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，具有很高的蛋白含量和較高的營養(yǎng)價(jià)值，但是因其毒性大，主要 被作為肥料用或直接排放于自然環(huán)境中，不但嚴(yán)重地浪費(fèi)了大量的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，而且還 造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，若能降低其毒性，則可作為飼用蛋白使用。
[0003] 麻瘋樹餅柏的主要毒性物質(zhì)是佛波酯及其衍生物、胰蛋白酶抑制劑和Curcin。其 中，胰蛋白酶抑制劑和Curcin是熱不穩(wěn)定性成分，簡單的加熱處理就可以使它們的分子構(gòu) 型發(fā)生變化，從而失去活性通過熱處理可以使其大量減少，至幾乎完全消失。但是，佛波酯 (Phorbol-ester, PE)為熱穩(wěn)定性成分，毒性強(qiáng)，可以在160°C下耐受30min而不受影響，其 結(jié)構(gòu)屬于四環(huán)二萜型，巴豆烷是佛波醇酯的基本結(jié)構(gòu)部分。因此，脫除佛波酯的是麻瘋樹餅 柏利用的關(guān)鍵因素。
[0004] 目前，關(guān)于麻瘋樹餅柏脫除佛波酯的研究中，通常為物理和化學(xué)方法聯(lián)用，或通過 微生物發(fā)酵的生物方法進(jìn)行。由于佛波酯具有熱穩(wěn)定性，所以通過熱處理方法進(jìn)行佛波酯 去除效果并不理想。現(xiàn)有的去除效率較高的物理和化學(xué)聯(lián)用方法包括：將佛波酯融于甲醇 中通過等離子照射可以降解佛波酯，乙醇反復(fù)洗滌也可去除佛波酯，用含有NaHC0 3的乙 醇溶液可除去種子中的佛波酯等。利用物理化學(xué)方法進(jìn)行脫毒時(shí)，操作復(fù)雜過程繁瑣、易導(dǎo) 致化學(xué)物殘留、成本高，且對(duì)餅柏中的營養(yǎng)成分造成一定的破壞。微生物具有繁殖快、數(shù)量 大、產(chǎn)酶系復(fù)雜等特點(diǎn)，利用微生物發(fā)酵工程技術(shù)脫毒是一種較為有效的方法。文獻(xiàn)報(bào)道采 用銅綠假單胞菌（P. aeruginosaPseA)發(fā)酵能夠降解麻瘋樹籽柏中的佛波酯。但是，銅綠假 單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，經(jīng)常引起術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化 膿性中耳炎等，還是尿路感染的常見病原菌。因而用銅綠假單胞菌處理的麻瘋樹餅柏作為 飼料使用，存在潛在的安全隱患。
[0005] 中國專利CN 102329739 B公開了一株用于發(fā)酵小桐子餅柏制作生物菌肥的雜色 曲霉菌（Aspergillusversicolor A003);中國專利CN 102358887 B公開了一株用于脫除 小桐子餅柏毒性的糞生鏈霉菌（Streptomyces fimicarius 3)。中國專利CN 102316998 A公開了有機(jī)物中的佛波酯去除方法、高蛋白質(zhì)含量有機(jī)物的制造方法、高蛋白質(zhì)含量 有機(jī)物、飼料的制造方法、以及飼料，將含有佛波酯成分的有機(jī)物與納豆菌（Bacillus subtilisvar. natto)混合，通過使其發(fā)酵來分解佛波酯，發(fā)酵時(shí)間為2?4周。中國專利 CN 103509738 A公開了一種日溝維腸桿菌及其在麻瘋樹餅柏發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用，日溝維腸 桿菌Enterobactergergoviae zxy-15,可以有效降低麻瘋樹餅柏有毒成分，發(fā)酵時(shí)間8天， 佛波酯的去除率最高達(dá)到55. 6%。中國專利CN 103509737 A公開了一種摩氏摩根菌及其 在麻瘋樹餅柏發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用，摩氏摩根菌（Morganellamorganii) zxy-12-4,可以有效 降低麻瘋樹餅柏有毒成分，發(fā)酵時(shí)間3天，佛波酯總量的下降率最高為73. 0 %。中國專利 CN 103734559 A公開了一種麻瘋樹餅柏的發(fā)酵脫毒方法，利用日溝維腸桿菌和摩氏摩根菌 混合，降低麻瘋樹餅柏毒性，發(fā)酵時(shí)間2天，佛波酯的去除率高達(dá)51. 54%?，F(xiàn)有技術(shù)公開的 方法中，大多發(fā)酵時(shí)間較長，若發(fā)酵時(shí)間短，佛波酯的降解率又不理想，不利于工業(yè)生產(chǎn)。
[0006] 棲異地克雷伯氏菌是克雷伯氏菌的變種，現(xiàn)有技術(shù)公開的應(yīng)用，如：中國專利 CN 102344898 B 公開了一株變棲克雷伯氏菌菌株（Klebsiellavariicola)HUB-IV-005， 對(duì)于白蟻腸道固氮菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物可以有效的殺滅白蟻。中國專 利CN 103484399 A公開了一株植物內(nèi)生細(xì)菌SH-1及其應(yīng)用，生產(chǎn)菌株變棲克雷伯菌 (KlebSiella Variic〇la)SH-l，對(duì)鏈格孢菌引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病、番茄早疫病有 顯著的防治效果。未見其應(yīng)用于麻瘋樹餅柏脫毒的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種棲異地克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola)LY-l在麻瘋樹餅 柏發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明棲異地克雷伯氏菌在麻瘋樹餅柏發(fā)酵脫毒中的用途。
[0009] 所述棲異地克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola)LY-l的菌株保藏編號(hào)為CICM B1743。
[〇〇1〇] 本發(fā)明麻瘋樹餅柏的發(fā)酵脫毒方法，包括如下步驟：
[0011] (1)取棲異地克雷伯氏菌LY-1，活化，得到種子液；
[0012] (2)取麻瘋樹餅柏，加水，混勻，接種步驟（1)制備的種子液，其中，接種量為麻瘋 樹餅柏的20%?100% (v/w，即體積質(zhì)量比），初始加水量為麻瘋樹餅柏的50%?150% (v/w)；
[0013] (3)在溫度為27°C?47°C的條件下發(fā)酵24?72小時(shí)，即可。
[0014] 步驟（1)中，所述棲異地克雷伯氏菌LY-1的菌株保藏編號(hào)為CICIM B1743。
[0015] 步驟（1)中，所述棲異地克雷伯氏菌LY-1的種子液按照如下方法制備：采用LB固 體培養(yǎng)基活化棲異地克雷伯氏菌LY-1后，分別挑取接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C、180r/ min下振蕩培養(yǎng)14h，使得菌種濃度達(dá)到108cfu/mL。
[0016] 步驟（2)中，所述麻瘋樹餅柏按照如下方法制備：取麻瘋樹種子，榨取脫油，粉碎， 過40目篩，即可。
[0017] 步驟⑵中，所述接種量為麻瘋樹餅柏的33 %?40 % (v/w)，初始加水量為麻瘋樹 餅柏的 100 % ?105% (v/w)。
[0018] 步驟⑶中，所述溫度為37°C ;所述發(fā)酵的時(shí)間為48小時(shí)。
[〇〇19] 本發(fā)明方法利用棲異地克雷伯氏菌LY-1對(duì)麻瘋樹餅柏進(jìn)行發(fā)酵脫毒，大大提高 麻瘋樹餅柏中佛波酯的降解率，縮短發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)不破壞餅柏的營養(yǎng)成分，方法簡便，成 本低廉。
[0020] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0021] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0022] 本發(fā)明棲異地克雷伯氏菌LY-1來源于中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心（隸 屬單位名稱：江南大學(xué)），菌株保藏編號(hào)為CICM B1743,屬名：Klebsiella，種名加詞： variicola，特征特性：菌落小而平坦、白色、邊緣及表面光滑、革蘭氏陰性。 【具體實(shí)施方式】
[0023] 材料
[0024] 菌種：本發(fā)明棲異地克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola)LY-l，簡稱菌株LY-1。
[0025] 麻瘋樹餅柏：取麻瘋樹種子，榨取脫油，粉碎，過40目篩，即可。
[0026] 本發(fā)明麻瘋樹種子采于云南省永勝縣仁里鄉(xiāng)或片角鄉(xiāng)，取當(dāng)年成熟、自然干燥的 種子進(jìn)行試驗(yàn)。
[0027] 主要儀器
[0028] Waters515高效液相色譜儀（美國）、UT-1900紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析 通用儀器廠）、AE-240電子分析天平（0. OOOlg)、SB-300DTR超聲波掃頻清洗機(jī)、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、幾-100萬能粉碎機(jī)（上海廣沙工貿(mào)有限公司）、 SpectraMax M2/M2e型多功能酶聯(lián)免疫分析儀（美國Molercular Devices公司）、螺旋式 冷榨機(jī)、生化培養(yǎng)箱、搖床、無菌操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、灌胃針。
[0029] 試劑：
[0030] 酶標(biāo)記二抗：山羊抗兔IgG-HRP (北京中杉金橋公司'Ν,Ν,Ν'，N' -TMB(四甲基 聯(lián)苯胺）顯色液（美國Amresco)。
[0031] 所有試劑均為分析純，色譜所用試劑為色譜純，均購自成都科龍?jiān)噭┕?。層析?膠（160-200 目）。
[0032] 固態(tài)發(fā)酵餅柏中佛波酯的提取與檢測方法
[〇〇33] (1)佛波酯的提取
[0034] 采用二氯甲烷提取法：向含有餅柏或餅柏發(fā)酵物三角瓶中，每次加入40mL二氯甲 烷并進(jìn)行20min超聲，如此重復(fù)6次。將超聲液收集進(jìn)行抽濾旋蒸，得到佛波酯濃縮液并用 甲醇溶解。再經(jīng)過12000r/min離心10min后，取上清液用0. 22 μ m有機(jī)濾膜過濾,得到含 有佛波酯的甲醇溶液。
[0035] (2)HPLC 檢測方法
[0036] 通過高效液相色譜法檢測，高效液相色譜條件為：以80%乙腈（含有0. 175 %磷 酸）作為流動(dòng)相，以8%甲醇作為清洗流動(dòng)相，以純乙腈作為保護(hù)液流動(dòng)相；檢測波長為 280nm、流速為1. OmL/min、柱溫為25°C、進(jìn)樣量為20μ L，以外標(biāo)法作為基礎(chǔ)，通過峰面積計(jì) 算確定樣品中麻瘋樹佛波酯的含量，公式為y = 3025300Χ-33. 38,其中y為峰面積和，X為 佛波酯含量（mg/g)。
[0037] (3)佛波酯的降解率計(jì)算公式
[0038] 佛波酯降解量以佛波酯的降解率表示：
[0039]
【權(quán)利要求】
1. 棲異地克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola)在麻瘋樹餅柏發(fā)酵脫毒中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述棲異地克雷伯氏菌 (Klebsiellavariicola)LY-1 的菌株保藏編號(hào)為 CICM B1743。
3. -種麻瘋樹餅柏的發(fā)酵脫毒方法，其特征在于：它包括如下步驟： (1) 取棲異地克雷伯氏菌LY-1，活化，得到種子液； (2) 取麻瘋樹餅柏，加水，混勻，接種步驟（1)制備的種子液，其中，接種量為麻瘋樹餅 柏的20 %?100 % (v/w)，初始加水量為麻瘋樹餅柏的50 %?150 % (v/w); ⑶在溫度為27°C?47°C的條件下發(fā)酵24?72小時(shí)，即可。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述棲異地克雷伯氏菌LY-1 的菌株保藏編號(hào)為CICIM B1743。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述棲異地克雷伯氏菌LY-1 的種子液按照如下方法制備：采用LB固體培養(yǎng)基活化棲異地克雷伯氏菌LY-1后，分別挑取 接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C、180r/min下振蕩培養(yǎng)14h，使得菌種濃度達(dá)到10 8cfu/mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟⑵中，所述麻瘋樹餅柏按照如下方 法制備：取麻瘋樹種子，榨取脫油，粉碎，過40目篩，即可。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述接種量為麻瘋樹餅柏的 33 %?40 % (v/w)，初始加水量為麻瘋樹餅柏的100 %?105 % (v/w)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（3)中，所述溫度為37°C ;所述發(fā)酵 的時(shí)間為48小時(shí)。
【文檔編號(hào)】A23K1/14GK104082525SQ201410276120
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】唐琳, 劉瑩, 陳放 申請(qǐng)人:四川大學(xué)