專利名稱：喹唑啉類及其作為aurora激酶抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及本文定義的式(I)化合物及其鹽。用于藥物組合物中的鹽應(yīng)是可藥用鹽，但是其它鹽可以用于式(I)化合物和它們可藥用鹽的制備。本發(fā)明的可藥用鹽例如可以包括本文定義的式(I)化合物的酸加成鹽，所述化合物具有足夠的堿性以形成鹽。這樣的酸加成鹽包括但不限于富馬酸鹽(furmarate)、甲烷磺酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、檸檬酸鹽和馬來酸鹽，和與磷酸和硫酸形成的鹽。此外，如果式(I)化合物有足夠的酸性，鹽為堿鹽，實例包括但不限于堿金屬鹽例如鈉鹽或鉀鹽，堿土金屬鹽例如鈣鹽或鎂鹽，或有機胺鹽例如三乙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、嗎啉、N-甲基哌啶、N-乙基哌啶、二芐基胺或氨基酸例如賴氨酸的鹽。
式(I)化合物還可以以前藥的形式被施用，其在人或動物身體內(nèi)被分解得到式(I)化合物。因此，本發(fā)明還提供式(I)化合物的前藥。各種形式的前藥在本領(lǐng)域是已知的。例如這樣的前藥衍生物，參見 a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard編輯，(Elsevier，1985)和Methods inEnzymology，42卷，309-396頁，K.Widder等編輯(Academic Press，1985)； b)A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard編輯，第5章“Design and Application of Prodrugs”，HBundgaard，113-191(1991)。
c)H Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)； d)H.Bundgaard，等，Journal of Pharmaceutical Sciences，77，285(1988)；和 e)N.Kakeya，等，Chem Pharm Bull，32，692(1984)。
在本發(fā)明的一方面，X為鍵。當(dāng)X為鍵時，本發(fā)明提供式(IA)化合物
式(IA) 或其鹽； 其中R1為氫或甲基。
當(dāng)X為鍵和R1為氫時，式(I)化合物為N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(2R)-吡咯烷-2-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺。當(dāng)X為鍵和R1為甲基時，式(I)化合物為N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-{[(2R)-1-甲基吡咯烷-2-基]甲氧基}喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺。
在本發(fā)明的另一方面，X為氧。當(dāng)X為氧時，本發(fā)明提供式(IB)化合物
式(IB) 或其鹽； 其中R1為氫或甲基。
當(dāng)X為氧和R1為氫時，式(I)化合物為N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(3R)-嗎啉-3-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺。當(dāng)X為氧和R1為甲基時，式(I)化合物為N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-{[(3R)-4-甲基嗎啉-3-基]甲氧基}喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺。
本發(fā)明還提供其中R1為甲基的式(I)化合物的制備方法，該方法包含將其中R1為氫的式(I)化合物與甲醛在甲酸中在升高的溫度下，例如在從50℃至100℃下，反應(yīng)一段時間例如30分鐘至2小時，此后，如果必要 i)除去任何保護基；和/或 ii)形成其鹽。
制備其中R1為氫的式(I)化合物的方法，包含將N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-羥基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺與式(II)的 醇反應(yīng)
其中PG為合適的保護基，例如叔丁氧基羰基(BOC)、芐氧基羰基(Z)或9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，和此后如果必要 i)除去任何保護基；和/或 ii)形成其鹽。
該反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如將N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-羥基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺與式(II)的醇在溶劑例如四氫呋喃中，在合適的偶合試劑例如偶氮二羧酸二叔丁酯和合適的膦例如三苯基膦存在下，在溫度為20至60℃偶合1至5小時。
或者，其中R1為氫的式(I)化合物可以通過以下方法制備，該方法包含將式(III)化合物
其中PG為合適的保護基，例如叔丁氧基羰基(BOC)、芐氧基羰基(Z)或9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，和L為合適的離去基例如氯，與2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺反應(yīng)，此后如果必要 i)除去任何保護基；和/或 ii)形成其鹽。
該反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如將式(III)化合物與2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺在溶劑例如異丙醇或二甲基乙酰胺中，在有或沒有酸性催化劑例如鹽酸下，在溫度為20至100℃反應(yīng)30分鐘至24小時。
本發(fā)明還提供制備N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-羥基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺的方法，該方法包含將N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺與合適的脫甲基化試劑例如吡啶鹽酸鹽或溴化鎂，在合適的溶劑例如吡啶或四氫呋喃中，在溫度為60至120℃下反應(yīng)5至48小時。
所述的方法可以進一步包含N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺的制備方法，該方法包含將式(IV)化合物
其中L為合適的離去基，例如氯，與2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺反應(yīng)。這樣的反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如將式(IV)化合物與2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺，在溶劑例如異丙醇或二甲基乙酰胺中，在有或或沒有酸催化劑例如鹽酸下，在溫度為20至100℃加熱30分鐘至24小時。
式(IV)化合物可以通過常規(guī)的方法制備。特別地式(IV)化合物可以通過如下方法制備將7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮與合適的氯化試劑例如三氯氧磷在合適的溶劑例如1，2-二氯乙烷或乙腈中，在合適的堿例如二-異丙基乙基胺存在下，在溫度為0至80℃反應(yīng)2至24小時。
化合物例如7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮可以通過常規(guī)的方法制備。特別地7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮可以通過如下方法制備將5，7-二乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮與甲醇鈉，在合適的溶劑例如二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮中，在溫度90至110℃下反應(yīng)6至24小時。
化合物例如5，7-二乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮可以通過常規(guī)的方法制備。特別地5，7-二乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮可以通過如下方法制備將5，7-二氟喹唑啉-4(3H)-酮與乙醇鈉在溶劑例如二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮中，在溫度為90至110℃下，反應(yīng)2至12小時。
5，7-二氟喹唑啉-4(3H)-酮在本領(lǐng)域是已知的。
本發(fā)明還提供制備2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺的方法，該方法包含將N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(二苯基亞甲基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺在合適的溶劑例如乙酸乙酯中，在濃酸水溶液例如鹽酸存在下水解。
N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(二苯基亞甲基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺可以通過如下方法制備，該方法包含將式(V)化合物
其中X為鹵素例如溴或碘，與二苯甲酮亞胺反應(yīng)。該反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如將式(V)化合物與二苯甲酮亞胺在溶劑例如1，4-二烷中，在合適的堿催化劑例如叔丁醇鈉、碳酸銫、碳酸鉀或磷酸鉀存在下，在合適的配體例如(9，9-二甲基-9H-呫噸-4，5-二基)雙(二苯基膦)、1，1′-聯(lián)萘-2，2′-二基雙(二苯基膦)或1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵存在下，和在合適的催化劑例如三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)或醋酸鈀存在下，在溫度為例如90℃下加熱30分鐘至6小時。
該方法可以進一步包含式(V)化合物制備方法，該方法包含將式(VI)化合物
其中X為鹵素例如溴或碘，與式(VII)化合物反應(yīng)
其中L為離去基例如氯或溴。該反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如將式(VI)化合物與式(VII)化合物，在堿例如碳酸鉀的存在下，在溶劑例如二甲基乙酰胺中，在溫度例如20℃下反應(yīng)14至48小時。
式(VI)和(VII)化合物或者在本領(lǐng)域是已知的，或者可以通過文獻出現(xiàn)的常規(guī)方法從本領(lǐng)域已知的其它化合物衍生得到。
或者，2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺可以通過還原N-(2，3-二氟苯基)-2-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)乙酰胺制備。該反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如在1至5巴氫氣壓力下，在合適的催化劑例如氧化鉑或披鈀碳的存在下，在合適的溶劑例如乙醇和/或乙酸乙酯中，在合適的溫度例如20℃下還原N-(2，3-二氟苯基)-2-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)乙酰胺0.5至5小時。
N-(2，3-二氟苯基)-2-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)乙酰胺可以通過(4-硝基-1H-吡唑-1-基)乙酸與2，3-二氟苯胺反應(yīng)制備。該反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如將(4-硝基-1H-吡唑-1-基)乙酸與2，3-二氟苯胺，與三氯氧磷和吡啶，在溶劑例如二氯甲烷中，在溫度為0至20℃下偶合2-3小時。
(4-硝基-1H-吡唑-1-基)乙酸和2，3-二氟苯胺在本領(lǐng)域是已知的。
本發(fā)明進一步提供制備式(III)化合物的方法，方法包含將式(VIII)化合物
其中PG為合適的保護基例如叔丁氧基羰基(BOC)、芐氧基羰基(Z)或9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，與合適的氯化試劑例如三氯氧磷，在合適的溶劑例如1，2-二氯乙烷或乙腈中，在合適的堿例如二-異丙基乙基胺存在下，在溫度為0至80℃下反應(yīng)2至24小時。
該方法可以進一步包含制備式(VIII)化合物的方法，其中PG為合適的保護基例如叔丁氧基羰基(BOC)、芐氧基羰基(Z)或9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，該方法包含將7-乙氧基-5-氟喹唑啉-4(3H)-酮與式(II)化合物反應(yīng)，隨后保護基轉(zhuǎn)變。其中7-乙氧基-5-氟喹唑啉-4(3H)-酮與式(II)化合物反應(yīng)，PG或者為氫或者為合適的保護基例如芐基。該反應(yīng)可以在文獻描述的條件范圍下完成，例如將7-乙氧基-5-氟喹唑啉-4(3H)-酮，與其中PG或者為氫或者為合適的保護基例如芐基的式(II)化合物，在溶劑例如四氫呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮中，與堿例如氫化鈉或叔丁醇鉀，在溫度為20至100℃下反應(yīng)2至24小時。
其中PG或者為氫或者為合適的保護基例如芐基的式(II)化合物，或者為本領(lǐng)域已知的，或者可以通過文獻中的常規(guī)方法從本領(lǐng)域已知的其它化合物衍生得到。
7-乙氧基-5-氟喹唑啉-4(3H)-酮可以通過將2-氨基-4-乙氧基-6-氟芐腈與甲酸，與催化量的無機酸例如硫酸，在溫度例如100℃下反應(yīng)2至24小時制備。
化合物例如2-氨基-4-乙氧基-6-氟芐腈或者為本領(lǐng)域已知的，或者可以通過文獻中的常規(guī)方法從本領(lǐng)域已知的其它化合物衍生得到。
要理解的是本發(fā)明化合物各種環(huán)取代基中的某些可以在上文提及的方法之前或之后立刻，通過標準芳香取代反應(yīng)引入，或通過常規(guī)的官能團修飾產(chǎn)生，這樣的方法也包括在本發(fā)明的方法方面。這樣的反應(yīng)和修飾包括例如通過芳香取代反應(yīng)的方法引入取代基、取代基的還原、取代基的烷基化和取代基的氧化。這樣方法的試劑和反應(yīng)條件在化學(xué)領(lǐng)域中是眾所周知的。芳香取代反應(yīng)的特定的實例包括使用濃硝酸引入硝基，在Friedel Crafts條件下使用例如酰鹵和路易斯酸(例如三氯化鋁)引入?；?；在Friedel Crafts條件下使用烷基鹵代物和路易斯酸(例如三氯化鋁)引入烷基；和引入鹵素基團。修飾的特定實例包括通過例如用鎳催化劑催化氫化，或在鹽酸存在加熱下用鐵處理將硝基還原至氨基；烷硫基氧化為烷基亞磺?；蛲榛酋；?。
還應(yīng)當(dāng)理解本文提及的一些反應(yīng)可能必需/需要保護化合物中的任何敏感的基團。其中保護是必需或需要的實例和合適的保護方法對于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是已知的。常規(guī)的保護基可以根據(jù)標準操作方法使用(例如參見T.W.Green，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wileyand Sons，1991)。因此，如果反應(yīng)物包括基團例如氨基、羧基或羥基，其在本文提及的一些反應(yīng)中可能是需要保護的。
氨基或烷基氨基的合適保護基為例如酰基，例如烷酰基，例如乙酰基，烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基，芳基甲氧基羰基例如芐氧基羰基，或芳?；?，例如苯甲?；?。上述保護基的脫保護條件必須隨著保護基的選擇而變化。因此，例如?；缤轷；蛲檠趸驶蚍减；梢岳缤ㄟ^在合適的堿例如堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鋰或氫氧化鈉水解。或者?；缡宥⊙趸驶梢岳缤ㄟ^用合適的酸如鹽酸、硫酸或磷酸或三氟乙酸處理除去，和芳基甲氧基羰基例如芐氧基羰基，可以通過例如在催化劑例如披鈀碳上氫化除去，或通過用路易斯酸例如三(三氟乙酸)硼處理。伯氨基的合適的可選擇的保護基例如為鄰苯二甲?；?，其可以通過用烷基胺例如二甲基氨基丙基胺，或用肼處理除去。
羥基的合適保護基例如為?；缤轷；?，例如乙酰基，芳?；绫郊柞；?，或芳基甲基，例如芐基。上述保護基的脫保護條件必須隨著保護基的選擇而改變。因此，例如?；?，例如烷?；蚍减；梢岳缤ㄟ^用合適的堿例如堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鋰或氫氧化鈉水解除去?；蛘叻蓟谆缙S基可以通過用催化劑例如披鈀碳氫化除去。
用于羧基的合適保護基例如為酯化基團，例如甲基或乙基酯，其可以例如通過用堿例如氫氧化鈉水解除去，或例如為叔丁基酯，其可以通過用酸例如有機酸例如三氟乙酸處理除去，或例如為芐基酯，其可以例如通過在催化劑例如披鈀碳上氫化除去。
保護基可以使用在化學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的常規(guī)技術(shù)在任何方便的合成階段除去。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面提供藥物組合物，其包含本文定義的式(I)化合物或其可藥用鹽和與之混合的可藥用稀釋劑或載體。
本發(fā)明的組合物可以為適合口服使用的形式(例如片劑、錠劑(lozenge)、硬或軟膠囊、水性或油性混懸劑、乳劑、可分散的粉劑或顆粒劑、糖漿或酏劑)，用于局部使用的(例如霜劑、膏劑、凝膠，或水性或油性溶液或混懸劑)，通過吸入施用的(例如精細粉碎的粉劑或液體氣霧劑)，通過吹入施用的(例如精細粉碎的粉劑)或用于腸胃外施用的(例如用于靜脈內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥的滅菌水性或油性溶液或作為用于直腸給藥的栓劑)。
本發(fā)明組合物可以通過常規(guī)的方法使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)的藥物賦形劑獲得。因此，目的用于口服使用的組合物可以含有例如一種或多種著色劑、甜味劑、增香劑和/或防腐劑。
合適的用于片劑劑型的可藥用賦形劑包括例如惰性的稀釋劑，例如乳糖、碳酸鈉、磷酸鈣或碳酸鈣，制粒和崩解劑例如玉米淀粉或algenic酸；粘合劑例如淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉；防腐劑例如對羥基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧化劑，例如抗壞血酸。片劑劑型可以為未包衣的或包衣的，以修飾它們的崩解和隨后活性成分在胃腸道之內(nèi)的吸收，或改善它們的穩(wěn)定性和/或外觀，在各種情況下，使用在本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)包衣劑和方法。
用于口服使用的組合物可以以硬明膠膠囊的形式，其中將活性成分與惰性的固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或為軟明膠膠囊，其中將活性成分與水或油例如花生油、液體石蠟、大豆油、椰子油或優(yōu)選的橄欖油或任何其它可接受的介質(zhì)混合。
水性混懸劑一般說來含有精細粉碎形式的活性成分與一種或多種下列試劑懸浮劑，例如羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散劑或增濕劑，例如卵磷脂或亞烷基氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如聚氧亞乙基硬脂酸酯)，或氧化乙烯與長鏈脂肪族醇的縮合產(chǎn)物，例如十七碳亞乙基氧基十六烷醇，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧亞乙基山梨糖醇單油酸酯，或氧化乙烯與長鏈脂肪族醇的縮合產(chǎn)物例如十七碳亞乙基氧基十六烷醇，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧亞乙基山梨糖醇單油酸酯，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚亞乙基脫水山梨糖醇單油酸酯。水性混懸劑還可以含有一種或多種防腐劑(例如對羥基苯甲酸乙酯或丙酯、抗氧化劑(例如抗壞血酸)、著色劑、增香劑和/或甜味劑(例如蔗糖、糖精或天冬甜素)。
油性混懸劑可以通過將活性成分懸浮在植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或在礦物油(例如液體石蠟)中配制。油性混懸劑還可以含有增稠劑例如蜂蠟、硬石蠟或十六烷基醇。甜味劑例如上文列出的那些，可以加入增香劑以提供適口的口服制劑。這些組合物可以通過加入抗氧化劑例如抗壞血酸保存。
可分散的或凍干的粉劑和顆粒劑適合用于制備水性混懸劑或溶液，通過加入水而實現(xiàn)，一般說來含有與活性成分一起的分散劑或增濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑。合適的分散劑或增濕劑和懸浮劑通過上文已經(jīng)提及的那些示例說明。還可以存在另外的賦形劑例如甜味劑、增香劑和著色劑。
本發(fā)明的藥物組合物還可以以水包油乳劑的形式。油相可以為植物油例如橄欖油或花生油，或礦物油例如液體石蠟或任何這些的混合物。合適的乳化劑可以為例如天然存在的膠質(zhì)，例如阿拉伯樹膠或西黃蓍膠，天然存在的磷脂例如大豆油、卵磷脂、來自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯或偏酯(例如脫水山梨糖醇單油酸酯)，和所述的偏酯與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物例如聚氧亞乙基脫水山梨糖醇單油酸酯。該乳劑還可以含有甜味劑、增香劑和防腐劑。
糖漿和酏劑可以用甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、天冬甜素或蔗糖配制，還可以含有緩和劑、防腐劑、增香劑和/或著色劑。
藥物組合物還可以為滅菌可注射的水性或油性混懸劑、溶液，乳劑或特定的系統(tǒng)形式，其可以根據(jù)已知的方法使用一種或多種上文提及的適當(dāng)?shù)姆稚┗蛟鰸駝┖蛻腋┡渲?。滅菌可注射的制劑還可以為在無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑例如聚乙二醇溶液中的滅菌可注射的溶液或混懸劑。
栓劑劑型可以通過將活性成分與合適的非刺激性賦形劑混合制備，所述賦形劑在通常溫度下是固體，但是在直腸溫度下是液體，因此在直腸熔化釋放藥物。合適的賦形劑包括例如可可油和聚乙二醇類。
局部劑型例如霜劑、膏劑、凝膠和水性或油性溶液或混懸劑，一般說來可以通過將活性成分與常規(guī)的、局部可接受的介質(zhì)或稀釋劑使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法配制獲得。
通過吹入施用的組合物可以為精細粉碎的粉劑形式，含有的微粒平均直徑例如為30μm或更小，優(yōu)選5μm或更小，更優(yōu)選在5 μm和1μm之間，粉劑本身單獨包含活性成分，或者用一種或多種生理學(xué)可接受的載體例如乳糖稀釋。然后用于吹入的粉劑方便地保留在膠囊中，例如1至50mg活性成分用于渦輪吸入器設(shè)備使用，例如用于吹入已知的試劑色甘酸鈉。
通過吸入施用的組合物可以為常規(guī)的壓力氣霧劑形式，用于將活性成分或者分配為含有精細粉碎固體或液體小滴的氣霧劑。常規(guī)的氣霧劑推進劑例如可以使用揮發(fā)性的氟代烴或烴，氣霧劑設(shè)備方便地用于分配計量數(shù)量的活性成分。
對于劑型的更多信息，請讀者參考Comprehensive MedicinalChemistry(Corwin Hansch；編委會主席)，Pergamon Press 1990的第五卷的25.2章。
因此在本發(fā)明進一步的方面，提供用于治療的式(I)化合物或其可藥用鹽。進一步提供用作藥物的式(I)化合物或其可藥用鹽。本發(fā)明其它方面提供式(I)化合物或其可藥用鹽用作治療過度增生疾病例如癌癥，和特別地用于治療結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤的任何一項或任何組合的藥物。
此外，提供式(I)化合物或其可藥用鹽用于通過治療用于治療溫血動物例如人的方法。在本發(fā)明的其它方面提供用于治療過度增生疾病例如癌癥，和特別地治療結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤的任何一項或任何組合的方法的式(I)化合物或其可藥用鹽。
在本發(fā)明的另一方面，提供式(I)化合物或其可藥用鹽用于制備治療疾病藥物的用途，其中抑制一種或多種aurora激酶是有益的。特別地設(shè)想aurora A激酶和/或aurora B激酶的抑制可能是有益的。優(yōu)選aurora B激酶的抑制是有益的。在本發(fā)明的另一方面，提供式(I)化合物或其可藥用鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療過度增生疾病例如癌癥，和特別地治療結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤的任何一項或任何組合。
根據(jù)另一方面，提供用于治療患有疾病的人的方法的式(I)化合物或其可藥用鹽，在所述疾病中抑制一種或多種aurora激酶是有益的，包含對需要治療的人施用治療有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽。特別地設(shè)想抑制aurora A激酶和/或aurora B激酶可能是有益的。優(yōu)選抑制aurora B激酶是有益的。進一步提供用于治療患有過度增生疾病例如癌癥，和特別地患有結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤的任何一項或任何組合的人的式(I)化合物或其可藥用鹽，包含給需要治療的人施用治療有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽的步驟。式(I)化合物或其可藥用鹽在治療上文描述的人的任何方法中的用途還構(gòu)成本發(fā)明的方面。
在本發(fā)明進一步的方面，提供治療患有疾病的人的方法，在所述疾病中抑制一種或多種aurora激酶是有益的，包含對需要治療的人施用治療有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽的步驟。
特別地設(shè)想抑制aurora A激酶和/或aurora B激酶可能是有益的。優(yōu)選抑制aurora B激酶是有益的。進一步提供治療患有過度增生疾病例如癌癥和特別地患有結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤的任何一項或任何組合的人的方法，包含給需要治療的人施用治療有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽的步驟。
對于上述提及的治療用途，施用的劑量將隨著采用的化合物、施用方式、所需治療、適應(yīng)病癥和動物或患者的年齡和性別等變化。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)眾所周知的藥物原理計算劑量的大小。
在式(I)化合物用于治療或預(yù)防的目的時，一般說來施用的日劑量范圍為例如接受0.05mg/kg至50mg/kg體重(和特別地0.05mg/kg至15mg/kg體重)，如果需要則給予分開的劑量。通常當(dāng)采用腸胃外途徑時施用較低的劑量。因此，例如對于靜脈內(nèi)施用，劑量范圍例如一般使用0.05mg/kg至25mg/kg體重(和特別地0.05mg/kg至15mg/kg體重)。類似地，通過吸入施用的劑量范圍將使用例如0.05mg/kg至25mg/kg體重(和特別地0.05mg/kg至15mg/kg體重)。
本文定義的治療可以為應(yīng)用為單獨的治療，或可以除本發(fā)明的化合物外包括常規(guī)的外科手術(shù)或放療或化療。這樣的化療可以包括一種或多種下列種類的抗腫瘤藥劑 (i)用于醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)的其它抗增生/抗腫瘤藥物和其組合，例如烷基化試劑(例如順鉑、奧沙利鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、氮芥、美法蘭、苯丁酸氮芥、白消安、替莫唑胺和亞硝基脲)；抗代謝物(例如吉西他濱，和抗葉酸劑例如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨喋呤、阿糖胞苷和羥基脲)；抗腫瘤抗生素(例如蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素、博來霉素、多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達比星、絲裂霉素-C、放線菌素D和普卡霉素)；抗有絲分裂劑(例如長春花生物堿，如長春新堿、長春堿、長春酰胺和長春瑞濱和紫杉烷類如紫杉醇和紫杉特爾和polokinase抑制劑)；和拓撲異構(gòu)酶抑制劑(例如鬼臼乙叉苷毒素，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康和喜樹堿)； (ii)細胞生長抑制劑例如抗雌激素藥(例如他莫昔芬、氟維司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、雌激素受體向下調(diào)節(jié)劑(例如fulvestratrant)、抗雄激素藥(例如比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特和醋酸環(huán)丙孕酮)、LHRH拮抗劑或LHRH激動劑(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑、來曲唑、vorazole和依西美坦)和5α-還原酶抑制劑例如非那司提； (iii)抗侵入藥物(例如c-Src激酶家族抑制劑，如4-(6-氯-2，3-亞甲基二氧基苯氨基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氫吡喃-4-基氧基喹唑啉(AZD0530；國際專利申請WO 01/94341)和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-羧酰胺(dasatinib、BMS-354825；J.Med.Chem.，2004，47，6658-6661)，和金屬蛋白酶抑制劑，如馬馬司他，尿激酶纖溶酶原活化劑受體功能抑制劑或類肝素酶抗體)； (iv)生長因子功能抑制劑，例如這樣的抑制劑包括生長因子抗體、生長因子受體抗體(例如抗-erbB2抗體曲妥單抗[HerceptinTM]、抗-EGFR抗體panitumumab、抗-erbB1抗體西妥昔單抗[Erbitux，C225]和任何通過Stern等在oncology/haematology2005，54卷，11-29頁關(guān)鍵綜述公開的生長因子或生長因子受體抗體；這樣的抑制劑還包括酪氨酸激酶抑制劑，例如表皮生長因子家族抑制劑(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制劑，例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(gefitinib，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(erlotinib，OSI-774)和6-丙烯基酰胺-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-嗎啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI 1033)，erbB2酪氨酸激酶抑制劑例如lapatinib，肝細胞生長因子家族抑制劑，血小板衍生的生長因子家族抑制劑例如imatinib，絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑(例如Ras/Raf信號抑制劑，例如法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，例如sorafenib(BAY 43-9006))，通過MEK和/或AKT激酶的細胞信號抑制劑，肝細胞生長因子家族抑制劑，c-kit抑制劑、abl激酶抑制劑、IGF受體(類胰島素生長因子)激酶抑制劑；aurora激酶抑制劑(例如PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑例如CDK2和/或CDK4抑制劑； (v)抗血管生成劑，例如抑制血管內(nèi)皮生長因子作用的那些(例如抗血管內(nèi)皮細胞生長因子抗體貝伐單抗[AvastinTM]，和VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑，例如4-(4-溴-2-氟苯氨基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO 01/32651之內(nèi)的實施例2)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO00/47212之內(nèi)的實施例240)，vatalanib(PTK787；WO 98/35985)和SU11248(sunitinib；WO 01/60814)，例如那些在國際專利申請WO 97/22596，WO 97/30035，WO 97/32856和WO 98/13354中公開的化合物，和通過其它機制起效的化合物(例如利諾胺，整聯(lián)蛋白αvβ3功能抑制劑和血管他汀)； (vi)血管損傷劑例如考布他汀A4和在國際專利申請WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公開的化合物； (vii)反義治療，例如導(dǎo)向上文所列靶標的那些，例如ISIS 2503，為抗-ras反義的； (viii)基因治療方法，包括例如替換異常基因例如異常的p53或異常的BRCA1或BRCA2，GDEPT(基因?qū)虻拿盖八幹委?的方法，例如在胞嘧啶脫氨基酶、胸腺嘧啶脫氧核苷激酶或細菌硝基還原酶酶中使用的那些，和增加患者對化療或放療耐受性的方法，例如多-藥物耐受癥基因治療； (ix)免疫療法，包括例如離體(ex-vivo)和體內(nèi)方法，以增加患者腫瘤細胞免疫原性，例如用細胞因子例如白介素2、白介素4或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子轉(zhuǎn)染，降低T細胞應(yīng)變力缺乏的方法，使用轉(zhuǎn)染免疫細胞的方法，例如細胞因子轉(zhuǎn)染的樹突細胞的方法，使用細胞因子轉(zhuǎn)染腫瘤細胞系的方法和使用抗個體基因型抗體的方法。
此外，本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽，可以與一種或多種細胞周期抑制劑聯(lián)合使用。特別地與抑制bub1、bubR1或CDK的細胞周期抑制劑聯(lián)合使用。
這樣的聯(lián)合治療可以通過同時、相繼或分離給予治療的單個成分的方式實現(xiàn)。這樣的組合產(chǎn)物采用在本文描述的劑量范圍之內(nèi)的本發(fā)明化合物，其它藥物活性試劑在其被批準的劑量范圍之內(nèi)。
除它們在治療藥物的用途外，式(I)化合物和其可藥用鹽還可用作藥理學(xué)工具，用于在實驗動物例如貓、狗、兔子、猴、大鼠和小鼠中評價細胞周期活性抑制劑作用的體外和體內(nèi)實驗系統(tǒng)的開發(fā)和標準化，所述實驗用于尋找新的治療劑。
在上述其它藥物組合物、過程、方法、用途和藥物制備特征中，還可應(yīng)用本文描述的本發(fā)明的化合物可選擇的和優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明的化合物抑制aurora激酶的絲氨酸-蘇氨酸激酶活性，特別地抑制aurora A激酶和/或aurora B激酶的活性，因此抑制細胞周期和細胞增生。抑制aurora B激酶的化合物是特別感興趣的?；衔镌谀退幮约毎幸彩腔钚缘模哂杏欣奈锢硇再|(zhì)。這些性質(zhì)可以例如使用下文方法列出的一種或多種評價。
(a)體外aurora A激酶抑制實驗 該分析確定試驗化合物抑制絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的能力。編碼aurora A的DNA可以通過基因全合成或通過克隆獲得。然后該DNA可以在合適的表達系統(tǒng)表達以獲得具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的多肽。在aurora A的情況下，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從cDNA分離編碼序列，克隆到桿狀病毒表達載體pFastBac HTc(GibcoBRL/Life technologies)的BamH1和Not1限制性核酸內(nèi)切酶位點。5′PCR引物含有限制性核酸內(nèi)切酶BamH1 5′對aurora A編碼序列的識別序列。這使得aurora A基因插入到帶有6個組氨酸殘基、間隔區(qū)和由pFastBac HTc載體編碼的rTEV蛋白酶裂解位點的框架中。3′PCR引物用另外的編碼序列替換aurora A停止密碼子，所述另外的編碼序列之后是停止密碼子和限制性核酸內(nèi)切酶not1識別序列。這另外的編碼序列(5′TAC CCA TAC GAT GTT CCAGAT TAC GCT TCT TAA 3’)編碼多肽序列YPYDVPDYAS。該序列來自流行性感冒血凝素蛋白，經(jīng)常用作標簽抗原決定部位序列，可以使用特定的單克隆抗體識別。重組pFastBac載體因此編碼N-末端6 his標記的、C末端流行性感冒血凝素抗原決定部位標記的Aurora-A蛋白。重組DNA分子組裝的方法可以在標準文本中發(fā)現(xiàn)，例如Sambrook等1989，Molecular Clonmg-A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory press and Ausubel等1999，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons Inc.。
重組病毒的制備可以按照來自GibcoBRL生產(chǎn)商的方案完成。
簡而言之，將帶有aurora A基因的pFastBac-1載體轉(zhuǎn)移到含有桿狀病毒基因組(bacmid DNA)的E.coli DH10Bac細胞中，通過細胞移位活動，將含有慶大霉素耐藥基因的pFastBac載體和包括桿狀病毒多角體蛋白啟動子的aurora A基因直接換位到bacmid DNA中。通過選擇慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素和X-gal，得到編碼aurora A的含有重組bacmidDNA的空白克隆。從幾種BH10Bac空白克隆的小批量培養(yǎng)基中萃取BacmidDNA，按照生產(chǎn)商的教導(dǎo)轉(zhuǎn)染到使用細胞FECTIN試劑(GibcoBRL)含有10％血清的TC100介質(zhì)(GibcoBRL)中生長的Spodoptera frugiperda Sf21細胞中。通過收集轉(zhuǎn)染72小時后細胞培養(yǎng)基介質(zhì)收獲病毒微粒。將0.5ml介質(zhì)用于感染100ml含有1×107細胞/ml的Sf21s培養(yǎng)基懸浮液。在感染48小時后收獲細胞培養(yǎng)基介質(zhì)，使用標準的斑塊分析方法確定病毒效價。使用備用病毒感染Sf9和“High 5”細胞至感染多重度(MOI)為3，以確定重組aurora A蛋白的表達。
為了大批量表達aurora A激酶活性，將Sf21昆蟲細胞在補充有10％胎牛血清(Viralex)和0.2％F68聚醚(Sigma)的TC100介質(zhì)中在Wheaton搖床上在3r.p.m.在28℃培養(yǎng)。當(dāng)細胞密度達到1.2×106細胞ml-1時，將它們用斑塊-純(plaque-pure)的aurora A重組病毒在感染多重度為1下感染，48小時后收獲。所有的隨后純化步驟在4℃完成。將含有總數(shù)2.0×108個細胞的冷凍昆蟲細胞小球熔化，用溶解緩沖液(25mMHEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸])，pH7.4在4℃，100mM KCl，25mM NaF，1mM Na3VO4，1mM PMSF(苯基甲基磺酰基氟化物)，2mM2-巰基乙醇，2mM咪唑，1μg/ml抑肽酶，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，1μg/ml亮肽素)稀釋，使用1.0ml每3×107細胞。使用dounce均質(zhì)器實施溶解，隨后將裂解物在41,000g離心35分鐘。將吸出的上清液泵到含有500μl Ni NTA(nitrilo-tri-乙酸)瓊脂糖(Qiagen，產(chǎn)品號30250)的5mm直徑色譜柱上，該柱已經(jīng)用溶解緩沖液平衡。在用12ml溶解緩沖液洗滌柱，隨后用7ml洗滌緩沖液(25mM HEPES pH7.4在4℃，100mM KCl，20mM咪唑，2mM 2-巰基乙醇)洗滌后，達到洗脫液的UV吸收水平基線水平。使用洗脫緩沖液(25mM HEPES pH7.4在4℃，100mM KCl，400mM咪唑，2mM 2-巰基乙醇)將結(jié)合的aurora A蛋白從柱上洗脫。收集對應(yīng)于UV吸收峰的洗脫部分(2.5ml)。將含有活性auroraA激酶的洗脫部分再次在透析緩沖液(25mM HEPES pH7.4在4℃，45％甘油(v/v)，100mM KCl，0.25％Nonidet P40(v/v)，1mM二硫代蘇糖醇)中充分滲析。
將每批新的aurora A酶通過用酶稀釋劑(25mM Tris-HCl pH7.5，12.5mM KCl，0.6mM DTT)稀釋滴定分析。對于典型的批次(Upstate提供)，備用酶用酶稀釋劑稀釋1μm每ml，每個分析孔使用20μl稀釋酶。用水稀釋實驗化合物(10mM在二甲亞砜(DMSO)中)，將10μl稀釋的化合物轉(zhuǎn)移到分析板的孔中?！巴耆焙汀翱瞻住睂φ湛缀?.5％DMSO而不是化合物。將20微升新鮮稀釋的酶加入到所有的孔中，除了“空白”孔外。將20微升酶稀釋劑加入到“空白”孔中。然后將20微升含有0.2μCi[γ33P]ATP(Amersham Pharmacia，特定活性≥2500Ci/mmol)的反應(yīng)混合物(25mM Tris-HCl，78.4mM KCl，2.5mM NaF，0.6mM二硫代蘇糖醇，6.25mM MnCl2，25mM ATP，7.5μM肽底物[生物素-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG])加入到所有的實驗孔中引發(fā)反應(yīng)。將板在室溫培養(yǎng)60分鐘。向所有的孔中加入100μl 20％v/v正磷酸停止反應(yīng)。使用96-孔板收集器(TomTek)將肽底物捕獲在正電荷硝基纖維素P30過濾墊(Whatman)上，然后用β板計數(shù)器分析33P的結(jié)合。“空白”(無酶)和“完全”(無化合物)對照值用于確定試驗混合物的稀釋范圍，給出抑制酶活性50％的值(IC50值)。本發(fā)明的化合物一般給出IC50值為0.1nM至5μM。
(b)體外aurora B激酶抑制實驗 該分析確定實驗化合物抑制絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的能力。通過全基因合成或通過克隆可以獲得編碼aurora的DNA。然后可將該DNA表達在合適的表達系統(tǒng)以獲得有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的多肽。在aurora B的情況下，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從cDNA分離編碼序列，以與上文對aurora A的描述類似的方式克隆到pFastBac系統(tǒng)中(即直接表達6-組氨酸標記的aurora B蛋白)。
為了大量表達aurora B激酶活性，將Sf21昆蟲細胞在用10％胎牛血清(Viralex)和0.2％F68 Pluronic(Sigma)補充的TC100介質(zhì)中在28℃在Wheaton搖床上在3r.p.m培養(yǎng)。當(dāng)細胞密度達到1.2×106細胞ml-1時，將它們用斑塊-純的aurora B重組病毒在感染多重度為1下感染，48小時后收獲。所有隨后的純化步驟在4℃完成。將含有總數(shù)2.0×108細胞的冷凍昆蟲細胞小球熔化，用溶解緩沖液(50mM HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸])，pH7.5在4℃，1mM Na3VO4，1mM PMSF(苯基甲基磺?；?，1mM二硫代蘇糖醇，1μg/ml抑肽酶，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，1μg/ml亮肽素)稀釋，使用1.0ml每2×107細胞。使用超聲均質(zhì)器實現(xiàn)溶解，隨后將裂解物在41,000g離心35分鐘。將吸出的上清液泵到含有1.0ml CM高流速瓊脂糖(Sepharose FastFlow)(Amersham Pharmacia Biotech)的5mm直徑色譜柱上，該柱已經(jīng)在溶解緩沖液中平衡。在用12ml溶解緩沖液洗滌柱，隨后用7ml洗滌緩沖液(50mM HEPES pH7.4在4℃，1mM二硫代蘇糖醇)洗滌后，洗脫液的UV吸收達到基線水平。使用梯度洗脫緩沖液(50mM HEPES pH7.4在4℃，0.6M NaCl，1mM二硫代蘇糖醇，從0％洗脫緩沖液至100％洗脫緩沖液，在0.5ml/min流速下經(jīng)歷15分鐘)從柱中洗脫結(jié)合的aurora B蛋白。收集對應(yīng)于UV吸收峰的洗脫部分(1.0ml)。將洗脫部分對透析緩沖液(25mM HEPES pH7.4在4℃，45％甘油(v/v)，100mM KCl，0.05％(v/v)IGEPAL CA630(Sigma Aldrich)，1mM二硫代蘇糖醇)再次充分滲析。分析滲析部分的aurora B激酶活性。
通過在50mM Tris-HCl pH7.5，0.1mM EGTA，0.1％2-巰基乙醇，0.1mM vandate鈉，10mM乙酸鎂，含有0.1mg/ml GST-INCENP[826-919]的0.1mM ATP中在30℃活化aurora B(5μM)30分鐘制備Aurora B-INCENP酶(Upstate提供)。
將每批新的aurora B-INCENP酶通過用酶稀釋劑(25mM Tris-HClpH7.5，12.5mM KCl，0.6mM DTT)稀釋滴定分析。對于典型的批次，備用酶用酶稀釋劑稀釋1∶40，每個分析孔使用20μl稀釋酶。用水稀釋實驗化合物(10mM在二甲亞砜(DMSO)中)，將10μl稀釋的化合物轉(zhuǎn)移到分析板的孔中。“完全”和“空白”對照孔含有2.5％DMSO而不是化合物。將20微升新鮮稀釋的酶加入到所有的孔中，除了“空白”孔外。將20微升酶稀釋劑加入到“空白”孔中。然后將含有0.2μCi[γ33P]ATP(Amersham Pharmacia，特異活性≥2500Ci/mmol)的20微升反應(yīng)混合物(25mM Tris-HCl，12.7mM KCl，2.5mM NaF，0.6mM二硫代蘇糖醇，6.25mM MnCl2，15mM ATP，6.25μM肽底物[生物素-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]))加入到所有的實驗孔中引發(fā)反應(yīng)。將板在室溫下培養(yǎng)60分鐘。向所有的孔中加入100μl 20％v/v正磷酸停止反應(yīng)。使用96-孔板收集器(TomTek)將肽底物捕獲在正電荷硝基纖維素P30過濾墊上，然后用β板計數(shù)器分析33P的結(jié)合?！翱瞻住?無酶)和“完全”(無化合物)對照值用于確定試驗混合物的稀釋范圍，給出抑制酶活性50％的值(IC50值)。本發(fā)明的化合物一般給出IC50值為0.05至10nM。特別地，化合物1給出IC50 0.5nM，化合物2為0.5nM和化合物3為0.1nM。
(c)體外細胞表型和底物磷酸化分析 該分析用于確定化合物體外對SW620人結(jié)腸腫瘤細胞的作用?；衔锏湫偷貙?dǎo)致磷組蛋白H3水平抑制，和細胞核面積的增加。
將每孔104 SW620細胞植入在costar 96孔板中的100μl DMEM介質(zhì)(含有10％FCS和1％谷氨酰胺)(DMEM為Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium(Sigma D6546))中，在37℃和5％CO2中放置過夜至粘附。然后將細胞用在介質(zhì)中稀釋(每個孔中加入50μl中得到0.00015μ-1μM化合物濃度)的化合物給藥，在用化合物處理24小時后，固定細胞。
首先使用光學(xué)顯微鏡檢查細胞，記錄細胞任何的形態(tài)學(xué)變化。然后加入100μl 3.7％甲醛到每個孔，將板在室溫放置至少30分鐘。在紙巾上潷析和輕敲板除去固定液，然后使用自動板洗滌器將板在PBS(Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液鹽水(Sigma D8537))中洗滌一次。加入100μl PBS和0.5％triton X-100，將板放在混合器上5分鐘。將板在100μlPBS中洗滌，溶液輕敲除去。加入在PBS 1％BSA(牛血清白蛋白)和0.5％吐溫中的50μl原始抗體，1∶500兔子抗-磷組蛋白H3。從UpstateBiotechnology購買抗磷組蛋白H3兔子多克隆06-750。將板在室溫下在混合器中放置1小時。
第二天，將抗體倒干凈，將板用PBS洗滌兩次。在單位面積中，加入在PBS 1％BSA，0.5％吐溫中的50μl第二抗體，1∶10,000 Hoechst和1∶200 Alexa Fluor 488山羊抗兔子IgGA(貨號11008分子探針)。將板包裹在錫箔薄片中，在室溫下?lián)u動1小時。將抗體倒干凈，用PBS洗滌板兩次。每個孔加入200μl PBS，將板搖動10分鐘，除去PBS，向每個孔中加入100μl PBS，并將板密封等待分析。使用陣列掃描靶標活化算法(Arrayscan Target Activation algorithm)測定磷組蛋白H3的細胞水平和核面積變化完成分析。結(jié)果報導(dǎo)為要求得到磷組蛋白H3水平50％抑制的有效濃度，和類似地細胞核面積50％增加的有效濃度(EC50值)。本發(fā)明的化合物一般給出磷組蛋白H3水平抑制的EC50值為0.5nM至0.1μM。特別地化合物1的IC50為5.5nM，化合物2的為2nM和化合物3的為2nM。
(d)體外耐藥細胞表型和底物磷酸化分析。
該分析用于體外確定化合物對耐藥性MCF7-ADR人乳腺腫瘤細胞的細胞作用。
將MCF7細胞用多劑量adriomycin預(yù)處理(Dr.Hickinson，MolecularOncology lab，ICRF，University of Oxford Institute of Molecular Medicine，Headington，Oxford)，該方法導(dǎo)致細胞過度表達耐藥蛋白。化合物典型地導(dǎo)致磷組蛋白H3水平的抑制，和治療細胞核面積的增加。但是，如果化合物是過度表達的流出蛋白的底物，它們將會比在以前的SW620分析中出現(xiàn)更小的活性。
將每孔0.8×104 MCF7-ADR細胞植入在100μl DMEM介質(zhì)(含有10％FCS(胎牛血清)和1％谷氨酰胺)中的costar 96孔板中，在37℃和5％CO2過夜至粘附。
所有其它的方法與上述使用SW620細胞分析的那些相同。
本發(fā)明的化合物一般具有抑制磷組蛋白H3EC50值水平為0.5nM至0.1μM。特別地化合物1給出IC50值17nM，化合物2為20nM和化合物3為4nM。
本發(fā)明現(xiàn)在以下列實施例舉例說明，除非另外說明，其中化學(xué)技術(shù)人員已知的標準技術(shù)和與在這些實施例中描述的那些類似的技術(shù)可以在適當(dāng)?shù)牡胤讲捎? (i)通過在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)完成蒸發(fā)，在通過過濾除去殘余固體例如干燥劑后完成后處理步驟； (ii)在環(huán)境溫度，典型地在18-25℃范圍下，操作在空氣中進行，除非另外指明，或除非技術(shù)人員特別要在惰性氣氛例如氬氣下進行； (iii)柱色譜法(通過快速方法)和中壓液相色譜法(MPLC)在Merck Kiesel凝膠硅膠(Art.9385)上完成 (iv)給出的產(chǎn)率僅僅是舉例說明，不必需是可獲得的最大量； (v)式(I)最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)一般通過核(一般是質(zhì)子)磁共振(NMR)和質(zhì)譜技術(shù)確證，質(zhì)子磁共振化學(xué)位移值使用下列4種儀器的一種在氘代二甲亞砜(DMSO d6)(除非另外指明)以δ量度(從四甲基甲硅烷以下場(downfield)的ppm)測定 -Varian Gemini 2000光譜儀，在場強度300MHz下操作 -Bruker DPX300光譜儀，在場強度300MHz下操作 -JEOL EX 400光譜儀，在場強度400 MHz下操作 -Bruker Avance 500光譜儀，在場強度500MHz下操作峰多重性顯示如下s，單峰；d，雙峰；dd，雙二重峰；t，三重峰；q，四重峰；qu，五重峰；m，多重峰；br s，寬單峰； (vi)自動機械合成(robotic synthesis)使用Zymate XP機器人完成，通過Zymate Master實驗工作站加入溶液，通過Stem RS5000反應(yīng)-工作站在25℃攪拌； (vii)從自動機械合成得到的反應(yīng)混合物的后處理和純化完成如下蒸發(fā)在真空下使用Genevac HT 4完成；柱色譜法使用或者硅膠上的AnachemSympur MPLC系統(tǒng)或者是使用直徑27mm用Merck硅膠(60μm，25g)填充的柱子完成；最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過LCMS(液相色譜質(zhì)譜)在Waters2890/ZMD微質(zhì)譜系統(tǒng)使用下列條件確證，保留時間(RT)以分鐘給出 柱 waters symmetry C183.5μm 4.6×50mm 溶劑A H2O 溶劑B CH3CN 溶劑C MeOH+5％HCOOH 流速2.5ml/min 運行時間5分鐘，4.5分鐘從0-100％C的梯度 波長254nm，帶寬10nm 質(zhì)量檢測器 ZMD微質(zhì)譜 注射體積 0.005ml (viii)對于沒有用自動機械合成制備化合物的分析的LCMS在WatersAlliance HT系統(tǒng)完成，使用下列條件，保留時間(RT)以分鐘給出 柱 2.0mm×5Gm Phenomenex Max-RP 80A 溶劑A 水 溶劑B 乙腈 溶劑C 甲醇/1％甲酸或水/1％甲酸 流速1.1ml/min 運行時間5分鐘，4.5分鐘從0-95％B+常數(shù)5％溶劑C的梯度 波長254nm，帶寬10nm 注射體積 0.005ml 質(zhì)量檢測器 Micromass ZMD (ix)制備型的高效液相色譜法(HPLC)或者完成如下 -Waters制備型的LCMS儀器，以分鐘測定保留時間(RT) 柱β-堿性Hypercil(21×100mm)5μm 溶劑A 水/0.1％碳酸銨 溶劑B 乙腈 流速 25ml/min 運行時間 10分鐘，7.5分鐘從0-100％B梯度 波長 254nm，帶寬10nm 注射體積1-1.5ml 質(zhì)量檢測器Micromass ZMD，或者為 -Gilson制備型的HPLC儀器，用分鐘測定保留時間(RT) 柱21mm×15cm Phenomenex Luna2 C18 溶劑A 水+0.1％三氟乙酸， 溶劑B 乙腈+0.1％三氟乙酸 流速 21ml/min 運行時間 20分鐘，10分鐘從5-100％B變化的梯度 波長 254nm，帶寬10nm 注射體積0.1-4.0ml (x)中間體一般沒有全部表征，純度通過薄層色譜法(TLC)、HPLC、紅外(IR)、MS或NMR分析評價。
表1
實施例1表1中化合物1-N(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-{[(2R)-1-甲基吡咯烷-2-基]甲氧基}喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺的制備 將N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(2R)-吡咯烷-2-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺(0.800g，1.53mmol)和甲醛(15ml37％水溶液)在甲酸(30ml)中的混合物在90℃加熱2.5小時。使得到的溶液冷卻至室溫，然后在真空下蒸發(fā)。殘余物用碳酸鈉在水(50ml)中的溶液(5％wt/v)處理，然后用含10％甲醇的二氯甲烷混合物萃取兩次。
將合并的萃取液用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)得到淡棕色固體，將其通過硅膠色譜法純化，用含2-5％甲醇的二氯甲烷混合物洗脫得到表1的化合物1，為無色固體(0.624g，76％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)10.28(s，1H)，10.11(s，1H)，8.45(s，1H)，8.28(s，1H)，7.72(m，1H)，7.57(s，1H)，7.20(m，2H)，6.75(d，1H)，6.52(d，1H)，5.16(s，2H)，4.43(dd，1H)，4.24(dd，1H)，4.1 8(q，2H)，3.16(m，1H)，2.56(m，1H)，2.37(s，3H)，2.27(q，1H)，2.02-1.93(m，1H)，1.85-1.62(m，3H)，1.39(t，3H). MS(+ve ESI)53 8(M+H)+ 實施例2表1中化合物2-N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(2R)-吡咯烷-2-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺的制備 在室溫下將三氟乙酸(8ml)一次加入攪拌中的(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.0g，3.21mmol)在二氯甲烷(30ml)中的溶液中。將得到的溶液在室溫下攪拌1小時，然后蒸發(fā)。殘余物用碳酸鈉在水(30ml)中的溶液(5％wt/v)處理，然后用含10％甲醇的二氯甲烷混合物萃取兩次。合并的有機部分用硫酸鎂干燥，然后蒸發(fā)得到灰白色固體，將其通過硅膠色譜法純化，用含有0-2％甲醇氨(7M)的含5％甲醇的二氯甲烷混合物洗脫得到表1的化合物2，為無色固體(1.35g，80％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)10.43(s，1H)，10.27(s，1H)，8.45(s，1H)，8.38(s，1H)，7.77(s，1H)，7.72(m，1H)，7.19(m，2H)，6.74(d，1H)，6.70(d，1H)，5.15(s，2H)，4.31(dd，1H)，4.17(q，2H)，3.93(t，1H)，3.63-3.57(m，1H)，2.96-2.81(m，3H)，1.91-1.83(m，1H)，1.80-1.63(m，2H)，1.50-1.42(m，1H)，1.38(t，3H).MS(+ve ESI)524(M+H)+ 用作原料的(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制備如下所述 a)將5，7-二氟喹唑啉-4(3H)-酮(2.0g，11.0mmol)(參見Hennequin，Laurent Francois Andre；Ple，Patrick.Preparation of 4-anilinoquinazolinederivatives for the treatment of tumors.PCT Int.Appl.WO01/094341)和乙醇鈉(3.7g，54.4mmol)在二甲基甲酰胺中的溶液在90℃加熱6小時。使該混合物冷卻至室溫，然后傾入到氯化銨(100ml)溶液中。過濾得到的沉淀，用水洗滌，然后在高真空下干燥得到5，7-二乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮(1.36g，53％產(chǎn)率) MS(+ve ESI)235(M+H)+ b)將5，7-二乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮(0.700g，2.99mmol)和甲醇鈉(2.66ml 28％w/v甲醇溶液，13.8mmol)在二甲基甲酰胺(7ml)中的溶液在110℃加熱18小時。使混合物冷卻至室溫，然后通過加入濃鹽酸調(diào)為酸性，然后通過制備型的hplc(C18硅膠柱)純化，用在水(0.2％三氟乙酸)中的梯度乙腈(0.2％三氟乙酸)洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分，通過加入固體碳酸氫鈉調(diào)至堿性，然后在真空下濃縮。過濾得到的沉淀，用水洗滌，隨后用乙腈洗滌，然后用乙醚洗滌，最終空氣干燥得到7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(0.1 98g，30％產(chǎn)率) 1NMR(DMSO d6)7.94(s，1H)，6.64(s，1H)，6.53(s，1H)，4.15(q，2H)，3.83(s，3H)，1.37(t，3H). MS(+ve ESI)221(M+H)+ c)將三氯氧磷(4.76g，31.0mmol)加入到7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(2.0g，9.1mmol)和二-異丙基乙基胺(4.26g，33.0mmol)在1，2-二氯乙烷(50ml)中的混合物中。將混合物在80℃加熱6小時。使混合物冷卻至室溫，然后在真空下蒸發(fā)。將殘余物在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉溶液之間分配。
分離有機層，用硫酸鎂干燥，然后在真空下蒸發(fā)。粗產(chǎn)物通過快速硅膠色譜法純化，用乙酸乙酯洗脫得到4-氯-7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉(2.0g，92％產(chǎn)率) MS(+ve ESI)23 9/24 1(M+H)+ d)將4-氯-7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉(1.90g，7.97mmol)和2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺(2.02g，8.01mmol)在2-丙醇(70ml)中的混合物在90℃加熱45分鐘。使反應(yīng)冷卻至室溫，然后用甲基叔丁基醚稀釋。過濾混合物得到N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺鹽酸鹽，為淡黃色固體(3.91g，100％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)10.63(s，1H)，10.44(s，1H)，8.81(s，1H)，8.35(s，1H)，7.95(s，1H)，7.69(m，1H)，7.22(m，2H)，6.95(d，1H)，6.90(d，1H)，5.21(s，2H)，4.24(q，2H)，4.14(s，3H)，1.43(t，3H). MS(+ve ESI)455(M+H)+ e)將N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-甲氧基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺(5.0g，10.2mmol)和吡啶鹽酸鹽(7.2g，62.3mmol)在吡啶(60ml)中的混合物在120℃加熱18小時。加入另一部分吡啶鹽酸鹽(4.0g，34.6mmol)，再繼續(xù)加熱24小時。將得到的溶液冷卻至室溫，然后在水(150ml)中淬滅。過濾得到的沉淀，用水洗滌，然后在高真空下干燥得到N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-羥基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺，為淡黃色固體(4.16g，93％產(chǎn)率) MS(+ve ESI)441(M+H)+ f)在室溫下分批將偶氮二羧酸二叔丁酯(1.25g，5.44mmol)加入到攪拌中的N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-羥基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺(2.0g，4.54mmol)、(2R)-2-(羥基甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(1.28g，6.37mmol)和三苯基膦(1.43g，5.46mmol)在四氫呋喃(30ml)中的懸浮液中。將混合物在室溫下攪拌2小時，然后加入另一部分的三苯基膦(0.700g，2.67mmol)和偶氮二羧酸二叔丁酯(0.600g，2.61mmol)。在室溫下攪拌混合物3小時，然后蒸發(fā)混合物。殘余物通過硅膠色譜法純化，用含2-5％甲醇的二氯甲烷混合物洗脫得到(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，為無色固體(2.25g，79％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)10.26(s，1H)，9.82(s)&9.52(s)(1H)，8.45(s，1H)，8.38(s，1H)，7.86(s，1H)，7.73(m，1H)，7.20(m，2H)，6.76(s，2H)，5.14(s，2H)，4.50-4.31(m，2H)，4.30-4.08(m，1H)，4.17(q，2H)，3.42-3.26(m，2H)，2.16-2.03(m，1H)，2.03-1.77(m，3H)，1.38(s，9H)，1.38(t，3H). MS(+ve ESI)624(M+H)+ 用作原料的2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺制備如下所述 a)將2，3-二氟苯胺(12.9g，100mmol)在乙醚(100ml)中的溶液用1M氫氧化鈉水溶液(98ml，98mmol)處理，并劇烈攪拌，在5℃同時經(jīng)20分鐘滴加氯乙酰氯(13.3g，117mmol)在乙醚(100ml)中的溶液。使混合物經(jīng)1小時升溫至20℃，然后加入乙酸乙酯(100ml)。分離有機相，用20％碳酸氫鉀水溶液洗滌，干燥，然后蒸發(fā)得到白色固體。將固體溶解在沸騰的四氫呋喃(20ml)中，然后用環(huán)己烷(300ml)和異己烷(100ml)稀釋。濃縮混合物至約250ml，冷卻和過濾得到2-氯-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺，為白色晶體(18.48g，90％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)10.26(br s，1H)，7.67(m，1H)，7.19(m，2H)，4.36(s，2H).MS(+ve ESI)206，204(M+H)+ b)將2-氯-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺(10.28g，50mmol)和4-溴吡唑(7 35g，50mmol)在二甲基乙酰胺(20ml)中的溶液用碳酸鉀(8.29g，60mmol)處理，在20℃在氮氣氛下攪拌18小時。將混合物傾入水(300ml)中，過濾并用水(500ml)洗滌固體，并空氣干燥。將固體溶解在沸騰的四氫呋喃(80ml)中，過濾，用環(huán)己烷(100ml)稀釋，然后蒸發(fā)至約100ml。得到的漿液用異己烷(100ml)稀釋，冷卻并過濾得到2-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺，為白色固體(13.09g，83％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)10.32(br s，1H)，8.00(s，1H)，7.70(m，1H)，7.59(s，1H)，7.19(m，2H)，5.14(s，2H). MS(+ve ESI)316，318(M+H)+ c)將2-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺(9.48g，30mmol)和(9，9-二甲基-9H-呫噸-4，5-二基)雙(二苯基膦)(1.74g，3mmol)在無水1，4-二烷(50ml)中的溶液用三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)(1.37g，1.5mmol)處理，將混合物在氮氣下攪拌5分鐘。一次加入二苯甲酮亞胺(5.7g，31.5mmol)，隨后加入叔丁醇鈉(8.64g，90mmol)。用氮氣使混合物脫氣，然后在氮氣下加熱至90℃ 4小時。將混合物冷卻，用乙醚(100ml)稀釋，然后傾入到飽和的氯化銨水溶液(100ml)中。通過硅藻土過濾混合物，然后分離各層。用硫酸鎂干燥有機相，濃縮為油狀物，用沸騰的環(huán)己烷(200ml，100ml)萃取兩次。蒸發(fā)環(huán)己烷溶液得到膠質(zhì)，將其從異己烷∶乙醚1∶1中結(jié)晶，得到N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(二苯基亞甲基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺，為淡黃色固體(5.50g，44％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)10.21(br s，1H)，7.66(m，3H)，7.56(m，3H)，7.44(m，3H)，7.35(s，1H)，7.24(m，2H)，7.18(m，2H)，6.48(s，1H)，4.98(s，2H). MS(+ve ESI)417(M+H)+ d)在室溫下將充分攪拌中的N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(二苯基亞甲基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺(2.08g，5mmol)在乙酸乙酯(25ml)中的溶液經(jīng)1分鐘逐滴加入37％鹽酸水溶液(0.496ml，6mmol)處理。將混合物攪拌1小時，然后過濾。殘余物用乙酸乙酯和乙醚洗滌，然后空氣干燥得到2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺鹽酸鹽，為白色粉末(1.35g，93％產(chǎn)率) 1H NMR(DMSO d6)10.48(s，1H)；10.22(br s，3H)；8.03(s，1H)；7.68(m，1H)；7.60(s，1H)；7.19(m，2H)；5.20(s，2H). MS(+ve ESI)253(M+H)+ e)將2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺鹽酸鹽(1.685g，5.84mmol)懸浮在乙酸乙酯(70ml)和飽和的碳酸氫鈉水溶液(35ml)的混合物中，然后攪拌1小時。分離澄清的各層，含水相用乙酸乙酯(4×30ml)洗滌。合并的有機溶液用硫酸鎂干燥，然后蒸發(fā)為固體，用乙醚洗滌得到2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺，為粉色固體(1.377g，94％)。
1H NMR(DMSO d6)10.06(br s，1H)；7.70(m，1H)；7.17(m，2H)；7.08(s，1H)；6.98(s，1H)4.90(s，2H)；3.84(br s，2H). MS(+ve ESI)253(M+H)+ 表1中的化合物2還制備如下 實施例2ii表1中的化合物2-N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(2R)-吡咯烷-2-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺的制備 將三氟乙酸(5ml)一次加入攪拌中的(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯鹽酸鹽(0.800g，1.21mmol)在二氯甲烷(20ml)中的懸浮液中。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，然后蒸發(fā)。將殘余物用碳酸鈉(5％wt/v)在水(40ml)中的溶液處理，然后用含10％甲醇的二氯甲烷混合物萃取。合并的有機部分用硫酸鎂干燥，然后蒸發(fā)得到淡黃色固體，通過硅膠色譜法純化，用含有0-2％甲醇氨(7M)的含5％甲醇的二氯甲烷混合物洗脫得到表1的化合物2，為無色固體(0.591g，93％) 1H-NMR(DMSO d6)10.43(s，1H)，10.27(s，1H)，8.45(s，1H)，8.38(s，1H)，7.77(s，1H)，7.72(m，1H)，7.19(m，2H)，6.74(d，1H)，6.70(d，1H)，5.15(s，2H)，4.31(dd，1H)，4.17(q，2H)，3.93(t，1H)，3.63-3.57(m，1H)，2.96-2.81(m，3H)，1.91-1.83(m，1H)，1.80-1.63(m，2H)，1.50-1.42(m，1H)，1.38(t，3H). MS(+ve ESI)524(M+H)+ 用作原料的(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯鹽酸鹽如下所述制備 a)向在冰/水浴冷卻的3，5-二氟苯酚(13.0g，0.10mol)和碳酸鉀(20.9g，0.15mol)在二甲基甲酰胺(200ml)中的溶液中加入硫酸二乙酯(13.1ml，0.10mol)。將混合物加熱至80℃1.5小時。加入另一部分的硫酸二乙酯(3.3ml，25mmol)和碳酸鉀(5.2g，37.5mmol)，混合物進一步加熱2小時。使得到的溶液冷卻至室溫，然后傾入到水中，然后用乙醚萃取兩次。合并的乙醚萃取液用水洗滌，用硫酸鎂干燥，然后蒸發(fā)得到1-乙氧基-3，5-二氟苯，為黃色油狀物(13.59g，86％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)6.77-6.65(m，3H)，4.06(q，2H)，1.32(t，3H).MS(+ve EI)158(M·+) b)在氮氣氛下在-78℃將正丁基鋰(13.5ml 1.6M己烷溶液，21.6mmol)滴加到攪拌中的1-乙氧基-3，5-二氟苯(3.42g，21.6mmol)在四氫呋喃(30ml)中的溶液中。將混合物在-78℃攪拌2小時，然后加入過量固體二氧化碳小球。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，將得到的溶液傾入到水中。通過加入氫氧化鈉水溶液將混合物調(diào)成堿性，然后用乙醚萃取混合物。分離混合物，通過加入稀鹽酸將水層調(diào)成酸性。用乙醚萃取混合物兩次。用水洗滌合并的乙醚萃取物，用硫酸鎂干燥，然后蒸發(fā)得到4-乙氧基-2，6-二氟苯甲酸，為無色固體(3.87g，89％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)13.36(br.s，1H)，6.82-6.76(m，2H)，4.11(q，2H)，1.33(t，3H). MS(+ve CI)203(M+H)+ c)將草酰氯(3.17ml，36.4mmol)滴加到攪拌中的4-乙氧基-2，6-二氟苯甲酸(3.5g，1 7.3mmol)和二甲基甲酰胺(5滴)在二氯甲烷(50ml)中的懸浮液中。將得到的溶液在室溫下攪拌4小時，然后蒸發(fā)。將殘余物溶解在四氫呋喃中，然后滴加到劇烈攪拌的35％氨水溶液(60ml)中。過濾混合物，用冰冷的水洗滌殘余物，然后在真空下干燥得到4-乙氧基-2，6-二氟苯甲酰胺，為無色固體(3.23g，93％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)7.91(br.s，1H)，7.65(br.s，1H)，6.78-6.71(m，2H)，4.08(q，2H)，1.32(t，3H). MS(+ve EI)201(M·+) d)在0-5℃向攪拌中的4-乙氧基-2，6-二氟苯甲酰胺(3.18g，15.8mmol)和三乙胺(4.44ml，31.6mmol)在二氯甲烷(25ml)中的懸浮液中加入三氯乙酰氯(1.94ml，17.4mmol)。在0-5℃將混合物攪拌5分鐘。用水、稀鹽酸、稀氫氧化鈉、稀鹽酸和最終用水依次洗滌得到的溶液。用硫酸鎂干燥有機溶液，然后蒸發(fā)得到4-乙氧基-2，6-二氟芐腈，為淡黃色固體(2.56g 89％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)7.06-7.03(m，2H)，4.17(q，2H)，1.34(t，3H).MS(+ve CI)184(M+H)+ e)將4-乙氧基-2，6-二氟芐腈(8.0g，44mmol)在氨在乙醇(270ml)中的飽和溶液中的混合物在高壓釜中加熱至150℃16小時。蒸發(fā)得到的溶液，將殘余物溶解在二氯甲烷中，然后用水洗滌。用硫酸鎂干燥有機溶液，在真空下濃縮，然后通過硅膠色譜法純化，用二氯甲烷洗脫得到2-氨基-4-乙氧基-6-氟芐腈，無色固體(6.07g，77％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)6.32(s，2H)，6.14-6.10(m，2H)，3.99(q，2H)，1.30(t，3H). MS(+ve EI)180(M·+) f)經(jīng)20分鐘將2-氨基-4-乙氧基-6-氟芐腈(2.5g，13.9mmol)分批加入到在100℃加熱的甲酸(20ml)和濃硫酸(5滴)的混合物中?；旌衔镌?00℃加熱5小時，然后使其冷卻至室溫。將混合物傾入到冰/水(80ml)中，通過過濾收集得到的沉淀，用水隨后用乙醚洗滌，然后在真空下干燥得到7-乙氧基-5-氟喹唑啉-4(3H)-酮，為無色固體(2.02g，70％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)12.06(br.S.1H)，8.01(s，1H)，6.91-6.85(m，2H)，4.17(q，2H)，1.36(t，3H). MS(+ve ESI)209(M+H)+ g)在氮氣氛下將在二甲基甲酰胺(7ml)中的[(2R)-1-芐基吡咯烷-2-基]甲醇(1.1g，57.6mmol)滴加到攪拌中的氫化鈉(0.461g 60％油分散劑，11.52mmol)在二甲基甲酰胺(8ml)中的懸浮液中。得到的溶液在室溫下攪拌30分鐘，然后加入7-乙氧基-5-氟喹唑啉-4(3H)-酮(1.0g，4.8mmol)，然后將混合物進一步在室溫下攪拌5小時。然后加入另一部分的[(2R)-1-芐基吡咯烷-2-基]甲醇(0.220g，1.15mmol)和氫化鈉(0.092g，2.3mmol)，將反應(yīng)混合物加熱至60℃1小時。使混合物冷卻至室溫，然后傾入到飽和的氯化銨溶液中。過濾得到的沉淀，用乙醚洗滌，然后在真空下干燥得到5-{[(2R)-1-芐基吡咯烷-2-基]甲氧基}-7-乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮，為無色固體(1.24g，68％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)11.61(br.s，1H)，7.89(s，1H)，7.31-7.17(m，5H)，6.63(d，1H)，6.52(d，1H)，4.49(d，1H)，4.14(q，2H)，4.05-3.94(m，2H)，3.44(d，1H)，3.12-3.00(m，1H)，2.87-2.79(m，1H)，2.31-2.20(m，1H)，2.03-1.96(m，1H)，1.69(m，3H)，1.36(t，3H). MS(+ve ESI)380(M+H)+ 用作原料的[(2R)-1-芐基吡咯烷-2-基]甲醇的制備如下所述 將(溴甲基)苯(2.36ml，19.8mmol)和碳酸鉀(8.20g，59.3mmol)加入到(2R)-吡咯烷-2-基甲醇(2.00g，19.8mmol)在乙醇(40ml)和水(6ml)中的溶液中。將得到的溶液加熱至80℃ 4小時，然后蒸發(fā)。殘余物用水(150ml)處理，用乙醚萃取兩次。合并的有機萃取物用水洗滌，用硫酸鎂干燥，然后蒸發(fā)。殘余物通過硅膠色譜法純化，用含有0-1％甲醇氨溶液(7M)的含5％甲醇的二氯甲烷混合物洗脫得到[(2R)-1-芐基吡咯烷-2-基]甲醇，為黃色油狀物(2.38g，63％產(chǎn)率) 1H NMR(DMSO d6)7.33-7.27(m，4H)，7.25-7.20(m，1H)，4.37(t，1H)，4.04(d，1H)，3.48-3.43(m，1H)，3.34-3.26(m，2H)，2.78-2.74(m，1H)，2.59-2.53(m，1H)，2.17-2.11(m，1H)，1.88-1.79(m，1H)，1.65-1.53(m，3H).] h)向5-{[(2R)-1-芐基吡咯烷-2-基]甲氧基}-7-乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮(1.2g，3.16mmol)和二碳酸二叔丁酯(0.758g，3.48mmol)在二甲基甲酰胺(15ml)中的懸浮液中加入10％披鈀碳，然后在室溫下在氫氣氛下攪拌混合物5小時。通過硅藻土過濾混合物，然后蒸發(fā)。殘余物通過硅膠色譜法純化，用含5％甲醇的二氯甲烷洗脫混合物得到(2R)-2-{[(7-乙氧基-4-氧代-3，4-二氫喹唑啉-5-基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，為無色固體(1.00g，81％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSO d6)7.83(s，1H)，6.64(d，1H)，6.55(d，1H)，4.19-4.03(m，5H)，3.40-3.30(m，2H)，2.16-2.05(m，2H)，2.03-1.94(m，1H)，1.79-1.69(m，1H)，1.40(s，9H)，1.63(t，3H). MS(+ve ESI)390(M+H)+ i)將(2R)-2-{[(7-乙氧基-4-氧代-3，4-二氫喹唑啉-5-基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(0.950g，2.44mmol)、N，N-二異丙基乙基胺(1.44ml，8.30mmol)和三氯氧磷(0.72ml，7.81mmol)在1，2-二氯乙烷(20ml)中的混合物在80℃加熱2小時。使得到的溶液冷卻至室溫，然后蒸發(fā)。將殘余物溶解在二氯甲烷中，用碳酸氫鈉水溶液洗滌，用硫酸鎂干燥，然后蒸發(fā)。殘余物通過硅膠色譜法純化，用乙酸乙酯洗脫得到(2R)-2-{[(4-氯-7-乙氧基喹唑啉-5-基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔酯，為黃色固體(0.621g，63％產(chǎn)率) MS(+ve ESI)408(M+H)+ j)將(2R)-2-{[(4-氯-7-乙氧基喹唑啉-5-基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(0.615g，1.51mmol)和2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺(0.380g，1.51mmol)在2-丙醇(20ml)中的混合物在70℃加熱30分鐘得到稠厚的沉淀。使混合物冷卻至室溫，用乙醚稀釋，然后過濾。用乙醚洗滌殘余物，然后在真空下干燥得到(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯鹽酸鹽，為乳膏狀固體(0.832g，83％產(chǎn)率) 1H-NMR(DMSOd6)8.69(s，1H)，8.33(s，1H)，7.94(s，1H)，7.70-7.66(m，1H)，7.17-7.10(m，2H)，6.96(d，1H)，6.88(d，1H)，5.13(s，2H)，4.48(dd，1H)，4.42-4.37(m，1H)，4.30(dd，1H)，4.27(q，2H)，3.47-3.42(m，1H)，3.34-3.29(m，1H)，2.16-2.08(m，1H)，2.00-1.83(m，3H)，1.42(t，3H)，1.35(s，9H). MS(+ve ESI)624(M+H)+ 實施例3化合物3-N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(3R)-嗎啉-3-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺的制備
與在實施例2ii描述類似的反應(yīng)，但是使用(3R)-3-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]嗎啉-4-羧酸叔丁酯鹽酸鹽(540mg，0.84mmol)得到化合物3(380 mg，84％產(chǎn)率)。
1H NMR(DMSO d6)10.1(br s，1H)，9.85(br s，1H)，8.43(s，1H)，8.27(s，1H)，7.74(s，1H)，7.71-7.66(m，1H)，7.19-7.11(m，2H)，6.77(d，1H)，6.65(d，1H)，5.08(s，2H)，4.35-4.22(m，3H)，4.17(q，3H)，3.88-3.84(m，1H)，3.73-3.68(m，1H)，3.52-3.44(m，2H)，3.38-3.33(m，1H)，3.03-2.88(m，2H)，1.37(t，3H). MS(+ve ESI)540(M+H)+ 用作原料的(3R)-3-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]嗎啉-4-羧酸叔丁酯制備如下所述 a)與在實施例2ii描述類似的反應(yīng)，但是使用[(3S)-4-芐基嗎啉-3-基]甲醇鹽酸鹽(843mg，3.46mmol)和氫化鈉(392mg 60％油分散劑，9.79mmol)得到5-{[(3R)-4-芐基嗎啉-3-基]甲氧基}-7-乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮，其在下一步?jīng)]有進一步純化而使用。
用作原料的[(3S)-4-芐基嗎啉-3-基]甲醇鹽酸鹽根據(jù)G.R.Brown et al.J.Chem.Soc.Perkins Trans.I，1985，2577-2580.描述制備。
b)與在實施例2ii描述類似的反應(yīng)，但是周5-{[(3R)-4-芐基嗎啉-3-基]甲氧基}-7-乙氧基喹唑啉-4(3H)-酮(大約2.9mmol)開始得到(3R)-3-{[(7-乙氧基-4-氧代-3，4-二氫喹唑啉-5-基)氧基]甲基}嗎啉-4-羧酸叔丁酯(570mg，經(jīng)兩步驟產(chǎn)率為49％)。
1H NMR(DMSO d6)7.84(s，1H)，6.65(dd，2H)，4.32(t，1H)，4.23-4.15(m，4H)，4.10-4.07(m 1H)，3.82-3.79(m，1H)，3.69-3.65(m，1H)，3.51-3.47(m，1H)，3 42-3.37(m 1H)，3.21-3.15(m，1H)，1.41(s，9H)，1.37(t，3H). MS(+ve ESI)406(M+H)+ c)與在實施例2ii描述類似的反應(yīng)，但是用(3R)-3-{[(7-乙氧基-4-氧代-3，4-二氫喹唑啉-5-基)氧基]甲基}嗎啉-4-羧酸叔丁酯(560mg，1.4mmol)開始得到(3R)-3-{[(4-氯-7-乙氧基喹唑啉-5-基)氧基]甲基}嗎啉-4-羧酸叔丁酯(420mg，71％產(chǎn)率)。
MS(+ve ESI)424(M+H)+ d)與在實施例2iij描述類似的反應(yīng)，但是用(3R)-3-{[(4-氯-7-乙氧基喹唑啉-5-基)氧基]甲基}嗎啉-4-羧酸叔丁酯(420mg，0.99mmol)開始，得到(3R)-3-[({4-[(1-{2-[(2，3-二氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-乙氧基喹唑啉-5-基}氧基)甲基]嗎啉-4-羧酸叔丁酯鹽酸鹽(561mg，84％產(chǎn)率)。
1H NMR(DMSO d6)10.38(s，1H)，10.01(s，1H)，8.69(s，1H)，8.31(s，1H)，7.92(s，1H)，7.69-7.64(m，1H)，7.20-7.11(m，2H)，7.01(m，2H)，5.15(s，2H)，4.83-4.79(m，1H)，4.61-4.58(m，1H)，4.54-4.50(m，1H)，4.27(q，2H)，4.03(d，1H)，3.86-3.81(m，1H)，3.75-3.71(m，1H)，3.68-3.63(m，1H)，3.47-3.32(m，2H)，1.42(t，3H)，1.26(s，9H). MS(+ve ESI)640(M+H)+
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物
或其鹽；
其中R1為氫或甲基和X為鍵或氧。
2.權(quán)利要求1的化合物或其鹽，其中X為鍵。
3.權(quán)利要求2的化合物或其鹽，其為N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(2R)-吡咯烷-2-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺。
4.權(quán)利要求2的化合物或其鹽，其為N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-{[(2R)-1-甲基吡咯烷-2-基]甲氧基}喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺。
5.權(quán)利要求1的化合物或其鹽，其中X為氧。
6.權(quán)利要求5的化合物或其鹽，其為N-(2，3-二氟苯基)-2-[4-({7-乙氧基-5-[(3R)-嗎啉-3-基甲氧基]喹唑啉-4-基}氨基)-1H-吡唑-1-基]乙酰胺。
7.權(quán)利要求5的化合物或其鹽，其為N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-{[(3R)-4-甲基嗎啉-3-基]甲氧基}喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺。
8.包含如權(quán)利要求1定義的式(I)化合物或其可藥用鹽的藥物組合物，與可藥用稀釋劑或載體相混合。
9.如權(quán)利要求1定義的式(I)化合物或其可藥用鹽，用作藥物。
10.如權(quán)利要求1定義的式(I)化合物或其可藥用鹽在制備用于治療過度增生疾病藥物中的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中過度增生疾病為癌癥。
12.權(quán)利要求11的用途，其中過度增生疾病為結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌癥或白血病或淋巴瘤的任何一種或其任意組合。
13.治療患有過度增生疾病的人的方法，包含向有此需求的人施用治療有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中過度增生疾病為癌癥。
15.權(quán)利要求14的方法，其中過度增生疾病為結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤的任何一種或其任意組合。
16.制備其中R1為甲基的式(I)化合物的方法，包含將其中R1為氫的式(I)化合物與甲醛在甲酸中，在升高的溫度例如50℃至100℃下，反應(yīng)一段時間例如30分鐘至2小時，此后如果必要
i)除去任何保護基；和/或
ii)形成其鹽。
17.制備其中R1為氫的式(I)化合物的方法，包含將N-(2，3-二氟苯基)-2-{4-[(7-乙氧基-5-羥基喹唑啉-4-基)氨基]-1H-吡唑-1-基}乙酰胺與式(II)的醇反應(yīng)
其中PG為合適的保護基，例如叔丁氧基羰基(BOC)、芐氧基羰基(Z)或9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，此后如果必要
i)除去任何保護基；和/或
ii)形成其鹽。
18.制備其中R1為氫的式(I)化合物的方法，包含將式(III)化合物
其中PG為合適的保護基，例如叔丁氧基羰基(BOC)、芐氧基羰基(Z)或9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，和L為合適的離去基例如氯，與2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(2，3-二氟苯基)乙酰胺反應(yīng)，此后如果必要
i)除去任何保護基；和/或
ii)形成其鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療疾病的式(I)化合物，特別地治療增生疾病，例如癌癥，用于制備治療增生疾病藥物的用途；本發(fā)明還涉及制備這樣化合物的方法，以及含有它們作為活性成分的藥物組合物。
文檔編號C07D413/00GK101184751SQ200680018768
公開日2008年5月21日 申請日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月28日
發(fā)明者K·M·富特 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司