專利名稱：：高親和力hivt細胞受體的制作方法髙親和力HIVT細胞受體本發(fā)明涉及對HIVGag多肽衍生的SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性的T細胞受體(TCR)。該TCR包含至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個TCR|3鏈可變區(qū)，其對于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于lpM禾Q/或?qū)LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)為1x10—3S"或更慢。發(fā)明背景人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子。該病毒是屬于慢病毒群(gro叩)中的一種被膜逆轉(zhuǎn)錄病毒。SLYNTVATL(SEQIDNO:16)肽衍生自Gag基因的gl7基因產(chǎn)物，Gag基因是構(gòu)成人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的九個基因中的一個。該肽由HLA-A*0201負載，并呈遞到HIV感染細胞的表面。因此，SLYNTVATL-HLA-A2*0201復(fù)合物提供了一種TCR可靶向的HIV標記，例如為將細胞毒劑或免疫刺激劑遞送到感染細胞的目的。然而，對于該目的，如果TCR對肽-HLA復(fù)合物具有高親和力和/或慢的解離速率將是有利的。發(fā)明概述本發(fā)明首次提供了對SLYNTVATL-HLA-A1110201復(fù)合物的親和力(Ko)小于或等于lpM禾n/或解離速率(k。ff)為lxl(T3S—'或更慢的TCR，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQIDNO:1禾B2時，所述細胞不是天然T細胞。此類TCR不論單用或是與治療劑一起使用對于靶向遞呈該復(fù)合物的HIV感染細胞都是很有利的。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種T細胞受體(TCR)，其對SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性，并包含至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個TCR|3鏈可變區(qū)，它的特征在于所述TCR對于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于lpM和/或?qū)τ赟LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)為lxl(T3S"或更慢，前提是當所述TCR由細胞遞呈且包含SEQIDNO:1和2時，該細胞不是天然T細胞。可采用任何已知的方法測定KD和/或(k。ff)。一種優(yōu)選的方法是實施例4中的表面等離子共振(SurfacePlasmonResonance,Biacore)方法。為了比較，通過實施例4的基于Biacore方法測定親本HIVgagTCR(TCRa鏈見SEQIDNO:9，TCR]3鏈見SEQIDNO:IO)的二硫鍵連接的可溶性變體與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物相互作用的KD約為85nM，解離速率(koff)為2.21X10—2S-l，半衰期為0.17分鐘。SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的特異性親本HIVGagTCR具有以下的V。鏈和Ve鏈基因用途a鏈-TRAV12.2P鏈-TRBV5.6可將親本HIVGagTCR用作模板來產(chǎn)生本發(fā)明的其它TCR，所述其它TCR對于所述TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物之間的相互作用的高親和力高和/或解離速率慢。因此，相對于親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)(參見圖la和SEQIDNo:1)和/或p鏈可變區(qū)(參見圖lb和SEQIDNO:2)，本發(fā)明的TCR在其至少一個互補決定區(qū)(CDR)和/或可變區(qū)框架區(qū)發(fā)生突變。本發(fā)明也考慮了本發(fā)明TCR可變區(qū)中的其它超變區(qū)(例如超變4(HV4)區(qū))可在高親和力突變TCR中發(fā)生突變。噬菌體展示為產(chǎn)生TCR變體文庫提供了一種手段。(Li箏，(2005)7Vfl&"23(3):349-354)和WO2004/04404詳述了適于噬菌體展示和隨后的TCR變體文庫篩選的方法，所述TCR變體各含有非天然鏈間二硫鍵。天然TCR以異二聚化的ap或^形式存在。然而，現(xiàn)已顯示由單條TCRTCRa或TCRp鏈組成的重組TCR可結(jié)合肽MHC分子。在一個實施方式中，本發(fā)明的TCR包括a鏈可變區(qū)和TCR(3鏈的可變區(qū)。TCRa鏈序列和/或TCRp鏈序列中的突變可為一個或多個取代、缺失或插入，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的?？捎萌魏魏线m的方法來實現(xiàn)這些突變，這些方法包括但不限于基于聚合鏈式反應(yīng)(PCR)方法、基于限制性內(nèi)切酶的克隆方法、或不依賴于連接反應(yīng)的克隆(LIC)方法。這些方法在許多標準分子生物學(xué)教材中有所詳述。關(guān)于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)誘變法和基于限制性內(nèi)切酶的克隆法更為詳盡的描述可參見(Sambrook&Russell，(2001)MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.)《分子克隆實驗室指南》第三版，CSHLPress)。關(guān)于LIC法的進一步描述可見于(Rashtchian，(1995)CwatOp/"腸tecA"o/6(1):30-6)。應(yīng)注意到包含相似Va和VP基因應(yīng)用并由此氨基酸序列與HIVGag相似的任何a卩TCR可用來制作便利的模板TCR。然后可能將產(chǎn)生本發(fā)明突變的高親和力TCR所需的改變引入編碼模板apTCR的一個或兩個可變區(qū)的DNA中。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道可通過許多方法，例如定點誘變引入所需的突變。與圖la和SEQIDNo:1的親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)序列中這些位置的氨基酸相比，本發(fā)明TCR包含那些在對應(yīng)于以下所列的一個或多個TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸發(fā)生突變的TCR。除非另有相反陳述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知該殘基在重組蛋白產(chǎn)生過程中可以除去。本領(lǐng)域技術(shù)人員也顯然知道，可將其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5個或更多個殘基，而基本不影響該TCR的pMHC結(jié)合性能，本發(fā)明包括所有這些不重要的變體。本文所用的術(shù)語"可變區(qū)"應(yīng)理解為包括給定TCR的不包含在由TCRa鏈的TRAC基因或TCR(3鏈的TRBCl或TRBC2基因所編碼的恒定區(qū)內(nèi)的所有氨基酸(序列)。(《T細胞受體手冊》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8)。本文所用的術(shù)語"可變域"應(yīng)理解為包括給定TCR的由TCRa鏈的TRAC基因或TCR(3鏈的TRBV基因所編碼的所有氨基酸(序列)。(《T細胞受體手冊》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc禾口LeFranc,科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，在本文定義的可變區(qū)和恒定區(qū)之間交界處由密碼子所編碼的氨基酸中發(fā)生變異可導(dǎo)致TCR庫(r印ertoire)的部分多樣性。例如，存在于親本HIVGagTCR序列中該交界處的密碼子(突變)導(dǎo)致本文可變區(qū)序列的C-末端存在組氨酸(H)殘基。該組氨酸取代了圖8a所示，TRAC基因編碼的N-末端天冬酰胺(N)殘基。本發(fā)明的實施方式中包括含有對應(yīng)于以下一個或多個a鏈可變區(qū)氨基酸發(fā)生突變的突變性TCR:95T、96N、97S、98G和100A，例如以下氨基酸95S或G96A97H98D100S以上的編號與圖la和SEQIDNo:l中所示的編號一致。本發(fā)明的實施方案也包括對應(yīng)于以下所列的一個或多個TCRP鏈可變區(qū)氨基酸相對于圖lb和SEQIDNo:2的天然HIVGagTCRP鏈可變區(qū)中這些位置的氨基酸發(fā)生突變的TCR。所指示的可能發(fā)生突變的氨基酸是51Y、52E、53E和54E，例如51V或A52R或L53G54V以上的編號與圖lb和SEQIDNo:2中所示的編號一致。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有圖6所示突變的a鏈可變區(qū)氨基酸序列之一的TCR。(SEQIDNo:11到13)。這種TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有圖7所示突變的3鏈可變區(qū)氨基酸序列之一的TCR。(SEQIDNo:14和15)。這種TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。天然TCR存在異源二聚體a(3或yS形式。然而，目前已顯示由aa或即同源二聚體構(gòu)成的重組TCR能與肽MHC分子結(jié)合。因此，本發(fā)明的一個實施方式是TCRaoc或TCR卩(5同源二聚體。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有下列a鏈可變區(qū)氨基酸序列和(3鏈可變區(qū)氨基酸序列組合的本發(fā)明的TCR，這類TCR的表型沉默變體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在另一優(yōu)選實施方案中，含有以上詳述的可變區(qū)組合的本發(fā)明TCR還含有圖8a所示a鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:19)以及圖8b和8c所示J3鏈氨基酸恒定區(qū)序列之一(SEQIDNO:20和21)或其表型沉默變體。本文所用的術(shù)語"表型沉默變體"應(yīng)理解為指對所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于1jiM禾口/或具有1X10—3S"或更慢的解離速率(k。ff)的那些TCR。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可能產(chǎn)生與以上詳述的那些TCR相比，在其恒定和/或可變區(qū)中摻入了較小變化但不改變與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物相互作用的親和力和/或解離速率的TCR。本發(fā)明范圍包括這類不重要的變體。其中含有一個或多個保守取代的那些TCR也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。就廣義而言，本發(fā)明TCR可以如WO04/033685和WO03/020763所述為單鏈TCR(scTCR)或二聚體TCR(dTCR)形式。合適的scTCR形式包括由對應(yīng)于TCRcc鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成的第一區(qū)段，由對應(yīng)于TCRp鏈可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成的第二區(qū)段，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列?；蛘?，所述第一區(qū)段可由對應(yīng)于TCR(3鏈可變區(qū)氨基酸序列構(gòu)成，所述第二區(qū)段可由對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成。以上scTCR在第一和第二鏈之間還含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然apT細胞受體中沒有等價物，其中該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應(yīng)使第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列的相互取向基本上如天然a卩T細胞受體中的那樣。更具體地說，所述第一區(qū)段可由對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成，第二區(qū)段可由對應(yīng)于TCR卩鏈可變區(qū)序列并與對應(yīng)于TCR卩鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構(gòu)成，和在第一和第二鏈之間可以存在天然apT細胞受體中沒有等價物的二硫鍵。在以上scTCR形式中，接頭序列可連接第一區(qū)段C末端和第二區(qū)段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGGVP-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO:17)-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG陽P(SEQIDNO:18)本發(fā)明TCR的合適dTCR形式包括第一多肽，其中對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)的序列的一條序列與對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；第二多肽，其中對應(yīng)于TCRP鏈可變區(qū)序列的一條序列與對應(yīng)于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；該第一和第二多肽通過在天然a卩T細胞受體中沒有等價物的二硫鍵相連。所述第一多肽可含有與對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的的N末端相融合的TCRa鏈可變區(qū)序列，而第二多肽中對應(yīng)于TCR(3鏈可變區(qū)序列的一條序列與對應(yīng)于TCR(3鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合，該第一和第二多肽通過取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等價物的外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵相連。("TRAC"等在本文根據(jù)《T細胞受體手冊》(TcellreceptorFactsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學(xué)出版社，ISBN0-12-441352-8命名)。本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可具有對應(yīng)于人apTCR胞外恒定區(qū)和可變區(qū)序列的氨基酸序列，在天然TCR中沒有等價物的二硫鍵可連接所述恒定區(qū)序列的氨基酸殘基。所述二硫鍵存在于與在天然TCR中其卩碳原子距離小于0.6nm的氨基酸殘基相對應(yīng)的半胱氨酸殘基之間，例如在取代TRA(^01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等價物的外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基之間。就TCRa鏈而言，可引入半胱氨酸形成二硫鍵的其它位點是TRACMl外顯子l中的以下殘基，就TCRP鏈而言，是TRBCPOl或TRBC2M1外顯子1中的以下殘基<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>除了以上提及的非天然二硫鍵以外，本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可在對應(yīng)于天然TCR中通過二硫鍵連接的殘基的殘基之間含有二硫鍵。本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式優(yōu)選不含有對應(yīng)于天然TCR的跨膜或胞質(zhì)序列的序列。本發(fā)明的TCR與SLYNTVATL-HLA-A2*0201牢固結(jié)合。當用HLA-A*0201負載時，這些TCR還可與HIVGag衍生的SLYNTVATL天然變體相結(jié)合，其結(jié)合程度雖然發(fā)生改變但仍然有用。已從AIDS患者中分離的SLYNTVATL變體包括下述變體(Sewell箏，(1997)￡wJ27:2323-2329):SL[NTVATLSL￡NTVAYLslyntvatlS處NTVATLSLLNTVATLSLYNTIATLSL￡NTIATLSL￡NTIAYLSL￡N￡VATL突變的氨基酸用下劃線表示。尸五g化游rci単沐在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的TCR與至少一條聚亞垸基二醇鏈結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有許多方法可產(chǎn)生這種結(jié)合。在一優(yōu)選的實施方式中，一條或多條聚亞烷基二醇鏈與TCR共價相連。在另一實施方式中，本發(fā)明該方面的聚乙二醇鏈含有至少兩個聚乙烯重復(fù)單位。多份rc7復(fù)會激本發(fā)明一方面提供含有至少兩個本發(fā)明TCR的多價TCR復(fù)合物。在該方面的一個實施方式中，至少兩個TCR分子經(jīng)接頭部分相連形成多價復(fù)合物。這些復(fù)合物優(yōu)選為水溶性的，所以應(yīng)照此(標準)選擇接頭部分。此外，接頭部分優(yōu)選能與TCR分子上確定的位置相連，從而盡可能降低所形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)多樣性。該方面的一個實施方式所提供的本發(fā)明TCR復(fù)合物中聚合物鏈或肽接頭序列延伸于各TCR中不位于該TCR可變區(qū)序列中的氨基酸殘基之間。由于本發(fā)明復(fù)合物可用作藥物，接頭部分應(yīng)該適當考慮它們的藥學(xué)適用性，例如它們的免疫原性來選擇。本領(lǐng)域己知符合以上所需標準的接頭部分的例子，例如連接抗體片段的技術(shù)。兩類接頭優(yōu)選用于產(chǎn)生本發(fā)明的多價TCR分子。其中的TCR通過聚亞烷基二醇鏈相連的本發(fā)明TCR復(fù)合物提供了該方面的一個實施方式。第一類是親水性聚合物，例如聚亞垸基二醇。此類中最常用的是聚乙二醇或PEG，其結(jié)構(gòu)如下式所示。HOCH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而其它聚合物可以基于其它合適的、任選取代的聚亞烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇與丙二醇的共聚物。這種聚合物可用于處理或偶聯(lián)治療劑，特別是多肽或蛋白質(zhì)治療劑來有益地改變該療劑的PK分布，例如降低腎廓清率、提高血漿半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。據(jù)信，一個或多個PEG分子在治療劑周圍形成的"外殼"能在立體上阻礙治療劑與免疫系統(tǒng)反應(yīng)并降低其蛋白酶降解，從而改善PEG-治療劑偶聯(lián)物的PK分布。(Casey等，(2000)，TumorTargetting，4235-244)。所用親水性聚合物的分子大小可根據(jù)TCR復(fù)合物預(yù)定的治療應(yīng)用來具體選擇。已有許多綜述文章和書籍詳細描述了PEG和類似分子在藥物制劑中的應(yīng)用。例如，參見Harris,(1992)，《聚乙二醇化學(xué)-生物技術(shù)和生物醫(yī)藥應(yīng)用》(PolyethyleneGlycolChemistry-BiotechnicalandBiomedicalApplications),Plenum,紐約，紐約州或Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇化學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用ACS手冊》(ChemistryandBiologicalApplicationsofPolyethyleneGlycolACSBooks),華盛頓，哥倫比亞特區(qū)。所用的聚合物可具有線形或分支構(gòu)型?？赏ㄟ^加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和賴氨酸來誘生分支PEG分子或其衍生物。該聚合物一般在其結(jié)構(gòu)中，例如在其一端或兩端，和/或骨架的支鏈處具有化學(xué)反應(yīng)活性基團而使該聚合物能與PCR中的靶位點相連。如下所示，這種化學(xué)反應(yīng)活性基團可與親水性聚合物直接相連，或者在親水性聚合物或反應(yīng)活性化學(xué)(基團)之間可以具有間隔基團/部分反應(yīng)活性化學(xué)(基團)-親水性聚合物-反應(yīng)活性化學(xué)(基團)反應(yīng)活性化學(xué)(基團)-間隔基團-親水性聚合物-間隔基團-反應(yīng)活性化學(xué)(基團)用于形成以上概述的該類型構(gòu)建物的間隔基團可以是無反應(yīng)活性、化學(xué)穩(wěn)定的、鏈狀的任何有機部分。這種間隔基團包括但不限于以下基團-(CH2)n-，其中n=2至U5-(CH2)3NHCO(CH2)2其中二價亞烷基間隔基團位于聚亞垸基二醇鏈和其與該復(fù)合物的TCR連接點之間的本發(fā)明TCR復(fù)合物是該方面的另一種實施方式。其中聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復(fù)單位的本發(fā)明TCR復(fù)合物是該方面的另一實施方式。本發(fā)明可用的直接或經(jīng)間隔基團與反應(yīng)活性化學(xué)物質(zhì)相連的親水性聚合物有許多商業(yè)供應(yīng)商。這些供應(yīng)商包括NektarTherapeutics(加利福尼亞州，美國)、NOFCorporation(日本)、Sunbio(韓國)和EnzonPharmaceuticals(新澤西州，美國)。本發(fā)明可用的直接或經(jīng)間隔基團與反應(yīng)活性化學(xué)物質(zhì)相連的親水性聚合物包括但不限于以下聚合物<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>髙級別TCR多聚體15K，3臂，Mal3(用于三聚體)NektarOJOON0320K,4臂，MaU(用于四聚體)NektarOJOOP0440K，8臂，Mals(用于八聚體)NsktarOJOOT08可利用各種偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))將聚合物分子偶聯(lián)于蛋白質(zhì)和肽治療劑。選擇最合適的偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))在很大程度上取決于所需的偶聯(lián)部位。例如，以下偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))已用于連接PEG分子(來源Nektar分子工程目錄2003(NektarMolecularEngineeringCatalogue2003))的一個或多個末端N-馬來酰亞胺乙烯基砜苯并三唑碳酸酯琥珀酰亞胺丙酸酯(Succinimidylpropionate)琥珀酰亞胺丁酸酯(Succinimidylbutanoate)硫代酯乙醛丙烯酸酯生物素伯胺如上所述，非PEG基聚合物也可為本發(fā)明TCR的多聚化提供合適的接頭。例如，可以利用含有通過脂肪鏈相連的馬來酰亞胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，產(chǎn)品號22330和22323)。肽接頭是另一類TCR接頭。這些接頭由氨基酸鏈組成，其作用為在可連接的TCR分子上產(chǎn)生簡單接頭或多聚化結(jié)構(gòu)域。曾采用生物素/鏈霉親和素系統(tǒng)來產(chǎn)生體外結(jié)合研究用的TCR四聚體(參見WO/99/60119)。然而，鏈霉親和素是微生物來源的多肽，因此用于治療劑中并不理想。其中的TCR通過源自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭連接的本發(fā)明TCR復(fù)合物提供了該方面的另一種實施方式。有許多含多聚化結(jié)構(gòu)域的人蛋白質(zhì)可用于產(chǎn)生多價TCR復(fù)合物。例如，p53四聚化結(jié)構(gòu)域，其已用于產(chǎn)生scFv抗體片段四聚體，該四聚體與單體scFV片段相比，顯示血清持久性增加和解離速率明顯降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血紅蛋白的四聚化結(jié)構(gòu)域也可能用于該類應(yīng)用。含有至少兩個TCR的本發(fā)明多價TCR復(fù)合物提供了該方面的最后一種實施方式，該復(fù)合物中所述TCR的至少一個與治療劑結(jié)合。在一方面，本發(fā)明TCR(或其多價復(fù)合物)或者還可或額外還可在其cc或(3鏈的C-末端或N-末端包含反應(yīng)活性半胱氨酸。珍銜浙治/f應(yīng)^一方面，本發(fā)明TCR可以與治療劑或可檢測部分結(jié)合。例如，所述治療劑或可檢測部分可與TCR共價相連。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述治療劑或可檢測部分與一條或兩條TCR鏈的C-末端共價相連。一方面，可利用可檢測部分，例如適用于診斷目的的標記物來標記本發(fā)明TCR的scTCR或一條或兩條dTCR鏈。這種標記的TCR可用于檢測SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的方法，該方法包括使TCR配體與該TCR配體的特異性TCR(或多聚高親和力TCR復(fù)合物)接觸；和檢測與該TCR配體的結(jié)合情況。在例如利用生物素化的異源二聚體形成的四聚體TCR復(fù)合物中，可利用熒光鏈霉親和素來提供可檢測標記。這種熒光標記的TCR四聚體適用于FACS分析，例如檢測攜帶這些高親和力TCR的特異性SLYNTVATL-HLA-A*020l復(fù)合物的抗原呈遞細胞?？蓹z測本發(fā)明可溶性TCR的另一種方法是利用TCR特異性抗體，特別是單克隆抗體。有許多商業(yè)可購得的抗-TCR抗體，例如ocFl和PF1可分別識別a和(3鏈的恒定區(qū)。在其它方面，本發(fā)明TCR(或其多價復(fù)合物)或者還可或額外還可與治療劑結(jié)合(例如，以共價或其它方式相連)，所述治療劑可以是，例如用于殺傷細胞的毒性部分，或免疫效應(yīng)分子，如白介素或細胞因子。與非多聚野生型或本發(fā)明的T細胞受體異源二聚體相比，本發(fā)明的多價TCR復(fù)合物對TCR配體的結(jié)合能力提高。因此，本發(fā)明的多價TCR復(fù)合物特別可用于在體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的細胞，也可用作中間體來產(chǎn)生具有這種用途的其它多價TCR復(fù)合物。因此，這些TCR或多價TCR復(fù)合物可以在體內(nèi)應(yīng)用的藥學(xué)上可接受的制劑中提供。本發(fā)明也提供將治療劑遞送至靶細胞的方法，該方法包括在允許潛在的靶細胞與本發(fā)明TCR或多價TCR復(fù)合物結(jié)合的條件下使二者接觸，所述TCR或多價TCR復(fù)合物對SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物具有特異性并結(jié)合有治療劑。具體地說，本發(fā)明的可溶性TCR或多價TCR復(fù)合物可用于將治療劑遞送至呈遞具體抗原的細胞。這可用于許多情況，特別是針對HIV感染的細胞。治療劑的遞送應(yīng)可在局部起作用而非只對與其結(jié)合的細胞起作用。因此，一種具體方案設(shè)想可采用與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物特異性的本發(fā)明TCR或多價TCR復(fù)合物相連的細胞毒性或免疫刺激分子。為此應(yīng)用，可利用許多治療劑，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化療藥物(例如，順鉑)。為保證在所需部位發(fā)揮毒性作用，可將毒素包裹在與鏈霉親和素相連的脂質(zhì)體內(nèi)從而使該化合物緩慢釋放。這防止了毒素在體內(nèi)轉(zhuǎn)運期間遭受破壞并且保證了TCR與相關(guān)的抗原呈遞細胞結(jié)合后毒素具有最大作用。其它合適的治療劑包括小分子細胞毒性藥物，即分子量小于700道爾頓，能殺傷哺乳動物細胞的化合物。這種化合物也可包含具有細胞毒性作用的毒性金屬。此外，應(yīng)該理解這些小分子細胞毒性藥物也包括藥物前體，即能在生理條件下分解或轉(zhuǎn)變從而釋放細胞毒性藥物的化合物。這種藥物的例子包括順鉑、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、刺胞霉素、多西他賽、鬼臼亞乙苷、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、依利替康、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer卟啉鈉II(sorfimersodiumphotofrin11)、替莫唑胺、拓撲替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奧利斯他汀E(auristatinE)、長春新堿和阿霉素；肽細胞毒素，即能殺傷哺乳動物細胞的蛋白質(zhì)或其片段。包括但不限于蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即一些元素的不穩(wěn)定同位素，其在衰減同時發(fā)射一種或多種oc或p粒子，或Y射線。包括但不限于碘131、錸186、銦111、銥90、鉍210和213、錒225和砹213;也可利用螯合劑來促進這些放射性核素與高親和力TCR或其多聚體結(jié)合；前藥，包括但不限于抗體定向的酶前藥；免疫刺激劑，即能激活免疫應(yīng)答的部分。包括但不限于細胞因子，例如IL-2和IFN;超抗原和其變體；TCR-HLA融合物和趨化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長刺激蛋白等抗體或其片段；補體激活劑；異種蛋白結(jié)構(gòu)域；同種蛋白結(jié)構(gòu)域；病毒/細菌蛋白結(jié)構(gòu)域；病毒/細菌肽和抗T細胞決定簇抗體(例如，抗-CD3或抗-CD28)或抗體類似物，例如Nanobodies和AffybodiesTM。本發(fā)明的可溶性TCR或多價TCR復(fù)合物可與能將前藥轉(zhuǎn)化為藥物的酶相連接。這就使前藥僅在需要藥物的位點得以轉(zhuǎn)化為藥物(即通過sTCR靶向)期望本文所揭示的高親和力SLYNTVATL(SEQIDNO:16)-HLA-A*0201特異性TCR可用于診斷和治療AIDS的方法中。出于治療目的，使治療劑定位在HIV感染的(CD4+)細胞鄰近處將增強毒劑或免疫刺激劑的效果。出于疫苗遞送的目的，疫苗抗原可定位于抗原遞呈細胞的附近，從而增強抗原的效力。該方法還可用于成像目的。一個實施方式是包含本發(fā)明TCR的膜制劑?？捎眉毎苽渌瞿ぶ苿?，或者所述膜制劑可包含合成的膜。另一實施方式是具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達載體的細胞。例如，所述細胞可為T細胞。本發(fā)明的其它實施方式是包含以下成分的藥物組合物本發(fā)明的TCR或多價TCR復(fù)合物(任選地與治療劑結(jié)合)，或包含本發(fā)明TCR的膜制劑，或多個具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達載體的細胞，同時還含有藥學(xué)上可接受的載體。AIDS的方法，所述方法包括給予罹患AIDS的對象有效量的本發(fā)明的TCR或多價TCR復(fù)合物，或包含本發(fā)明TCR的膜制劑，或多個具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達載體的細胞。在相關(guān)的實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明TCR或多價TCR復(fù)合物、包含本發(fā)明TCR的膜制劑、或多個具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達載體的細胞在制備治療AIDS的組合物中的用途。本發(fā)明的這些用途和方法的其它具體實施方式是將本發(fā)明的TCR或多價TCR復(fù)合物、或包含本發(fā)明TCR的膜制劑以與治療劑結(jié)合的方式給藥。在其它優(yōu)選的實施方式中，所述具有包含本發(fā)明TCR編碼核酸的表達載體的細胞是CD8+T細胞.本發(fā)明的治療性或成像TCR將通常作為一般包含藥學(xué)上可接受的載體的無菌藥物組合物的一部分應(yīng)用。該藥物組合物可為任何適合的形式(取決于將其給予患者所需的方法)。可以單位劑型提供，(所述單位劑型)通常裝在密封容器中提供，并可作為試劑盒的一部分提供。這種試劑盒通常(雖然并不是必須)裝有使用說明書。其可裝有多種所述的單位劑型。不希望受限于理論，期望本發(fā)明的TCR可提供能遞送治療劑(例如免疫刺激劑和/或針對HIV感染的(CD4+)細胞的細胞毒劑)的有效靶向劑。具體而言，期望將本發(fā)明TCR與免疫刺激劑和/或細胞毒劑一起給藥，并聯(lián)用常規(guī)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法和/或IL-2治療將能靶向HIV感染細胞。以下是在美國獲準使用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的列表Agenerase(安潑那韋)-蛋白酶抑制劑可比韋-疊氮胸苷(300mg)與拉米夫定(150mg)并用Crixivan(印地那韋(indinavir))-蛋白酶抑制劑拉米夫定(3-硫胞苷/lamivudine)—腺苷類似物，逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Epzicom(聯(lián)用兩種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(在同一藥丸中的NRTI;600mgZiagen(阿巴卡韋)和300mg拉米夫定(3TC))Emtriva[恩曲他濱(FTC)]沙奎那韋軟凝膠劑(沙奎那韋)-蛋白酶抑制劑Fuzeon(恩夫韋地(enfuvirtide))-融合抑制劑唑西他賓(ddc/扎西他賓)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Invirase(沙奎那韋)-蛋白酶抑制劑Kaletra(洛匹那韋)-蛋白酶抑制劑Lexiva(福沙那韋)-蛋白酶抑制劑，批準于10/20/03諾韋(利托那韋)-蛋白酶抑制劑Rescriptor(地拉夫定)-非核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑疊氮胸苷，AZT(齊多夫定)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Reyataz(阿扎奈韋(atazanavir);BMS-232632)-蛋白酶抑制劑Sustiva(依法韋侖)-非核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Trizivir(于同一片劑中的3種非核苷；阿巴卡韋+疊氮胸苷+疊氮胸苷Truvada(恩曲他濱+替諾福韋DF)惠妥滋(ddl/地達諾新)核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑惠妥滋EC;(ddl/地達諾新)核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；奈非那韋(那非那韋)-蛋白酶抑制劑Viramune(奈韋拉平)-非核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Viread(奈韋拉平；延胡索酸替諾福韋酯(tenofovirdisoproxilfomarate))核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(阿糖腺苷類)澤瑞特(d4t/司他夫定)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Ziagen(司他夫定)-核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑所述藥物組合物可適于用任何合適的途徑給藥，例如胃腸道外、透皮或通過吸入給藥，優(yōu)選經(jīng)胃腸道外途徑(包括皮下、肌內(nèi)或最優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥)。該組合物可用藥劑領(lǐng)域中己知的任何方法制備，例如在無菌條件下混合活性成分與載體或賦形劑。本發(fā)明物質(zhì)的劑量可根據(jù)待治療的疾病或病癥、待治療個體的年齡和狀況等而有較大不同，醫(yī)師最終可確定所使用的合適劑量。其它方面本發(fā)明的scTCR或dTCR(優(yōu)選由對應(yīng)于人序列的恒定區(qū)或可變區(qū)序列構(gòu)成)可以以基本純的形式、或作為純化或分離的制劑提供。例如，可以基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式提供。也可改變本發(fā)明TCR的一種或多種編碼核酸的序列，從而使得在宿主細胞中獲得的表達水平最優(yōu)化。宿主細胞可為任何適宜的原核細胞或真核細胞。例如，所述宿主細胞可為大腸桿菌(五.co/()細胞或人T細胞。對這些遺傳序列所作出的改變是沉默的，即它們不會改變所編碼的氨基酸序列。有很多提供此類表達最優(yōu)化服務(wù)的公司，包括德國的GeneArt。本發(fā)明也提供與SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性的高親和力TCR的制備方法。所述TCR的特征在于(i)含有至少一個TCRcx鏈可變區(qū)和/或至少一個TCRp鏈可變區(qū)，和(ii)對所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的Kd小于或等于1pM和/或?qū)LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)為1XlO—3S—1或更慢，該方法包括(a)制備含有親本HIVGagTCR的ot禾P卩鏈可變區(qū)的TCR，其中a和(3鏈可變區(qū)的一個或兩個在權(quán)利要求7和8所鑒定的一個或多個氨基酸中含有突變；(b)在適合于TCR和SLYNTVATL-HLA-A*0201結(jié)合的條件下使所述突變的TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201接觸；和測定該相互作用的Kd和/或k。ff。本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征與已作了必要修正的其它各方面的一樣。本文提及的現(xiàn)有技術(shù)文件按照法律所允許的最大程度納入。實施例以下實施例進一步描述了本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下文參考了附圖，其中圖la和lb分別詳細描述了親本HIVGagTCR的a鏈可變區(qū)氨基酸序列和卩鏈可變區(qū)氨基酸序列。圖2a和2b分別顯示了可溶形式親本HIVGagTCRa鏈和|3鏈的DNA序列。圖3a和3b分別顯示了從圖2a和2b的DNA序列產(chǎn)生的HIVGagTCRoc和卩鏈胞外氨基酸序列。圖4a和4b分別顯示了可溶形式HIVGagTCRa和(3鏈的DNA序列經(jīng)突變而能編碼額外的半胱氨酸殘基從而形成非天然的二硫鍵。陰影表示突變的密碼子。下劃線表示限制性內(nèi)切酶識別位點。圖5a和5b分別顯示了從圖4a和4b的DNA序列產(chǎn)生的HIVGagTCRa和p鏈胞外氨基酸序列。陰影表示各鏈中引入的半胱氨酸。圖6詳細描述了高親和力HIVGagTCR變體的cc鏈可變區(qū)氨基酸序列。圖7詳細描述了高親和力HIVGagTCR變體的|3鏈可變區(qū)氨基酸序列。圖8a詳細描述了TRA可溶部分的氨基酸序列。圖8b詳細描述了TRBC1可溶部分的氨基酸序列。圖8c詳細描述了TRBC2可溶部分的氨基酸序列。圖9詳細描述了pEX954質(zhì)粒的DNA序列。圖IO詳細描述了pEX821質(zhì)粒的DNA序列。圖11詳細描述了通過肽接頭連接于野生型人IL-2的親本可溶性HIVGagTCR變體的P鏈氨基酸序列。接頭的氨基酸和IL-2用斜體表示。圖12提供了可溶性二硫鍵連接的親本HIVGagTCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物相互作用的Biacore響應(yīng)曲線。圖13提供了pEX954質(zhì)粒的質(zhì)粒作圖。圖14提供了pEX821質(zhì)粒的質(zhì)粒作圖。圖15a提供了為在人T細胞中表達而優(yōu)化的親本HIVGagTCRa鏈的全長DNA序列。圖15b提供了為在人T細胞中表達而優(yōu)化的親本HIVGagTCR0鏈的全長DNA序列。圖16a提供了親本HIVGagTCRa鏈的全長氨基酸序列。圖16b提供了為在人T細胞中表達而優(yōu)化的親本HIVGagTCRP鏈的全長氨基酸序列。圖17a提供了未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照CD8+T細胞的FACS分析數(shù)據(jù)。圖17b提供了說明親本HIVGagTCR表達在轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8+T細胞表面上的FACS分析數(shù)據(jù)。圖18a和18b分別提供了可溶性二硫鍵連接的高親和力cllc6HIVGagTCR的a和P鏈的氨基酸序列。圖19顯示了在受HIV感染的To細胞存在下，通過IFN-y和TNF-a的產(chǎn)量測定的可溶性二硫鍵連接的高親和力clIc6HIVGagTCR對SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84單克隆T細胞株活化的抑制能力。圖20顯示了在SLYNTVATL肽脈沖的未受HIV感染的To細胞存在下，通過IFN-Y和TNF-a的產(chǎn)量測定的可溶性二硫鍵連接的高親和力clIc6HIVGagTCR對SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84單克隆T細胞株活化的抑制能力。圖21顯示了可溶性二硫鍵連接的高親和力clIc6HIVGagTCR染色SLYNTVATL肽脈沖的T2細胞的能力。實iiW;-包診襲本/z/KGagrc;^資,游^麥性二疏經(jīng)遂麥游rc/游產(chǎn)主圖4a和4b提供了對SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物具有特異性的親本TCR的可溶性二硫鍵連接ap鏈的DNA序列?？捎啥鄠€承包研究公司(contractresearchcompany)從頭合成這些DNA序列，例如GeneArt(德國)?？稍谶@些DNA序列中加入限制性內(nèi)切酶識別位點，從而使得這些DNA序列易于連接入基于pGMT7的表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有用于在大腸桿菌BL21-DE3(pLysS)中高水平表達的T7啟動子(Pan等，腸^c/zm々廳(2000)29(6):1234-8)。該TCRa鏈序列包含導(dǎo)入的C/a/和&///限制性內(nèi)切酶識別位點，并且該序列被連接入用C/a/和Z/zo/切割的pEX954(參見圖9和13)。該TCR|3鏈序列包含導(dǎo)入的Ae/和^ge/限制性內(nèi)切酶識別位點，并且該序列被連接入用A^e/^ge/切割的pEX821(參見圖10和14)。導(dǎo)乂編^rcw舒游"A^游銜劍絲/^級發(fā)街激泣^C/a/-ATCGAT5*淑-GTCGAC-ATTAAT々e/-ACCGGT遂麥采用快速DNA連接試劑盒(rapidDNAligationkit，Roche)，根據(jù)廠商說明書連接切割的TCRouJ3鏈DNA和切割的載體。將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的大腸桿菌菌株XLl-藍細胞，并將其接種于含有100mg/ml氨芐西林的LB/瓊脂平板上。于37'C孵育過夜后，挑選單菌落，使其在10ml含有100mg/ml氨芐西林的LB中于37'C搖動生長過夜。采用Miniprep試劑盒(Qiagen)純化克隆的質(zhì)粒，并采用自動化DNA測序儀(LarkTechnologies)對插入片段進行測序。圖5a和5b分,處激2-^",絲二藏經(jīng)遂麥游///「(^^re//^旁浙力變,游產(chǎn)主可將如實施例1所述產(chǎn)生的可溶性二硫鍵連接的天然HIVGagTCR用作模板，由該模板可產(chǎn)生對SLYNTVATL(SEQIDNO:16)-HLA-A*0201復(fù)合物的親和力提高的本發(fā)明TCR。噬菌體展示是可為鑒別高親和力變體而制備HIVGagTCR變體庫的一種方法。例如，可對Li等(2005)A^ft^e23(3):349-354)描述的TCR噬菌體展示和篩選方法進行調(diào)整并將其用于HIVGagTCR。圖6和7分別列出了與適當?shù)腡CR鏈結(jié)合時對SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物顯示出高親和力的突變TCRa和!3鏈氨基序列(分別為SEQIDNo:11-13和14-15)。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知可通過定點突變將產(chǎn)生這些突變鏈所需的必需密碼子變化導(dǎo)入編碼這些鏈的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定點突變試劑盒)。簡而言之，通過使用摻入所需的一個或多個密碼子變化的引物以及作為誘變模板的含相關(guān)TCR鏈DNA的質(zhì)粒來實現(xiàn)采用以下條件進行誘變50ng質(zhì)粒模板、lpl的10mMdNTP、由廠商提供的5pi的10XPfuDNA聚合酶緩沖液、25pmo1的正向引物、25pmol的反向引物、1^1的pfuDNA聚合酶，總體積為50nl。在95。C進行2分鐘的初始變性之后，進行25個循環(huán)的如下反應(yīng)變性(95。C，10秒)、退火(55'C,10秒)和延伸(72。C，8分鐘)。用DpnI限制性內(nèi)切酶消化所得產(chǎn)物以去除模板質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株XU-藍。通過測序驗證誘變。實嚴伊"-^#WTCA游表這、置叛#//7錄眾將實施例l或2中制備的分別含有突變a鏈和p鏈的表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21pLysS，并于37"C下在TYP培養(yǎng)基(含100嗎/ml氨芐西林)中培養(yǎng)具有氨芐西林抗性的單菌落直至OD6。o為0.4，然后用0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。誘導(dǎo)后3小時用BeckmanJ-6B以4000rpm離心30分鐘收集細胞。將細胞沉淀物重懸在含有50mMTris-HCI、25%(w/v)蔗糖、lmMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、10mMDTTpH8.0的緩沖液中。在過夜的凍融步驟之后，在MilsonixXL2020超聲波儀中用標準的12mm直徑探頭對重懸的細胞進行1分鐘的超聲破碎，總共超聲約IO分鐘。用BeckmanJ2-21離心機以13000rpm離心30分鐘回收包涵體沉淀物。然后用去污劑洗滌三次以去除細胞碎片和膜組分。每次將包涵體沉淀物在Triton緩沖液中均漿(50mMTris-HCl、0.5%Triton-X100、200mMNaCl、10mMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0)，然后用BeckmanJ2-21離心機以13000rpm離心15分鐘使其沉淀。然后在如下緩沖液中進行類似洗滌去除去污劑和鹽50mMTris-HCl、lmMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0。最后，將包涵體分成30mg的等分，并于-70。C冷凍。用6M鹽酸胍溶解并通過Bradford染料結(jié)合測試(PerBio)定量測定包涵體蛋白產(chǎn)率。融化冷凍儲備物中溶有約30mg的TCR|3鏈和60mg的TCRa鏈的包涵體，然后混合樣品，用15ml胍溶液(6M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mMEDTA)稀釋該混合物以確保鏈完全變性。然后將含有完全還原并變性的TCR鏈的胍溶液注入到1升如下的重折疊緩沖液中100mMTrispH8.5、400mML-精氨酸、2mMEDTA、5mM還原性谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、5M尿素、0.2mMPMSF。加入氧化還原對(2-巰乙胺和六甲烯胺(其終濃度分別為6.6mM禾tl3.7mM)，約5分鐘后加入變性的TCR鏈。將溶液靜置5小時±15分鐘。5T士3r，在Spectr叩or1膜(Spectrum;產(chǎn)品編號132670)中用10L10mMTrispH8.1透析重折疊的TCR18-20個小時。然后將透析緩沖液換為新鮮的10mMTrispH8.1(10L)，繼續(xù)在5°?！?匸下再透析20-22小時。從降解產(chǎn)物中分離sTCR，將透析的重折疊蛋白加載到POROS50HQ陰離子交換柱上，然后采用Akta純化儀(Pharmacia)以50倍以上柱體積的0-500mMNaCl梯度溶液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)來純化。將峰部分儲存于4t:，采用考馬斯染色的SDS-PAGE進行分析，然后合并和濃縮。最后，采用在HBS-EP緩沖液(IOmMHEPESpH7.4、150mMNaCl、3.5mMEDTA、0.05%乙基苯基聚乙二醇p40(nonidetp40))預(yù)平衡的Superdex200HR凝膠過濾柱純化和表征sTCR。收集并濃縮在相對分子量約為50kDa洗脫的峰，然后用BIAcore表面等離子共振分析法表征。-表厥箏蓐f關(guān)嚴表C茲^f錄,絲pMi/C游JC/采用表面等離子共振生物傳感器(Biacore3000")來分析sTCR與其肽-MHC配體的結(jié)合。產(chǎn)生以半定向形式固定于抗生物素蛋白鏈菌素包被的結(jié)合表面的一種pMHC復(fù)合物(如下所述)有助于該分析并可同時有效測試可溶性T-細胞受體與多達4種不同pMHC(固定于不同流動小室)的結(jié)合。手工注射HLA復(fù)合物易于操控固定的I類分子的精確水平。體外重新折疊含有組成性亞單位蛋白和合成肽的細菌表達的內(nèi)涵體的生物素化I類HLA-A*0201分子，然后純化并在體外進行酶生物素化(O'Callaghan#"(1999)ja/.B/ocAe/w.266:9-15)。所表達的HLA-A+0201-重鏈具有C末端生物素化標簽，其在適合的構(gòu)建物中替代了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。獲得的內(nèi)涵體表達水平約75mg/升細菌培養(yǎng)物。還從適合的構(gòu)建體在大腸桿菌中表達了MHC輕鏈或(52-微球蛋白，其水平約為500mg/升細菌培養(yǎng)物。裂解大腸桿菌細胞，將內(nèi)涵體純化到約80%的純度。在6M鹽酸胍、50mMTrispH8.1、100mMNaCl、10mMDTT、10mMEDTA中使內(nèi)涵體的蛋白質(zhì)變性，通過在低于5'C將變性蛋白一次脈沖加入重折疊緩沖液，以30mg/升重鏈、30mg/升(32m的濃度在0.4ML-精氨酸-HCl、100mMTrispH8.1、3.7mM六甲烯胺、6.6mM(3-巰乙胺，負載于HLA-A*0201分子所需的4mg/mlSLYNTVATL肽中重折疊。重折疊在4'C時進行至少1小時方能完成。用IO倍體積的10mMTrispH8.1進行透析來更換緩沖液。需更換緩沖液2次以充分降低溶液的離子強度。然后用1.5pm的醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，并加載到POROS50HQ陰離子交換柱上(8ml的床體積)。用線性0-500mMNaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)。以約250mMNaCl洗脫HLA-A"201-肽復(fù)合物，收集峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)，然后在冰上冷藏該部分。采用以10mMTrispH8.1、5mMNaCl平衡的Pharmacia快速脫鹽柱，將生物素化標記的pMHC分子的緩沖液更換為10mMTrispH8.1、5mMNaCl。洗脫后立即將含蛋白質(zhì)的組分置于冰上冷藏，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)。然后加入生物素試劑lmM生物素、5mMATP(緩沖至pH8)、7.5mMMgCb禾口5嗎/mlBirA酶(根據(jù)O，Callaghan#"(1999)勘a/.266:9-15進行純化)。然后將該混合物在室溫下孵育過夜。采用凝膠過濾層析來純化生物素化的pHLA-AW201分子。用經(jīng)過濾的PBS預(yù)平衡PharmaciaSuperdex75HR10/30柱，然后加載1ml生物素化反應(yīng)混合物，用PBS以0.5ml/分鐘洗脫柱。生物素化的pHLA-A*0201分子在約15ml時以單峰洗脫。合并含蛋白質(zhì)的組分，在冰上冷藏，然后加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結(jié)合分析法(PerBio)測定蛋白質(zhì)濃度，將生物素化pHLA-A*0201分子的等份試樣冷凍于-20°C。采用標準胺偶聯(lián)法固定抗生物素蛋白鏈菌素。該固定化的復(fù)合物與T-細胞受體和共同受體CD8otoc均能結(jié)合，這些受體都可注入可溶相。即便是在低濃度下(至少40Mg/ml)也獲得了TCR的特異性結(jié)合，這就暗示了TCR相對穩(wěn)定。如果采用溶解的或固定相的sTCR，所觀察到的sTCR的pMHC結(jié)合特性在質(zhì)量和數(shù)量上類似。這是可溶性物質(zhì)的部分活性的一種重要控制方法，也提示生物素化的pMHC復(fù)合物與非生物素化復(fù)合物具有相同的生物學(xué)活性。在Biacore3000tm表面等離子共振(SPR)生物傳感器上分析含新的鏈間鍵的HIVGagsTCR與其配體/MHC復(fù)合物或無關(guān)HLA-肽組合物之間的相互作用(其產(chǎn)生如上所述)。在一流動小室中，SPR檢測到傳感器表面附近以響應(yīng)單元(RU)表示的折光率發(fā)生變化，該原理可用于檢測受體配體相互作用和分析它們的親和力以及動力學(xué)參數(shù)。所述探針流動小室如下制備通過交聯(lián)到p2m上的生物素與已化學(xué)交聯(lián)到流動小室的活性表面上的抗生物素蛋白鏈菌素之間的結(jié)合，將各HLA-肽復(fù)合物固定在不同的流動小室中。然后使sTCR以恒定的流速通過不同流動小室的表面，并測定該情況下的SPR響應(yīng)以進行測試。情錄^煮',層定制備了親本或突變HIVGagsTCR的連續(xù)稀釋液，以5pl/分鐘的恒定流速注入兩個不同的流動小室；一個流動小室用約1000RU的特異性SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物包被，另一個用約1000RU的非特異性HLA-A2-肽復(fù)合物包被。采用對照小室的測定值對各濃度的響應(yīng)進行標準化。以標準化數(shù)據(jù)響應(yīng)對TCR樣品的濃度作圖，擬合成雙曲線(hyperbola)以計算平衡結(jié)合常數(shù)，KD。(Price&Dwek，PrinciplesandProblemsinPhysicalChemistryforBiochemists(2ndEdition)，《生物化學(xué)的物理化學(xué)中的原理和問題》第二版，1979，ClarendonPress,牛津)。動力學(xué)參教層定通過試驗測定解離速率常數(shù)Kd和結(jié)合速率常數(shù)Ka來確定高親和力TCR的KD。平衡常數(shù)KD計算為kd/ka。將TCR注射流過兩個不同小室，一個用約300RU的特異性HLA-A2-nyeso肽復(fù)合物包被，另一個用約300RU的非特異性HLA-A2-肽復(fù)合物包被。流速設(shè)置為50pl/分鐘。通常以約3pM的濃度注入250pi的TCR。然后使緩沖液流過直到響應(yīng)回復(fù)到基線。采用Biaevaluation軟件計算動力學(xué)參數(shù)。也將解離相擬合為單指數(shù)衰變方程式以計算半衰期。茲菜釆用上述方法分析可溶性二硫鍵連接的天然HIVGagTCR(由SEQIDNO:9禾B10分別詳述的a和(3TCR鏈組成)和SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物之間的相互作用，顯示I(D為85nM，解離速率(k。ff)為2.21Xl(T2S"。(Biacore響應(yīng)曲線可參見圖12)下表所述TCR具有的KD小于或等于1MM禾P/或k。ff為1X10—3S—1或更慢。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>貧^W5-/^霧絲葛凌浙力///FGagrCT-勞fMX^^歪/^游產(chǎn)主可利用大致上如實施例1-3中所述方法產(chǎn)生可溶性高親和力HIVGagTCR-野生型(WT)人IL-2融合蛋白。簡言之，將編碼所需接頭和WT人IL-2的DNA加到可溶性二硫鍵連接的親本HIVGagTCR(3鏈3'端，即直接在TAA("終止")密碼子的前部。圖11提供了融合蛋白的氨基酸序列，該融合蛋白包含通過接頭序列融合到WT人IL-2的二硫鍵連接的親本HIVGagTCR卩鏈(SEQIDNO:24)。該融合蛋白的接頭和IL-2部分用斜體表示。然后可將編碼該構(gòu)建物的DNA連接入pEX821。然后可采用基本上如實施例3所述的方法，使該(3鏈融合蛋白與圖5a詳述的可溶性二硫鍵連接的親本HIVGaga鏈TCR鏈相結(jié)合，從而表達可溶性親本HIVGagTCR-IL-2融合蛋白。實督/6-#本鮮G"gra,T—鍾表,J:游重資表這合成了編碼親本HIVGagTCR鏈的信號序列、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的DNA構(gòu)建物(GeneArt，德國)。這些TCRa鏈和TCR卩鏈DNA序列(分別示于圖15a和15b)與親本HIVGagTCRDNA序列不同，從而增強了所編碼的TCR鏈在人T細胞中的表達水平，并同時保留了天然氨基酸序列。圖16a和16b提供了分別由圖15a和15b所示DNA序列編碼的全長氨基酸序列。然后將TCRa鏈和TCR(3鏈DNA序列一起插入慢病毒(Lentiviral)表達載體。該載體包含作為單個開放讀框的編碼親本HIVGagTCRa鏈和卩鏈和隔開TCR鏈的框內(nèi)口蹄疫病毒(FMDV)2A分裂因子(cleaviagefactor)氨基酸序列(LLNFDLLKLAGDVESNPG(SEQIDNO:31))的DNA序列。(deFelipe等，Ge"e,Facc/"^77zw(2004)2(1):13)。在mRNA翻譯時，產(chǎn)生了在C末端具有2A肽序列的TCRa鏈，而TCRp鏈則作為單獨的多肽產(chǎn)生。用上述慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞。簡言之，用抗CD3/抗CD28珠刺激原始(primary)T細胞24小時。然后將表達TCR基因的慢病毒濃縮上清液與經(jīng)刺激的T細胞一起孵育以進行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后去除抗CD3/抗CD28珠，培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞直到它們達到200-300fL的"靜體積"(restingvolumn)。利用HLA-A*0201-SLYNTVALTPE三聚體和抗CD8單克隆抗體FITC共染色，通過FACS分析證實親本HIVGagTCR遞呈到轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞表面上。錄菜圖17b提供了FACS分析數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示親本HIVGagTCR成功地表達在轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細胞表面。圖17a提供了利用對照的未轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞產(chǎn)生的FACS分析數(shù)據(jù)。7-^銀絲腐;黃^7力///rGagTOC7X/g眾游漸劍進行了以下測試以證實可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR能抑制SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性單克隆T細胞株的活化。///f感染潘應(yīng)存在7oxs4^sxKv:n^^反應(yīng)絲^^"虔r潘應(yīng)^/g歸漸劍鋪本試驗中采用的可溶性cllc6高親和力HIVGagTCR包含分別如圖6c(SEQIDNO:13)和圖7b(SEQIDNO:15)所示的TCRa鏈可變區(qū)和TCR(5鏈可變區(qū)。該可溶性TCR的TCRa和卩鏈全長序列分別示于圖18a(SEQIDNO:29)和圖18b(SEQIDNO:30)中。將IFN-y和TNF-a的產(chǎn)生用作CTL活化的顯示。微RIO分析培養(yǎng)基10%FCS(經(jīng)熱滅活，Gibco，目錄號10108-165)、88%RPMI1640(Gibco，目錄號42401-018)、1%谷胺酰胺(Gibco，目錄號25030-024)和"/。青霉素/鏈霉素(Gibco，目錄號15070-063)。肽(獲自各種來源)最初溶于DMSO(Sigma，目錄號D2650),濃度為4mg/ml，凍存。BDTM細胞計數(shù)珠芯片試劑盒(BDTMCytometricBeadArrayKit)，人Thl/Th2細胞因子試劑盒II(HumanThl/Th2cytokineKitII，BDBiosciences,圣迭戈，美國)包含了該測試所需的所有試劑。r鄰應(yīng)^眾/，試洗漆慢性HIV感染的To靶細胞(HXB2和HIV3BHIV試驗株)，并重懸于RIO培養(yǎng)基中。作為對照，加入未感染的To靶細胞和lnM的SLYNTVATL肽，于37匸、5%。02中(培育)30分鐘。96孔U型底培養(yǎng)板中每孔含有RIO培養(yǎng)基配制的25,000個HIV感染的To耙細胞。每孔中含有RIO培養(yǎng)基配制的2X10—7M高親和力cllc6HIVGagTCR或親本HIVGagTCR。每孔中含有RIO培養(yǎng)基配制的50000X84單克隆效應(yīng)T細胞株。上述替代的無關(guān)可溶性TCR(HLA-A*0201-Tax特異性和HLA-A*0201-NY-ESO特異性TCR)或高親和力HIVGagTCR。然后將板在37。C、5%(302中孵育4小時。去除培養(yǎng)上清液，采用如下方法測定IFN-y和TNF-a存在的水平。/FjV7浙7WF-cc,/試根據(jù)廠商說明書制備(a)IFNY捕獲抗體和(b)抗TNFa捕獲抗體包被的bdtm細胞計數(shù)珠。然后制備含有以下添加物的多個分析管50p舊D測試稀釋液配制的混合抗IFNy和抗TNFabdtm細胞計數(shù)珠50plPE檢測試劑方法如下從T細胞活化測試孔中取出50pl培養(yǎng)上清液(試樣)或通過連續(xù)稀釋儲備標準液制備各濃度范圍的50pl混合IFNY和TNFa標準液(定標標準物)然后避光孵育試管3小時，再用lmlBD洗滌緩沖液洗滌，離心。最后，將這些珠重懸于300pl洗滌緩沖液中，通過流式細胞術(shù)根據(jù)廠商的說明書測定IFNy和TNFa存在的水平。以s丄]wnM7xi(fi^^游未^"糴ro潘應(yīng)存,7^s丄iwr^4r丄-特弄絲多jT虔r潘應(yīng)系游,虔y采用上述CTL活化測試所用的相同試劑和方法，除了在各T細胞活化測試中使用20000X84多克隆效應(yīng)T細胞。用1(T1G-l(T8MSLYNTVATL肽脈沖的未感染To類淋巴母細胞用作靶T細胞。錄菜通過IFN-y禾卩TNF-a產(chǎn)量測得，在HIV感染的To細胞存在下，可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR強烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84多克隆T細胞株活化(參見圖19)。通過IFN-y和TNF-a產(chǎn)量測得，在SLYNTVATL脈沖的未感染To細胞存在下，可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR強烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反應(yīng)性0X84多克隆T細胞株的活化(參見圖20)。實^Ws-邀過貴i^微籍^募襲^7力"/c(5///kc^gre/定著粼定if嚴;^游77紛應(yīng)J:游潘應(yīng)表鷹SLlW7T^r丄HJ"廁貧嚴通過單分子熒光顯微鏡用可溶性高親和力cllc6HIVGagTCR測定肽脈沖的T2類淋巴母細胞上SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原的數(shù)量(基于假設(shè)一個熒光信號與一個標記TCR結(jié)合其位于靶細胞表面的同源pMHC配體有關(guān))。采用生物素化TCR靶向表達抗原的癌細胞，然后用抗生物素蛋白鏈菌素R-藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)物來標記與細胞結(jié)合的TCR有助于該項測定。然后用三維熒光顯微鏡使單個PE分子成像。37。C用一定濃度范圍(10—5-1CT"M)的HIVGag-衍生的SLYNTVATL肽或無關(guān)肽(SLLMWITQC)脈沖T2類淋巴母細胞90分鐘。脈沖后，用50(^1PBS洗滌細胞2次。室溫下，將細胞孵育于200pl的TCR溶液中(100nM高親和力cllc6HIVGagTCR，用含0.5%BSA白蛋白的PBS配制)30分鐘。去除TCR溶液，用500plPBS洗滌細胞3次。室溫下，在200pl抗生物素蛋白鏈菌素-PE溶液中(5嗎ml"含0.5%BSA的PBS配制的抗生物素蛋白鏈菌素-PE中)避光孵育細胞20分鐘。去除抗生物素蛋白鏈菌素-PE溶液，用500plPBS洗滌細胞3次。去除洗滌介質(zhì)，將細胞保存在400plRlO中，在用熒光顯微鏡成像前不加入酚紅。資光^微法采用Axiovert200M(Zeiss)顯微鏡以63X油鏡(Zeiss)進行熒光顯微法。用將裝有300W氤弧燈(Sutter)的XLS光源照明，通過在光路中放入0.3和0.6中密度濾片將光強減低到優(yōu)化水平。采用TRITC/Dil濾波器組(Chroma)來分離激發(fā)和發(fā)射光譜。通過z-疊層(z-stack)采集(21個平面，1pm間隔)使細胞三維成像。采用如(Irvine等，淑匿419:p845-9禾口Purbhoo等，NatureImmunology5:p524-30)所述的Metamorph軟件(UniversalImaging)進行圖像采集和分析。茲菜如圖21所示，上述方法成功地使與肽脈沖的T2細胞表面上的SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原結(jié)合的高親和力cllc6HIVGagTCR成像。這些結(jié)果顯示采用高親和力c6cllHIVGagTCR對SLYNTVATL肽脈沖的細胞上表位進行計數(shù)的閾值約為10力M肽。權(quán)利要求1.一種T細胞受體(TCR)，其對于SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性，且包含至少一個TCRα鏈可變區(qū)和/或至少一個TCRβ鏈可變區(qū)，其特征在于，所述TCR對所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的KD小于或等于1μM和/或?qū)LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(koff)為1×10-3S-1或更慢，前提是當所述TCR由細胞遞呈并包含SEQIDNO1和2時，該細胞不是天然T細胞。2.如權(quán)利要求1所述的TCR，其包含a鏈可變區(qū)和TCR(3鏈可變區(qū)。3.如權(quán)利要求1所述的TCR，其為aa或即同二聚體。4.如前述任一權(quán)利要求所述的T細胞受體(TCR)，其特征在于，所述KD和/或k。ff用表面等離子共振法測定。5.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其相對于親本HIVGagTCRa鏈可變區(qū)(SEQIDNo:1)和/或卩鏈可變區(qū)(SEQIDNO:2)在至少一個互補決定區(qū)中存在突變。6.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其相對于親本HIVGagTCRoc鏈可變區(qū)(SEQIDNo:1)和/或(3鏈可變區(qū)(SEQIDN0:2)在其至少一個可變區(qū)框架區(qū)中存在突變。7.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:l所示編號，a鏈可變區(qū)氨基酸95T5、96N、97S、98G和IOOA中的一個或多個發(fā)生突變。8.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:2所示編號，(3鏈可變區(qū)氨基酸51Y、52E、53E和54E中的一個或多個發(fā)生突變。9.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的TCR，采用SEQIDNO:l所示編號，其包含a鏈可變區(qū)氨基酸95S、95G、96A、97H、98D或100S中的一個或多個。10.如權(quán)利要求l-6或9中任一項所述的TCR，采用SEQIDNO:2所示編號，其包含(3鏈可變區(qū)氨基酸51V、51A、52R、52L、53G或54V中的一個或多個。11.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的TCR，其包含SEQIDNO:ll-13所示a鏈可變區(qū)氨基酸序列之一，任選包含一個或多個表型沉默取代。12.如權(quán)利要求1-6或11中任一項所述的TCR，其包含SEQIDNO:14-15所示P鏈可變區(qū)氨基酸序列之一，任選包含一個或多個表型沉默取代。13.如權(quán)利要求2所述的TCR，其包含下表所示的a和P鏈可變區(qū)對，任選地包含一個或多個表型沉默取代<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>14.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其還包括SEQIDNO:19所示的a鏈恒定區(qū)氨基酸序列和/或SEQIDNO:20和21所示的e鏈氨基酸恒定區(qū)序列之一，任選地包含一個或多個表型沉默取代。15.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其為二聚T細胞受體(dTCR)或單鏈T細胞受體(scTCR)。16.如權(quán)利要求4-15中任一項所述的TCR，其為包含如下區(qū)段的scTCR:第一區(qū)段，其由對應(yīng)于TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成；第二區(qū)段，其由對應(yīng)于TCR(5鏈可變區(qū)序列并融合于對應(yīng)于TCR(3鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列構(gòu)成；和接頭序列，該序列連接第一區(qū)段的C末端和第二區(qū)段的N末端。17.如權(quán)利要求4-15中任一項所述的TCR，其為包含如下區(qū)段的scTCR:第一區(qū)段，其由對應(yīng)于TCRe鏈可變區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成；第二區(qū)段，其由對應(yīng)于TCRoc鏈可變區(qū)序列并融合于對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列構(gòu)成；和接頭序列，該序列連接第一區(qū)段的C末端和第二區(qū)段的N末端。18.如權(quán)利要求16或17所述的TCR，其還包含位于第一和第二鏈之間的二硫鍵，所述二硫鍵在天然a(3T細胞受體中沒有等價物，且其中所述接頭序列的長度和所述二硫鍵的位置使得第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列相互取向基本上與天然a(3T細胞受體相同。19.如權(quán)利要求16-18中任一項所述的scTCR，其特征在于，在結(jié)合部分中，所示接頭序列連接第一區(qū)段的C末端和第二區(qū)段的N末端。20.如權(quán)利要求16-19中任一項所述的scTCR，其特征在于，在結(jié)合部分中，所述接頭序列具有結(jié)構(gòu)式-000-(80000)5--(SEQIDNO:17)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQIDNO:18)，其中P為脯氨酸，G為甘氨酸，S為絲氨酸。21.如權(quán)利要求l、2或4-15中任一項所述的TCR，其是包含如下區(qū)段的dTCR:第一多肽，其中對應(yīng)于TCRoc鏈可變區(qū)序列的序列融合于對應(yīng)于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端；和第二多肽，其中對應(yīng)于TCRP鏈可變區(qū)序列的序列融合于對應(yīng)于TCR(3鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端，所述第一和第二多肽通過二硫鍵連接，該二硫鍵在天然aPT細胞受體中沒有等價物。22.如權(quán)利要求21所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵連接所述恒定區(qū)序列的氨基酸殘基，該二硫鍵在天然TCR中沒有等價物。23.如權(quán)利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵位于半胱氨酸殘基之間，所述半胱氨酸對應(yīng)于天然TCR中P碳原子距離小于0.6nm的氨基酸殘基。24.如權(quán)利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵位于半胱氨酸殘基之間，所述半胱氨酸殘基取代TRAC*01外顯子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等價物的外顯子1的Ser57。25.如權(quán)利要求15-24中任一項所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR結(jié)合部分包括二硫鍵，所述二硫鍵位于對應(yīng)于在天然TCR中由二硫鍵連接的那些殘基的殘基之間。26.如權(quán)利要求14-23中任一項所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR結(jié)合部分不含對應(yīng)于天然TCR跨膜或胞質(zhì)序列的序列。27.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR與至少一條聚亞垸基二醇鏈相連。28.如權(quán)利要求27所述的TCR，其特征在于，所述一條或多條聚亞烷基二醇鏈與TCR共價連接。29.如權(quán)利要求27或28所述的TCR，其特征在于，所述一條或多條聚亞垸基二醇鏈包含至少兩個聚乙二醇重復(fù)單元。30.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其還包括位于其a或(3鏈C末端或N末端的反應(yīng)活性半胱氨酸。31.如前述任一權(quán)利要求所述的TCR，其與治療劑或可檢測部分連接。32.如權(quán)利要求31所述的TCR，其特征在于，所述TCR與所述治療劑或可檢測部分共價連接。33.如權(quán)利要求31所述的TCR，其特征在于，所述治療劑或可檢測部分與一條或兩條TCR鏈的C末端共價連接。34.如權(quán)利要求31-33中任一項所述的TCR，其與治療劑連接，所述治療劑為免疫效應(yīng)分子。35.如權(quán)利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應(yīng)分子是細胞因子。36.如權(quán)利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應(yīng)分子是IL-2或其功能性變體或片段。37.如權(quán)利要求31-33中任一項所述的TCR，其特征在于，所述治療劑是細胞毒劑。38.如權(quán)利要求31-33中任一項所述的TCR，其特征在于，所述治療劑是放射性核素。39.—種多價TCR復(fù)合物，其包含前述任一權(quán)利要求中所述的至少兩個TCR。40.—種多價TCR復(fù)合物，其包含通過非肽聚合物鏈或肽接頭序列連接的前述任一權(quán)利要求中所述的至少兩個TCR。41.如權(quán)利要求40所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，所述聚合物鏈或肽接頭序列在各TCR的氨基酸殘基之間延伸，所述氨基酸殘基不位于TCR可變區(qū)序列中。42.如權(quán)利要求40或41所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，所述TCR通過聚亞垸基二醇鏈或衍生自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭連接。43.如權(quán)利要求42所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，二價亞垸基間隔基團位于所述聚亞烷基二醇鏈和其與所述復(fù)合物的TCR的連接點之間。44.如權(quán)利要求40或41所述的TCR復(fù)合物，其特征在于，所述聚亞垸基二醇鏈包括至少兩個聚乙二醇重復(fù)單元。45.—種多價TCR復(fù)合物，其包含如權(quán)利要求1-30中任一項所述的TCR中的至少兩個TCR，其中(i)所述TCR中的至少一個與權(quán)利要求31-38中任一項所述的治療劑連接。46.—種膜制劑，其包含權(quán)利要求1-26中任一項所述的TCR。47.—種包含表達載體的細胞，該表達載體包含權(quán)利要求1-26中任一項所述的TCR的編碼核酸。48.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-45中任一項所述的TCR或多價TCR復(fù)合物、或權(quán)利要求46所述的膜制劑、或多個權(quán)利要求47中所述的細胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。49.一種治療AIDS的方法，所述方法包括給予罹患AIDS的對象有效量的權(quán)利要求1-45中任一項所述的TCR或多價TCR復(fù)合物、或權(quán)利要求46所述的膜制劑、或多個遞呈權(quán)利要求1-30中任一項所述的TCR中的多個TCR的T細胞。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，以與治療劑結(jié)合的形式給予TCR或多價TCR復(fù)合物、或包含TCR的膜制劑。51.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，給予多個遞呈多個TCR的T細胞，且所述T細胞是CD8+T細胞。52.權(quán)利要求1-45中任一項所述的TCR或多價TCR復(fù)合物、或權(quán)利要求46所述的膜制劑、或多個權(quán)利要求47中所述的細胞在制備治療AIDS的組合物中的用途。53.如權(quán)利要求52所述的用途，其特征在于，以與治療劑結(jié)合的方式給予TCR或多價TCR復(fù)合物、或含有TCR的膜制劑。54.如權(quán)利要求52所述的用途，其特征在于，給予多個遞呈多個TCR的T細胞，且所述T細胞是CD8+T細胞。55.—種產(chǎn)生對SLYNTVATL-HLA-A*0201具有結(jié)合特性的高親和力TCR的方法，其特征在于，所述TCR(i)包含至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個TCR卩鏈可變區(qū)，和(ii)其對所述SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的KD小于l|iM和/或?qū)λ鯯LYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的解離速率(k。ff)小于1X10—3，所述方法包括(a)產(chǎn)生包含HIVGagTCR的a禾B|3鏈可變區(qū)的TCR，其中a禾Q卩鏈可變區(qū)中的一條或兩條在權(quán)利要求7和8中所限定的一個或多個氨基酸中含有突變；(b)在適于使所述突變的TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201結(jié)合的條件下，使所述TCR與SLYNTVATL-HLA-A*0201接觸；禾口測定該相互作用的Kd和/或k。ff。全文摘要本發(fā)明提供了對SLYNTVATL-HLA-A*0201復(fù)合物的親和力(K_D)小于或等于1μM和/或解離速率(k_off)為1×10^-3S^-1或更慢的TCR，前提是當所述TCR由細胞遞呈并包含SEQIDNO1和2時，所述細胞不是天然T細胞。此類TCR可單獨使用或與治療劑聯(lián)用，以靶向于遞呈該復(fù)合物的HIV感染細胞。文檔編號C07K14/725GK101155829SQ200680011470公開日2008年4月2日申請日期2006年3月29日優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日發(fā)明者B·K·雅各布森,P·E·莫洛伊,S·M·鄧恩,懿李申請人:阿維德克斯有限公司