一種glp-1受體激動(dòng)劑的受體親和力測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及受體親和力測定方法，具體涉及一種GLP-1受體 激動(dòng)劑的受體親和力測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸促胰島素是指人體在進(jìn)食后由腸道分泌的一類可引起降血糖效應(yīng)多肽的總稱。 由腸促胰島素引起的胰島素分泌約占其分泌總量的50%~70%。近年來，以胰高血糖素樣 肽-l(GLP-l)為代表的腸促胰島素類藥物在糖尿病治療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。GLP-1與其受 體結(jié)合后可激活與之偶聯(lián)的G蛋白，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度并激活蛋白激酶A(PKA)，由此上 調(diào)0細(xì)胞內(nèi)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而增加胰島素分泌量并增強(qiáng)葡萄糖刺激信號(hào)的 敏感性，發(fā)揮降糖效果。由于其降血糖效應(yīng)具有血糖依賴性，因而將GLP-1用于II型糖尿 病治療時(shí)所誘發(fā)低血糖的風(fēng)險(xiǎn)極低，是一項(xiàng)非常重要的安全特性。此外，GLP-1還可以通過 抑制胰高血糖素的分泌、抑制腸蠕動(dòng)、減少胃排空、促進(jìn)胰島0細(xì)胞的增殖與分化并抑制 其凋亡等方式來調(diào)節(jié)血糖。然而，GLP-1在人體內(nèi)易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，體內(nèi) 半衰期不足5min，這在很大程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。GLP-1受體激動(dòng)劑可與體內(nèi) 廣泛分布的GLP-1受體（GLP-1R)結(jié)合，發(fā)揮與GLP-1類似的藥理作用，這使得GLP-1R激動(dòng) 劑成為一類治療II型糖尿病的理想的候選藥物分子。
[0003] Exendin-4是從美洲巨蜥的唾液中提取的一種由39個(gè)氨基酸構(gòu)成的GLP-1類似 物，與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的GLP-1具有53%的同源性，是一種天然的能夠抵抗DPP-4降解的 GLP-1R激動(dòng)劑。由于Exendin-4與GLP-1R具有更高的親和力，因而能發(fā)揮更為顯著的降 血糖作用；同時(shí)Exendin-4在體內(nèi)能夠發(fā)揮比GLP-1更持久的生物學(xué)活性。人工合成的 Exendin-4,商品名為Byetta，是由美國艾美林公司（Amylin)和禮來公司（Eli Lilly)聯(lián)合 開發(fā)的皮下注射液，于2005年獲FDA批準(zhǔn)上市，作為磺脲類及二甲雙胍等藥物治療不能達(dá) 標(biāo)的II型糖尿病患者的輔助用藥。但由于該藥物仍然存在著體內(nèi)半衰期較短（2. 4h)，用藥 次數(shù)頻繁（一天用藥兩次）等問題，使其在臨床上的應(yīng)用也受到了一定程度的限制。
[0004] 由此可見，開發(fā)親和力更高、性質(zhì)更優(yōu)良，作用時(shí)間更長的新型GLP-1R激動(dòng)劑具 有重要的臨床意義和巨大的市場潛力。為此，藥物研發(fā)人員針對(duì)GLP-1和Exendin-4分子， 進(jìn)行了大量的化學(xué)改構(gòu)與修飾等方面的研宄，同時(shí)非肽類的小分子GLP-1受體激動(dòng)劑的研 發(fā)也取得了一定的成果。隨著大量來源不同，物理化學(xué)性質(zhì)各異的GLP-1受體激動(dòng)劑被開 發(fā)出來，對(duì)高效、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)和篩選GP1-R激動(dòng)劑類藥物的方法提出了新的要求，而基于 GP1-R激動(dòng)劑的受體親和力的測定是快速，高通量篩選此類藥物的一項(xiàng)重要依據(jù)。常用的 測定方法包括以下三類：（1)基于放射性同位素受體配體結(jié)合的原理，將同位素標(biāo)記的藥 物分子和原型分子共同作用于高表達(dá)GLP-1R的細(xì)胞，通過檢測最總結(jié)合到細(xì)胞上的放射 性強(qiáng)度來計(jì)算出藥物的親和力，但該方法依賴于同位素標(biāo)記技術(shù)，且對(duì)人體有一定的傷害。 (2)以酶聯(lián)免疫分析吸附試驗(yàn)（ELISA)、均相放射免疫閃爍迫近分析法為代表的針對(duì)GPCR 信號(hào)通路中第二信使cAMP/cGMP的檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單一靶點(diǎn)的單一功能分析，但專屬性 較差，可能會(huì)存在細(xì)胞內(nèi)源性的干擾作用。（3)報(bào)告基因測定法：基于GLP-1R及相關(guān)信號(hào) 通路的功能測定可作為高通量篩選GLP-1R激動(dòng)劑類藥物的重要手段。與傳統(tǒng)的受體功能 檢測法相比，該法能夠區(qū)分激動(dòng)劑和拮抗劑，是篩選受體激動(dòng)劑和拮抗劑的有效方法。目前 常用的報(bào)告基因有：氯霉素乙酞轉(zhuǎn)移酶，堿性磷酸化酶，P-半乳糖昔酶，綠色熒光蛋白和熒 光素酶等。熒光素酶（Luciferase)是一類能夠催化不同底物發(fā)生氧化作用并伴隨發(fā)出生 物熒光的酶，其檢測速度快，靈敏度高、穩(wěn)定性好、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，具有其他報(bào)告基因無 可替代的優(yōu)勢。
[0005] 本實(shí)驗(yàn)室前期研宄中，基于G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路和熒光素酶報(bào)告基因 檢測技術(shù)，通過重組質(zhì)粒構(gòu)建、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及加壓篩選等手段，獲得了能穩(wěn)定共表達(dá)螢火 蟲熒光素酶與GLP-1R，并能特異性響應(yīng)GLP-1R介導(dǎo)的cAMP響應(yīng)元件（CRE)的工具細(xì)胞 株--CH0-GLP-1 R-CRE-Luc+。
[0006] 利用熒光素酶報(bào)告基因法所構(gòu)建的細(xì)胞篩選模型，建立GLP-1R激動(dòng)劑的受體親 和力測定方法，從而對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)與篩選，可作為此類藥物早期研發(fā)與篩選過程中的一種 有效措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種GLP-1受體激動(dòng)劑的受體親和力測定方 法。本發(fā)明基于熒光素酶報(bào)告基因法，通過因素考察與優(yōu)化，建立了一種測定GLP-1R激動(dòng) 劑的受體親和力的方法，可用于GLP-1R激動(dòng)劑的快速評(píng)價(jià)與篩選。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 利用CH0-GLP-1R-CRE-LUC+細(xì)胞，測定GLP-1R激動(dòng)劑的受體親和力的實(shí)驗(yàn)步驟如 下：
[0010] ⑴細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代：
[0011] 從液氮罐中取出凍存的CH0-GLP-1R-CRE-LUC+細(xì)胞，將細(xì)胞快速融化復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)入 含5mL細(xì)胞生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長后，用 0. 25%胰蛋白酶消化傳代，每3天按1 : 3比例傳代1次。
[0012] ⑵細(xì)胞接種與培養(yǎng)：
[0013] 取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用0. 25%胰酶消化，1000r/min離心5min，棄上清，將細(xì) 胞重懸于含0. 25% FBS(胎牛血清）的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，記數(shù)。將細(xì)胞懸液稀釋至 一定濃度后，以100 U L/孔接種于96孔板。于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。
[0014] (3)待測樣品溶液的配制與稀釋：
[0015] 配制待測樣品溶液，通過BCA法測定其濃度，以含有0. 25 % FBS的DMEM/F12培養(yǎng) 基對(duì)對(duì)待測樣品按倍比依次稀釋，得到10-11個(gè)不同濃度梯度。
[0016] (4)待測樣品作用于細(xì)胞：
[0017] 將上述不同濃度梯度的待測樣品，按每孔20 yL加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)待測樣 品的濃度設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0018] (5)熒光素酶與化學(xué)發(fā)光底物作用：
[0019] 將化學(xué)發(fā)光底物與含有細(xì)胞裂解液的底物緩沖液（均購自Promega公司）混勻。 以每孔100 y L加至上述孵育后的細(xì)胞板中。室溫下，在振蕩器上震蕩一定時(shí)間后轉(zhuǎn)移至96 孔酶標(biāo)板中。
[0020] (6)熒光強(qiáng)度測定：
[0021] 使用化學(xué)發(fā)光分析儀（Luminoskan Ascent，Thermo Scientific)，以 Is/孔的速 度讀取各孔的熒光強(qiáng)度，以相對(duì)光單位（RLU)表示。
[0022] (7)數(shù)據(jù)處理：以所測樣品的摩爾濃度的對(duì)數(shù)值（Log[M])為橫坐標(biāo)，所測各樣品 孔的熒光強(qiáng)度（RL值）為縱坐標(biāo)繪制量效曲線。并通過軟件GraphPad Prism 5.0非線性 擬合中的Dose-response-Stimulation模式對(duì)量效曲線進(jìn)行參數(shù)擬合，計(jì)算樣品的半數(shù)有 效濃度（EC 5Q)。
[0023] 其中，步驟（1)中的細(xì)胞生長培養(yǎng)基是在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加10% FBS、 0? 6mg/mL潮霉素B和lmg/mL G418配制而成的。
[0024] 其中，步驟（2)中的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制方法如下：DMEM/F12培養(yǎng)基干粉 一袋（Gibco)，碳酸氫鈉1. 201g、鏈霉素鈉0. lg、氨節(jié)西林0. 06g，溶解于超純水中并定容至 1L，于超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾除菌。
[0025] 其中，步驟⑵中接種于96孔板中的細(xì)胞密度的范圍為：2X 104-4X 104個(gè)/mL，優(yōu) 選為3X104個(gè)/mL。
[0026] 其中，步驟（3)中待測樣品的濃度范圍為：1X l(T4-2. 4X 104nM。
[0027] 其中，步驟⑷中加入的待測樣品與細(xì)胞的作用時(shí)間范圍為2_6h，優(yōu)選為4h。
[0028] 其中，步驟（5)中細(xì)胞經(jīng)裂解后，其與化學(xué)發(fā)光底物的作用時(shí)間范圍為： 10min-lh，優(yōu)選為 15min〇
[0029] 其中，步驟（7)中由原始數(shù)據(jù)繪制而成的量效曲線采用四參數(shù)法擬合并計(jì)算EC5(i 值。
[0030] 本方法的精密度和準(zhǔn)確度較高，同時(shí)專屬性強(qiáng)，耐用性良好，可用于測定GLP-1R 激動(dòng)劑的受體親和力，以實(shí)現(xiàn)對(duì)該類藥物的快速評(píng)價(jià)與篩選。
【附圖說明】：
[0031] 圖1為幾種不同的GLP-1受體激動(dòng)劑的受體親和力測定的擬合曲線。
[0032] 圖2為以mPEG2Qk-Ex4C為測試樣品，本方法的方法學(xué)驗(yàn)證中專屬性考察試驗(yàn)所得 的擬合曲線。其中，a :不添加CH0-GLP-1R-CRE-Luc+細(xì)胞試驗(yàn)；b :陰性對(duì)照細(xì)胞株試驗(yàn)；c : 空白溶劑試驗(yàn)；d :PEG干擾試驗(yàn)。
[0033] 圖3為以mPEG2(lk_Ex4C為測試樣品，本方法的方法學(xué)的方法學(xué)驗(yàn)證中線性與范圍 考察試驗(yàn)所得的擬合曲線。
[0034] 圖4為以mPEG2Qk-Ex4C為測試樣品，本方法的方法學(xué)驗(yàn)證中準(zhǔn)確度考察試驗(yàn)所得 的擬合曲線。
[0035] 圖5為以mPEG2Qk-Ex4C為測試樣品，本方法的方法學(xué)驗(yàn)證中耐用性考察試驗(yàn)所得 的擬合曲線。其中，a :細(xì)胞密度考察試驗(yàn)；b :藥物與細(xì)胞作用時(shí)間考察試驗(yàn)；c :細(xì)胞裂解液 與發(fā)光底物不同作用時(shí)間考察試驗(yàn)；d :細(xì)胞代數(shù)考察試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范 圍。
[0037] 實(shí)施例
[0038] 用本法測定5種不同種類的GLP-1R激動(dòng)劑的受體親和力
[0039] 5種GLP-1R激動(dòng)劑為：Exendin-4和4種不同分子量的聚乙二醇定點(diǎn)修飾 Exendin-4類似物的產(chǎn)物。通過在Exendin-4的C端加入一個(gè)半胱氨酸等到Exendin-4 類似物（簡稱Ex4C)，分別使用分子量為5kDa、10kDa、20kDa和40kDa的單甲氧基聚乙二 醇-馬來酰亞胺（mPEG-MAL)與Ex4C反應(yīng)后經(jīng)純化得到4種修飾產(chǎn)物，分別為mPEG 5k-Ex4C、 mPEG1(lk-Ex4C、mPEG2Qk-Ex4C和mPEG 4Qk-Ex4C。以上5種GLP-1R激動(dòng)劑的受體親和力的測定 步驟如下：<