br>[0040] (1)從液氮罐中取出凍存的CH0-GLP-1R-CRE-LUC+細胞，將細胞快速融化復蘇后， 轉(zhuǎn)入含5mL細胞生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長 至80%左右時，用0. 25%胰蛋白酶消化傳代，每3天按1 : 3比例傳代1次。
[0041] (2)取處于對數(shù)生長期的細胞，用0. 25%胰酶消化，1000r/min離心5min，棄上清， 將細胞重懸于含〇. 25% FBS的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中，記數(shù)。將細胞懸液的密度稀釋至 3X 104個/mL，以100 y L/孔接種于96孔板。于37°C、5% C0 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約4h。
[0042] (3)分別配制5種樣品的溶液并通過BCA法測定濃度，以含有0. 25 % FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基對樣品進行稀釋。將Exendin-4的起始濃度調(diào)整為250nM ;mPEG5k-Ex4C、 mPEG1Qk-Ex4C和mPEG2Qk-Ex4C的起始濃度調(diào)整為1500nM，以上4種樣品均按4倍倍比稀釋 至10個濃度梯度；mPEG 4(lk-Ex4C的起始濃度調(diào)整為24000nM，按4倍倍比稀釋至11個濃度 梯度。
[0043] (4)按上述配置好的不同濃度梯度的樣品，按每孔20 yL向中加至上述細胞板，每 個濃度梯度設置3個復孔，于37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h。
[0044] (5)將化學發(fā)光底物與含有細胞裂解液的底物緩沖液（均購自Promega公司）混 勻。以每孔100UL加至上述孵育后的細胞板中。室溫下，在振蕩器上震蕩15min后轉(zhuǎn)移至 96孔酶標板中。
[0045](6)使用化學發(fā)光分析儀（Luminoskan Ascent，Thermo Scientific)，以 Is/孔的 速度讀取各孔的熒光強度，以相對光單位（RLU)表示。
[0046] (7)數(shù)據(jù)處理：以所測樣品的摩爾濃度的對數(shù)值（Log[M])為橫坐標，以所測各樣 品孔的熒光強度（RLU值）為縱坐標繪制量效曲線。并通過軟件GraphPad Prism 5.0的 Dose-response-Stimulation模式對量效曲線進行四參數(shù)擬合，計算各樣品的半數(shù)有效濃 度（EC 5Q)。
[0047] 結(jié)果如圖1所示，本法測得的Exendin-4的EC5Q約為0. 539nM，mPEG 5k-Ex4C、 mPEG1(lk-Ex4C、mPEG2(lk-Ex4C 的 EC5(I的平均值分別為 0. 896nM，3. 392nM 和 3. 766nM，相比 Exendin-4 分別增加了 1. 64、6. 23、6. 91 倍。而 mPEG4Qk-Ex4C 的量效曲線相較于 Exendin-4 明顯右移，EC5Q為64. 205nM，是Exendin-4的118. 03倍。說明PEG修飾會影響到Exendin-4 與GLP-1R結(jié)合，使其受體親和力下降。
[0048] 驗證例
[0049] 以mPEG2(lk-Ex4C為例，對本方法進行方法學驗證。
[0050] 除下述各項中的特殊說明外，實驗材料、方法與實施例中的操作基本相同。
[0051] (1)專屬性：
[0052] 分別考察了以下四種情況對熒光素酶表達活性的影響及測定結(jié)果的影響。（a)不 添加CH0-GLP-1R-CRE-Luc+細胞試驗：考察無細胞體系對測定結(jié)果的影響。（b)陰性對照細 胞株試驗：以僅轉(zhuǎn)染熒光素酶報告基因而未轉(zhuǎn)染GLP-1R基因的CH〇-CRE-Luc+照細胞株作 為陰性對照，考察mPEG 2(lk-Ex4C對其作用。（c)空白溶劑試驗：以不含mPEG2(lk-Ex4C的PBS 緩沖液作為空白對照。（d)PEG干擾試驗：以相同濃度梯度的20kDa的mPEG-MAL溶液作為 對照，分別考察PBS和PEG對測定結(jié)果的影響。
[0053] 結(jié)果如圖2所示，當不添加CH0-GLP-1R-CRE-Luc+細胞時，所測熒光的RLU值近乎 為〇,說明熒光產(chǎn)生的前提是細胞中熒光素酶的表達。當mPEG 2(lk-Ex4C與陰性對照細胞作 用時，其RLU維持在較低水平，且無劑量依賴性，表明內(nèi)源性干擾值較小，熒光素酶表達的 增加依賴于樣品與GLP-1R的作用。而當只加入空白溶劑或PEG溶液時，所測得的RUL值與 mPEG 2(lk-Ex4C的量效曲線的低平臺區(qū)相當，且無劑量依賴性，對mPEG2(lk-Ex4C的量效曲線無 影響。上結(jié)果證明了 mPEG2(lk-Ex4C是通過其多肽部分與工具細胞株表面高表達的GLP-1R結(jié) 合后，激活其介導的信號通路后，促進了熒光素酶的表達，也表明該方法的專屬性良好。
[0054] (2)線性與范圍：
[0055] 配制濃度為1500nM的mPEG2(lk-Ex4C溶液，以含0. 25% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基按 4倍倍比對其稀釋至10個濃度梯度。
[0056] 結(jié)果如圖3所示，所擬合的mPEG2Qk-Ex4C量效曲線呈典型的"S"型。用GraphPad Prism 5.0非線性四參數(shù)擬合而得的曲線為：Y= %-4)八1+(乂/〇1)+4。其中夂:曲線 上漸近線估值即最大RLU值（10. 740) ;B :曲線的斜率（0. 700) ;C :最大有效量一半時所對 應的濃度（3. 853nM) ;A2:曲線下漸近線估值即最小RLU值（5. 503)。
[0057] (3)精密度：
[0058] (a)重現(xiàn)性
[0059] 根據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
中具體步驟及線性與范圍的要求，配置6份相同的mPEG2(lk-Ex4C 溶液，測定并計算每份樣品的EC 5(I和RSD值。
[0060] 表1本方法的重復性驗證試驗結(jié)果
[0061]
【主權(quán)項】
1. 一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法。其特征在于該方法是利用工具細胞 株CHO-GLP-IR-CRE-Luc+，通過熒光素酶報告基因法測定GLP-I受體激動劑的受體親和力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法，其特征在于 包括以下步驟： (1) 細胞的復蘇及傳代： 從液氮罐中取出凍存的CHO-GLP-IR-CRE-Luc+細胞，將細胞快速融化復蘇后，轉(zhuǎn)入含 5mL細胞生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長后，用 0. 25%胰蛋白酶消化傳代，每3天按1 : 3比例傳代1次。 (2) 細胞接種與培養(yǎng)： 取處于對數(shù)生長期的CH0-GLP-1R-CRE-Luc+細胞，用0. 25%胰酶消化，lOOOr/min離心 5min，棄上清，將細胞重懸于含0. 25% FBS的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中，記數(shù)。將細胞懸液中 的細胞密度稀釋至2 X 105-4 X IO5個/mL，以100 y L/孔接種于96孔板，即每孔的細胞數(shù)為 2X 104-4X 104個，于 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4h。 (3) 待測樣品溶液的配制與稀釋： 配制待測樣品溶液，通過BCA法測定其濃度，以含有0. 25 % FBS的DMEM/F12培養(yǎng) 基對待測樣品按倍比依次稀釋，得10-11個不同濃度梯度。待測樣品的濃度范圍為： 1X10(2. 4 X 104nM〇 (4) 待測樣品作用于細胞： 將配置好的不同濃度梯度的待測樣品，按每孔20 y L加至細胞培養(yǎng)板中，每個待測樣 品的濃度設置3個平行復孔，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-6h。 (5) 熒光素酶與化學發(fā)光底物作用： 將化學發(fā)光底物與含有細胞裂解液的底物緩沖液（均購自Promega公司）混勻。以每 孔100 y L加至上述孵育后的細胞板中。室溫下，在振蕩器上震蕩IOmin-Ih后轉(zhuǎn)移至96孔 酶標板中。 (6) 熒光強度測定： 使用化學發(fā)光分析儀（Luminoskan Ascent，Thermo Scientific)，以Is/孔的速度讀 取各孔的熒光強度，以相對光單位（RLU)表示。 (7) 數(shù)據(jù)處理： 以所測樣品的摩爾濃度的對數(shù)值（Log[M])為橫坐標，所測各樣品孔的熒光強度 (RLU值）為縱坐標繪制量效曲線。并通過軟件GraphPad Prism 5.0非線性擬合中的 Dose-response-Stimulation模式對量效曲線進行四參數(shù)擬合，計算樣品的半數(shù)有效濃度 (EC50)。
3. 如權(quán)利要求2中所述的一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法，其特征在于 所述的GLP-I受體激動劑為GLP-1，Exendin-4,或由它們的結(jié)構(gòu)改造而成的類似物或非其 它非肽類GLP-I受體激動劑。
4.如權(quán)利要求2中所述的一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法，其特征在于 步驟⑵中接種于96孔板中的細胞密度的范圍為：2 X 105-4XIO5個/mL，即每孔接種的細 胞的數(shù)目范圍是：2X 104-4X 104個。
5. 如權(quán)利要求2中所述的一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法，其特征在于 步驟⑶中待測樣品的濃度范圍為：1 x l(T4-2. 4X 104nM，所用濃度梯度為10-11個。
6. 如權(quán)利要求2中所述的一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法，其特征在于 步驟（4)中加入的待測樣品與細胞的作用時間范圍為2-6h。
7. 如權(quán)利要求2中所述的一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法，其特征在于 步驟（5)中細胞經(jīng)裂解后，其與化學發(fā)光底物的作用時間范圍為：10min-lh。
8. 如權(quán)利要求2中所述的一種GLP-I受體激動劑的受體親和力測定方法，其特征在于 步驟（7)中由原始數(shù)據(jù)繪制而成的量效曲線采用四參數(shù)法擬合并計算EC 5tl值。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種GLP-1受體激動劑的受體親和力測定方法。本發(fā)明基于工具細胞株——CHO-GLP-1R-CRE-Luc+，當待測樣品與該細胞表面的GLP-1受體結(jié)合后，可激活受體所介導的信號級聯(lián)反應，特異性激活cAMP響應元件(CRE)并促進熒光素酶報告基因的表達，通過檢測細胞溶質(zhì)中熒光素酶的量來繪制并擬合得到樣品與GLP-1受體作用的量效曲線，并計算其半數(shù)有效濃度(EC50)。本發(fā)明通過對測定過程中各影響因素的考察與優(yōu)化，最終建立了一種GLP-1受體激動劑受體親和力的測定方法。其具有專屬性強，精密度和準確度高，耐用性良好，操作簡便等優(yōu)點?？捎糜贕LP-1受體激動劑受體親和力的測定，以對該類藥物進行快速評價與篩選。
【IPC分類】C12Q1-02, C12Q1-66
【公開號】CN104846061
【申請?zhí)枴緾N201510239124
【發(fā)明人】姚文兵, 田浤, 郭林峰, 高向東, 胡曉靜
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月7日