專利名稱：水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻中第一個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinaseinhibitor)基因，命名為OsICK1。
背景技術(shù)：
細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程。在真核生物中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是細(xì)胞周期調(diào)控的中心組分(Morgan.Principles of CDK regulation.Nature.1995 Mar9；374(6518)131-134)，對細(xì)胞周期起著核心性的調(diào)控作用。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)能夠與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)結(jié)合，形成Cyclin-CDK復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，使底物蛋白質(zhì)磷酸化，調(diào)控細(xì)胞周期的運行。不同種類的CDK能夠與不同種類的周期蛋白結(jié)合，構(gòu)成不同的CDK激酶，在細(xì)胞周期的不同時期表現(xiàn)出活性，對細(xì)胞周期的不同時期進行調(diào)節(jié)。
細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(ICK)在細(xì)胞周期進程中起著重要的調(diào)控作用。ICK通過在細(xì)胞周期適當(dāng)?shù)臅r間點上抑制CDK的活性，從而對細(xì)胞周期進展起負(fù)調(diào)控作用(Coats Set al.Requirement of p27Kipl for restriction point control of the fibroblast cellcycle.Science.1996 May 10；272(5263)877-880)。ICK能夠與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期進程被阻滯，失去增殖活性，從而影響到植物的生長和發(fā)育(Yongming Zhou，Hong Wang，Susan Gilmer，Steve Whitwill，Larry C.Fowke.Effects ofco-expressing the plant CDK inhibitor ICKland D-type cyclin genes on plant growth，cell size and ploidy in Arabidopsis thaliana.Planta 2003，216604-613)。因此，ICK對細(xì)胞周期的調(diào)控作用也越來越引起人們的關(guān)注。
1997年，王宏等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了第一個植物細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，并命名為ICK1(Hong.wang，larryC.Fowke.A plant cyclin-dependent kinase inhibitor gene.Nature，1997，386(3)April)。ICK1過量表達(dá)能夠使植株矮小，細(xì)胞數(shù)目減小而體積增大，抑制核內(nèi)復(fù)制和減少倍數(shù)性水平(A.L.Cleary’，L.C.Fowke，H.Wang and P.C.L.John.The effect of ICK1，a plant cyclin-dependent kinase inhibitor，on mitosis in livingplant cells.Plant cell reports 20814-820)；運用花粉組織特異性啟動子，使ICKI基因在花粉中表達(dá)，可以導(dǎo)致花粉發(fā)育能力的降低，出現(xiàn)雄性不育(Yongming Zhou，HongWang，Susan Gilmer，Steve Whitwill，Wilf Keller，Larry C.Fowke.Control of petal andpollen development by the plant cyclin-dependent kinase inhibitor ICK1 intransgenic Brassica plants.Planta(2002)215248-257)；有絲分裂前期和前中期之間，把ICK1微注射到個體分化的紫露草雄蕊毛細(xì)胞中，可以增加細(xì)胞有絲分裂中期的時間，從而使細(xì)胞分化變慢(A.L.Cleary’，L.C.Fowke，H.Wang and P.C.L.John.Theeffect of ICK1，a plant cyclin-dependent kinase inhibitor，on mitosis in livingplant cells.Plant cell reports 20814-820)。這表明植物ICK在研究細(xì)胞周期，生長發(fā)育和育種等方面，具有重要的作用。
單子葉植物中，玉米和水稻等是重要的糧食作物，對其ICK基因的研究有助于玉米和水稻細(xì)胞周期的調(diào)控，進而調(diào)節(jié)生長發(fā)育。Cintia M.Coelho等已經(jīng)從玉米中得到了兩個ICK基因(Zeama；KRP；1和Zeama；KRP；2)(Cintia M.Coelho et al.Cyclin-dependent kinaseinihibitor in Maize endosperm And their potential role in endoreduplication.Plantphysiology.August 2005，Vol.138，pp.2323-2336)隨著水稻基因組測序計劃的完成以及飽和物理圖譜的建立(Feng Q，Zhang Y，Hao P，et al.Sequence and analysis of ricechomosome 4.Nature.2002 21；420(6913)316-320)，其功能基因組的研究已成為熱點之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前關(guān)于水稻中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的研究報道罕見的問題，提供一種通過RT-PCR的方法克隆得到的新的具有調(diào)控細(xì)胞周期的功能基因，即水稻中的第1個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，命名為OsICK1基因。本發(fā)明獲得的水稻第1個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因(OsICK1)，將禰補水稻中這方面研究的空白。
本發(fā)明的另一目的在于使OsICK1基因在水稻中過量表達(dá)，研究了該基因的功能。
本發(fā)明所說的OsICK1基因cDNA序列為ATGGGCAAGTACATGCGCAAGGCCAAGGTGGTGGTCTCCGGCGAGGTGGTGGCCGCCGCC 60GTCATGGAGCTCGCCGCGGCGCCGCTCGGGGTGCGCACCCGCGCCCGCTCCCTCGCGCTG 120CAGAAGAGGCAGGGCGGGGAGTACCTCGAGCTCAGGAGCCGCAGGCTCGAGAAGCTCCCT 180CCTCCCCCGCCGCCGCCGCCGAGGAGGAGGGCGACGGCTGCGGCTGCGACTGCTGATGCG 240ACGGCGACGGAGAGCGCGGAGGCGGAGGTGTCGTTCGGGGGGGAGAACGTCCTCGAGCTG 300GAGGCCATGGAAAGGAATACCAGGGAGACGACACCTTGCAGCTTGATCAGGGACCCCGAT 360
ACGATTAGCACCCCTGGATCTACCACAAGGCGCAGCCACTCGAGTTCTCATTGCAAGGTG 420CAAACACCCGTGCGCCACAACATTATTCCAGCATCAGCAGAGCTGGAAGCGTTCTTCGCC 480GCCGAAGAGCAACGGCAACGACAGGCTTTCATCGACAAGTATAACTTTGATCCTGTGAAT 540GACTGCCCTCTTCCCGGCCGATTTGAATGGGTCAAGCTAGACTGA 585基因編碼序列全長為585bp，共編碼194個氨基酸，其中1-3的ATG為啟始密碼子，583-585的TGA為終止密碼子。
本發(fā)明所說OsICK1基因cDNA序列克隆方法為1)根據(jù)blast分析結(jié)果，以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，提取水稻(9311)總RNA，運用RT-PCR的方法擴增出了585bp的核酸片斷；2)回收上述核酸片斷，連接到pMD-18T載體上后，測序，確證此核酸序列即為OsICK1基因。
本發(fā)明所說OsICK1基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建方法為1)按獲得的OsICK1基因的兩端核酸序列，合成兩對引物，并在兩對引物中分別引入EcoR I和BamH I酶切位點，然后PCR擴增得到編碼序列；2)用EcoR I和BamH I雙酶切OsICK1基因的PCR產(chǎn)物以及中間載體pBpF(含有啟動子CaMV 35S和終止子NOS)，回收雙酶切產(chǎn)物并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到中間表達(dá)載體pBpF-OsICK1；3)用HindIII單酶切中間表達(dá)載體pBpF-OsICK1和雙元表達(dá)載體1301，回收酶切目的產(chǎn)物并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到過量表達(dá)載體1301-OsICK1；4)測序驗證結(jié)果；5)抽提1301-OsICK1質(zhì)粒DNA；制備農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞；6)取1301-OsICK1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞；7)經(jīng)PCR及酶切鑒定得陽性克隆，甘油保存，備用。
所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，可應(yīng)用于水稻細(xì)胞周期的調(diào)控，其過量表達(dá)可以用于限制特定組織器官的發(fā)育，所述的發(fā)育為雄蕊的超量表達(dá)控制雄蕊的發(fā)育，達(dá)到創(chuàng)建雄蕊不育材料。
所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因的敲除可以用于促進特定組織器官的發(fā)育，可以通過敲除OsICK1基因在葉片的表達(dá)，達(dá)到使葉片長的更大。
本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)OsICK1基因水稻的性狀表現(xiàn)1)OsICK1基因超過量表達(dá)可影響抗性愈傷組織分化成苗。
2)OsICK1基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株可出現(xiàn)植株矮化。
3)OsICK1基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株可引起水稻種子結(jié)實率的減少。
本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點1、本發(fā)明克隆的水稻OsICK1基因是一種新的具有調(diào)控細(xì)胞周期的功能基因。
2、根據(jù)OsICK1基因序列，構(gòu)建過量表達(dá)載體使OsICK1基因在水稻中過量表達(dá)，對該基因的功能進行研究。


圖1為本發(fā)明轉(zhuǎn)1301-OsICK1基因的再生小苗。
圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)化植株的PCR擴增結(jié)果。在圖2中，1-8轉(zhuǎn)基因植株；9DL 2000marker；101301-OsICK1質(zhì)粒DNA；11對照植株。
圖3為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株和對照植株(WT)的形態(tài)比較。在圖3中，T7結(jié)實率較低的植株；T1O矮化的植株。
圖4為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株(T7)和對照植株(WT)的OsICK1基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。在圖4中，A OsICK1基因擴增結(jié)果，11301-OsICK1質(zhì)粒DNA，2對照植株(WT)，3轉(zhuǎn)化植株(T7)4DNA Marker DL 2000；B內(nèi)標(biāo)actin擴增結(jié)果。2對照植株(WT)，3轉(zhuǎn)化植株(T7)，4DNA Marker DL 2000.
圖5為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株(T7)和對照植株(WT)的OsICK1基因蛋白表達(dá)水平的差異。
具體實施例方式
以下實施例將對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1以水稻品種9311的總RNA為模板，以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計兩對引物，進行PCR擴增?；厥諗U增產(chǎn)物，并取7μl回收產(chǎn)物與1μl的T-載體在16℃的條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組子，進行PCR和酶切鑒定。
挑取鑒定呈陽性的重組子pMD-18T-OsICK1，送交博亞公司測序。
實施例2選取OsICK1基因兩端核酸序列，合成兩對引物，并在引物中分別引入EcoR I和BamH I酶切位點。然后以pMD-18T-OsICK1為模板，進行PCR擴增，PCR的擴增條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，55℃退火1min，72℃ 1min，36個循環(huán)；72℃延伸10min?；厥誔CR產(chǎn)物，并分別EcoR I和BamH I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。將中間載體pBpF用EcoRI和BamH I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。取1μlT4連接酶Buffer，6μl回收的EcoR I和BamH I雙酶切的PCR產(chǎn)物，2μl EcoR I和BamH I雙酶切的pBpF產(chǎn)物，10U T4連接酶，在16℃條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組子，進行PCR和酶切鑒定后，獲得中間載體pBpF-OsICK1。
挑取中間載體pBpF-OsICK1陽性重組子，在LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒，并用HindIII單酶切，回收酶切產(chǎn)物，待用。取1μl T4連接酶Buffer，7μl回收的經(jīng)HindIII單酶切的中間載體pBpF-OsICK1產(chǎn)物，1μl雙元表達(dá)載體1301 HindIII單酶切產(chǎn)物，10UT4連接酶，在10μl的體系下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組子，進行PCR、酶切鑒定以及測序驗證后，獲得1301-OsICK1過量表達(dá)載體。
實施例3共培養(yǎng)基的制備挑取-20℃保存的甘油菌于1.5ml LB(含Kan 50μg/ml)中，28℃振蕩32h后，吸取150μl農(nóng)桿菌液于10ml LB(含Kan 50μg/ml)中，28℃培養(yǎng)24h后，離心，收集菌體，用等體積的AAM液體培養(yǎng)基懸浮菌體，并向菌體中加入乙酰丁香酮(AS)，使其濃度達(dá)到100μmol/L。
實施例4取日本晴幼胚，用10％的次氯酸鈉表面消毒45min后；用無菌水清洗3～5遍，每次2～3min；用解剖針剝出幼胚，接種于NB培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25～26℃，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，15天后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中繼代1次。
取新鮮的愈傷組織，浸泡在菌液中30min后，用鑷子夾出愈傷組織，放在含有多層濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干多余的菌液。然后放入NB培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+100μmol/L AS的共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3天。
用鑷子夾取共培養(yǎng)3天后的愈傷組織，放入NB培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+Cb 500mg/L+Hyg100mg/L的篩選培養(yǎng)基上進行篩選，大部分愈傷在10天內(nèi)逐漸變褐，10天之后一部分褐化的組織上先后長出乳白色，略透明，松散，生長相對旺盛的抗性愈傷。
將抗性愈傷在NB培養(yǎng)基+ABA 2mg/L+6-BA 3mg/L+Cb 250mg/L+Hyg 25mg/L的預(yù)分化培養(yǎng)基中預(yù)分化1周后，抗性愈傷組織中有綠色的小芽點出現(xiàn)，將這些帶綠點的愈傷組織轉(zhuǎn)移到NB培養(yǎng)基+6-BA 3mg/L+NAA 1mg/L+Sorbitol 13g/L+Cb 250mg/L+Hyg 25mg/L的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，綠色小點繼續(xù)分化，并相繼成苗。從綠點到分化成苗所需要的時間為3～6周不等。
實施例5將分化后的小苗移栽到土壤中，待成活后，剪取葉片，進行PCR鑒定，分析轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)變化(并與轉(zhuǎn)化空載體的植株比較)，進行RT-PCR定量分析和Western blotting驗證。
實施例6如實例2中載體構(gòu)建的方法，把啟動子CaMV 35S替換成花粉組織特異性表達(dá)啟動子(如Osg6B啟動子)，構(gòu)建osICK1基因的花粉組織特異性表達(dá)載體，通過實例4中的遺傳轉(zhuǎn)化方法，使osICK1基因在花粉中特異性表達(dá)，可以得到雄性不育的植株。
實施例7如實例2中載體構(gòu)建的方法，通過葉片組織特異性表達(dá)啟動子(如Osg6B啟動子)，構(gòu)建反義osICK1基因的葉片組織特異性表達(dá)載體，通過實施例4中的遺傳轉(zhuǎn)化方法，使osICK1基因在葉片中的表達(dá)減少，可以使轉(zhuǎn)基因植株的葉片長得更大。
權(quán)利要求
1.水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其特征在于其cDNA序列為ATGGGCAAGTACATGCGCAAGGCCAAGGTGGTGGTCTCCGGCGAGGTGGTGGCCGCCGCC 60GTCATGGAGCTCGCCGCGGCGCCGCTCGGGGTGCGCACCCGCGCCCGCTCCCTCGCGCTG120CAGAAGAGGCAGGGCGGGGAGTACCTCGAGCTCAGGAGCCGCAGGCTCGAGAAGCTCCCT180CCTCCCCCGCCGCCGCCGCCGAGGAGGAGGGCGACGGCTGCGGCTGCGACTGCTGATGCG240ACGGCGACGGAGAGCGCGGAGGCGGAGGTGTCGTTCGGGGGGGAGAACGTCCTCGAGCTG300GAGGCCATGGAAAGGAATACCAGGGAGACGACACCTTGCAGCTTGATCAGGGACCCCGAT360ACGATTAGCACCCCTGGATCTACCACAAGGCGCAGCCACTCGAGTTCTCATTGCAAGGTG420CAAACACCCGTGCGCCACAACATTATTCCAGCATCAGCAGAGCTGGAAGCGTTCTTCGCC480GCCGAAGAGCAACGGCAACGACAGGCTTTCATCGACAAGTATAACTTTGATCCTGTGAAT540GACTGCCCTCTTCCCGGCCGATTTGAATGGGTCAAGCTAGACTGA 585基因編碼序列全長為585bp，共編碼194個氨基酸，其中1-3的ATG為啟始密碼子，583-585的TGA為終止密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其特征在于其cDNA序列克隆方法為1)根據(jù)blast分析結(jié)果，以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，提取水稻(9311)總RNA，運用RT-PCR的方法擴增出了585bp的核酸片斷；2)回收上述核酸片斷，連接到pMD-18T載體上后，測序，確證此核酸序列即為OsICK1基因。
3.如權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其特征在于其過量表達(dá)載體的構(gòu)建方法為1)按獲得的OsICK1基因的兩端核酸序列，合成兩對引物，并在兩對引物中分別引入EcoRI和BamHI酶切位點，然后PCR擴增得到編碼序列；2)用EcoRI和BamHI雙酶切OsICK1基因的PCR產(chǎn)物以及中間載體pBpF(含有啟動子CaMV 35S和終止子NOS)，回收雙酶切產(chǎn)物并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到中間表達(dá)載體pBpF-OsICK1；3)用HindIII單酶切中間表達(dá)載體pBpF-OsICK1和雙元表達(dá)載體1301，回收酶切目的產(chǎn)物并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到過量表達(dá)載體1301-OsICK1；4)測序驗證結(jié)果；5)抽提1301-OsICK1質(zhì)粒DNA；制備農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞；6)取20μg1301-OsICK1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞；7)經(jīng)PCR及酶切鑒定得到陽性克隆，甘油保存，備用。
4.如權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其特征在于可應(yīng)用于水稻細(xì)胞周期的調(diào)控。
5.如權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其過量表達(dá)在限制特定組織器官發(fā)育中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其特征在于所述的發(fā)育為雄蕊的超量表達(dá)控制雄蕊的發(fā)育，達(dá)到創(chuàng)建雄蕊不育材料。
7.如權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其敲除在促進特定組織器官發(fā)育中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，其特征在于所述的應(yīng)用是指通過敲除OsICK1基因在葉片的表達(dá)，達(dá)到使葉片長的更大。
全文摘要
水稻細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，涉及水稻中第一個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，命名為OsICK1。提供一種通過RT－PCR的方法克隆得到的新的具有調(diào)控細(xì)胞周期的功能基因，即水稻中的第1個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因，命名為OsICK1基因。基因編碼序列全長為585bp，共編碼194個氨基酸，其中1－3的ATG為啟始密碼子，583－585的TGA為終止密碼子。其克隆方法為根據(jù)blast分析結(jié)果，以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，提取水稻總RNA，擴增出585bp的核酸片斷并回收連接到pMD－18T載體上測序確證。是一種新的具有調(diào)控細(xì)胞周期的功能基因。
文檔編號C07K14/415GK1807626SQ20051012996
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者陳亮, 何藝賓, 沈明山, 張紅心, 曾雅明, 王蕾 申請人:廈門大學(xué)