專利名稱：二聚體化肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥疫苗治療，更具體地涉及肽二聚體，其可以產(chǎn)生具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性的腫瘤抗原肽，還涉及含有該肽二聚體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，尤其細(xì)胞毒性T細(xì)胞(下文中稱作“CTL”)在腫瘤細(xì)胞或者病毒感染的細(xì)胞的體內(nèi)排斥中起重要作用。CTLs識(shí)別來源于腫瘤抗原蛋白的抗原肽(“腫瘤抗原肽”)和癌細(xì)胞上MHC(主要組織相容性復(fù)合體)I類抗原(人的MHC I類抗原稱為“HLA抗原”)，并攻擊和殺死細(xì)胞。
腫瘤抗原蛋白的典型實(shí)例包括Immunity，卷10281，1999的表中列出的那些。特定實(shí)例包括黑素體抗原如黑素細(xì)胞組織特異性蛋白gp100(J.Exp.Med.，1791005，1994)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，913515，1994)和酪氨酸激酶(J.Exp.Med.，178489，1993)，和腫瘤標(biāo)記，如不同于黑素瘤的腫瘤抗原，如HER2/neu(J.Exp.Med.，1812019，1995)、CEA(J.Natl.Cancer.Inst.，87982，1995)和PSA(J.Natl.Cancer.Inst.，89293，1997)。
腫瘤抗原肽是約8到11個(gè)氨基酸的肽，其可以由細(xì)胞中蛋白酶對(duì)腫瘤抗原蛋白的細(xì)胞內(nèi)加工產(chǎn)生(Cur.Opin.，Immunol.，5709，1993；Cur.Opi，Immunol.，5719，1993；Cell，8213，1995；Immunol.Rev.，146167，1995)。如上文描述的，如此產(chǎn)生的腫瘤抗原肽作為與MHCI類抗原(HLA抗原)的復(fù)合體呈遞在細(xì)胞表面并被CTLs識(shí)別。因此，為了開發(fā)利用CTLs破壞腫瘤細(xì)胞的癌癥免疫治療劑(癌癥疫苗)，非常重要的是鑒定腫瘤抗原蛋白中的腫瘤抗原肽，所述肽能夠有效誘導(dǎo)CTLs。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可以體內(nèi)使用的來源于腫瘤抗原肽的新的腫瘤抗原。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)證明為腫瘤抗原肽的某些肽含有半胱氨酸殘基并且由這些肽組成的二聚體當(dāng)施用時(shí)令人驚奇地表現(xiàn)出相當(dāng)于單體的誘導(dǎo)CTLs的活性(“CTL-誘導(dǎo)活性”)，從而建立了本發(fā)明。
從而，本發(fā)明包括下面的內(nèi)容。
(1)肽二聚體，其中由包括至少一個(gè)半胱氨酸殘基的7-30個(gè)氨基酸組成并且能夠產(chǎn)生具有CTL-誘導(dǎo)活性的腫瘤抗原肽的兩種肽單體每一種相互通過二硫鍵結(jié)合。
(2)根據(jù)上面(1)的肽二聚體，其可以產(chǎn)生具有CTL-誘導(dǎo)活性的腫瘤抗原肽。
(3)根據(jù)上面(1)或(2)的肽二聚體，其中兩種肽單體通過一個(gè)或兩個(gè)二硫鍵結(jié)合。
(4)根據(jù)上面(1)到(3)任一項(xiàng)的肽二聚體，其中肽單體來源于腫瘤抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物WT1。
(5)根據(jù)上面(1)到(4)任一項(xiàng)的肽二聚體，其中肽單體如下Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa(SEQ ID NO72)其中2位的Xaa為選自Tyr、Phe、Met和Trp的氨基酸殘基；9位Xaa為選自Phe、Leu、Ile、Trp和Met的氨基酸殘基。
(6)根據(jù)上面(1)到(4)任一項(xiàng)的肽二聚體，其中肽單體選自下面的肽。
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO11)Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe (SEQ ID NO18)Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr (SEQ ID NO19)Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu (SEQ ID NO20)Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (SEQ ID NO21)Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (SEQ ID NO22)Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu (SEQ ID NO23)Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO44)
(7)含有根據(jù)上面(1)到(6)任一項(xiàng)的肽二聚體與藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
(8)根據(jù)上面(7)的藥物組合物，其用作癌癥疫苗。
(9)根據(jù)上面(1)到(6)任一項(xiàng)的肽二聚體在生產(chǎn)癌癥疫苗中的應(yīng)用。
(10)治療或者預(yù)防癌癥的方法，其包括對(duì)需要該治療或預(yù)防的WT-1陽性患者施用治療有效量的根據(jù)上面(1)到(6)任一項(xiàng)的肽二聚體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示肽二聚體(SEQ ID NO44)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠中CTLs的圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式在本發(fā)明的肽二聚體中，兩個(gè)肽單體通過該肽單體中存在的至少一對(duì)半胱氨酸殘基的SH基團(tuán)之間的二硫鍵二聚體化。
本發(fā)明的肽二聚體具有CTL誘導(dǎo)活性并且所誘導(dǎo)的CTL可以通過細(xì)胞毒性作用或者產(chǎn)生淋巴因子發(fā)揮抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明的肽二聚體可以用作治療或者預(yù)防癌癥(腫瘤)的癌癥疫苗。
構(gòu)成本發(fā)明的肽二聚體的肽單體由含有至少一個(gè)半胱氨酸殘基的7-30個(gè)氨基酸殘基組成，并且產(chǎn)生具有CTL誘導(dǎo)活性的腫瘤抗原肽。短語“產(chǎn)生腫瘤抗原肽”指肽單體具有使腫瘤抗原肽能夠結(jié)合HLA抗原并被細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識(shí)別的特征。任何肽單體只要其具有CTL誘導(dǎo)活性都可以無限制地用于本發(fā)明；然而，優(yōu)選來源于人維耳姆斯氏瘤的腫瘤抑制基因WT1并且含有至少一個(gè)半胱氨酸殘基的肽單體。腫瘤抑制基因WT1在多種腫瘤中表達(dá)(Cell，60509，1990；NCBI數(shù)據(jù)庫存取號(hào)XP_034418，SEQ ID NO1)?；趯?duì)并發(fā)維耳姆斯氏瘤、無虹膜、尿生殖異常、智力障礙等的WAGR綜合征的分析，從染色體11p13分離出WT1基因，其作為維耳姆斯氏瘤的致病基因之一。(Nature，343774，1990)。WT1的基因組DNA為約50kb，由10個(gè)外顯子組成，并且其cDNA為約3kb。從cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列在SEQID NO1中顯示(Cell.，60509，1990)。根據(jù)WT1基因在人白血病中高水平表達(dá)和通過WT1反義寡聚體治療抑制白血病細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)這一事實(shí)提出WT1基因促進(jìn)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)(JP-A-1-4627/1997)。然后，已經(jīng)闡明WT1基因是白血病和實(shí)體癌的新的腫瘤抗原蛋白(J.Immunol.，1641873-80，2000和J.Clin.Immunol.，20，195-202，2000)，這是根據(jù)如下事實(shí)WT1基因在實(shí)體癌如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌，和卵巢癌中也高水平表達(dá)(JP-A-104627/1977，WO 00/06602)。因?yàn)榘┌Y免疫治療(癌癥疫苗)優(yōu)選可應(yīng)用于盡可能多的癌癥患者，因此重要的是從許多類型的癌癥中高度表達(dá)的WT1鑒定腫瘤抗原肽，和使用所得腫瘤抗原肽開發(fā)癌癥疫苗。在這點(diǎn)上，由WT1蛋白質(zhì)的部分片段組成的幾種天然類型的腫瘤抗原肽在WO 00/06602和WO 00/18795中描述；然而，關(guān)于它們的體內(nèi)效果還不知道。
可用于本發(fā)明的其他肽單體包括來源于Immunity，卷10281，1999的表中列出的腫瘤抗原蛋白的含有至少一個(gè)半胱氨酸殘基的腫瘤抗原肽。
通過HLA四聚體方法(Int.J.Cancer100，565-570(2002))或者有限稀釋方法(Nat.Med4，321-327(1998))測(cè)量CTLs數(shù)可以證實(shí)CTL-誘導(dǎo)活性。備選地，例如，對(duì)于HLA-A24-限制的CTL-誘導(dǎo)，根據(jù)WO 02/47474或者Int.J.Cancer100，565-570(2002)中描述的方法使用HLA-A24模型小鼠可以確定活性。
肽單體由7-30個(gè)，優(yōu)選8-12個(gè)，更優(yōu)選9-11個(gè)氨基酸殘基組成?？紤]與HLA結(jié)合的基序和肽長(zhǎng)度，肽單體優(yōu)選含有1或2個(gè)半胱氨酸殘基。
根據(jù)肽化學(xué)領(lǐng)域中的常用方法可以合成肽單體。這種方法可以在文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，所述文獻(xiàn)包括Peptide Systhesis，Interscience，NewYork，1966；The Proteins，卷2，Academic Press Inc.，New York，1976；Peptide Syhthesis，Maruzen，Inc.，1975；Peptide-Goseino Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.，1985；和Lyakuhin nokainatsu(Zoku)，卷14，Peptide Systhesis，Hirokawa-syoten，1991。
根據(jù)肽化學(xué)領(lǐng)域中的常用方法可以允許形成所得肽單體。形成二硫鍵的方法可以在包括Peptide Systhesis，Interscience，NewYork，1966；The Proteins，卷2，Academic Press Inc.，New York，1976；Peptide Syhthesis，Maruzen，Inc.，1975；Peptide-Goseino Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.，1985；和Lyakuhin nokainatsu(Zoku)，卷14，Peptide Systhesis，Hirokawa-syoten，1991的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。
具體地，可以通過例如，除去包括半胱氨酸側(cè)鏈上保護(hù)基的所有保護(hù)基，然后將所得單體溶液在堿性條件下空氣氧化，或者通過在堿性或酸性條件下加入氧化劑形成二硫鍵合成含有一個(gè)半胱氨酸殘基的肽單體。氧化劑的實(shí)例包括碘、二甲亞砜(DMSO)、鐵氰化鉀，等等。
根據(jù)上面描述的方法也可以合成含有兩個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的單體肽。在該情況中，可以得到不同結(jié)合方式的二硫鍵導(dǎo)致的異構(gòu)體。通過選擇半胱氨酸側(cè)鏈的保護(hù)基的特定組合可以制備其中在目的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵的肽二聚體。保護(hù)基組合的實(shí)例包括MeBzl(甲基芐基)和Acm(乙酰胺甲基)基團(tuán)、Trt(三苯甲基)和Acm基團(tuán)、Npys(3-硝基-2-吡啶基硫代)和Acm基團(tuán)、S-Bu-t(S-叔丁基)和Acm基團(tuán)，等等。例如，對(duì)于MeBzl和Acm基團(tuán)的組合的情況，通過一種方法可以實(shí)施制備，該方法包括除去不同于MeBzl基團(tuán)的保護(hù)基和半胱氨酸側(cè)鏈上的保護(hù)基，和將所得單體溶液進(jìn)行空氣氧化以在去保護(hù)的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，然后去保護(hù)并用碘氧化以在之前受Acm保護(hù)的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。
根據(jù)肽化學(xué)中常用方法可以純化所得肽二聚體。這種純化方法可以在包括Peptide Systhesis，Interscience，New York，1966；TheProteins，卷2，Academic Press Inc.，New York，1976；PeptideSyhthesis，Maruzen，Inc.，1975；Peptide-Gosei no Kiso toJikken，Maruzen，Inc.，1985；和Lyakuhin no kainatsu(Zoku)，卷14，Peptide Systhesis，Hirokawa-syoten，1991的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選使用HPLC的方法。
本發(fā)明的所得肽二聚體顯示出針對(duì)溶液中的氧化劑等的優(yōu)良的穩(wěn)定性并且由于半胱氨酸殘基之間的二硫鍵而具有給定的質(zhì)量和CTL-誘導(dǎo)活性。
可用于本發(fā)明的優(yōu)選的肽單體在下面闡明，以WT1為例。如本文中所用的，用單字母或者三字母縮寫簡(jiǎn)寫各自氨基酸殘基。Ala(A)丙氨酸殘基，Arg(R)精氨酸殘基，Asn(N)天冬酰胺殘基；Asp(D)天冬氨酸殘基，Cys(C)半胱氨酸殘基，Gln(Q)谷氨酰胺殘基，Glu(E)谷氨酸殘基，Gly(G)甘氨酸殘基，His(H)組氨酸殘基，Ile(I)異亮氨酸殘基，Leu(L)亮氨酸殘基，Lys(K)賴氨酸殘基，Met(M)甲硫氨酸殘基，Phe(F)苯丙氨酸殘基，Pro(P)脯氨酸殘基，Ser(S)絲氨酸殘基，Thr(T)蘇氨酸殘基，Trp(W)色氨酸殘基，Tyr(Y)酪氨酸殘基，Val(V)纈氨酸殘基。
表中，術(shù)語“位置”指人WT1中肽的位置。
表1HLA-Al-限制的肽單體

表2HLA-A0201-限制的肽單體

表3HLA-A0205-限制的肽單體

表4HLA-A24-限制的肽單體
SEQ ID NO11中236位M改變成Y。
表5HLA-A3-限制的肽單體

表6HLA-A68-1-限制的肽單體

表7HLA-A110-限制的肽單體

表8HLA-A310-限制的肽單體

表9HLA-A3302-限制的肽單體

表10HLA-B14-限制的肽單體

表11HLA-B40-限制的肽單體

表12HLA-B60-限制的肽單體

表13HLA-B61-限制的肽單體

表14HLA-B62-限制的肽單體

表15HLA-B7-限制的肽單體

表16HLA-B8-限制的肽單體

表17HLA-B2702-限制的肽單體

表18HLA-B2705-限制的肽單體

表19HLA-B350-限制的肽單體

表20HLA-B3701-限制的肽單體

表21HLA-B380-限制的肽單體

表22HLA-B3901-限制的肽單體

表23HLA-B3902-限制的肽單體

表24HLA-B4403-限制的肽單體

表25HLA-B510-限制的肽單體

表26HLA-B5102-限制的肽單體

表27HLA-B520-限制的肽單體

表28HLA-B5801-限制的肽單體

表29HLA-CW0301-限制的肽單體

表30HLA-CW0401-限制的肽單體

表31HLA-CW0602-限制的肽單體

表32HLA-CW0702-限制的肽單體

已經(jīng)知道有許多HLA分子的亞型并且結(jié)合每種亞型的腫瘤抗原肽的氨基酸序列遵循某種規(guī)則(結(jié)合基序)。HLA-A24的結(jié)合基序是公知的，在由8到11個(gè)氨基酸殘基組成的肽中，2位氨基酸為酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或者色氨酸(Trp)，C-末端氨基酸為苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)或者甲硫氨酸(Met)(J.Immunol.，152，3913頁，1994)，Immunogenetics，41，p178，1995，J.Immunol.，155，4307，1994)。因此，除了表4中的肽單體，下式中的肽單體也可優(yōu)選用作HLA-24-限制的肽單體。
Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa(SEQ ID NO72)其中2位Xaa為選自Tyr、Phe、Met和Trp的氨基酸殘基；9位Xaa為選自Phe、Leu、Ile、Trp和Met的氨基酸殘基。
HLA-A0201的結(jié)合基序是公知的，在由8到11個(gè)氨基酸殘基組成的肽中，2位氨基酸為亮氨酸(Leu)或者甲硫氨酸(Met)，C-末端氨基酸為纈氨酸(Val)或者亮氨酸(Leu)。HLA-A0205的結(jié)合基序是公知的，在由8到11個(gè)氨基酸殘基組成的肽中，2位氨基酸為纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)或者甲硫氨酸(Met)，C末端氨基酸為亮氨酸(Leu)(Immunogenetics，41，178頁，1995；J.Immunol.，1554749頁，1995)。因此，其中表2或3中所示的肽單體的2位或C末端氨基酸被上述任何一種氨基酸基序取代的肽也可以優(yōu)選用作HLA-A0201-或者HLA-A0205-限制肽單體。
上面表4中所示肽單體特別優(yōu)選用于本發(fā)明中。在表4中的肽中，SEQ ID NO44為非天然變體肽，其中SEQ ID NO11的236位甲硫氨酸(235位-243位)改變成酪氨酸。因此，本發(fā)明的肽單體包括這樣的序列，該序列中不同于半胱氨酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基在天然型肽的序列中被改變并且顯示出CTL誘導(dǎo)活性。
作為另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有本發(fā)明的肽二聚體與治療上可接受的載體。盡管作為藥物組合物中活性成分的本發(fā)明的肽二聚體的量可以根據(jù)治療目的、患者的年齡、體重等等而變，所述量通常為0.0001mg到1000mg，優(yōu)選0.001mg到1000mg，更優(yōu)選0.1mg到20mg。
本發(fā)明的藥物組合物可以含有作為活性成分的本發(fā)明的肽單體以及肽二聚體。對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物中“肽二聚體”的含量沒有限制，條件是能發(fā)揮CTL誘導(dǎo)活性；然而，所述含量可以為總肽的50％或以上，優(yōu)選70-100％，更優(yōu)選80-100％。可以通過高效液相層析(HPLC)確定肽二聚體的含量。
藥學(xué)上可接受的載體為能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫力的那些載體。這些載體包括佐劑。可應(yīng)用于本發(fā)明的佐劑的實(shí)例包括文獻(xiàn)中描述的那些(Clin.Microbiol.Rev.，7277-289，1994)，具體地，來源于微生物的組分、細(xì)胞因子、來源于植物的組分、礦物凝膠如氫氧化鋁、溶血卵磷脂、表面活性劑如Pluronic_多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑(乳劑制劑)等等。而且，載體包括制備脂質(zhì)體制劑所需的組分，尤其其中成分結(jié)合到具有幾微米直徑的珠子的制劑、其中成分結(jié)合到脂質(zhì)等的制劑。
例如，可以皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)地實(shí)現(xiàn)施用。優(yōu)選途徑為有效誘導(dǎo)CTLs的皮內(nèi)或皮下施用。施用的頻率或間隔可以根據(jù)所治療或預(yù)防的疾病、個(gè)體差異等等適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)；然而，優(yōu)選以幾天到數(shù)月一次的間隔施用一次以上。
例如，當(dāng)含有由來源于WT1的肽單體組成的肽二聚體的本發(fā)明的藥物組合物施用于WT1-陽性患者時(shí)，該肽呈遞給抗原呈遞細(xì)胞的HLA抗原以形成復(fù)合體。然后所呈遞的HLA抗原復(fù)合體特異的CLTs增殖并破壞癌細(xì)胞，從而可以治療或者預(yù)防癌癥。本發(fā)明的藥物組合物可用于治療或者預(yù)防與WT1基因的上升的表達(dá)水平有關(guān)的癌中包括血癌，如白血病、脊髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤，和實(shí)體癌，如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌。
在進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過對(duì)WT1-陽性患者施用本發(fā)明的藥物組合物治療或者預(yù)防癌癥的方法。
實(shí)施例通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但是本發(fā)明不在任何方面受到這些實(shí)施例的限制。
制備1
1.合成受保護(hù)的肽樹脂(H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-樹脂)將Fmoc-Leu-Alko-樹脂(其中Alko為對(duì)-烷氧基芐基醇)(12g)(0.81mmol/g，Watanabe Chemical Industries，Ltd.)裝入反應(yīng)容器(500ml，ACT90型固相合成儀)并用DMF等洗滌一次(步驟1)。然后用25％Pip(哌啶)處理樹脂(3分鐘×1，15分鐘×1)以切除Fmoc基團(tuán)(步驟2)，并用DMF等再次洗滌(步驟1)以除去Pip。向反應(yīng)容器加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(29.36g)和HOBT(1-羥基苯并三唑)(7.5g)在NMP(N-甲基吡咯烷酮)(150ml)中的溶液。加入DIPCI(N，N’-二異丙基碳二亞胺)后(7.6ml)后，將混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘(步驟3)。30分鐘后，用NMP洗滌樹脂(步驟4)，并將樹脂用Fmoc-Asn(Trt)-OH(29.36g)和HOBT(7.5g)再次進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)(步驟5)以合成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko樹脂。然后通過重復(fù)步驟2的去保護(hù)將所得樹脂轉(zhuǎn)化成H-Asn(Trt)-Leu-Alko-樹脂。洗滌(步驟1)后，連續(xù)加入Fmoc-Met-OH(18.27g)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(30.04g)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(29.36g)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(25.91g)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(19.56g)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH(22.60g)和Fmoc-Cys(Trt)-OH(28.82g)以實(shí)施偶聯(lián)反應(yīng)(步驟3)，其中用Fmoc-Thr(tBu)-OH重復(fù)偶聯(lián)3次。所得樹脂用DMF洗滌并用25％AC2O(乙酸酐)處理(15分鐘×2)以帽化未反應(yīng)的氨基。N-末端Fmoc-Cys(Trt)-OH縮合后，進(jìn)行去保護(hù)(步驟2)和洗滌(步驟6)得到H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-樹脂。上面的合成步驟在表33中概述。
表33<合成步驟>

2.受保護(hù)肽樹脂的去保護(hù)向根據(jù)上面的方法得到的受保護(hù)的肽樹脂(H-Cys(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-樹脂)(14.06g)加入試劑K(5％苯酚/5％苯硫基甲烷/5％H2O/2.5％乙二醇/TFA溶液，100ml)和三異丙基硅烷(TIPS，15ml)，并將混合物在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。加入二乙醚(約500ml)后，混合物通過玻璃濾器過濾除去作為濾液的試劑K和二乙醚。然后通過加入TFA(約100ml×3)用二乙醚(約100ml，×3)洗滌殘?jiān)玫胶心繕?biāo)產(chǎn)物的濾液(300ml)。濃縮濾液除去TFA并加入乙腈(約50ml)和20％水性乙酸溶液(約250ml)后凍干得到粉末狀粗制肽(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH，SEQ IDNO44)(6.12g)。
3.純化粗制肽所得粗制肽(749mg)溶于TFA(10ml)中并加到HPLC(Shimadzu；LC8AD型)的ODS C18柱(5cmΦ×50cmL，YMC，Co.，Ltd.)，該柱子用溶液1(＝H2O/0.1％TFA)平衡，使用HPLC泵。使柱子按照原狀保持約30分鐘，然后溶液2(＝CH3CN/0.1％TFA)的濃度在30分鐘內(nèi)從0％增加到15％。之后，溶液2的濃度在330分鐘內(nèi)增加到28％，而通過220nm處UV吸收監(jiān)視含有目標(biāo)肽的洗脫物以得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的級(jí)分。合并級(jí)分并注射到連接至HPLC(Hitachi，L-4000型)的ODS C18柱(4.6mmΦ×25cmL，YMC，Co.，Ltd)并用處于溶液1(＝H2O/0.1％TFA)和溶液2(CH3CN/0.1％TFA)的混合物中的17％溶液2平衡，然后將溶液2的濃度在30分鐘內(nèi)提高到47％以獲得所純化的目標(biāo)肽單體(227.5mg)，其存留時(shí)間為14.79分鐘。
氨基酸分析水解1％苯酚/6N水性鹽酸溶液110℃，10小時(shí)分析方法茚三酮方法Asx1.71(2)Thr0.75(1)Glx1.07(1)Met0.91(1)*Leu(1)Tyr0.82(1)*)Leu＝參考氨基酸括號(hào)( )中的值理論值質(zhì)譜法LC/MS M+1＝1173.0(理論值＝1172.36)肽測(cè)序從N-末端的第二個(gè)殘基(Tyr)連續(xù)到C-末端Leu證實(shí)序列。
實(shí)施例1下式二聚體的合成 通過將制備1中制備的肽單體(227.5mg)、N-甲基葡糖胺(NMG)(227.5mg)和水(23ml)在室溫下攪拌約2天實(shí)施空氣氧化。向反應(yīng)溶液加入乙酸鈉(2g)在水(5ml)中的水性溶液，并將混合物在室溫?cái)嚢杓s20分鐘。加入水(200ml)和乙腈(約200ml)后，混合物通過Kiriyama Roht(濾紙?zhí)?C)過濾，并用水(約50ml×3)洗滌濾器上的殘?jiān)?。收集濾器上的殘?jiān)⒃诩尤胨髢龈?約200ml)以得到目標(biāo)肽二聚體的粗產(chǎn)物(158mg)。
粗制肽二聚體的純化粗制肽二聚體(158mg)溶于DMSO(9ml)中并加到HPLC(Shimadzu；LC8AD型)的ODS C18柱(5cmΦ×50cmL，YMC，Co.，Ltd.)，該柱子用溶液1(＝H2O/0.1％AcOH)平衡，使用HPLC泵。使柱子按照原狀保持約30分鐘，然后溶液2(＝CH3CN/0.1％AcOH)的濃度在360分鐘內(nèi)從0％增加到40％。之后，通過自動(dòng)部分收集器收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的級(jí)分，而通過220nm的UV吸收監(jiān)視含有目標(biāo)肽的洗脫物。合并級(jí)分并注射到連接到HPLC(Hitachi，L-4000型)并且用溶液1(＝H2O/0.1％TFA)和溶液2(＝CH3CN/0.1％TFA)中的17％溶液2(＝CH3CN/0.1％TFA)平衡的ODS C18柱(4.6mmΦ×25cm L，YMC，Co.，Ltd.)。然后溶液2的濃度在30分鐘內(nèi)從0％增加到47％并通過220nm處UV吸收監(jiān)視洗脫物以得到純化的目標(biāo)肽二聚體(46.6mg)，其存留時(shí)間為20.51分鐘。
FAB.MS 2365.0(理論值2342.70)Na+F＝0.25％。
試驗(yàn)實(shí)施例1用肽二聚體誘導(dǎo)CTLs用HLA-A24轉(zhuǎn)基因小鼠(Int.J.Cancer100，565，2002)評(píng)估實(shí)施例1中制備的肽二聚體的CTL-誘導(dǎo)活性。將肽二聚體溶于二甲基亞砜(DMSO)以得到40mg/ml肽溶液。然后將肽溶液(35μl)加入10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)(581μl)得到肽懸浮液。用連接的玻璃注射器混合所得肽懸浮液(550μl)和MontanideISA51(Seppic)(700μl)以制備乳液作為施用溶液。
將施用溶液(200μl)皮下注射到HLA-A24轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴基部。使用三只小鼠。注射后7天，除去脾臟并制備脾細(xì)胞。將一部分脾細(xì)胞用肽二聚體(100μg/ml)脈沖1小時(shí)。未用肽脈沖的脾細(xì)胞以7×106個(gè)細(xì)胞/孔接種在24孔板中并向孔中加入上述用所述肽脈沖的脾細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞/孔)，并孵育平板。在補(bǔ)加10％FCS，10mMHEPES，20mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，1mM MEM非必需氨基酸，1％MEM維生素和55μM 2-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育5天。
通過51Cr釋放測(cè)定法(J.Immunol.159，4753，1997)檢查所培養(yǎng)的脾細(xì)胞對(duì)用于施用的肽特異的細(xì)胞毒性活性。將通過以如此方式轉(zhuǎn)化EL-4細(xì)胞(ATCC號(hào)TIB-39)使得HLA-A24和H2Kb(Int.J.Cancer100，565，2002)的嵌合體MHCI類分子穩(wěn)定表達(dá)所得的EL4-A2402/Kb細(xì)胞用作靶細(xì)胞。將靶細(xì)胞用51Cr(3.7MBq/106個(gè)細(xì)胞)標(biāo)記并以100μg/ml所述肽脈沖1小時(shí)。對(duì)于對(duì)照，未用肽脈沖的靶細(xì)胞用51Cr標(biāo)記2小時(shí)。那些標(biāo)記的靶細(xì)胞和以前制備的脾細(xì)胞以1∶120的比例混合，培養(yǎng)4小時(shí)并基于受損的靶細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)評(píng)估CTL活性。結(jié)果在圖1中顯示。從用所述肽注射的小鼠制備的脾細(xì)胞強(qiáng)烈傷害用所述肽脈沖的靶細(xì)胞。然而，它們對(duì)不用所述肽脈沖的靶細(xì)胞僅顯示出弱細(xì)胞毒性。這些結(jié)果清楚地表明誘導(dǎo)了對(duì)該肽特異的CLTs。
工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了具有體內(nèi)CTL誘導(dǎo)活性的肽二聚體，和含有所述肽二聚體作為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明可用于改善許多腫瘤患者的病癥。
序列表<110>Haruo SugiyamaChugai Seiyaku Kabushiki KaishaSUMITOMO PHARMACEUTICALS COMPANY，LIMITED<120>二聚體化肽<130>664263<140>
<141>2004-01-15<150>JP 2003-007122<151>2003-01-15<160>71<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>449<212>PRT<213>人<400>1Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Ash His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽
<400>3Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cysl 5<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽<400>26Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg1 5<210>27<211>9<212>PRT
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<223>人工序列描述合成肽
<400>30Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽<400>32Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg1 5<210>33<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽<400>37Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe1 5<210>38<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽<400>40Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala
1 5<210>41<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>44Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>45<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>45Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu1 5<210>46<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>46Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu1 5<210>47<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽
<400>47Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val1 5<210>48<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>48Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala1 5<210>49<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽<400>51Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser1 5<210>52<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>52Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser1 5<210>53<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>53Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile1 5<210>54<211>9<212>PRT<213>人工序列
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<223>人工序列描述合成肽<400>54His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys1 5<210>55<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>55Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys1 5<210>56<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>56Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro1 5<210>57<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>57
Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr1 5<210>58<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>58Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe1 5<210>59<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽<400>60Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser1 5<210>61
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<223>人工序列描述合成肽<400>61Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr1 5<210>62<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>62Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala1 5<210>63<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>63Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe1 5<210>64<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>64Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala1 5<210>65<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>65Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser1 5<210>66<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>66Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala1 5<210>67<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>67Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp1 5
<210>68<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>68Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp1 5<210>69<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>69His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala1 5<210>70<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>70Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys1 5<210>71<211>9<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽<400>71Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr1 5<210>72<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成肽位置2的Xaa代表Tyr，Phe，Met或Trp，以及位置9的Xaa代表Phe，Leu，Ile，Trp或Met。
<400>72Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa1 權(quán)利要求
1.肽二聚體，其中由包括至少一個(gè)半胱氨酸殘基的7-30個(gè)氨基酸組成并且能夠產(chǎn)生具有CTL-誘導(dǎo)活性的腫瘤抗原肽的兩種肽單體的每一種相互通過二硫鍵結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽二聚體，其可以產(chǎn)生具有CTL-誘導(dǎo)活性的腫瘤抗原肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽二聚體，其中兩種肽單體通過一個(gè)或兩個(gè)二硫鍵結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的肽二聚體，其中肽單體來源于腫瘤抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物WT1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的肽二聚體，其中肽單體如下Cys Xaa Thr Trp Asn Gln Met Asn Xaa(SEQ ID NO72)其中2位的Xaa為選自Tyr、Phe、Met和Trp的氨基酸殘基；9位Xaa為選自Phe、Leu、Ile、Trp和Met的氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的肽二聚體，其中肽單體選自下面的肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO11)Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe(SEQ ID NO18)Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr(SEQ ID NO19)Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu(SEQ ID NO20)Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu(SEQ ID NO21)Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO22)Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu(SEQ ID NO23)Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO44)
7.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的肽二聚體與藥學(xué)上可接受的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其用作癌癥疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的肽二聚體在癌癥疫苗制備中的用途。
10.治療或者預(yù)防癌癥的方法，其包括對(duì)需要該治療或預(yù)防的WT-1陽性患者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的肽二聚體。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的腫瘤抗原肽和其癌癥疫苗，具體地，肽二聚體，其中由包括至少一個(gè)半胱氨酸殘基的7－30個(gè)氨基酸組成并且能夠產(chǎn)生腫瘤抗原肽的兩種肽單體相互通過二硫鍵結(jié)合。
文檔編號(hào)C07K7/08GK1756763SQ20048000584
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月15日
發(fā)明者杉山治夫, 高須秀夫, 三溝文雄 申請(qǐng)人:杉山治夫, 中外制藥株式會(huì)社, 住友制藥株式會(huì)社