專利名稱：用于在體內(nèi)快速鑒定藥物活性化合物的動物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于腫瘤生長，特別是癌性生長的動物模型。具體地，動物模型使得能夠體內(nèi)鑒定藥物活性化合物，包括利用由包括可操作地連接啟動子的報道基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，其中該啟動子還控制與腫瘤退化、腫瘤生長穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)的蛋白的表達(dá)。
背景技術(shù)：
長久以來一直都需要代表性的動物模型來測試被推薦的新抗腫瘤試劑的效果而不必進(jìn)行長期的異種移植研究。測試潛在的抗腫瘤試劑的現(xiàn)有體內(nèi)模型包括將腫瘤細(xì)胞植入非人動物，用被推薦的新抗腫瘤試劑處理該動物，然后監(jiān)控動物以確定該處理對腫瘤生長的影響。為了有助于腫瘤細(xì)胞相對于宿主細(xì)胞背景的顯示，許多體內(nèi)模型使用由報道基因，例如生物發(fā)光分子的螢光素酶家族和水母發(fā)光蛋白家族穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。
在開發(fā)抗癌試劑的過程中，這些體內(nèi)模型的主要缺點(diǎn)是有限的通量，即需要大量的動物和大量被推薦的抗癌化合物。此外，這些體內(nèi)模型是很耗時的，因?yàn)槠湫枰銐虻臅r間來使植入的腫瘤在動物中生長。因此，最近Lassota P.在2002年7月18日公開的國際專利申請WO 02/055742(PCT/EP02/00106)中提出了改進(jìn)的模型。在這個模型中，具有被抗腫瘤試劑激活的報道基因的腫瘤細(xì)胞生長在生物相容的半滲透性的密封裝置內(nèi)，將該裝置植入非人動物并且在使該動物暴露于待測試的化合物后將其取出。然而，考慮到腫瘤細(xì)胞的人工環(huán)境，腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答是否真正地模仿體內(nèi)狀態(tài)是有疑問的，在體內(nèi)狀態(tài)中化合物必須進(jìn)入循環(huán)、浸潤腫瘤組織并且發(fā)揮其生物效應(yīng)。
因此，為了滿足對沒有上述缺陷的用于人腫瘤疾病的動物模型的需要，本發(fā)明公開了已經(jīng)能夠真正模仿被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥理學(xué)活性的新動物模型。該模型使得能夠以非侵入性的方式監(jiān)控化合物的抗腫瘤活性，并且包括利用已經(jīng)用包含可操作連接啟動子的報道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞，其中該啟動子還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的表達(dá)。為了提供所需要的動物模型，該細(xì)胞應(yīng)-當(dāng)被植入或注射入動物時，保持形成腫瘤的能力；-產(chǎn)生與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的內(nèi)源應(yīng)答平行的信號；-產(chǎn)生具有優(yōu)良信噪比的信號，以使得能夠在體內(nèi)實(shí)時分析藥物物質(zhì)的動力學(xué)效應(yīng)；-產(chǎn)生具有優(yōu)良可重復(fù)性的信號以提供動物之間的低變異性；以及-產(chǎn)生能夠使誘導(dǎo)的應(yīng)答非侵入性成像的信號。
發(fā)明概述在第一個方面，本發(fā)明提供用包含可操作地連接啟動子的報道基因，優(yōu)選熒光蛋白的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系，其中啟動子還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的表達(dá)，其特征在于當(dāng)被植入或注射入非人動物中時，所述的細(xì)胞系能夠形成腫瘤。
與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，本發(fā)明的不同點(diǎn)在于報道基因不是組成型表達(dá)的，而只有在暴露于導(dǎo)致與腫瘤退化相關(guān)的蛋白或酶表達(dá)的測試化合物后才會表達(dá)。只有當(dāng)待測試的化合物進(jìn)入循環(huán)并浸潤腫瘤時，如果其促進(jìn)與腫瘤退化相關(guān)的蛋白表達(dá)并且所述蛋白的啟動子可操作地連接報道基因，就可能產(chǎn)生報道信號。
該模型相對于現(xiàn)有的體內(nèi)模型是高度有利的，因?yàn)闇p少了測試被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥物活性的周轉(zhuǎn)時間。在傳統(tǒng)的體內(nèi)模型中，一般需要4至5周來獲得結(jié)果，而在本模型中，一旦在非人動物中形成腫瘤，就有可能在幾天中看到測試化合物的效應(yīng)。進(jìn)一步的，考慮到熒光信號的亮度和可重復(fù)性，可透過皮膚看到腫瘤并且利用自動的全體(whole-body)成像系統(tǒng)進(jìn)行測量。因此只需要較低數(shù)目的動物來獲得統(tǒng)計學(xué)顯著的效果。本動物模型的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)是在廣泛濃度范圍的測試化合物內(nèi)的熒光信號的靈敏性和反應(yīng)性。這個組合使得能夠?qū)y試化合物的體內(nèi)活性進(jìn)行動力學(xué)的實(shí)時分析并且當(dāng)與觀察到的腫瘤重量變化組合時預(yù)測測試化合物的抗腫瘤效果。這些特征的組合使得能夠在使用有限量的測試化合物劑量(4天，而不是傳統(tǒng)的30天時間段)后進(jìn)行非侵入性的成像，其減少了實(shí)驗(yàn)時間并且因此減少了測試化合物，以及減少了動物遭受的病痛和動物設(shè)施的占用時間。
在特定的實(shí)施方案中，啟動子由p21啟動子組成。p21蛋白作為依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性的抑制劑起作用并且有效地終止細(xì)胞周期進(jìn)展。已經(jīng)顯示多種抗腫瘤試劑激活p21啟動子，包括DNA破壞試劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑，其分別通過p53應(yīng)答元件(位于相對于TATA框-4500bp至-1300bp的區(qū)域)或sp1位點(diǎn)(位于相對于TATA框-60bp至+40bp的區(qū)域)而激活p21啟動子，并且導(dǎo)致p21蛋白的表達(dá)增加。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，p21啟動子由p21的1300bp啟動子片段組成，其特征在于所述的啟動子片段不包括p53應(yīng)答元件，因此對DNA破壞試劑不起反應(yīng)。在另一個實(shí)施方案中，p21啟動子由包括p53應(yīng)答元件的p21啟動子組成，所述的p21啟動子對DNA破壞試劑起反應(yīng)。備選地對DNA破壞試劑起反應(yīng)的啟動子由例如包括至少一個p53應(yīng)答元件的單純皰疹病毒的胸苷激酶基本啟動子(HSV-TK)的最小啟動子組成。因此，以所使用的啟動子為基礎(chǔ)，本發(fā)明提供對DNA破壞試劑和/或組蛋白脫乙酰酶抑制劑的體內(nèi)藥理學(xué)效果具有選擇性的模型。或一般說來，根據(jù)目標(biāo)腫瘤試劑，可使用備選的應(yīng)答元件。
此外本發(fā)明的目的也提供篩選化合物的抗腫瘤活性的體外方法，包括步驟-使根據(jù)本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞接觸待測試的化合物；以及-測量報道基因的表達(dá)；其中與對照水平相比，報道基因表達(dá)的增加鑒定化合物為具有抗腫瘤活性。在特定的實(shí)施方案中，報道基因是熒光蛋白并且測量報道基因的表達(dá)為發(fā)射的熒光的量。如上文所說明的，對于這個體外方法也有可能根據(jù)所使用的啟動子改變篩選的選擇能力。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，體外篩選法對于組蛋白脫乙酰酶抑制劑是選擇性的并且包括用包括p21的1300bp啟動子片段的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，其特征在于所述的啟動子片段不包括p53應(yīng)答元件。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，體外篩選法對于DNA破壞試劑，例如放線菌素D是選擇性的，并且包括用包含至少一個p53應(yīng)答元件的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括由SEQ ID No.10組成的p53應(yīng)答元件，優(yōu)選作為例如HSV-TK啟動子的最小啟動子的部分。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于篩選化合物藥物活性的非人動物模型，所述的動物包括根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。可以腫瘤細(xì)胞懸浮液的形式，將所述的腫瘤細(xì)胞通過手術(shù)植入或注射入非人動物的皮膚下以提供皮下模型，進(jìn)入腫瘤來源的器官(例如進(jìn)入肺的肺腫瘤細(xì)胞)以提供同位的模型，進(jìn)入非人動物的腹膜腔以提供腹膜模型，或進(jìn)入非人動物的血管以提供轉(zhuǎn)移模型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，皮下注射腫瘤細(xì)胞以提供皮下的模型。
因此本發(fā)明的目的是提供篩選化合物的藥物活性的方法，包括以下步驟-將根據(jù)本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞以在所述的非人動物中足夠影響腫瘤產(chǎn)生的量施用于非人動物；-提供腫瘤細(xì)胞足夠的時間以在所述的非人動物中形成腫瘤；-將潛在的活性化合物施用于所述的非人動物；以及-通過測量報道基因的表達(dá)評估所述的化合物對腫瘤細(xì)胞的影響。
與藥物活性化合物進(jìn)行溫育將導(dǎo)致與對照水平相比報道基因的表達(dá)增加。
在下文中將更詳細(xì)地論述本發(fā)明的這個方面和進(jìn)一步的方面。
附圖簡述

圖1A克隆1的p21啟動子構(gòu)建體對DNA破壞試劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)的劑量反應(yīng)。用指明的化合物處理細(xì)胞24小時，所述化合物即DNA破壞試劑喜樹堿(campthotecin)(camp.)、博來霉素(bleo)和阿霉素(dox)以及HDACi化合物TSA、Mitsui、化合物X和SAHA。如M&M所描述的，利用Ascent Fluoroskan測量熒光。將誘導(dǎo)后的熒光除以DMSO處理細(xì)胞的熒光計算誘導(dǎo)倍數(shù)。用10-7M TSA處理后克隆1顯示5倍的誘導(dǎo)；10-6M Mitsui顯示2倍的誘導(dǎo)，以及10-6M化合物X顯示3倍的誘導(dǎo)。
圖1B克隆5的p21啟動子構(gòu)建體對DNA破壞試劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)的劑量反應(yīng)。用指明的化合物處理細(xì)胞24小時，所述化合物即DNA破壞試劑喜樹堿(camp.)、博來霉素(bleo)和阿霉素(dox)以及HDACi化合物TSA、Mitsui、JNJ99(化合物X)和SAHA。如M&M所描述的，利用Fluoroskan測量熒光。將誘導(dǎo)后的熒光除以DMSO處理細(xì)胞的熒光計算誘導(dǎo)倍數(shù)。用10-7M TSA處理后克隆5顯示5倍的誘導(dǎo)；10-6M Mitsui顯示2倍的誘導(dǎo)，以及10-6M化合物X顯示4倍的誘導(dǎo)。
圖2.異種移植熒光的體內(nèi)顯示。將克隆1皮下注射(107個細(xì)胞/200μl)進(jìn)入裸鼠脅腹。從第12天開始，在6天期間每日使動物服用溶劑、Mitsui(20mpk)或化合物X(40mpk)。在內(nèi)部(in house)顯影的自動全體成像系統(tǒng)中評估活小鼠中腫瘤的熒光并且比較熒光強(qiáng)度。施用第一劑后3天ZsGreen的誘導(dǎo)是非常明顯的，并且開始處理后5天達(dá)到平臺。
圖3.在A2780和HCT116克隆中，p53RE啟動子構(gòu)建體對DNA破壞試劑放線菌素D的應(yīng)答。用放線菌素D處理細(xì)胞24小時。如在實(shí)施例2中所描述的，利用Fluoroskan測量熒光。將誘導(dǎo)后的熒光除以DMSO處理細(xì)胞的熒光計算誘導(dǎo)倍數(shù)。A2780克隆36顯示用10ng/ml放線菌素D處理后有2倍的誘導(dǎo)；使用HCT116克隆觀察到2至幾乎4倍的誘導(dǎo)。
圖4.p21waf，cip1啟動子-ZsGreen模型預(yù)測HDAC抑制劑的體外生物效應(yīng)。用標(biāo)明濃度的HDAC抑制劑SAHA(*)、MS-275(Δ)、LAQ-824( )和TSA(·)或溶劑(0.1％DMSO)對用pGl3-基本-ZsGreen-1300轉(zhuǎn)染的A2780卵巢腫瘤細(xì)胞的克隆5處理24小時。圖4A顯示利用p21 ELISA測量的克隆5的p21蛋白誘導(dǎo)。圖4B表示利用Ascent Fluoroskan測量的克隆5中誘導(dǎo)的熒光。p21的誘導(dǎo)模式與p21應(yīng)答的ZsGreen表達(dá)載體pGl3-基本-ZsGreen-1300的誘導(dǎo)模式相同。
圖5.p21waf，cip1啟動子-ZsGreen模型預(yù)測個體小鼠中MS-275的體內(nèi)抗腫瘤效果。用人A2780p21waf，cip1ZsGreen卵巢腫瘤細(xì)胞(107個細(xì)胞/小鼠)皮下注射裸鼠，并且從第4天接著用載體(對照組、20％羥丙基-β-環(huán)糊精)或MS-275(QD)以指明的劑量口服(p.o.)處理。在第28天利用自動全體成像系統(tǒng)評估腫瘤重量和個體腫瘤的熒光。
圖6.53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen表達(dá)載體發(fā)明詳述載體本發(fā)明涉及包括可操作地連接啟動子的報道基因的載體，其中該啟動子還控制表達(dá)水平與生理狀況相關(guān)的蛋白或酶的表達(dá)。
在此所使用的可操作地連接，是指使啟動子與基因在正確的讀框中功能性地融合以在該啟動子的控制下表達(dá)該基因。如在此所使用的，術(shù)語“報道基因”是指編碼可利用簡單、廉價的方法或試劑鑒定的基因產(chǎn)物的基因，并且其可與啟動子區(qū)域或其活性片段可操作地連接。例如螢火蟲螢光素酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或熒光蛋白報道基因的報道基因可用于在根據(jù)本發(fā)明的篩選測定中確定轉(zhuǎn)錄活性(參見，例如，Goeddel(編輯.)，MethodsEnzymol.，Vol.185，San DiegoAcademic Press，Inc.(1990)；也參見Sambrook，上文)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，報道基因是熒光蛋白，特別地選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed的熒光蛋白或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，報道基因是熒光蛋白ZsGreen。所述的報道分子及其基因序列是本領(lǐng)域已知的并且是可商業(yè)購買的，例如由Clontech，San Diego，Califonia銷售的熒光蛋白。
用于核酸操作，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)，以及蛋白分析的技術(shù)和方法在Current Protocolsin Molecular Biology，Ausbel等人編輯，John Wiley & Sons，1997中有詳細(xì)描述。
根據(jù)本發(fā)明的載體可從商業(yè)購買的載體選擇或構(gòu)建，例如pCAT3、pGL2、pGL3或pSV-β-半乳糖苷酶，并且一般包括適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列以及一種或多種選擇標(biāo)記基因，例如在細(xì)菌質(zhì)粒情況下為氨芐青霉素抗性基因或?qū)τ诓溉閯游镙d體來說為新霉素抗性基因。如下文所例證的，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，從pGL3基本載體構(gòu)建載體。所述的載體序列是本領(lǐng)域已知的并且是可商業(yè)購買的，例如pGL3基本載體由Promega，Madison，WI銷售。特別地，本發(fā)明的載體包含作為一個調(diào)控序列的啟動子序列，其不僅與設(shè)計表達(dá)載體的宿主細(xì)胞相容，而且對已知在各自的宿主細(xì)胞中具有所需要的生理效應(yīng)的化合物，包括蛋白、肽、寡核苷酸和小分子起反應(yīng)。因此，本發(fā)明表達(dá)載體中的啟動子序列包括至少一個調(diào)控序列元件，亦稱為應(yīng)答元件，其特征在于它調(diào)節(jié)連接的報道基因的表達(dá)，并且由于結(jié)合或釋放轉(zhuǎn)錄因子而被激活，其中所述轉(zhuǎn)錄因子的存在或不存在與宿主細(xì)胞的所需要的生理?xiàng)l件相關(guān)。例如，如果所需要的生理?xiàng)l件由在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和分化組成，那么啟動子序列可包括存在于p21WAF- 1/Cip1啟動子鄰近部分的富含GC的基序，已知當(dāng)暴露于p21激活劑，例如轉(zhuǎn)錄因子Sp1和Sp3，以及細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化的其它誘導(dǎo)物，例如類固醇激素、神經(jīng)生長因子、腫瘤壞死因子-α、佛波酯、磷酸酶抑制劑、干擾素γ、和Smad腫瘤抑制蛋白時所述基序被激活。
因此，在此所使用的啟動子可以是天然存在的啟動子，例如p21WAF-1/Cip1啟動子，其還控制表達(dá)水平依賴于所需要的生理?xiàng)l件的蛋白的表達(dá)，或者可以是其具有啟動子活性的片段，例如如在下文的實(shí)施例中所描述的p21的1300bp啟動子片段。在特定的實(shí)施方案中，啟動子序列由重組DNA構(gòu)建體組成，其包括一個上述的調(diào)控序列元件，例如可操作地連接最小啟動子元件，例如最小的白細(xì)胞介素6(IL6)啟動子(phu.IL6Pluc+Plaisance等人(1997)MCB17，3733-3743)、最小的E1B啟動子(可從Stratagene商業(yè)購買的pMCSluc)或可商業(yè)購買的用于螢光素酶的TK啟動子(pTKluc Promega)的p53應(yīng)答元件，優(yōu)選地啟動子由如下文所描述的p21的1300bp啟動子片段、或包括如下文所描述的p53應(yīng)答元件的HSV-TK最小啟動子組成。在另一個實(shí)施方案中，啟動子序列可以是還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白表達(dá)的啟動子，或其具有啟動子活性的片段。
靶細(xì)胞在另一個方面，本發(fā)明涉及用包括可操作地連接啟動子的報道基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞，其中啟動子還控制表達(dá)水平與生理?xiàng)l件相關(guān)的蛋白或酶的表達(dá)。
可通過任何已知的方法，例如轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，優(yōu)選利用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法，例如脂質(zhì)體、磷酸鈣沉淀、電穿孔和使用基因槍將如上所述的載體構(gòu)建體導(dǎo)入靶細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面是提供用于腫瘤生長，特別是癌性生長的非人動物模型?？蓪⒏鶕?jù)本發(fā)明的載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，當(dāng)將所述靶細(xì)胞植入或注射入非人動物時能夠形成腫瘤。合適的細(xì)胞系實(shí)例包括黑素瘤、肺腫瘤系、腎腫瘤系、結(jié)腸腫瘤系、前列腺腫瘤系、卵巢腫瘤系、乳腺腫瘤系、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤系、白血病細(xì)胞系等。在一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞由卵巢腫瘤細(xì)胞系，特別是A2780(ECACC No.93112520)組成，在另一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞由結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系，特別是HCT116(ATCC No.CCL-247)組成。進(jìn)一步的靶細(xì)胞可選自多種細(xì)胞系，其包括多種哺乳動物細(xì)胞系，特別是人細(xì)胞系。應(yīng)注意到在此所使用的靶細(xì)胞包括任何上述的細(xì)胞，其已經(jīng)用針對選擇標(biāo)記，例如新霉素，治療性的蛋白，例如甲硫氨酸酶或報道基因產(chǎn)物的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化。例如，在本發(fā)明備選的實(shí)施方案中，當(dāng)被施用于非人動物時能夠形成腫瘤的靶細(xì)胞已經(jīng)用編碼報道蛋白，例如螢火蟲螢光素酶或熒光蛋白(參見上文)的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化?？捎酶鶕?jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞，前提是提供基礎(chǔ)色的發(fā)光蛋白，即報道基因，和提供可誘導(dǎo)色的根據(jù)本發(fā)明的載體的發(fā)射波長相互不重疊?？赡艿慕M合包括DsRed與增強(qiáng)的熒光蛋白EBFP、ECFP、EGFP和EYFP；ZsGreen與DsRed；EGFP與EYFP；EGFP與EBFP；EBFP與EYFP；或ECFP與EYFP。一旦用根據(jù)本發(fā)明的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這些細(xì)胞就使得能夠有效檢測完整的腫瘤，例如，確定所施用的腫瘤細(xì)胞何時在所述的非人動物中具有足夠的時間來形成腫瘤，結(jié)合在此所描述的誘導(dǎo)型系統(tǒng)研究測試化合物的抗腫瘤活性。特別地，用來研究待測試的化合物是否通過被動擴(kuò)散和/或血管生成進(jìn)入腫瘤。無論如何靶細(xì)胞的選擇取決于所研究的生理?xiàng)l件。備選地，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體具有低的但可檢測的報道基因的基本表達(dá)，其具有達(dá)到顯著性的優(yōu)良誘導(dǎo)系數(shù)。在這個實(shí)施方案中，低的基本表達(dá)可用于確定所施用的腫瘤細(xì)胞何時在所述的非人動物中具有足夠的時間來形成腫瘤。因此不需要靶細(xì)胞的雙重轉(zhuǎn)染。當(dāng)本發(fā)明所述的載體包括ZsGreen作為報道基因時，這個實(shí)施方案是有利的。
因此本發(fā)明的目的是提供已經(jīng)用包含可操作地連接啟動子的報道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系，其中所述的啟動子還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的表達(dá)。特別地，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞系，優(yōu)選A2780細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，所述的啟動子對p21激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選所述的啟動子包括1300bp的p21啟動子序列(SEQ ID No.1)，更優(yōu)選地，所述的啟動子序列由1300bp的p21啟動子序列(SEQ IDNo.1)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP，以及在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選自于2003年1月20日，作為pGL3-基本-ZsGreen-1300-克隆1和pGL3-基本-ZsGreen-1300-克隆2保藏在比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM)的克隆，其各自的保藏號為LMBP 5958CB和LMBP5959CB。所述的克隆包括來源于可商業(yè)購買的pGL3載體，并且包含可操作地連接啟動子的編碼ZsGreen的核酸序列的表達(dá)載體，其中所述的啟動子對p21激活劑起反應(yīng)，所述的啟動子包括1300bp p21啟動子序列(SEQ ID No.1)，其中所述克隆的特征在于具有低的基本熒光表達(dá)，當(dāng)用已知的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化誘導(dǎo)物，例如Mitsui(也稱為MS-275-Shering-注冊號209783-80-2)誘導(dǎo)時，使得能夠通過自動全體成像系統(tǒng)檢測熒光。
考慮到這些特征，即-當(dāng)被植入或注射入非人動物時，能夠形成腫瘤，-低的基本熒光，-當(dāng)暴露于已知的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化誘導(dǎo)物時，以特異的方式可誘導(dǎo)熒光，以及-達(dá)到利用非侵入性全體成像技術(shù)可檢測的水平，所述的克隆為研究被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥物活性提供了重要工具。與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，在非人動物中，特別是在例如兔、豚鼠、小鼠、大鼠和狗，優(yōu)選嚙齒類動物的實(shí)驗(yàn)動物中使用這些細(xì)胞，使得能夠在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期時間點(diǎn)評估化合物，而不必進(jìn)行耗時和耗費(fèi)化合物的藥物代謝動力學(xué)(PK)和藥物動力學(xué)(PD)研究。
在備選的實(shí)施方案中，用包括由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動子序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，該構(gòu)建體包括一個上述的調(diào)控序列元件，例如可操作地連接最小啟動子元件，例如最小的白細(xì)胞介素6(IL6)啟動子(phu.IL6Pluc+Plaisance等人(1997)MCB 17，3733-3743)、最小的E1B啟動子(可從Stratagene商業(yè)購買的pMCSluc)或可商業(yè)購買的用于螢光素酶的TK啟動子(pTKluc Promega)的p53應(yīng)答元件。特別地，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系或卵巢癌細(xì)胞系，優(yōu)選HCT116細(xì)胞或A2780細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，該啟動子對p53激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選地所述的啟動子包括p53應(yīng)答元件(SEQ ID No.10)，更優(yōu)選地，所述的啟動子由包括p53應(yīng)答元件(Seq ID No.10)的最小HSV-TK啟動子組成，更優(yōu)選地，由p53應(yīng)答的HSV-TK啟動子序列(SEQ ID No.13)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP，以及在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在特定的實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由用p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen載體(圖)轉(zhuǎn)染的A2780或HCT116細(xì)胞組成，所述載體衍生自可商業(yè)購買的pGL3載體并且包含可操作地連接啟動子的編碼ZsGreen的核酸序列，其中啟動子對p53激活劑起反應(yīng)，所述的啟動子包括p53應(yīng)答的HSV-TK啟動子序列(SEQ ID No.14)，其中所述克隆的特征在于其具有低的基本熒光表達(dá)，當(dāng)用p53激活劑誘導(dǎo)時，例如暴露于DNA破壞試劑、低氧、核苷酸耗盡或致癌激活時，使得能夠通過自動全體成像系統(tǒng)檢測熒光。
考慮到這些特征，即-當(dāng)被植入或注射入非人動物時，能夠形成腫瘤，-低的基本熒光，-當(dāng)暴露于已知的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化誘導(dǎo)物時，以特異的方式可誘導(dǎo)熒光，以及-達(dá)到利用非侵入性全體成像技術(shù)可檢測的水平，所述的克隆為研究被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥物活性提供了重要工具。與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，在非人動物中，特別是在例如兔、豚鼠、小鼠、大鼠和狗，優(yōu)選嚙齒類動物的實(shí)驗(yàn)動物中使用這些細(xì)胞，使得能夠在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期時間點(diǎn)評估化合物，而不必進(jìn)行耗時和耗費(fèi)化合物的藥物代謝動力學(xué)(PK)和藥物動力學(xué)(PD)研究。
因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供已經(jīng)用包含報道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系，其中報道基因與由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動子序列可操作地連接，該構(gòu)建體包括可操作地連接到最小啟動子元件的調(diào)控序列元件，其特征在于所述的啟動子序列對與腫瘤退化相關(guān)的化合物起反應(yīng)。在此所使用的化合物包括蛋白、肽、寡核苷酸和小分子。
測定本發(fā)明的目的也在于提供上述細(xì)胞系在體外篩選測定中的用途，來鑒定藥物學(xué)上的活性化合物，所述的方法包括使根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與待測試的化合物接觸；并且測量報道基因的表達(dá)。在此所使用的藥物學(xué)上的活性化合物是指能夠激活存在于表達(dá)載體中的啟動子序列的化合物。
在鑒定具有抗腫瘤活性的化合物的特定實(shí)施方案中，上述篩選法中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動子序列的報道基因的表達(dá)載體，該啟動子序列對與腫瘤退化相關(guān)的化合物起反應(yīng)。因此本發(fā)明的一個目的是提供鑒定具有抗腫瘤活性的化合物的體外方法，所述的方法包括使根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞與待測試的化合物接觸，并且測量報道基因的表達(dá)。
在上述體外篩選法的優(yōu)選實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞，優(yōu)選A2780細(xì)胞組成，該細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，所述的啟動子對p21激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選所述的啟動子包括1300bp的p21啟動子序列(SEQ ID No.1)，更優(yōu)選地，所述的啟動子序列由1300bp的p21啟動子序列(SEQ ID No.1)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP，以及在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen或ZsRed組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于體外篩選法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞選自以保藏號LMBP 5958CB和LMBP 5959CB保藏在BCCM的克隆。在上述體外篩選法的另一個實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞組成，優(yōu)選A2780細(xì)胞或HCT116細(xì)胞，所述細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，該啟動子對p53激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選地所述的啟動子包括p53應(yīng)答元件(SEQ ID No.10)，更優(yōu)選地，所述的啟動子由包含p53應(yīng)答元件的最小HSV-TK啟動子(SEQ IDNo.13)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP，且在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在特定的實(shí)施方案中，用于體外方法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由用p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen載體轉(zhuǎn)染的A2780或HCT116細(xì)胞組成(圖6)。
技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到，上述測定可適合于高通量的篩選目的。例如可根據(jù)稱為熒光成像平板讀數(shù)器((FLIPR)，MolecularDevices Corporation)的儀器來設(shè)計通過測量熒光變化評估抗腫瘤活性的測定。在其最常見的構(gòu)型中，它激發(fā)并測量由熒光化合物發(fā)射的熒光。它使用氬離子激光器產(chǎn)生熒光團(tuán)的高功率激發(fā)，使用光學(xué)器件系統(tǒng)迅速掃描越過96-/384-孔平板的底部，并且使用靈敏的、冷卻的CCD照相機(jī)捕獲發(fā)射的熒光。它也包含96-/384-孔移液管頭來使得該儀器能夠?qū)y試試劑的溶液遞送進(jìn)入96-/384-孔平板的孔中。FLIPR分析被設(shè)計用于在加入化合物前、加入期間和加入后實(shí)時地同時測量來自所有的96-/384-孔的細(xì)胞群體的熒光信號。FLIPR測定可用來篩選和表征在根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中有功能活性的化合物。
高通量的篩選測定，特別是對鑒定p21或p53激活劑有用的測定可由單個的步驟排列組成，其中將卵巢癌細(xì)胞，特別是用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的A2780細(xì)胞與測試化合物一起溫育，并且在使得能夠進(jìn)行相互作用的足夠時間后(8-24小時，一般為12-24小時，特別為24小時)利用自動的熒光平板讀數(shù)器，例如FLIPR或AscentFluoroskan(可從Thermo Labsystems，Brussel，比利時商業(yè)購買)測量相對熒光單位的變化。
非人動物模型本發(fā)明的實(shí)施方案也提供包括根據(jù)本發(fā)明的靶細(xì)胞的非人動物。特別提供用于腫瘤生長，特別是癌性生長的非人動物模型。
因此，本發(fā)明提供制備用于腫瘤生長的非人動物模型的方法，所述的方法包括將根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞以足夠在所述的非人動物中影響腫瘤產(chǎn)生的量施用于所述的非人動物。其中用作模型的所述非人動物優(yōu)選是哺乳動物受試者，最優(yōu)選是便利的實(shí)驗(yàn)動物，例如豚鼠、兔、大鼠和小鼠等。為了更類似于人受試者，也可使用靈長類。特別有用的是對腫瘤發(fā)展敏感的受試者，例如免疫系統(tǒng)減損的受試者，一般為裸鼠或SCID小鼠?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)募棺祫游锸茉囌撸饕ㄟ^便利性和與最終目標(biāo)系統(tǒng)的相似性決定選擇。非人動物模型優(yōu)選是嚙齒類動物，例如裸鼠，并且影響腫瘤產(chǎn)生的細(xì)胞量一般是從106至108個細(xì)胞(參見例如US6,251,384)。優(yōu)選的所述施用是皮下的并且形成實(shí)體的腫瘤。
上述的動物模型可用于篩選具有抗腫瘤活性的化合物的方法。優(yōu)選地，施用于所述非人動物的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞系，優(yōu)選A2780細(xì)胞組成，其包括包含可操作地連接啟動子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，所述的啟動子對p21激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選所述的啟動子包括1300bp的p21啟動子序列(SEQ ID No.1)，更優(yōu)選地，所述的啟動子序列由1300bp的p21啟動子序列(SEQ ID No.1)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP，且在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen或ZsRed組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于體內(nèi)篩選法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞選自以保藏號LMBP 5958CB和LMBP5959CB保藏在BCCM的克隆。
在備選的實(shí)施方案中，用于體內(nèi)篩選法的腫瘤細(xì)胞是用包括由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動子序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的，該構(gòu)建體包括一個上述的調(diào)控序列元件，例如p53應(yīng)答元件，其可操作地連接最小啟動子元件，例如最小的白細(xì)胞介素6(IL6)啟動子(phu.IL6Pluc+Plaisance等人(1997)MCB17，3733-3743)、最小的E1B啟動子(可從Stratagene商業(yè)購買的pMCSluc)或可商業(yè)購買的用于螢光素酶的TK啟動子(pTKluc Promega)。在一個實(shí)施方案中，用于體內(nèi)篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞組成，優(yōu)選A2780細(xì)胞或HCT116細(xì)胞，其包括包含可操作地連接啟動子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，該啟動子對p53激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選地所述的啟動子包括p53應(yīng)答元件(SEQ IDNo.10)，更優(yōu)選地，所述的啟動子由包括p53應(yīng)答元件的最小HSV-TK啟動子(SEQ ID No.13)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP，且在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在特定的實(shí)施方案中，用于體內(nèi)方法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由用p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen載體轉(zhuǎn)染的A2780或HCT116細(xì)胞組成(圖6)。
因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體內(nèi)篩選法中，本發(fā)明提供已經(jīng)用包含報道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系的用途，其中報道基因與由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動子序列可操作地連接，該構(gòu)建體包括可操作地連接到最小啟動子元件的調(diào)控序列元件，其特征在于所述的啟動子序列對與腫瘤退化相關(guān)的化合物起反應(yīng)。
當(dāng)用于體內(nèi)篩選法時，施用于所述的非人動物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞必須具有足夠的時間在所述的非人動物中形成腫瘤。腫瘤，特別是用卡鉗可測量的實(shí)體瘤一般在將穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞施用于非人動物后7-20天形成。在具體的實(shí)施方案中，利用根據(jù)本發(fā)明的A2780轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，特別是利用以保藏號LMBP 5958CB或LMBP 5959CB保藏在BCCM的卵巢癌細(xì)胞，在注射該細(xì)胞后12天獲得卡鉗可測量的腫瘤。
因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生非人體內(nèi)動物模型的方法以鑒定具有抗腫瘤活性的化合物，所述的方法包括以下步驟將根據(jù)本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞施用于非人動物，其中一般以包括106至108個細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞懸浮液的形式在非人動物的皮膚下進(jìn)行注射來施用根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞；以及使得所述腫瘤細(xì)胞能夠有足夠的時間在所述的非人動物中形成腫瘤，其中在特定的實(shí)施方案中，利用如上所列出的卵巢癌細(xì)胞，其一般由7-14天組成，更優(yōu)選為9-12天以及特別的為12天。
可將按照上述方法獲得的非人動物模型隨后用于鑒定具有抗腫瘤活性的化合物的體內(nèi)方法，所述的方法包括以下步驟將潛在的活性化合物施用于根據(jù)本發(fā)明的非人動物，優(yōu)選為用如上所列出的卵巢癌細(xì)胞注射的裸鼠，其中可通過所有的臨床相關(guān)施用途徑，包括靜脈內(nèi)地、口服地和腹膜內(nèi)地施用潛在的活性化合物；以及通過測量報道基因的表達(dá)來評估所述的潛在活性化合物對腫瘤細(xì)胞的影響。
本說明書自始至終的術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)方法”、“標(biāo)準(zhǔn)方案”和“標(biāo)準(zhǔn)步驟”，當(dāng)被用于分子生物學(xué)技術(shù)的范圍內(nèi)時，被理解為可在普通的實(shí)驗(yàn)室手冊中找到的方法和操作步驟，所述手冊例如CurrentProtocols in Molecular Biology，編輯F.Ausubel等人，John Wiley &Sons，Inc.1994，或Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA laboratory manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989。
可通過參考下述的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到這些只是為了說明本發(fā)明，正如在此后的權(quán)利要求中更充分描述的。另外，本申請自始至終引用了多種出版物。因此將這些出版物的公開內(nèi)容引入本申請作為參考以更充分地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)水平。
實(shí)施例1材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)和試劑在補(bǔ)充有10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃具有5％CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A2780細(xì)胞(ATCC)。在補(bǔ)充有10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的McCoy’s 5a培養(yǎng)基中，在37℃具有5％CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HCT116細(xì)胞(ATCC)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)溶液由Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)提供。其它的材料由Nunc提供。
產(chǎn)生4500kb的p21啟動子片段和1300kb的p21啟動子片段從增殖的A2780細(xì)胞提取基因組DNA，并且用作嵌套式PCR分離p21啟動子的模板。在55℃的退火溫度，利用寡核苷酸對GAGGGCGCGGTGCTTGG(SEQ ID No.2)和TGCCGCCGCTCTCTCACC(SEQ ID No.3)，以基因組DNA作為模板進(jìn)行20個循環(huán)的第一擴(kuò)增。用寡核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG(SEQ ID No.4)和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC(SEQ ID No.5)在88℃退火再擴(kuò)增所得到的包含相對于TATA框-4551至+88片段的4.5kb片段20個循環(huán)，產(chǎn)生4.5kb的片段，隨后用寡核苷酸對TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC(SEQ IDNo.6)和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC(SEQ ID No.7)在88℃退火擴(kuò)增20個循環(huán)，產(chǎn)生1.3kb的片段，其包含相對于TATA框的-1300至+88的片段。將存在于寡核苷酸中的限制酶切位點(diǎn)XhoI和KpnI(加下劃線的序列)用于進(jìn)行亞克隆。
p21啟動子構(gòu)建體從pGL3-基本中移去螢光素酶報道基因并在KpnI和XbaI限制酶切位點(diǎn)由ZsGreen報道基因替代(來自pZsGreen1-N1質(zhì)粒)。通過將人p21啟動子區(qū)域的上述1.3kb片段在XhoI和KpnI位點(diǎn)插入pGL3-基本-ZsGreen來構(gòu)建pGL3-基本-ZsGreen-1300。所有的限制性內(nèi)切酶均由Boehringer Manheim(德國)提供。
瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將A2780細(xì)胞以2×105個細(xì)胞的密度鋪平板到6孔平板中，培養(yǎng)24小時，并如制造商所描述的利用Lipofectamine2000(Invitrogen，Brussels，比利時)用2μg的pGL3-基本-ZsGreen-1300和0.2μg的pSV2neo載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用G418(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞10天并使單細(xì)胞懸浮液生長。3周后，獲得80個單克隆。
誘導(dǎo)p21啟動子活性擴(kuò)增A2780轉(zhuǎn)染的庫和所選擇的80個克隆并且以每孔10000個細(xì)胞接種到96孔平板中。接種后24小時，用靶定的化合物(影響最接近的p21啟動子區(qū)域中的sp1位點(diǎn))或DNA破壞試劑(影響p53應(yīng)答元件)處理細(xì)胞另外的24小時。隨后，用4％PFA固定細(xì)胞30秒并用Hoechst染料復(fù)染。p21啟動子的激活導(dǎo)致ZsGreen產(chǎn)生并且因此導(dǎo)致產(chǎn)生熒光，其通過Ascent Fluoroskan(Thermo Labsystems，Brussels，比利時)和通過熒光顯微鏡(Zeiss)監(jiān)控。
體內(nèi)評估將所選擇的克隆(107個細(xì)胞/200μl)皮下注射入裸鼠的脅腹，12天后獲得可用卡尺測量的腫瘤。從第12天開始，在6天期間使動物每日一次口服溶劑、20mpk Mitsui(也稱為MS-275-Shering-注冊號209783-80-2)或40mpk JNJX(各自為10、10和4只動物)。通過內(nèi)部顯影的自動全體成像系統(tǒng)(裝有GFP濾色片并偶聯(lián)有CCD照相機(jī)型JAICV-M90的熒光立體顯微鏡型OlympusSZX12，其中CCD照相機(jī)由以來自National Instruments的IMAQ圖像軟件為基礎(chǔ)的軟件包控制)評估腫瘤的熒光。
結(jié)果通過HDAC抑制劑體外誘導(dǎo)p21 1300bp的啟動子片段如M&M所描述的用TSA(10-7M)、博來霉素(15mU)和Mitsui(10-6M)處理A2780穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的庫和所選擇的80個克隆。80個克隆中有6個克隆對TSA和Mitsui處理起反應(yīng)。這些克隆中的4個顯示如此低的基礎(chǔ)熒光表達(dá)，以致于用Fluoroskan不可檢測，但可利用熒光顯微鏡通過人工評估ZsGreen的產(chǎn)生而進(jìn)行選擇?？蓽y量其它2個克隆并且顯示經(jīng)TSA(10-7)的5倍誘導(dǎo)和經(jīng)Mitsui(10-6)的1.2-1.5倍誘導(dǎo)。
在DNA破壞試劑(喜樹堿、博來霉素和阿霉素)和HDAC抑制劑(TSA、Mitsui、化合物X和Saha)的劑量應(yīng)答中評估這6個克隆。克隆1顯示應(yīng)答10-7TSA的5倍誘導(dǎo)，應(yīng)答10-6M Mitsui的1.8倍和應(yīng)答10-6M JNJX的3倍誘導(dǎo)(圖1)。DNA破壞試劑不能激活1300bp片段的p21啟動子(圖1)?？寺?顯示完全相同的應(yīng)答(圖1)。由于系統(tǒng)的靈敏性問題，不能通過Fluoroskan測量克隆2、3、4和6的誘導(dǎo)，但可利用熒光顯微鏡顯現(xiàn)熒光的增加(數(shù)據(jù)未示出)。
通過HDAC抑制劑體內(nèi)誘導(dǎo)p21啟動子如M&M所描述的用克隆1、2、3和5注射小鼠并服用化合物(溶劑、20mpk Mitsui或40mpk JNJ’99)。在克隆2和3中基礎(chǔ)的ZsGreen表達(dá)和誘導(dǎo)太低而不能通過自動全體成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測?？蓽y量克隆1和5的基礎(chǔ)熒光，且第一劑施用后3天ZsGreen的誘導(dǎo)是非常明顯的，并且5天后達(dá)到平臺(圖2)。
討論已經(jīng)顯示幾種已知的組蛋白脫乙酰酶抑制劑，例如TSA、Mitsui和SAHA，誘導(dǎo)相對于TATA框的-60bp至+40bp的鼠p21waf1，cip1啟動子的反式激活。這個區(qū)域存在于我們的p21waf1，cip11300bp啟動子構(gòu)建體中。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)這些試劑在pGL3-基本-ZsGreen-1300轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞中體外誘導(dǎo)ZsGreen產(chǎn)生。DNA破壞試劑(喜樹堿、博來霉素和阿霉素)通過p21waf1，cip1啟動子的依賴p53的調(diào)節(jié)發(fā)揮其活性。p53應(yīng)答元件位于不存在于1300bp啟動子片段中區(qū)域的p21waf1，cip1啟動子中的更下游。這解釋了該系統(tǒng)對DNA破壞試劑的非反應(yīng)性。通過這些數(shù)據(jù)我們推斷出我們的報道系統(tǒng)提供用于研究涉及組蛋白脫乙?；姆肿邮录哪Ｐ鸵约敖沂玖梭w外報道系統(tǒng)的特異性。這個概念也可用來通過改變應(yīng)答元件而特異地測試DNA破壞試劑或任何其它的藥物。
化合物的體內(nèi)作用是更加復(fù)雜的，并且需要勞動密集型的動物研究來確定該化合物是否進(jìn)入循環(huán)，以活性形式到達(dá)腫瘤，以及腫瘤內(nèi)的濃度是否足夠高以發(fā)揮其生物活性。已經(jīng)在更復(fù)雜的PK/PD研究中顯示Mitsui化合物可到達(dá)腫瘤而且在腫瘤中達(dá)到的濃度足夠高以致于阻止腫瘤的生長。在這個報告中，我們表明處理4天后，Mitsui化合物在pGL3-基本-ZsGreen-1300轉(zhuǎn)染的A2780異種移植物中誘導(dǎo)熒光，意味著該化合物到達(dá)腫瘤并且體內(nèi)發(fā)揮其生物活性。這證實(shí)這個系統(tǒng)是十分有力的體內(nèi)工具，其使得能夠?qū)w內(nèi)活性做出快速和精確的結(jié)論，使得能夠在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的早期時間點(diǎn)評估化合物而不用進(jìn)行耗時和消耗化合物的PK/PD研究。
實(shí)施例2材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)和試劑在補(bǔ)充有10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃具有5％CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A2780細(xì)胞(ATCC)。在補(bǔ)充有10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的McCoy’s 5a培養(yǎng)基中，在37℃具有5％CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HCT116細(xì)胞(ATCC)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)溶液均由Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)提供。其它的材料由Nunc提供。
產(chǎn)生p53應(yīng)答元件從Eurogentec購買下列寡核苷酸(oligo)p53RE正向CCCTGCCTGGACTTGCCTGGGTCGACCCTGCCTGGACTTGCCTGGC(SEQ ID No.8)和p53RE反向TCGAGCCAGGCAAGTCCAGGCAGGGTCGACCCAGGCAAGTCCAGGCAGGGAGCT(SEQ ID No.9)。通過每隔5分鐘逐步降低退火溫度，從65℃開始經(jīng)過50℃、40℃、30℃至20℃的最終溫度，在退火緩沖液(150mM tris pH7.6，15mM MgCl2，23mM DTT)中使寡核苷酸對退火。為了克隆的目的，形成具有SacI/XhoI突出端的片段(應(yīng)答元件是加下劃線的序列)(SEQ ID No.10)TCCCTG CCTGGACTTG CCTGGGTCGA CCCTGCCTGG ACTTGCCTGGCCTCGAGGGAC GGACCTGAAC GGACCCAGCT GGGACGGACC TGAACGGACC GAGCTC構(gòu)建體從pGL3-基本中移除螢光素酶報道基因并在KpnI和XbaI限制酶切位點(diǎn)由ZsGreen報道基因替代(來自pZsGreen1-N1質(zhì)粒)。
通過PCR獲得HSV-TK的最小啟動子(單純皰疹病毒的胸苷激酶基本啟動子)，使用pTK Luc質(zhì)粒(Clontech#6252-1)作為模板。設(shè)計引物以擴(kuò)增HSV-TK最小啟動子和pTK Luc質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。在58℃的退火溫度，利用寡核苷酸對GTACCGAGCTCTTACGCGTG(SEQ ID No.11)和GTGGATCCCTGCTTCATCCCCGTGGC(SEQID No.12)，以質(zhì)粒作為模板進(jìn)行30個循環(huán)的擴(kuò)增。由Roche提供擴(kuò)展的高保真度PCR系統(tǒng)(Expand High Fidelity PCR System)。將存在于寡核苷酸中的限制酶切位點(diǎn)SacI和BamHI(加下劃線的序列)用于進(jìn)行亞克隆。通過將上述197bp的PCR片段在SacI/BglII位點(diǎn)插入pGL3-基本-ZsGreen1-N1，構(gòu)建了構(gòu)建體TK/pGL3-基本-ZsGreen。所有的限制性內(nèi)切酶由Roche(德國)提供。
然后在TK/pGL3-基本-ZsGreen載體的SacI/XhoI克隆位點(diǎn)，在TK啟動子前克隆p53應(yīng)答元件以獲得構(gòu)建體p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen(圖6)。
穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染將A2780細(xì)胞和HCT116細(xì)胞以4×105個細(xì)胞的密度鋪平板到6孔平板中，培養(yǎng)24小時，并如制造商所述，利用Lipofectamine和PlusReagent(Invitrogen，Brussels，比利時)用2μg的p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen和0.2μg的pMC1-neo-Poly A載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用G418(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞16天并使單細(xì)胞懸浮液生長。3周后，從轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞獲得60個單克隆，并從轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞獲得40個單克隆。
誘導(dǎo)p53RE_tk活性擴(kuò)增A2780和HCT116轉(zhuǎn)染的庫以及所選擇的克隆并且以每孔20000個細(xì)胞接種到96孔平板中。接種后24小時，用DNA破壞試劑(影響p53應(yīng)答)另外處理細(xì)胞24小時。p53RE_tk的激活導(dǎo)致ZsGreen產(chǎn)生并且因此導(dǎo)致產(chǎn)生熒光，其通過Ascent Fluoroskan(ThermoLabsystems，Brussels，比利時)和通過熒光顯微鏡(Zeiss)進(jìn)行監(jiān)控。
結(jié)果通過DNA破壞試劑體外誘導(dǎo)p53RE_tk用放線菌素D(10ng/ml)處理HCT116和A2780的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的庫以及所選擇的克隆。所選擇的克隆中有6個HCT116克隆和2個A2780克隆對放線菌素D處理起反應(yīng)。對于這8個克隆，可用Fluoroskan檢測到對該處理反應(yīng)的至少兩倍熒光誘導(dǎo)。特別地A2780克隆36和HCT116克隆5和36顯示可檢測的低的基礎(chǔ)熒光表達(dá)，其對放線菌素處理反應(yīng)有強(qiáng)的誘導(dǎo)倍數(shù)(圖3)。
序列表<110>Janssen Pharmaceutica N.V.
<120>用于在體內(nèi)快速鑒定藥物活性化合物的動物模型<130>PRD 2036<150>PCT/EP03/02264<151>2003-03-05<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1279<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從相對于TATA框的位置-1300到+88的p21啟動子序列的1300bp片段<400>1ggtaccggta gatgggagcg gatagacaca tcactcattt ctgtgtctgt cagaagaacc60agtagacact tccagaattg tcctttattt atgtcatctc cataaaccat ctgcaaatga120gggttatttg gcatttttgt cattttggaa ccacagaaat aaaggatgac aagcagagag180ccccgggcag gaggcaaaag tcctgtgttc caactatagt catttctttg ctgcatgatc240tgagttaggt caccagactt ctctgagccc cagtttcccc agcagtgtat acgggctatg300tggggagtat tcaggagaca gacaactcac tcgtcaaatc ctccccttcc tggccaacaa360agctgctgca accacagggg tttcttctgt tcaggtgagt gtagggtgta gggagattgg420ttcaatgtcc aattcttctg tttccctgga gatcaggttg cccttttttg gtagtctctc480caattccctc cttcccggaa gcatgtgaca atcaacaact ttgtatactt aagttcagtg540gacctcaatt tcctcatctg tgaaataaac gggactgaaa aatcattctg gcctcaagat600
gctttgttgg ggtgtctagg tgctccaggt gcttctggga gaggtgacct agtgagggat660cagtgggaat agaggtgata ttgtggggct tttctggaaa ttgcagagag gtgcatcgtt720tttataattt atgaattttt atgtattaat gtcatcctcc tgatcttttc agctgcattg780ggtaaatcct tgcctgccag agtgggtcag cggtgagcca gaaagggggc tcattctaac840agtgctgtgt cctcctggag agtgccaact cattctccaa gtaaaaaaag ccagatttgt900ggctcacttc gtggggaaat gtgtccagcg caccaacgca ggcgagggac tgggggagga960gggaagtgcc ctcctgcagc acgcgaggtt ccgggaccgg ctggcctgct ggaactcggc1020caggctcagc tgctccgcgc tgggcagcca ggagcctggg ccccggggag ggcggtcccg1080ggcggcgcgg tgggccgagc gcgggtcgcc tccttgaggc gggcccgggc ggggcggttg1140tatatcaggg ccgcgctgag ctgcgccagc tgaggtgtga gcagctgccg aagtcagttc1200cttgtggagc cggagctggg cgcggattcg ccgaggcacc gaggcactca gaggaggtga1260gagagcggcg gcactcgag 1279<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>P21特異性正向引物<400>2gagggcgcgg tgcttgg17<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p21特異性反向引物
<400>3tgccgccgct ctctcacc18<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p21特異性正向引物<400>4tcgggtaccg agggcgcggt gcttgg 26<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p21特異性反向引物<400>5atactcgagt gccgccgctc tctcacc 27<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p21特異性正向引物<400>6tcgggtaccg gtagatggga gcggatagac acatc 35<210>7<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>p21特異性反向引物<400>7atactcgagt gccgccgctc tctcacc 27<210>8<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p53RE正向引物<400>8ccctgcctgg acttgcctgg gtcgaccctg cctggacttg cctggc 46<210>9<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p53RE反向引物<400>9tcgagccagg caagtccagg cagggtcgac ccaggcaagt ccaggcaggg agct54<210>10<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p53RE啟動子元件<400>10tccctgcctg gacttgcctg ggtcgaccct gcctggactt gcctggc47
<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HSV-TK正向引物<400>11gtaccgagct cttacgcgtg20<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HSV-TK反向引物<400>12gtggatccct gcttcatccc cgtggc 26<210>13<211>256<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>p53RE_TK最小啟動子<400>13aggtaccgag ctccctgcct ggacttgcct gggtcgaccc tgcctggact tgcctggctc 60gagatctgcc gccccgactg catctgcgtg ttcgaattcg ccaatgacaa gacgctgggc120ggggtttgtg tcatcataga actaaagaca tgcaaatata tttcttccgg ggacaccgcc180agcaaacgcg agcaacgggc cacggggatg aagcagggat ctgcgatcta agtaagctga240tccaccggtc gccacc256
<210>14<211>952<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于pGL3基本載體中的p53RE_TK-ZsGreen插入片段<400>14aggtaccgag ctccctgcct ggacttgcct gggtcgaccc tgcctggact tgcctggctc 60gagatctgcc gccccgactg catctgcgtg ttcgaattcg ccaatgacaa gacgctgggc120ggggtttgtg tcatcataga actaaagaca tgcaaatata tttcttccgg ggacaccgcc180agcaaacgcg agcaacgggc cacggggatg aagcagggat ctgcgatcta agtaagctga240tccaccggtc gccaccatgg cccagtccaa gcacggcctg accaaggaga tgaccatgaa300gtaccgcatg gagggctgcg tggacggcca caagttcgtg atcaccggcg agggcatcgg360ctaccccttc aagggcaagc aggccatcaa cctgtgcgtg gtggagggcg gccccttgcc420cttcgccgag gacatcttgt ccgccgcctt catgtacggc aaccgcgtgt tcaccgagta480cccccaggac atcgtcgact acttcaagaa ctcctgcccc gccggctaca cctgggaccg540ctccttcctg ttcgaggacg gcgccgtgtg catctgcaac gccgacatca ccgtgagcgt600ggaggagaac tgcatgtacc acgagtccaa gttctacggc gtgaacttcc ccgccgacgg660ccccgtgatg aagaagatga ccgacaactg ggagccctcc tgcgagaaga tcatccccgt720gcccaagcag ggcatcttga agggcgacgt gagcatgtac ctgctgctga aggacggtgg780ccgcttgcgc tgccagttcg acaccgtgta caaggccaag tccgtgcccc gcaagatgcc840cgactggcac ttcatccagc acaagctgac ccgcgaggac cgcagcgacg ccaagaacca900gaagtggcac ctgaccgagc acgccatcgc ctccggctcc gccttgccct ga95權(quán)利要求
1.一種已經(jīng)用包含可操作地連接啟動子的報道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞，其中所述的啟動子還控制與腫瘤退化、腫瘤生長穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移性生長的抑制相關(guān)的蛋白的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的腫瘤細(xì)胞，其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的腫瘤細(xì)胞，其中報道基因由熒光蛋白組成，優(yōu)選地選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRed1、pd2EGFP或pd2EYFP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞，其中啟動子由p21啟動子或其功能性的片段組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的腫瘤細(xì)胞，其中啟動子包括1300bp的p21啟動子序列(SEQ ID No.1)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞，其中啟動子包括p53應(yīng)答元件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的腫瘤細(xì)胞，其中p53應(yīng)答元件具有SEQ IDNO.10的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的腫瘤細(xì)胞，其中啟動子由包括具有SEQID No.13的p53應(yīng)答元件的最小HSV-TK啟動子組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞，其于2003年1月20日以pGL3-基本-ZsGreen-1300-克隆1保藏在比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心，保藏號為LMBP 5958CB。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞，其于2003年1月20日以pGL3-基本-ZsGreen-1300-克隆2保藏在比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心，保藏號為LMBP 5959CB。
11.用于篩選化合物藥物活性的非人動物模型，所述的動物模型包括根據(jù)權(quán)利要求1至10中任何一項(xiàng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的非人動物，其中在非人動物的皮膚下通過手術(shù)植入或注射入穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的非人動物，其中非人動物是嚙齒類動物。
14.制備根據(jù)權(quán)利要求11至13中任何一項(xiàng)的非人動物的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1至10中任何一項(xiàng)的細(xì)胞以足夠在所述的非人動物中影響腫瘤產(chǎn)生的量施用于所述的非人動物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中非人動物是遺傳性無免疫應(yīng)答的或與所述的腫瘤是同源的。
16.篩選化合物的抗腫瘤活性的體外方法，包括步驟將根據(jù)權(quán)利要求1至10中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞與待測試的化合物接觸；以及測量報道基因的表達(dá)。
17.篩選化合物的藥物活性的方法，包括步驟將潛在的活性化合物施用于根據(jù)權(quán)利要求1至10中任何一項(xiàng)的非人動物；以及通過測量報道基因的表達(dá)來評估所述化合物對腫瘤細(xì)胞的影響。
全文摘要
在第一個方面，本發(fā)明提供用包含可操作地連接啟動子的報道基因，優(yōu)選熒光蛋白的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系，其中啟動子還控制與腫瘤退化、腫瘤生長穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移性生長的抑制相關(guān)的蛋白的表達(dá)，其特征在于當(dāng)被植入或注射入非人動物中時，所述的細(xì)胞系能夠形成腫瘤。與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，本發(fā)明的不同點(diǎn)在于報道基因不是組成型表達(dá)的，而只有在暴露于導(dǎo)致與腫瘤退化、腫瘤生長穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移性生長的抑制相關(guān)的蛋白或酶表達(dá)的測試化合物后才會表達(dá)。只有當(dāng)待測試的化合物進(jìn)入循環(huán)并浸潤腫瘤時，如果其促進(jìn)與腫瘤退化相關(guān)的蛋白表達(dá)并且所述蛋白的啟動子可操作地連接報道基因，就可能產(chǎn)生報道信號。
文檔編號C07K14/47GK1756846SQ200480005845
公開日2006年4月5日 申請日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月5日
發(fā)明者A·T·J·貝利恩, J·阿茨, A·O·A·馬里恩, A·F·瓦爾克斯 申請人:詹森藥業(yè)有限公司