專利名稱：孤獨癥的診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過對對象的標(biāo)本進(jìn)行簡單測試而診斷孤獨癥的方法。
背景技術(shù)：
孤獨癥是用于對象的綜合癥狀的術(shù)語，意指與周圍人的交流可能性差到使得該對象在其整個生命中必須由社會以不同方式照顧。
在瑞典出生的每1000人中有1-5人患有孤獨癥。其診斷難以確立，并可能需要數(shù)年才能獲得。社會和孤獨癥患者的家庭必須采取的教育學(xué)和社會措施是終生的且極為昂貴?；颊呒捌浼彝サ耐纯嗍蔷薮蟮?。迄今為止還不知道任何生物化學(xué)治療(例如使用藥物)。
孤獨癥的病理生理學(xué)涉及神經(jīng)元之間異常的通訊聯(lián)系，可能與腦中異常模式肽例如神經(jīng)肽有關(guān)。異常肽水平可能通過對脊髓液和/或血漿中低于10kDa的蛋白質(zhì)/肽的蛋白組學(xué)研究來揭示。檢測孤獨癥中肽異常水平將產(chǎn)生關(guān)于其病理生理學(xué)的新假說，并可能有助于診斷和提示新的治療可能性。由于多數(shù)肽由較大前體分子的蛋白水解而生成，肽的異常水平可能是由異常的蛋白水解活性引起的。
關(guān)于孤獨癥已完成和可得到的生物化學(xué)研究非常之少，因為沒有可以利用的動物模型，并且存在收集更實質(zhì)性的患者材料的實際問題。
在現(xiàn)有技術(shù)EP-A-0 979 828中公開了一種通過測定生物液體中存在的特定肽而診斷孤獨癥的方法。據(jù)稱包含3-4個氨基酸的所述肽當(dāng)以高量存在時指示孤獨癥。
EP-A-0 969 015涉及診斷疾病如孤獨癥的方法，通過鑒定存在于組織或體液中的肽。公開的肽具有3-8個氨基酸的長度，并且分子量＜1081。
Green，L.A.等人在Biological Psychiatry，50609-613(2001)中公開，孤獨癥患者血漿中的催產(chǎn)素濃度不同于健康人。催產(chǎn)素-extened(OT-X)的量在孤獨癥患者中較高，而催產(chǎn)素(9個氨基酸)的量較低。
US-A-2002/0006640涉及診斷孤獨癥等的多肽和方法。
這些文件均未公開本發(fā)明的肽。
本發(fā)明概述本發(fā)明基于以下假設(shè)，即孤獨癥的基礎(chǔ)是腦和/或穿透或圍繞腦的液體即血液和腦脊液中存在異常肽模式，這些肽中的某些可能擾亂腦用于通訊聯(lián)系的信號(例如攜帶的神經(jīng)肽)。
本發(fā)明特征在于測定存在于機體標(biāo)本中的具有特定氨基酸序列的某些蛋白質(zhì)/肽的存在或缺失，所述蛋白質(zhì)/肽的分子量分別為1779+/-1Da，1865+/-1Da和2022+/-1Da。
具體而言，本發(fā)明涉及在組織標(biāo)本、體液和/或血漿標(biāo)本中測定高于正常水平的一種或多種以下的肽SKITHRIHWESASLL (SEQ.ID.NO.1)SSKITHRIHWESASLL(SEQ.ID.NO.2)SSKITHRIHWESASLLR (SEQ.ID.NO.3)在所述方法的一個優(yōu)選的實施方案中，所述肽的量大于健康對象標(biāo)本中存在量的10倍。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用ELISA技術(shù)測定各肽。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用RIA技術(shù)測定各肽。
在又一個其它的優(yōu)選實施方案中，使用SELDI-TOF-MS體系測定各肽。
在本發(fā)明的另一方面，其涉及用于測定所述肽的試劑盒，所述試劑盒包含對于某些肽的標(biāo)志，所述肽的分子量分別為1779、1865和2022。
在其優(yōu)選實施方案中，所述試劑盒包含對于一種或多種肽的標(biāo)志，所述肽是由氨基酸序列SSKITHRIHWESASLLR、SSKITHRIHWESASLL和/或SKITHRIHWESASLL編碼的。
體液在此是指任何體液，如血液、血清、血漿、脊髓液、腦脊液和淋巴。
以上特別鑒定的本發(fā)明的肽可以是稱為補體因子C 3的血漿蛋白的片段。
本發(fā)明詳述本發(fā)明已在一項利用所謂的SELDI-TOF-MS(ClphergenBiosystems Inc.Palo Alto，CA，USA)技術(shù)-一種新的蛋白組學(xué)技術(shù)的先導(dǎo)研究中得到證實，通過該技術(shù)分析并比較了4名孤獨癥兒童和4名非孤獨癥兒童的血漿的肽模式。由此發(fā)現(xiàn)，至少3種肽，每種含有15-20個氨基酸，在所有孤獨癥兒童中過量表示于分子條帶1700-2200道爾頓。由此在孤獨癥兒童血漿中所述肽的量至少10倍高于非孤獨癥兒童。


圖1顯示了獲自8名個體的8幅不同的1700-2200道爾頓條帶的質(zhì)譜曲線圖，4名無孤獨癥診斷，4名診斷為孤獨癥兒童。上面4幅為來自無孤獨癥診斷的個體的質(zhì)譜條帶，下4幅來自孤獨癥兒童。
很明顯，在孤獨癥兒童的標(biāo)本中有至少3個不同的峰出現(xiàn)，其顯著區(qū)別于無孤獨癥診斷的兒童。當(dāng)使用適宜的分子量標(biāo)志時，測定到在大約1779、1865和2022道爾頓有顯著的峰存在。不同的峰面積代表存在的各肽的量，所述量在來自孤獨癥兒童的標(biāo)本中比在來自無孤獨癥診斷的兒童的標(biāo)本中高10倍以上。
使用MS/MS質(zhì)譜測定所述肽的結(jié)構(gòu)，由此確定其氨基酸序列分別為SSKITHRIHWESASLLR(SEQ.ID.NO.1)、SSKITHRIHWESASLL(SEQ.ID.NO.2)和SKITHRIHWESASLL(SEQ.ID.NO.3)。第一種肽已知為補體C3f(NCBI登錄號1413205A)，第二種缺乏C-末端精氨酸，第三種進(jìn)一步缺乏N-末端絲氨酸。
所選肽在例如血漿或脊髓液標(biāo)本中的濃度可容易地通過免疫化學(xué)技術(shù)如ELISA或RIA來測定。將使用抗體，并將按照通用方案進(jìn)行對抗體和/或抗原肽的標(biāo)記，使用例如氯胺T法用于放射性標(biāo)記。
顯然，以上鑒定的這些肽在體液/組織中的高水平至少是孤獨病癥的標(biāo)志，并可容易地用于診斷孤獨癥。但是，測定這些肽高水平的存在還意味著孤獨癥的可能發(fā)病機制已被發(fā)現(xiàn)，并且這可能導(dǎo)致對孤獨癥的新治療可能性，例如通過抑制這些肽的形成。
權(quán)利要求
1.在懷疑患有孤獨癥的對象中診斷孤獨癥的方法，通過分析組織標(biāo)本、體液標(biāo)本和/或血漿標(biāo)本中是否存在高濃度的某些肽，所述肽的分子量分別為1779+/-1Da、1865+/-1Da和2022+/-1Da。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽的氨基酸序列為SKITHRIHWESASLL (SEQ.ID.NO.1)SSKITHRIHWESASLL，and/or(SEQ.ID.NO.2)SSKITHRIHWESASLLR (SEQ.ID.NO.3)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽的量為非孤獨癥對象標(biāo)本中存在量的10倍以上。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中使用任何定量免疫化學(xué)方法。
5.權(quán)利要求1-3的方法，其中使用ELISA技術(shù)測定各肽。
6.權(quán)利要求1-3的方法，其中使用RIA技術(shù)測定各肽。
7.權(quán)利要求1-3的方法，其中使用SELDI-TOF-MS體系測定各肽。
8.試劑盒，包含對于某些肽的標(biāo)志，所述肽的分子量分別為1779+/-1Da、1865+/-1Da和2022+/-1Da。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述試劑盒包含對于一種或多種肽的標(biāo)志，所述肽具有以下氨基酸序列SKITHRIHWESASLL (SEQ.ID.NO.1)SSKITHRIHWESASLL，and/or(SEQ.ID.NO.2)SSKITHRIHWESASLLR. (SEQ.ID.NO.3)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種診斷孤獨癥的方法，通過測定高濃度的某些肽的存在，分析組織標(biāo)本、體液標(biāo)本和/或血漿標(biāo)本中是否存在某些肽，所述肽的氨基酸序列分別為SKITHRIHWESASLL、SSKITHRIHWESASLL和SSKITHRIHWESASLLR，分子量分別為1779+/－1 Da、1865+/－1 Da和2022+/－1 Da。
文檔編號C07K7/08GK1795386SQ200480005823
公開日2006年6月28日 申請日期2004年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者安德斯·格魯布, 納吉·莫梅尼 申請人:納吉·莫梅尼