專利名稱：新型療法和篩選治療化合物的方法
新型療法和篩選治療化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選化合物的方法，用以評(píng)價(jià)該化合物殺死細(xì)胞的能 力，具體而言是肺瘤細(xì)胞以及細(xì)菌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞，同樣涉及用于 治療的殺死細(xì)胞的新型試劑，例如用于腫瘤的治療。
HAMLET(人oc -乳清蛋白制成的腫瘤細(xì)胞致死因子)(Human!-lactalbumin made lethal to tumor cells)是一種分子復(fù)合物，其i秀導(dǎo)月中瘤細(xì) 胞的細(xì)胞死亡。實(shí)際上，這種作用對(duì)于腫瘤細(xì)胞和一些未成熟細(xì)胞是選 擇性的，而健康的分化細(xì)胞并不響應(yīng)HAMLET而經(jīng)受細(xì)胞死亡。這種 選擇性意味著HAMLET觸及到腫瘤細(xì)胞中的獨(dú)特靶標(biāo)，而在耐受細(xì)胞 中則未觸及。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"HAMLET"指cc -乳清蛋白的生物學(xué)活性復(fù)合 物(其可以是或者可以不是人類來源的)，其可以通過從在pH4.6下被 沉淀下來的乳的酪蛋白級(jí)分中分離，通過例如在EP-A-0776214中所述 的陰離子交換色譜和凝膠色譜的組合而獲得，或者通過在存在來自人乳 酪蛋白的輔因子，如W099/26979中所述的表征為C18:l脂肪酸的情況 下將a-乳清蛋白經(jīng)離子交換色譜而獲得。具有相似活性的這種復(fù)合物的 生物學(xué)活性變體或衍生物在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/IBO3/01293中被 加以描述。
HAMLET在許多不同的體外胂瘤細(xì)胞系中引發(fā)凋亡樣死亡 (apoptosis-like death)。白血病細(xì)胞最為敏感，而癌、黑素瘤和膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤細(xì)胞系均死于HAMLET,并伴有凋亡樣特征。成熟的分化細(xì)胞對(duì) 于HAMLET是耐受的，如其存活力以及完好的細(xì)胞形態(tài)所顯示，而胚 細(xì)胞則表現(xiàn)為部分響應(yīng)。HAMLET廣泛的抗腫瘤活性是似非而是的 (paradoxical),因?yàn)槟[瘤細(xì)胞通常對(duì)于指導(dǎo)正常細(xì)胞死亡的凋亡信號(hào) 是耐受的。肺瘤細(xì)胞攜帶著突變，該突變打亂了傳統(tǒng)凋亡是涉及的主要 信號(hào)通路，包括/ 53和/W-2基因家族，而HAMLET的作用獨(dú)立于這些 通路，表明HAMLET復(fù)合物具有鑒別基本的細(xì)胞死亡程序的能力，該 細(xì)胞死亡程序在腫瘤細(xì)胞中保持活躍，而在成熟的分化細(xì)胞中則失去 了。近來，已表明HAMLET在人大鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異體移植物模型中 同樣在體內(nèi)引發(fā)了選擇性胂瘤細(xì)胞凋亡，并且表明在安慰劑對(duì)照臨床研
究中HAMLET局部應(yīng)用于皮膚乳頭瘤上能夠減少或消除損害。
被檢測(cè)[Hakansson et al., 1999 Exp Cell Res. 246, 451-60]。 HAMLET結(jié)合
于細(xì)胞表面，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在那里它與線粒體相互作用并使其活化。 最終，此蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，在其中積聚。
申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)耐受細(xì)胞和敏感細(xì)胞以相似的效率將HAMLET結(jié)合 于其表面，表明這并不是產(chǎn)生差異的事件。相反，細(xì)胞核內(nèi)的積聚僅在 瀕死細(xì)胞中發(fā)生，表明此步驟將敏感細(xì)胞與耐受細(xì)胞區(qū)分開。通過共聚 焦顯微術(shù)，細(xì)胞核積聚似乎是不可逆的，表明存在細(xì)胞核靶標(biāo)，其在細(xì) 胞核隔室內(nèi)結(jié)合并保留了 HAMLET。
申請(qǐng)人已對(duì)HAMLET的細(xì)胞核內(nèi)分布進(jìn)行了更加細(xì)致的檢測(cè)，并 已發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)優(yōu)先定位于核仁對(duì)應(yīng)的區(qū)域，意味著HAMLET與涉及 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的分子相互作用。
作為進(jìn)一步研究的結(jié)果，HAMLET的核靶標(biāo)被加以鑒定。令人驚訝 的是發(fā)現(xiàn)HAMLET與特異性組蛋白以及與核小體相互作用。因此，似 乎這種相互作用可能是將細(xì)胞不可逆地鎖入死亡通^^的事件。
不過，目前進(jìn)一步的機(jī)制呈現(xiàn)了其自身，其被認(rèn)為是產(chǎn)生了進(jìn)一步 的篩選方法，該方法將導(dǎo)致進(jìn)一步的治療劑和治療機(jī)會(huì)。
本發(fā)明提供了 一種篩選用于殺死細(xì)胞的測(cè)試物質(zhì)的方法，所述方法 包括使測(cè)試物質(zhì)與蛋白酶體接觸，并檢測(cè)它們之間導(dǎo)致蛋白酶體結(jié)構(gòu)變 化的相互作用。
為滿足測(cè)試的要求，該測(cè)試物質(zhì)應(yīng)當(dāng)能夠與蛋白酶體(有時(shí)被稱為 蛋白體)以產(chǎn)生蛋白酶體結(jié)構(gòu)改變的方式相互作用。 一般而言，這些變 化將包括蛋白酶體的片段化(fragmentation)。此類差異通過溫育后檢 測(cè)蛋白酶體的結(jié)構(gòu)而被適當(dāng)?shù)丶右源_定。
一般使用常規(guī)的凝膠分離法進(jìn)行此種類型的結(jié)構(gòu)檢測(cè)。指示條帶尺 寸變化的任何的條帶顯著位移、或者新條帶的形成都預(yù)示該測(cè)試物質(zhì)已 與蛋白酶體以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性變化的方式相互作用。
本發(fā)明的方法可以以多種方式進(jìn)行。例如，本方法可以通過使測(cè)試
者額外地，本方法可以通過使測(cè)試物質(zhì)與細(xì)胞體外4妄觸，并確定該測(cè)試 物質(zhì)是否在細(xì)胞中與蛋白酶體共定位(colocalise)并相互作用來進(jìn)行。
在一種實(shí)施方式中，本方法通過使測(cè)試物質(zhì)與完好的蛋白酶體體外
接觸而實(shí)現(xiàn)。合適的蛋白酶體包括例如20S蛋白酶體，諸如人紅細(xì)胞20S 蛋白酶體。所用蛋白酶體的濃度將會(huì)影響測(cè)試的靈敏度， 一般而言，將 會(huì)在50至500 ju g/ml的范圍內(nèi)，例如以150 M g/ml的濃度。
接觸通常在生理學(xué)上可接受的pH,例如7.2的緩沖液存在的情況下 進(jìn)行的。適當(dāng)?shù)?，蛋白酶體將在存在選擇性的但是可逆的蛋白酶體抑制 劑，諸如MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO, Affinity Research)的情況下經(jīng)過預(yù) 溫育的步驟。
在一種特別優(yōu)選實(shí)施方式中，該物質(zhì)使蛋白酶體的cc6亞基產(chǎn)生變 4匕。這是因?yàn)榇藖喕环N核定4立序列(nuclear localization sequence, NLS)。核定位序列的準(zhǔn)確氨基酸序列可能會(huì)變化，但是一般而言它們是 富含賴氨酸的區(qū)域。 一種具體的NLS序列(KKVKKK)與20S蛋白酶體的 氨基酸181-186相對(duì)應(yīng)。
NLS的暴露被認(rèn)為在使蛋白酶體能夠攜帶該物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核方面 是重要的，在細(xì)胞核中可以最有效地殺死細(xì)胞。如下所述，此作用是 HAMLET的作用方式所獨(dú)有的，其具有已知的殺死胂瘤的活性。
可選地，測(cè)試物質(zhì)可以與細(xì)胞進(jìn)行體外溫育，并監(jiān)測(cè)該測(cè)試物質(zhì)在 細(xì)胞中的位置，例如使用共聚焦顯微術(shù)。在此實(shí)施方式中，測(cè)試物質(zhì)被 適當(dāng)?shù)貥?biāo)記，例如在添加之前使用可見的標(biāo)記，如熒光標(biāo)記。同樣，蛋 白酶體的標(biāo)記結(jié)合劑，諸如標(biāo)記的抗體或其結(jié)合片段，被與該物質(zhì)共同 施用，并觀察其在細(xì)胞中的相對(duì)位置。具體而言，合適的蛋白酶體結(jié)合 劑對(duì)蛋白酶體的催化核心是特異性的。
結(jié)合劑上的標(biāo)記可以與測(cè)試物質(zhì)上的標(biāo)記相同或者不同。合適地，
兩者都是熒光標(biāo)記的。
具體而言，對(duì)于檢測(cè)與如上所述的蛋白酶體相互作用而相對(duì)耐受蛋 白酶的化合物可能是有用的，從而它們進(jìn)一步的模擬了 HAMLET類型 的活性。
在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種篩選用于殺死細(xì) 胞的測(cè)試物質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟
(a) 使測(cè)試物質(zhì)與蛋白酶接觸以檢測(cè)出至少是部分的蛋白酶抗性；
(b) 使測(cè)試物質(zhì)與蛋白酶體體外接觸并檢測(cè)它們之間的相互作用； 或者與細(xì)胞體外接觸并確定測(cè)試物質(zhì)是否與其中的蛋白酶體共定位；以及
(c)選擇一種物質(zhì)，其被發(fā)現(xiàn)在步驟(a)中是蛋白酶抗性的并且根據(jù) 步驟(b)與蛋白酶體相互作用或者與細(xì)胞中的蛋白酶體共定位。
步驟(a)和(b)可以按任何順序執(zhí)行。在步驟(b)中未產(chǎn)生陽(yáng) 性結(jié)果的物質(zhì)可以被丟棄而不執(zhí)行其它步驟
步驟(a)通過將該物質(zhì)與至少一種蛋白酶進(jìn)行溫育而被適當(dāng)?shù)貓?zhí) 行，所述蛋白酶是目標(biāo)物種諸如哺乳動(dòng)物，特別是人類的蛋白水解酶。 哺乳動(dòng)物的蛋白酶體表現(xiàn)出多達(dá)5種不同的肽酶活性，包括那些優(yōu)先在 疏水殘基、堿性殘基和酸性殘基的羧基末端切開肽的活性，通常被稱為 胰凝乳蛋白酶樣或胰蛋白酶樣的活性，或者具有肽基谷氨酰-肽水解活性 的酶。
合適的酶包括蛋白水解的肽酶諸如胰凝乳蛋白酶或具有胰凝乳蛋 白酶樣活性的酶、具有胰蛋白酶樣活性的胰蛋白酶，或者具有肽基谷氨 酰-肽水解活性的酶。具體而言，所述的酶是胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶。
合適地，該物質(zhì)與 一種以上的此類酶諸如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶 一起溫育以確認(rèn)耐受狀態(tài)。
步驟(a)中所用的酶量將會(huì)根據(jù)酶的準(zhǔn)確性質(zhì)、所測(cè)試的物質(zhì)等 而有所變化。 一般地，所使用酶的濃度將是在按重量計(jì)1/20至1/200的 范圍內(nèi)。例如，胰蛋白酶可能以按重量計(jì)E/S 1/50使用，而胰凝乳蛋白 酶則以按重量計(jì)E/S 1/100使用。
溫育是在生理學(xué)上可接受的溫度例如在37。C下適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。
為使測(cè)試物質(zhì)滿足測(cè)試(a),該物質(zhì)應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出對(duì)蛋白酶的至少 部分抗性。因此，適當(dāng)?shù)?，該物質(zhì)在10分鐘以內(nèi)的一段時(shí)間內(nèi)將不會(huì) 被完全降解，且優(yōu)選的不少于l小時(shí)。
在每一情形中，降解過程可以通過檢測(cè)蛋白質(zhì)片斷而被測(cè)定。這可 以使用常規(guī)的方法來完成，諸如在凝膠上進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，例如使用凝 膠電泳，且尤其是SDS-PAGE或者蛋白質(zhì)免疫印跡。
以上步驟(b)將按照如上所述與本發(fā)明的方法相關(guān)的內(nèi)容執(zhí)行。
按照此方式鑒定的測(cè)試物質(zhì)將成為抗癌藥物良好的候選對(duì)象，原因 是它們將模擬HAMLET的行為。然而，它們可能額外地被用于殺死不 想要的細(xì)胞，諸如被病毒感染的細(xì)胞，或者細(xì)菌諸如肺炎雙球菌
用于上述方法的合適的測(cè)試物質(zhì)包括化學(xué)化合物，以及蛋白質(zhì)或
肽。它們可以從化合物收藏庫(kù)(collection)或文庫(kù)中獲得，或者可以祐: 合成而用于篩選過程。
特別優(yōu)選的測(cè)試物質(zhì)將是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，并且具體而言， 將包括內(nèi)源蛋白，其處于一種解折疊狀態(tài)。
細(xì)胞質(zhì)量控制系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)的合成進(jìn)行檢查，以確保不穩(wěn)定的或未 折疊的產(chǎn)物被清除。新合成的蛋白質(zhì)被核對(duì)，而折疊有缺陷的品種則成 為蛋白酶體降解作用的目標(biāo)。較大的26S蛋白酶體復(fù)合物催化泛素化蛋 白的ATP依賴型降解，該泛素化蛋白被裝填進(jìn)圓桶形的蛋白酶體復(fù)合物 的20S核心。此外，20S蛋白酶體降解解折疊的蛋白質(zhì)，其無(wú)需泛素標(biāo) 簽被識(shí)別。內(nèi)源性的錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)未充分清除可能會(huì)激活解折疊蛋白質(zhì) 反應(yīng)(the unfolded protein response, UPR), 并伴有生長(zhǎng)停滯(growth arrest)和調(diào)亡，不過用以降解從細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)入細(xì)胞的解折疊蛋白質(zhì)的 機(jī)制尚未被討論過。
申請(qǐng)人已研究了針對(duì)HAMLET的死亡反應(yīng)是否涉及蛋白質(zhì)的解折 疊狀態(tài)，以及蛋白酶體的識(shí)別。結(jié)果表明蛋白酶體的受損以及解折疊蛋 白質(zhì)的過載是響應(yīng)于HAMLET的肺瘤細(xì)胞死亡的一種基本特征。
成熟的經(jīng)折疊的蛋白質(zhì)可以被分泌進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，它們?cè)谄渲新?行其功能。三級(jí)構(gòu)象的改變可能是在對(duì)環(huán)境信號(hào)變更作出響應(yīng)時(shí)發(fā)生 的，不過，多肽鏈的解折疊被認(rèn)為是暴露新的結(jié)構(gòu)域并獲得功能多樣性 的機(jī)制。申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)解折疊蛋白的攝入通過擾亂清除內(nèi)源性錯(cuò)折疊蛋 白質(zhì)的細(xì)胞機(jī)器而引起腫瘤細(xì)胞的死亡。腫瘤細(xì)胞死亡是由HAMLET 引發(fā)的，其為部分解折疊的oc -乳清蛋白和脂肪酸輔因子的復(fù)合物。
20S蛋白酶體被激活，但是HAMLET復(fù)合物被緩慢降解，而反過來 該蛋白酶體在結(jié)構(gòu)上被改變。核定位序列(NLS)被暴露，而肺瘤細(xì)胞通 過將HAMLET和激活的蛋白酶體移入細(xì)胞核而作出響應(yīng)，在細(xì)胞核中， 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的蛋白酶體依賴型變化發(fā)生。因此，降解HAMLET的失 敗以及受挫的蛋白酶體的反應(yīng)導(dǎo)致核內(nèi)積聚和腫瘤細(xì)胞死亡。20S蛋白 酶體在防御外源性解折疊蛋白方面的這種作用以前尚未被描述過。對(duì)蛋 白酶體的"搶劫"似乎有可能與細(xì)胞對(duì)其他解折疊蛋白的反應(yīng)相關(guān)，包 括那些從細(xì)胞外環(huán)境中進(jìn)入細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
解折疊蛋白反應(yīng)(UPR)已經(jīng)演化為一種使細(xì)胞能夠在不需要的蛋白
質(zhì)發(fā)生積聚的情況下存活的機(jī)制。內(nèi)在的解折疊蛋白的生理學(xué)清除是通
過細(xì)胞溶質(zhì)中ER-相關(guān)的降解作用、通過分子伴侶和折疊酶(foldase)以 及通過對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)合成的抑制來完成的。生長(zhǎng) 停滯可能源于泛素系統(tǒng)的失活以及通過20S蛋白酶體進(jìn)行的細(xì)胞周期蛋 白的功能障礙的再生(dysfunctional recycling) 。 26S蛋白酶體的失靈同 樣可能會(huì)由于阻礙了 IkB抑制物的降解而削弱NF-kb依賴型轉(zhuǎn)錄活性。 但是，如果解折疊蛋白負(fù)擔(dān)超過正常ER-穩(wěn)態(tài)的臨界水平，似乎蛋白酶 體的壓力可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
細(xì)胞死亡反應(yīng)可以通過ER中的caspase-12的活化或者通過傳統(tǒng)的 凋亡而被完成，其涉及線粒體、caspases和6c/-2// 53基因家族。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)無(wú)法折疊并且變得無(wú)法經(jīng)受蛋白酶體降解時(shí)，UPR的致死 階段被激活。錯(cuò)折疊可能來源于突變，其改變了二級(jí)結(jié)構(gòu)并且永久地破 壞了蛋白質(zhì)的折疊能力，或者來源于由UV輻射或化學(xué)損傷所造成的合 成后損傷。
但是，oc-乳清蛋白不是突變或受損的蛋白質(zhì)，而是由乳腺分泌的天 然的折疊蛋白質(zhì)。HAMLET可以在細(xì)胞外形成，而正是HAMLET進(jìn)入 腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)將胂瘤細(xì)胞暴露于解折疊形式的oc-乳清蛋白。此處所報(bào)道 的工作表明HAMLET被降解內(nèi)在的解折疊蛋白質(zhì)的細(xì)胞機(jī)器鑒定為解 折疊蛋白。對(duì)HAMLET的反應(yīng)表現(xiàn)出許多UPR的特征，但主要差異也 被提及。如同其他解折疊蛋白，HAMLET被靶向至20S蛋白酶體，但 HAMLET比解折疊的oc -乳清蛋白更耐受降解作用。經(jīng)HAMLET處理的 細(xì)胞表現(xiàn)出ER相關(guān)的變化，包括ER膨脹，熱休克反應(yīng)以及翻譯的終 止(數(shù)據(jù)未顯示)。
HAMLET已被表明能夠引發(fā)線粒體反應(yīng)以及caspase-依賴型染色質(zhì) 變化，但是HAMLET并不是通過經(jīng)典的調(diào)亡作用殺死胂瘤細(xì)胞，如存 在caspase抑制物時(shí)腫瘤細(xì)胞的存活所顯示的。而且，胂瘤細(xì)胞的 HAMLET敏感性并未由于抗-調(diào)亡的6c/-2家族成員的過量表達(dá)或者由于 變體p53的表達(dá)而有所變化。因此，結(jié)果表明HAMLET是通過一種新 的機(jī)制來引發(fā)細(xì)胞死亡的，該機(jī)制涉及20S蛋白酶體的活化和蛋白酶體 依賴型功能紊亂。
哺乳動(dòng)物蛋白酶體包括20S核心微粒(700KD)，其可能與一種或 兩種19S調(diào)節(jié)微粒結(jié)合。催化單元是一個(gè)圓筒，由四個(gè)堆疊環(huán)組成，每
個(gè)環(huán)帶有七個(gè)亞基(oc i-7, (3 w, (3 w, oc w)，而催化腔是由兩個(gè)內(nèi)部的P環(huán) 形成，其每一個(gè)都含有3個(gè)活化的蛋白水解位點(diǎn)。由于對(duì)涉及細(xì)胞周期 調(diào)控和染色質(zhì)穩(wěn)態(tài)的蛋白質(zhì)的不當(dāng)監(jiān)測(cè)，蛋白酶體的抑制產(chǎn)生了 一種 UFR樣的狀態(tài)。本研究基于體外研究關(guān)注20S蛋白酶體，該體外研究表 明20S蛋白酶體降解了解折疊形式的oc乳清蛋白。此結(jié)果證實(shí)了 HAMLET中解折疊的a乳清蛋白對(duì)于體內(nèi)胂瘤細(xì)胞中20S蛋白酶體的 親合力，表明該蛋白酶體將HAMLET識(shí)別為解折疊的oc乳清蛋白。
消化HAMLET復(fù)合物的失敗可能引起未消化HAMLET的積壓并造 成解折疊蛋白的延遲裝載，該蛋白占據(jù)了蛋白酶體的核心并阻礙了其他 解折疊蛋白接近酶促位點(diǎn)。因此，HAMLET可能會(huì)通過占據(jù)而非通過抑 制酶促活性來干擾20S蛋白酶體的功能。HAMLET并不是作為蛋白酶體 抑制物而發(fā)揮作用，不過，蛋白酶體的活性被表明對(duì)于細(xì)胞死亡是必須 的。我們推論UPR與對(duì)HAMLET的細(xì)胞死亡反應(yīng)的機(jī)制不同于由蛋白 酶體抑制物啟動(dòng)的反應(yīng)。
HAMLET被表明刺激了 20S蛋白酶體中的結(jié)構(gòu)修飾。20S蛋白酶體 片段化的證據(jù)是在與HAMLET溫育幾分鐘后體外獲得的。此前，a-亞 基中的次要構(gòu)象變化已被描述。對(duì)布氏錐蟲(Z^/ a"aww" /)mvez)的結(jié)構(gòu) 研究已表明11S激活物通過對(duì)cc -亞基的修飾打開了蛋白酶體的入口 。對(duì) 酵母蛋白酶體的功能研究確認(rèn)了此作用，因?yàn)閛c亞基的N-末端缺失足以 使蛋白酶體的肽酶活性被破壞并打亂其余的孔殘基。本研究檢測(cè)到了 a 3亞基的結(jié)構(gòu)修飾，表明HAMLET有可能通過誘導(dǎo)N末端缺失而對(duì)此 亞基產(chǎn)生直接的影響，從而抑制核心的開放和蛋白水解作用。此外，cc 1和cc3結(jié)構(gòu)亞基如P 1和(3 5催化亞基一樣被修飾。蛋白質(zhì)大小的顯著 減少通過PAGE和蛋白質(zhì)免疫印跡在這些亞基中被發(fā)現(xiàn)。對(duì)細(xì)胞激動(dòng)劑 作出響應(yīng)的蛋白酶體的片段化，以前未被描述。我們提出HAMLET引 起了體內(nèi)蛋白酶體的片段化，并且這可能是細(xì)胞死亡的一條重要途徑。
蛋白酶體在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有發(fā)現(xiàn)，并且在細(xì)胞周期進(jìn)程期間 穿梭于在這些隔室之間。以前的研究已表明蛋白酶體在對(duì)調(diào)亡刺激響應(yīng) 時(shí)離開了細(xì)胞核，而在本研究中，HAMLET和蛋白酶體被顯示為移向細(xì) 胞核。對(duì)于HAMLET和20S蛋白酶體的這種核易位的一種可能的機(jī)制 可被討論。若干種蛋白酶體的亞基含有NLS KKXK基元以及與NLS互 補(bǔ)的假定基元，并可能調(diào)節(jié)核易位。由HAMLET引起蛋白酶體片段化
被提出是暴露了 a6亞基中的NLS基元。這些片段可能保持附著于 HAMLET/蛋白酶體復(fù)合物上，并進(jìn)一步有助于HAMLET和蛋白酶體的 核易位。細(xì)胞核中此類復(fù)合物的存在是通過共聚焦顯微術(shù)來加以證明 的，其顯示了兩種分子在核聚集體中完全的共定位。似乎HAMLET誘 導(dǎo)的20S蛋白酶體結(jié)構(gòu)修飾可為HAMLET和蛋白酶體的核易位提供了 一種機(jī)制。
迄今為止，降解解折疊蛋白的失敗僅被描述為疾病的原因。淀粉樣 纖維形成聚合體，其在阿爾茨海默氏癥中引起細(xì)胞死亡和組織損傷，而 朊蛋白疾病可能是由相似的機(jī)制引起的。對(duì)HAMLET的細(xì)胞反應(yīng)與對(duì) 此類錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)的反應(yīng)相類似，但與淀粉樣蛋白沉淀相反，HAMLET 具有有益的作用。因此，HAMLET如何能夠成為癌細(xì)胞的選擇性殺手而 對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)毒呢？最重要的特征有可能是解折疊的HAMLET侵入 肺瘤細(xì)胞，繼而發(fā)生蛋白酶體反應(yīng)。相反，淀粉樣纖維似乎無(wú)法在細(xì)胞 類型之間進(jìn)行區(qū)分，而是在其沉積的部位引起總體的組織損傷。另一個(gè) 重要的不同之處有可能是在于對(duì)蛋白水解降解的敏感度。不同于朊蛋白 或淀粉樣蛋白沉積，HAMLET最終是被蛋白酶體的酶類降解，這表明帶 有凋亡標(biāo)簽的瀕死的胂瘤細(xì)胞和它們的HAMLET負(fù)載可能會(huì)被巨嗟細(xì) 胞依賴型機(jī)制所清理并從組織中去除。相反，淀粉樣纖維形成持久的細(xì) 胞外沉積，在此情況下的組織損傷機(jī)制或解決辦法還不清楚。
因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種用于殺死細(xì)胞的試劑， 其與細(xì)胞的蛋白酶體相互作用從而導(dǎo)致蛋白酶體結(jié)構(gòu)變化，諸如片段 化，前提是所述試劑不是HAMLET或它的已知生物學(xué)活性的修飾，或 者它們之一的生物學(xué)活性片段。具體而言，該試劑是一種激活細(xì)胞的蛋 白酶體但對(duì)該蛋白酶體的降解作用具有抗性的試劑。
在此情況下，細(xì)胞適當(dāng)?shù)厥前┘?xì)胞、細(xì)菌或病毒感染的細(xì)胞。
為形成生物學(xué)活性復(fù)合物，cc -乳清蛋白 一般要求構(gòu)象或折疊的變 化，以及脂類輔因子的存在。構(gòu)象的變化是通過從cc-乳清蛋白中去除4丐 離子而被適當(dāng)?shù)貙?shí)現(xiàn)的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，這通過使用oc-乳清 蛋白的變體而被輔助，該變體不具有功能性的4丐結(jié)合位點(diǎn)。
含有此類變體的生物學(xué)活性復(fù)合物被包括在如此處所用的術(shù)語(yǔ) HAMLET的"已知生物學(xué)活性修飾"中。這些在WO 99/26979或WO 03/074547中被具體地加以說明并進(jìn)行權(quán)利要求，其內(nèi)容在此被通過引
用并入本文。
如此處所用，表達(dá)方式"變體"指與基礎(chǔ)蛋白質(zhì)同源的多肽或蛋白 質(zhì)，其適當(dāng)?shù)厥侨嘶蚺C乳清蛋白，但其不同于其所來源的基礎(chǔ)序列， 因?yàn)樵撔蛄兄械囊粋€(gè)或多個(gè)氨基酸被其他氨基酸所取代。氨基酸取代可 能被稱為"保守型，，，如果一種氨基酸被具有廣泛相似特性的不同氨基 酸所替代。非保守型取代是其中氨基酸被不同類型的氨基酸所取代。寬 泛的說，在不改變多肽的生物學(xué)活性的情況下，非保守型取代可能更
少。適當(dāng)?shù)?，變體將會(huì)是至少60%同一的，優(yōu)選地至少70%，更優(yōu)選地 80%或85%，且特別優(yōu)選的是90%、 95%或98%或者更高的同一性。
在為確定同一性程度而比較氨基酸序列時(shí)，程序諸如BESTFIT和 GAP(兩者均來自 Wisconsin Genetics Computer Group(GCG) software package)。 BESTFIT,例如，比較兩種序列并產(chǎn)生最相似片段的最佳比 對(duì)。GAP使序列能夠沿其全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)，并通過在任一序列中適當(dāng)?shù)夭?入空缺而找到最佳的比對(duì)。適當(dāng)?shù)?，在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)討論序列 同一性時(shí)，是通過沿序列全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)來完成比較的。
術(shù)語(yǔ)"其片段"指給定氨基酸序列的任一部份，其將形成與包括完 整的oc -乳清蛋白氨基酸序列的復(fù)合物具有相似活性的復(fù)合物。
具體而言，該試劑將包括蛋白質(zhì)或包含蛋白質(zhì)(除oc乳清蛋白或其變 體以外)的蛋白質(zhì)復(fù)合物,該蛋白質(zhì)至少是部分解折疊或錯(cuò)折疊的。該蛋 白質(zhì)可以是內(nèi)源性蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，其在解折疊狀態(tài)下被穩(wěn)定化，例如 通過合適輔因子的存在。在HAMLET的情況下，合適的輔因子是在人 乳的含酪蛋白級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的脂類或脂肪酸，諸如cisC18:l:9或C18: 1: 11脂肪酸，或者具有相似構(gòu)型的不同脂肪酸。具體而言，輔因子是油酸。
蛋白質(zhì)的解折疊，例如形成被稱為"apo"的狀態(tài)，可以使用常規(guī)方法 來完成。例如，蛋白質(zhì)諸如oc-乳清蛋白在暴露于低pH時(shí)經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)換。 A狀態(tài)或熔化小球狀態(tài)具有天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但與天然狀態(tài)相比，很好 定義的三級(jí)結(jié)構(gòu)更少。oc-乳清蛋白的相似狀態(tài)同樣可以在中性pH下， 在去除緊密結(jié)合的Ca"離子時(shí)，在還原二硫鍵時(shí)或者在升高溫度時(shí)形 成。
然而，可替換地，該試劑可以包括突變形式內(nèi)源性蛋白，其中結(jié)合 位點(diǎn)，諸如釣結(jié)合位點(diǎn)，或半胱氨酸結(jié)合位點(diǎn)已被破壞，以致該蛋白質(zhì) 的折疊無(wú)法被細(xì)胞識(shí)別為天然折疊形式。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑可包括內(nèi)源性蛋白質(zhì)，其是使用重組 的方法在非天然的細(xì)胞類型中形成的，這導(dǎo)致了該蛋白質(zhì)不正確折疊。 例如，在原核細(xì)胞中表達(dá)真核蛋白可能導(dǎo)致不同折疊的蛋白，其可能是 不同糖基化方法的結(jié)果。因此，重組的內(nèi)源性哺乳動(dòng)物蛋白，在原核宿 主諸如E.COll中表達(dá)，可能形成本發(fā)明的試劑。
為了測(cè)試該試劑是否具有所需的活性，如上所闡述的篩選方法應(yīng)當(dāng) 被應(yīng)用于它們。
為了近一步模擬HAMLET的活性，該試劑可進(jìn)一步包含靶向試劑 (targeting reagent),其對(duì)于腫瘤細(xì)胞或未分化細(xì)胞是特異性的，諸如 腫瘤特異性抗體或其結(jié)合片段。
如有必要，它們可以包括合適的易位因子或與之融合，該易位因子 使它們能夠穿過細(xì)胞。易位因子的實(shí)例包括來自HIV的tat蛋白或I型 單純皰滲病毒被膜蛋白VP22，或者它們的功能性片段或同源物(參見例 如WO 98/32866，以及如WO 99/11809中所述的穿膜肽(Antennapedia) 的同源域。)
根據(jù)本發(fā)明又進(jìn)一步的方面，提供了一種殺死細(xì)胞的方法，所述方 法包括將有效量的上述試劑導(dǎo)入細(xì)胞。
當(dāng)該試劑是蛋白質(zhì)或肽，諸如在靶細(xì)胞中以所需的折疊狀態(tài)表達(dá)的 突變的內(nèi)源蛋白或肽時(shí)，該蛋白質(zhì)或肽可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。在此情況 下，細(xì)胞與載體諸如能夠進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒載體或病毒載體接觸，此載體 包含編碼該試劑的核酸序列，并在該細(xì)胞中表達(dá)該序列。載體的具體實(shí)
例可包括病毒載體，諸如腺病毒或痘病毒載體。
編碼此類試劑的核酸也可以是新型的，并可以構(gòu)成本發(fā)明的進(jìn)一步 方面。這些核酸可以被用于載體轉(zhuǎn)化，該載體用以使該試劑在細(xì)胞中進(jìn) 行體內(nèi)表達(dá)。它們也可以使用重組的方法用于生產(chǎn)該試劑本身。
因此，這些核酸將會(huì)被整合入合適的表達(dá)載體，其被用于轉(zhuǎn)化宿主 細(xì)胞，該細(xì)胞可以是真核的或原核的，但優(yōu)選地是原核細(xì)胞。這些載體 和細(xì)胞構(gòu)成了本發(fā)明進(jìn)一步的方面。
具體而言，此類試劑將應(yīng)用于病癥諸如癌癥的治療，并且這些方法 還構(gòu)成了本發(fā)明進(jìn)一步的方面。包含此類試劑的藥物組合物構(gòu)成了本發(fā) 明的另一方面，其中該試劑與制藥上可接受的載體組合，以適宜的劑量 單位，并遵照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)慣例。
現(xiàn)在，本發(fā)明將通過實(shí)施例的方式進(jìn)行具體描述，參考如下所述的 附圖。


圖1. HAMLET侵入腫瘤細(xì)胞。A549肺癌細(xì)胞中HAMLET(A, B)和 cc-乳清蛋白(C)的結(jié)合與攝入。(D)流式細(xì)胞術(shù)定量。(E)腫瘤細(xì)胞(人成 膠質(zhì)瘤細(xì)胞、人腎癌細(xì)胞(A498)和正常細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞和人腎細(xì)胞 (HRTEC))之間的HAMLET攝入差異。將細(xì)胞用34 M M的HAMLET或 oc-乳清蛋白處理1小時(shí)。共聚焦圖像顯示了經(jīng)Alexa Fluor 568標(biāo)記的 HAMLET(上圖)以及相對(duì)應(yīng)的光學(xué)透射圖像(下圖)。
圖2. HAMLET復(fù)合物。(A)HAMLET是來自人乳的a -乳清蛋白和 油酸的分子復(fù)合物。當(dāng)牢固結(jié)合的Ca"離子被釋放時(shí)，HAMLET的形成 有賴于oc-乳清蛋白采取部分解折疊的構(gòu)象的傾向。因此，此蛋白變?yōu)椴?分解折疊并暴露出脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)，此位點(diǎn)允許油酸(C18:9， 9cis)與之相 互作用并使部分解折疊的蛋白構(gòu)象穩(wěn)定。此結(jié)構(gòu)已被用人oc -乳清蛋白， PDB ID: 1HML (54)和MOLMOL 2K.2 (55)的晶體結(jié)構(gòu)生成。(B)近UV CD光譜學(xué)。在無(wú)EDTA的磷酸鈉緩沖液中記錄光譜。天然oc-乳清蛋白 (淺灰色)具有源于酪氨酸殘基的最小值250 nm和源于色氨酸殘基的最 大值290 nm。部分解折疊的cc-乳清蛋白(黑色)和HAMLET (中度灰色) 顯示出在解折疊蛋白質(zhì)特有的酪氨酸和色氨酸區(qū)域中降低的橢圓率。 (C-D) HAMLET部分耐受蛋白酶體酶類的降解作用。天然oc-乳清蛋白、 HAMLET和部分解折疊的oc-乳清蛋白使用蛋白酶體酶類胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶進(jìn)行體外蛋白水解。片段通過SDS-PAGE檢測(cè)。
圖3. HAMLET與20S蛋白酶體的共定位。(A-C)將A549細(xì)胞與34 mMHAMLET溫育1小時(shí)后演化出的三種典型的細(xì)胞類型。共聚焦圖傳^ 顯示了帶有相應(yīng)的光學(xué)透射圖像的Alexa Fluor 568標(biāo)記HAMLET和20S 蛋白酶體染色情況。底部的圖示顯示了共定位像素/區(qū)域(膜泡、細(xì)胞質(zhì) 室以及核室)的百分比。黃色人工覆蓋圖定義了每種細(xì)胞類型的共定位像 素。
圖4.功能性蛋白酶體涉及HAMLET和蛋白酶體易位至腫瘤細(xì)胞的 細(xì)胞核。(A, B)細(xì)胞提取物的細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞核級(jí)分中的蛋白酶體活 性，該提取物來自用34 nM HAMLET或a-乳清蛋白處理1小時(shí)的 A549細(xì)胞。用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理1小時(shí)。蛋白酶體的活性 是以從蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶特異性底物suc-LLVY-AMC釋放的
AMC進(jìn)行監(jiān)測(cè)的。結(jié)果表示為對(duì)照細(xì)胞提取物活性的百分比。(C, D) A549細(xì)胞與34 |uM HAMLET ±MG132溫育1小時(shí)后，20S蛋白酶體 染色強(qiáng)度和蛋白酶體的定位。共聚焦圖像顯示了 20S的染色情況。(E-F) HAMLET在活細(xì)胞中的細(xì)胞定位±蛋白酶體活性的抑制。AM9細(xì)胞用 MG132或Lactacystin預(yù)處理1小時(shí)并進(jìn)一步用34 juM HAMLET溫育。
圖5. HAMLET引發(fā)20S蛋白酶體的結(jié)構(gòu)修飾。哺乳動(dòng)物蛋白酶體 包括20S核心微粒(700kD),其可能與一個(gè)或兩個(gè)19S調(diào)節(jié)微粒結(jié)合。 催化單元是一種由四個(gè)堆疊環(huán)組成的圓筒，每環(huán)帶有七個(gè)亞基(0U-7， P w, (3w, ocw),且催化腔由兩個(gè)內(nèi)部p-環(huán)形成，其每一個(gè)都含有三個(gè) 活性蛋白水解位點(diǎn)。(A)將HAMLET、 cc-乳清蛋白(34 M M)與12 y g人 20S蛋白酶體混合20分鐘后進(jìn)行PAGE。經(jīng)HAMLET-處理后，對(duì)20S 蛋白酶體亞基的若干變化進(jìn)行檢測(cè)(見箭頭)。將樣品在變性的4-12% Bis-Tris (NuPAGE)上跑并用Amido Black染色。(B)用針對(duì)人20S蛋白 酶體cc/(3亞基的多克隆抗體通過蛋白質(zhì)免疫印跡加以證實(shí)。HAMLET 引發(fā)了分子量〈20kDa的新蛋白酶體條帶的形成。(C)20S蛋白酶體以及 具體地a6亞基的結(jié)構(gòu)，其被HAMLET所修飾。對(duì)應(yīng)于氨基酸181-186 的NLS (KKVKKK)在序列中以及在相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域中用淺灰色表示。加下 劃線的氨基酸表示通過質(zhì)譜檢測(cè)的序列。結(jié)構(gòu)是用牛20S晶體結(jié)構(gòu)PDB ID: 1IRU(31)和MOLMOL2K.2(55)生成的。
圖6.由HAMLET造成的腫瘤細(xì)胞死亡部分地依賴于功能性蛋白酶 體。對(duì)HAMLET的形態(tài)學(xué)變化(A,B)和染色質(zhì)反應(yīng)(C,D)以及由MG132 造成的蛋白酶體抑制的作用。A549細(xì)胞在用34|uM HAMLET刺激之 前，在載玻片上生長(zhǎng)3小時(shí)±用MG132預(yù)溫育1小時(shí)。對(duì)于染色質(zhì)反 應(yīng)，將細(xì)胞在4% PFA中固定并用DNA標(biāo)記物TOPRO-3染色。
實(shí)施例 材料與方法
天然cc-乳清蛋白、未折疊的oc-乳清蛋白和HAMLET。 oc-乳清蛋 白是由人乳中純化而來(Svensson et al . Proc. Natl. Acad Sci. USA (2000)97:4221-4226)或者購(gòu)自Sigma (St. Louis, MO, U.S.A.)。如所述， HAMLET由解折疊的oc-乳清蛋白制得(Svensson et al. supra)。筒而言 之，將該蛋白質(zhì)用EDTA解折疊，并通過離子交換色譜，在一種經(jīng)C18:l，
9 cis脂肪酸預(yù)處理的DEAE-Trisacryl M (BioSepra, France)柱上與油酸 結(jié)合。為進(jìn)行實(shí)時(shí)共聚焦顯微觀察，將HAMLET偶聯(lián)于AlexaFluor 568 (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, U.S.A.)。
蛋白水解作用。天然cc-乳清蛋白、HAMLET或者部分解折疊的oc-
乳清蛋白用蛋白酶體酶類進(jìn)行體外蛋白水解。蛋白樣品被溶解于10mM 乙酸銨，pH7.5。天然a-乳清蛋白中存在200 juM乙酸鈣，而解折疊的 乳清蛋白是在200 EDTA中。將混合物與胰蛋白酶(E/S按重量計(jì)
1/50)和胰凝乳蛋白酶(分別為E/S按重量計(jì)1/100)—起溫育，并通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)片段化。
細(xì)胞系。人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 (CCL 185, ATCC)、人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 D54和人腎癌A498 (HTB44, ATCC)如所述進(jìn)行培養(yǎng)(Hakansson et al . (1994) Infect. Immnun. 62:2707-2714, Hedlund et al. J. Exp. Med. (1996)183 1037-1044)。人非轉(zhuǎn)化的星形膠質(zhì)細(xì)胞(CC-2565, Cambrex, La Jolla, CA, USA)，按照生產(chǎn)商使用說明接受補(bǔ)充了抗壞血酸、rhEGF、 GA-IOOO、胰島素、L-谷酰胺和3%FBS的星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。人 腎上皮細(xì)胞，HRTEC，如所述，分離自3歲男孩的腎臟。
細(xì)胞成像。從組織培養(yǎng)瓶中收獲細(xì)胞，并使其在補(bǔ)充了 5%胎牛血 清(FCS)的各種培養(yǎng)基中(見上)附著于8-孔載玻片(0.1 x 106) (Nalge Nunc, Naperville, IL, USA)3小時(shí)。將附著的細(xì)胞用PBS清洗兩遍，暴露于0.5 mg/ml Alexa Fluor 568標(biāo)記的HAMLET或cc -乳清蛋白(在RPMI培養(yǎng)基 中，Gibco/BRL, Life Technology Ltd.補(bǔ)充了非必需氨基酸(1:100稀釋， NEAA)、 lmM丙酮酸鈉和50 ju g/ml的慶大霉素)并在"。C下溫育。在 用HAMLET或a-乳清蛋白溫育1小時(shí)后，加入5。/。FCS。將細(xì)胞在PBS 中清洗一次，并在LSM 510 META系統(tǒng)(Carl Zeiss AB, Germany)中通過 共聚焦顯微術(shù)加以分析。共聚焦掃描是用同一設(shè)置進(jìn)行記錄。光學(xué)切片 為1.0 Mm。熒光強(qiáng)度使用LSM META 510軟件套裝(Carl Zeiss AB)進(jìn) 行定量。為測(cè)量亞細(xì)胞室(表面，Su;細(xì)胞質(zhì)，Cy;細(xì)胞核，Nu)中的熒 光強(qiáng)度，將感興趣的區(qū)域(ROIs)根據(jù)相應(yīng)的微分千涉相差(DIC)圖像進(jìn)行 手動(dòng)定位。
將附著于8-孔載玻片的A549細(xì)胞(O.l x 106)用Alexa Fluor標(biāo)記的 HAMLET處理1小時(shí)，如上所述。將載片進(jìn)一步在4% PFA中固定10 分鐘，在PBS中清洗一次，在0.01% PBS-Saponin/5% FCS中滲透處理
20分鐘并在室溫下與第一抗體溫育1小時(shí)，與第二抗體溫育1小時(shí)。將
帶有解離細(xì)胞的上清在1500 rpm下細(xì)胞離心5分鐘至載玻片上并分別 進(jìn)行分析。針對(duì)20S蛋白酶體oc/(3亞基的單克隆抗體(PW8265, Affinity Research, Denvon, UK)或多克隆兔抗體(PW8155, Affinity Research)被用 于檢測(cè)20S蛋白酶體。第二抗體是兔抗-小鼠-Alexa 488或山羊抗-兔-Alexa 488 (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, U.S.A.)。通過共聚焦顯 微術(shù)進(jìn)行共定位分析,使用LSM META 510軟件套裝(Carl Zeiss),并且圖 ^象對(duì)應(yīng)于1.0 pm的細(xì)^^切片。
蛋白酶體活性。將細(xì)胞(2xlO勺在PBS中清洗一次并在低滲緩沖液(10 mMHEPES、 1.5mMMgCl2、 10mMKCl、 0.01%NP-40、 0.2mMPMSF、 0.5 mM P-巰基乙醇，pH7.9)中重懸。將細(xì)胞在水上膨脹10分鐘。MOO rpm下離心IO分鐘收集細(xì)胞核。收集上清作為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分并儲(chǔ)存于-70 °C。將細(xì)胞核級(jí)分重懸于低鹽緩沖液(20mMHEPES、 25%甘油、1.5 mM MgCl2、 20mMKCl、 0.2mMEDTA、 0.01%NP-40、 0.2mMPMSF、 0.5 mM p-巰基乙醇，pH7.9),隨后在渦漩振蕩過程中滴加高鹽緩沖液(20 mMHEPES、 25%甘油、1.5mMMgCl2、 1MKC1、 0.2mMEDTA、 0.01% NP-40、 0.2mMPMSF、 0.5 mM P-巰基乙醇，pH 7.9)以提取核蛋白。細(xì) 胞核級(jí)分作為上清在16000 rpm下離心30分鐘加以收集并儲(chǔ)存于-7(TC 直至使用。使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，用DC蛋白檢驗(yàn)對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行定量 (BioRad, CA, U.S.A.)。熒光底物Suc-Leu-Leu-VAL-Tyr-7-酰胺-甲基香豆 素(suc-LLVY-AMC, 25 mM),其對(duì)蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶活性為特異 性的，加入至20mMTRIS-HCl(pH7.5，總體積200 jul)中的10 p g細(xì) 胞提取物中。在37°C下，使用Novostar熒光分光光度計(jì)(BMG, Offenburg， Germany)在350/440 nm激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)該反應(yīng)30分鐘。
蛋白酶體的抑制。將細(xì)胞用25 ju M選擇性的但是可逆的蛋白酶體抑 制劑MG132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO, Affinity Research)預(yù)溫育1小時(shí)。為 了體外研究，用MG132預(yù)溫育15分鐘。不可逆的蛋白酶體抑制劑 Lactacystin (1.5pM)被用于HAMLET定位研究以驗(yàn)證蛋白酶體抑制作 用的效果。
HAMLET與20S蛋白酶體的體外混合。
HAMLET、 cc-乳清蛋白(34nM)在20 ju 1反應(yīng)緩沖液(20 mM Tris, pH7.2, 1 mMEDTA, 1 mMDTT)中與3 n g人紅細(xì)胞20S蛋白酶體一起溫育1小時(shí)。蛋白酶體的抑制作用是通過與25juMMG132(Calbiochem) 一起預(yù)溫育10分鐘而被誘導(dǎo)的。將樣品在變性4-12% Bis-Tris (NuPAGE) 上跑，并免疫印跡至PVDF膜，用針對(duì)20S ot/p亞基(l:1000)的第一小 鼠多克隆抗體(PW8155, Affinity Research)和偶聯(lián)于HRP的第二兔抗小 鼠抗體(1:1 OOO)進(jìn)行檢測(cè)。第二塊同樣的凝膠被印跡并用小鼠單克隆a-乳清蛋白抗體(DAKO)進(jìn)行探測(cè)。
MALDI-TOF (基質(zhì)輔助激光解吸附/電離，飛行時(shí)間)。 在HAMLET與20S蛋白酶體進(jìn)行體外混合并在SDS-PAGE上分離 亞基后，挑選一些條帶用以進(jìn)一步鑒定。在使用M@LDITM-LR HT設(shè) 備(Micromass, Manchester, England)進(jìn)行質(zhì)譜分析之前，將條帶從凝膠中 提取出來并用胰蛋白酶處理。使用MASCOT進(jìn)行分析)。 對(duì)HAMLET的細(xì)胞反應(yīng)。
對(duì)附著細(xì)胞和解離細(xì)胞針對(duì)經(jīng)HAMLET處理后的染色質(zhì)凝聚變化 進(jìn)行檢測(cè)。將載片在4% PFA中固定IO分鐘，在PBS中清洗一次，用 0.01% PBS-Saponin/5%FCS滲透處理20分鐘并用TOPRO-3 DNA探針 (Molecular Probes)染色5分鐘。解離細(xì)胞在1500 rpm下細(xì)胞離心 (cytospin)5分鐘至載玻片上并分別分析。細(xì)胞核中染色質(zhì)凝聚程度是通 過共聚焦顯微術(shù)(LSM 510 META system, Carl Zeiss AB)和炎光強(qiáng)度的定 量測(cè)量來加以確定的。
結(jié)果
HAMLET侵入胂瘤細(xì)胞
腫瘤細(xì)胞對(duì)HAMLET的攝入在1小時(shí)后通過共聚焦顯微術(shù)進(jìn)行檢 測(cè)，并與cc-乳清蛋白進(jìn)行比較(圖1)。 HAMLET結(jié)合于癌細(xì)胞表面，大 量穿過膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并在細(xì)胞核中積聚(圖1 A和B)。腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷大 量的形態(tài)學(xué)變化，以凋亡樣形態(tài)死亡。未處理的細(xì)胞為圓形，具有平滑 的細(xì)胞輪廓，而在暴露于HAMLET以后，它們變得不規(guī)則，帶有細(xì)胞 質(zhì)小泡，并且尺寸減小，形成凋亡小體(圖1 A)。天然oc-乳清蛋白以更 低的效率結(jié)合于肺瘤細(xì)胞，少量被內(nèi)在化并且未觀察到易位至細(xì)胞核(圖 1 C)。 oc-乳清蛋白處理的細(xì)胞以完整的細(xì)胞形態(tài)存活至少24小時(shí)。通 過流式細(xì)胞術(shù)，HAMLET-和oc-乳清蛋白之間在攝入方面的巨大差異被 證實(shí)(圖1 D)。
隨后，對(duì)腫瘤細(xì)胞與相同組織來源的正常細(xì)胞進(jìn)行比較(圖1 E)。HAMLET被惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤或人腎癌細(xì)胞迅速內(nèi)在化，該細(xì)胞經(jīng)歷 了典型的形態(tài)變化。相反，在原代腎細(xì)胞培養(yǎng)物中幾乎沒有可檢測(cè)到的 HAMLET攝入，而且該細(xì)胞保持完好和充足的活力。人星形膠質(zhì)細(xì)胞 內(nèi)在化一些HAMLET而并未形成更大的聚合體，而且沒有易位至細(xì)胞 核或產(chǎn)生形態(tài)或存活力的變化。我們推論HAMLET的攝入是腫瘤細(xì)胞 的一種特征，該細(xì)胞以凋亡樣特征死去。
HAMLET對(duì)于由蛋白酶體的酶活性產(chǎn)生的降解作用是具有抗性的。
HAMLET的流入將腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)暴露于大量部分解折疊的蛋 白質(zhì)。通過oc -乳清蛋白的解折疊和油酸的結(jié)合而形成HAMLET的過程 在圖2 A中被說明。天然的和解折疊的oc-乳清蛋白以及HAMLET之間 三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異通過圓二色(CD)譜(圖2 B)被加以證實(shí)。
錯(cuò)折疊的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白酶體中被降解。哺乳動(dòng)物 20S蛋白酶體顯示出三種主要的肽酶活性，被稱為胰凝乳蛋白酶樣、胰 蛋白酶樣和肽基谷氨酰-肽水解活性。使用天然的oc-乳清蛋白和部分解 折疊的oc-乳清蛋白作為對(duì)照，對(duì)HAMLET對(duì)于蛋白水解降解作用的敏 感度進(jìn)行體外檢測(cè)(圖2 A-B)。天然oc-乳清蛋白對(duì)胰蛋白酶具有抗性并 在54小時(shí)后保持完好，而部分解折疊的oc-乳清蛋白則在5分鐘內(nèi)被降 解。HAMLET對(duì)胰蛋白酶比部分解折疊的cc-乳清蛋白更耐受，需要六 小時(shí)降解(圖2C)。用胰凝乳蛋白酶也表現(xiàn)了 HAMLET蛋白水解降解過 程中相似的延遲。天然a-乳清蛋白在29小時(shí)后保持完好，部分解折疊 的a-乳清蛋白在5分鐘后被完全降解，而HAMLET需要2小時(shí)(圖2 D)。
HAMLET和20S蛋白酶體的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核共定位 如果HAMLET以與內(nèi)源性錯(cuò)折疊蛋白相同的方式被感知，那么將 會(huì)預(yù)期蛋白酶體將降解此復(fù)合物。體外研究已表明20S蛋白酶體可以降 解解折疊形式的oc-乳清蛋白和相關(guān)的溶菌酶C以及酪蛋白，其含有解 折疊形式的a -乳清蛋白。使用經(jīng)Alexa-Fluor 568標(biāo)記的HAMLET和針 對(duì)20S蛋白酶體催化核心的抗體，對(duì)HAMLET與20S蛋白酶體間直接 相互作用的可能性通過共聚焦顯微術(shù)加以研究。未處理的細(xì)胞表現(xiàn)出微 弱且相當(dāng)均 一的細(xì)胞質(zhì)20S蛋白酶體染色而無(wú)細(xì)胞核染色。在HAMLET 暴露1小時(shí)后，觀察到三種共定位模式。細(xì)胞質(zhì)20S蛋白酶體與HAMLET 共定位，尤其是在細(xì)胞質(zhì)小泡中(圖3A)。其他細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞質(zhì)
共定位(89%)，在細(xì)胞核中幾乎是完全的共定位(99%), HAMLET和蛋白 酶體在細(xì)胞核中形成獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖3 B)。第三個(gè)細(xì)胞群體表現(xiàn)出強(qiáng) 烈的細(xì)胞核HAMLET染色，但是非常微弱的細(xì)胞核20S蛋白酶體染色， 并且似乎已經(jīng)丟失了大部分細(xì)胞質(zhì)(圖3C)?？傊贖AMLET處理的 細(xì)胞中檢測(cè)到蛋白酶體染色的增強(qiáng)。這些結(jié)果表明在腫瘤細(xì)胞中 HAMLET與蛋白酶體相互作用。
HAMLET-處理細(xì)胞中蛋白酶體的活化與再分配
使用熒光底物，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核提取物中，對(duì)HAMLET對(duì)于蛋 白酶體活性的體內(nèi)作用進(jìn)行定量(圖4 A)。 l小時(shí)后，細(xì)胞質(zhì)蛋白酶體活 性在HAMLET-處理的細(xì)胞中有所增加，但在cc-乳清蛋白處理的細(xì)胞中 則沒有。相反，細(xì)胞核蛋白酶體活性在HAMLET處理細(xì)胞中有所降低(圖 4 B)。蛋白酶體抑制劑MG132阻斷了這種作用。結(jié)果表明在腫瘤細(xì)胞 中，與HAMLET的相互作用改變了蛋白酶體的活性。
蛋白酶體的再分配在HAMLET-處理細(xì)胞而不是在cc-乳清蛋白-處 理細(xì)胞中被檢測(cè)到(圖3 A且數(shù)據(jù)未顯示)。20S蛋白酶體在對(duì)HAMLET 的早期凋亡反應(yīng)期間移向細(xì)胞質(zhì)外圍。細(xì)胞質(zhì)蛋白酶體染色在HAMLET 處理后增加至1.8倍(與對(duì)照相比p<0.001)。此外，蛋白酶體移向細(xì)胞核， 如通過在細(xì)胞核染色中的22-倍增加所示(與對(duì)照相比pO.001)(圖4 C)。 再分配被證明需要蛋白酶體活性(圖4C和D)。MG132抑制了 HAMLET-誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)染色以及蛋白酶體的細(xì)胞核積聚的增加(與對(duì)照相比 p<0.001)。結(jié)果表明20S蛋白酶體被HAMLET激活以及不能消化復(fù)合物
引起蛋白酶體向細(xì)胞外周和細(xì)胞核再分配。
HAMLET的細(xì)胞核積聚涉及蛋白酶體活性。
由于oc -乳清蛋白缺乏已知的核定位序列(NLS)，所以HAMLET向細(xì) 胞核的運(yùn)輸尚未被解釋。在本研究中，蛋白酶體的活化被表明同樣涉及 于HAMLET的細(xì)胞核易位(圖4 D-E)。利用MG132的蛋白酶體抑制作 用被證明將細(xì)胞核中帶有HAMLET的細(xì)胞數(shù)由55%減少至21%,且 Lactacystein引起79%至34%的減少^<0.05)。結(jié)果表明蛋白酶體的活 化對(duì)于HAMLET的細(xì)胞核攝入而言是必須的。
蛋白酶體的修飾與核定位序列的暴露。
若干個(gè)20S蛋白酶體的a亞基攜帶核定位序列(NLS)。 KKXK基元
在對(duì)某種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白作出反應(yīng)過程中被暴露，并在轉(zhuǎn)錄期間促進(jìn)
蛋白酶體的核易位。因此，由HAMLET導(dǎo)致的20S蛋白酶體的活化可 能暴露了 NLS,其反過來可能幫助蛋白酶體與HAMLET進(jìn)行核易位。 此假設(shè)通過混合HAMLET與完整的蛋白酶體而進(jìn)行體外檢測(cè)。蛋白酶 體的片段化在溫育20分鐘后通過SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，并使用Mascot 軟件，通過質(zhì)譜對(duì)該片段加以鑒定。20S蛋白酶體亞基的若干變化被加 以檢測(cè)(見圖5 A中的箭頭以及在和C中的蛋白酶體的分子模型)。條帶 1包含結(jié)構(gòu)性的oc3亞基和aP亞基，其含有完整蛋白酶體中的細(xì)胞核 KKXK基元。但是，對(duì)應(yīng)于口6亞基中NLS基元的大量片段在HAMLET 處理后缺乏(圖5 C)。條帶3含有結(jié)構(gòu)性的P 3亞基。條帶4被表明含有 具肽基谷氨?；饣钚缘拇呋瘉喕鵓1和具胰凝乳蛋白酶樣活性的P 5的混合物。所觀察到的蛋白匹配高度顯著(P值范圍1.3 x10—19至2Jx 10—37)。片段化過程是通過使用針對(duì)蛋白酶體的a/(3亞基的多克隆抗體 進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡來加以證實(shí)的。此抗體識(shí)別分子量<20 kDa的新蛋 白酶體條帶(圖5 B)。然而，它無(wú)法識(shí)別其它新條帶，如圖5 A中通過 SDS-PAGE所示。
結(jié)果表明HAMLET引起了 20S蛋白酶體中主要的結(jié)構(gòu)修飾，并表 明此過程暴露了 HAMLET的核定位信號(hào)。
蛋白酶體活性與HAMLET-處理細(xì)胞的死亡
蛋白酶體反應(yīng)在細(xì)胞死亡方面的涉及是使用細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核終點(diǎn) 進(jìn)行檢測(cè)的。在用HAMLET溫育1小時(shí)后，71%的細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷了伴 有出泡并從載玻片上解離的形態(tài)學(xué)變化。蛋白酶體的抑制作用將解離減 少至29% (p<0.05,圖6 A)。蛋白酶體活性同樣涉及染色質(zhì)凝聚。在用 HAMLET溫育1小時(shí)后，64%的腫瘤細(xì)胞包含凝聚的或片段化的染色 質(zhì)，而蛋白酶體的抑制作用將染色質(zhì)凝聚和片段化頻率減少至31% (圖 6 B, p<0.01).
權(quán)利要求
1.一種篩選用于殺死細(xì)胞的測(cè)試物質(zhì)的方法，所述方法包括使測(cè)試物質(zhì)與蛋白酶體接觸，并檢測(cè)它們之間導(dǎo)致所述蛋白酶體結(jié)構(gòu)變化的相互作用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其通過使所述測(cè)試物質(zhì)與完整的蛋白酶體體外接觸，并檢測(cè)與所述蛋白酶體的相互作用而實(shí)現(xiàn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白酶體是人紅細(xì)胞20S蛋白酶體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中所述蛋白酶體已經(jīng) 過預(yù)溫育步驟，所述步驟中存在選擇性的但是可逆的蛋白酶體抑制劑。
5. 根據(jù)前面所述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試物質(zhì) 與所述蛋白酶體之間的相互作用是通過檢測(cè)所述蛋白酶體結(jié)構(gòu)的片段 化而進(jìn)4于4企測(cè)的。
6. 根據(jù)前面所述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶體 結(jié)構(gòu)的變化是使用凝膠分離法進(jìn)行檢測(cè)的。
7. 根據(jù)前面所述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中選擇了使所述 蛋白酶體的a6亞基產(chǎn)生變化的物質(zhì)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述測(cè)試物質(zhì)與細(xì)胞體外 溫育，并監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞中該測(cè)試物質(zhì)的位置。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞是使用共聚焦顯微 術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的方法，其中所述測(cè)試物質(zhì) 用熒光標(biāo)記物進(jìn)4亍標(biāo)記。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8至10中任何一項(xiàng)所述的方法，其中將用于所 述蛋白酶體的標(biāo)記的結(jié)合劑與所述物質(zhì)共同施用，并觀察在所述細(xì)胞中 的相對(duì)位置。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述結(jié)合劑是標(biāo)記抗體， 其對(duì)所述蛋白酶體的催化核心是特異性的。
13. —種篩選用于殺死細(xì)胞的測(cè)試物質(zhì)的方法，所述方法包括下列 步驟(a) 使測(cè)試物質(zhì)與蛋白酶接觸以一企測(cè)至少部分的蛋白酶抗性；(b) 使測(cè)試物質(zhì)與蛋白酶體體外接觸并檢測(cè)它們之間的相互作用；或者與細(xì)胞體外接觸，并確定所述測(cè)試物質(zhì)是否與所述細(xì)胞中的蛋白酶體共定位；并且(c)選擇在步驟(a)中被發(fā)現(xiàn)為蛋白酶抗性并與蛋白酶體相互作用， 或者根據(jù)步驟(b)與細(xì)胞中的蛋白酶體共定位的物質(zhì)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟(a)是通過將所述測(cè)試 物質(zhì)與至少一種蛋白酶進(jìn)行溫育而進(jìn)行的，所述蛋白酶是哺乳動(dòng)物蛋白 水解酶。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述蛋白水解酶是胰凝乳 蛋白酶或者胰蛋白酶。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任何一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)中蛋 白酶抗性是通過檢測(cè)由于降解所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)片段來檢測(cè)的。
17. —種試劑，其與細(xì)胞的蛋白酶體相互作用造成其結(jié)構(gòu)變化而用 于殺死細(xì)胞，前提是所述試劑是HAMLET或者其已知的生物學(xué)活性修 飾、或者它們兩者之 一 的生物學(xué)活性片段以外的試劑。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑，其中所述蛋白酶體中的結(jié)構(gòu)變 化是所述蛋白酶體的片段化。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的試劑，其中所述試劑使細(xì)胞的蛋白酶體活化，但其對(duì)于所述蛋白酶體的降解作用是具有抗性的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17至權(quán)利要求19中任何一項(xiàng)所述的試劑，其為 蛋白質(zhì)或包含蛋白質(zhì)(a-乳清蛋白或者其變體除外)的蛋白復(fù)合物，所 述蛋白質(zhì)至少是部分未折疊或錯(cuò)折疊。
21. 根據(jù)權(quán)利要求17至權(quán)利要求20中任何一項(xiàng)所述的試劑，其包括靶向試劑，該試劑對(duì)于腫瘤細(xì)胞或者未分化細(xì)胞是特異性的。
22. 根據(jù)權(quán)利要求17至權(quán)利要求21中任何一項(xiàng)所述的試劑，其進(jìn)一步包括易位因子。
23. 根據(jù)權(quán)利要求17至權(quán)利要求22中任何一項(xiàng)所述的試劑，其是蛋白質(zhì)或肽。
24. 根據(jù)權(quán)利要求17至權(quán)利要求23中任何一項(xiàng)所述的試劑，用于 癌癥的治療。
25. —種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑。
26. —種表達(dá)載體或者質(zhì)粒，其包括根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的表達(dá)載體或質(zhì)粒，其是制藥上可接受的載體。
28. —種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求17至權(quán)利要求24中任 何一項(xiàng)所述試劑與制藥上可接受的載體的組合。
29. —種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求27所述表達(dá)載體或質(zhì)粒。
30. —種殺死細(xì)胞的方法，所述方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求 17至權(quán)利要求24中任何一項(xiàng)的試劑或者根據(jù)權(quán)利要求27所述的表達(dá)載體或質(zhì)粒導(dǎo)入所述細(xì)胞。
31. —種細(xì)胞，其被根據(jù)權(quán)利要求26所述的載體轉(zhuǎn)化。
32. 根據(jù)權(quán)利要求17至權(quán)利要求24中任何一項(xiàng)所述的試劑或者根 據(jù)權(quán)利要求27所述的表達(dá)載體或質(zhì)粒的用途，用于制備治療癌癥的藥 物。
33. —種篩選用于殺死細(xì)胞的測(cè)試物質(zhì)的方法，基本如上文所述。
34. 使用根據(jù)權(quán)利要求1至權(quán)利要求16中任何一項(xiàng)所述的方法鑒 定的試劑，用于殺死細(xì)胞。
35. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑，用于殺死細(xì)胞，基本如上文所述。
全文摘要
一種篩選用于殺死細(xì)胞的測(cè)試物質(zhì)的方法，所述方法包括使測(cè)試物質(zhì)與蛋白酶體接觸并檢測(cè)它們之間導(dǎo)致蛋白酶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的相互作用。按照此方法鑒定的物質(zhì)在治療癌癥以及病毒感染的細(xì)胞和細(xì)菌方面有用，并形成本發(fā)明進(jìn)一步的方面。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101194163SQ200680015384
公開日2008年6月4日 申請(qǐng)日期2006年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月3日
發(fā)明者C·斯文伯格, L·古斯特夫森 申請(qǐng)人:尼亞哈姆雷特藥品公司