專利名稱：利用腺苷脫氨酶制備雙脫氧肌苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及從2′，3′-雙脫氧腺苷(ddA)制備2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)的方法，更具體地，本發(fā)明涉及利用源自人類ADA核苷酸序列的腺苷脫氨酶(ADA)制備ddI的方法。
背景技術(shù)：
的描述雙脫氧核苷是相對穩(wěn)定的核苷類似物。雙脫氧核苷2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)已展示有作為抗病毒劑的有用的藥理學(xué)活性。Hartman，etal.，Clin.Pharmacol.Ther.47647(1990)。具體地，ddI已展示可單獨(dú)使用或聯(lián)合3′-疊氮基-2′，3′-雙脫氧胸苷(AZT)治療愛滋病。隨著人類免疫缺陷病毒AZT抗性菌株的產(chǎn)生，ddI的利用越來越重要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)合成雙脫氧核苷的努力已有報道，例如在2′或3′位置的核苷的脫氧。Chem.Pharm.Bull.，22128(1974)。然而，在通常需要用來驅(qū)動反應(yīng)的溫度以及pH條件下，由于空間阻礙及核苷的不穩(wěn)定，化學(xué)合成是困難的。此外，用于合成的起始材料是昂貴的，并且不可大量供應(yīng)。到目前為止，無法按比例增加實(shí)驗(yàn)室合成雙脫氧核苷的規(guī)模至此類化合物工業(yè)規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。
已知可以用多種方法通過腺苷脫氨酶由雙脫氧腺苷(ddA)的酶促脫氨作用進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的ddI生產(chǎn)。已報導(dǎo)利用牛腺苷脫氨酶使2′，3′-雙脫氧腺苷脫氨基，從而合成ddI。Webb et al.，Nucleosides& Nucleotides，7(2)147-153(1988).亦有報導(dǎo)利用牛腺苷脫氨酶按比例放大合成ddl的過程，包括溶劑以及緩沖液等參數(shù)的優(yōu)化。Nucleosides & Nucleotides，10(7)1499-1505(1991)。
Farina等的美國專利No.5,011,774號公開了一種方法，其中(D)-2′，3′-雙脫氧腺苷的端基異構(gòu)混合物在有利ddl更具活性的β端基異構(gòu)體酶促脫氨的速率的適當(dāng)?shù)娜軇﹥?nèi)與ADA反應(yīng)。此方法使用的市售ADA源自小牛脾臟。這個方法避免了分離出不需要的α-端基異構(gòu)體所需的層析以及結(jié)晶技術(shù)的步驟。然而，利用此方法可能的缺點(diǎn)是當(dāng)用牛來源的酶時，有傳播傳染性海綿狀腦病(TSE)的危險。
Yokozeki等的美國專利No.4,970,148公開了一種方法，其中將2′，3′-雙脫氧腺苷(ddA)與含有能將ddA轉(zhuǎn)化為ddI的ADA酶的微生物培養(yǎng)液接觸。此方法使用全部微生物、細(xì)胞勻漿物、或溶菌酶、鹽、表面活性劑等處理的細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)液做為ADA的來源。此方法的一個缺點(diǎn)是酶的天然來源在超過8的pH下是固有不穩(wěn)定的，并且要求嚴(yán)格的pH控制。當(dāng)在小于8的pH下進(jìn)行時，產(chǎn)物ddI僅在非常稀的濃度(重量體積＜1％)下是可溶的。結(jié)果此方法每批產(chǎn)生非常少的ddI。此外，如此產(chǎn)生的ddI必須進(jìn)行廣泛的純化步驟以去除殘留的蛋白質(zhì)污染物以獲得純化的ddI產(chǎn)物。此類純化步驟是昂貴的，并且可導(dǎo)致產(chǎn)物的損傷以及降低產(chǎn)量。
Noguchi等的日本專利申請No.5-219978公開了生產(chǎn)核酸相關(guān)物質(zhì)例ddI的方法，包括克隆編碼適當(dāng)酶的基因，構(gòu)建具有導(dǎo)致此基因高表達(dá)的調(diào)控序列的表達(dá)載體，用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物以形成轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)克隆基因的表達(dá)，以及提取和分離如此表達(dá)的酶。然后用分離的酶和適當(dāng)?shù)钠鹗疾牧侠鏳dA反應(yīng)，產(chǎn)生所需要的核酸相關(guān)物質(zhì)。與Yokozeki專利相比，此方法產(chǎn)生的可用的酶量增加100倍。然而，依據(jù)此方法分離的酶是微生物酶。因此，至少對于ADA，此酶在pH值大于8時缺少穩(wěn)定性。結(jié)果，為了獲得可接受的產(chǎn)量，必須嚴(yán)密調(diào)控pH。此外，此方法產(chǎn)生的產(chǎn)物和ADA緊密接觸。反應(yīng)混合物受到雜質(zhì)例如未反應(yīng)的ddA、核酸副產(chǎn)物以及ADA和產(chǎn)物的污染。因此，必須進(jìn)行廣泛的純化方法從反應(yīng)混合物中分離ddI。該純化方法典型地需要重復(fù)的液相層析或薄層層析。此類純化步驟不易用于商業(yè)性的規(guī)模放大。
Yokozeki等的美國專利No.4,962,193公開了由采用酶的方法純化ddI的方法，其中使用多孔的、非極性樹脂吸附ddI到樹脂上，分離樹脂與溶液，并且分級洗脫吸附的ddI以獲得純化的產(chǎn)物。然而，此方法在最終純化步驟之前要先經(jīng)前處理以去除蛋白質(zhì)和濃縮物并且過濾含產(chǎn)物的溶液。因此，此方法既昂貴且耗時。
因此目前需要一種工業(yè)規(guī)模的方法來制備ddI，該方法提供令人滿意的產(chǎn)率而無傳播TSE的危險或無須進(jìn)行廣泛的純化程序以去除殘留蛋白質(zhì)，而且使用在寬的pH范圍穩(wěn)定的酶。
發(fā)明概述本發(fā)明總體涉及通過使ddA與固定在不溶的支持物上的具有ddA脫氨酶活性的酶接觸而制備ddI的方法。本發(fā)明提供制備雙脫氧肌苷(ddI)的方法，包括以下的步驟(a)獲得表達(dá)ddA脫氨酶活性的酶；(b)將酶固定到不溶的支持物上；(c)于產(chǎn)生ddI溶液的時間內(nèi)和條件下使酶與雙脫氧腺苷(ddA)溶液接觸，所述雙脫氧腺苷溶液的濃度至少為在水中的約4％重量體積；以及(d)從ddI溶液中分離ddI。任選地，將產(chǎn)生的ddI母液再利用于后續(xù)的程序中以改良產(chǎn)率。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及以經(jīng)濟(jì)和可靠的方式從ddA制備ddI的方法，其可避免現(xiàn)有技術(shù)的方法的缺點(diǎn)。
以前從ddA制備ddI的方法包括利用市售的ADA，例如牛ADA(可購自Sigma)或源自培養(yǎng)用微生物ADA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的ADA。此方法包括在溶液中混合酶和ddA，將ddA轉(zhuǎn)化成ddI。接著，必須從含各種污染物，包括酶的溶液中移出ddI。這要求大量純化和分離以從污染的反應(yīng)混合物中獲得ddI。
與現(xiàn)有技術(shù)的方法相反，本發(fā)明使用ADA，或其它能使ddA脫氨基的固定化狀態(tài)的酶。固定化有利于改進(jìn)酶在反應(yīng)混合物中的穩(wěn)定性。更重要的，固定化允許從反應(yīng)混合物中容易地分離ddI終產(chǎn)物，因?yàn)橹饕奈廴疚?，即酶保持固定于不溶的支持物上?br> 本發(fā)明進(jìn)一步提供新的ADA來源。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，是利用使人ADA或其保守衍生物轉(zhuǎn)化的生物生長而獲得的ADA，從ddA制備ddI。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)之一是人ADA在更寬的pH范圍內(nèi)比微生物的ADA更穩(wěn)定。當(dāng)反應(yīng)在超過大約8的pH下進(jìn)行時，ddA保持穩(wěn)定且改進(jìn)了轉(zhuǎn)化為ddI的效率。其它優(yōu)點(diǎn)是在這些pH下ddI比pH低于大約8時更易保持在溶液內(nèi)。產(chǎn)物ddI在高pH值(＞8)下改進(jìn)的溶解度的特性可使反應(yīng)在更高的濃度下進(jìn)行，由此改進(jìn)ddI的產(chǎn)率。
本發(fā)明方法利用固定于不溶的支持物上的人類ADA酶或者具有ddA脫氨酶能力的其它酶。本發(fā)明是利用由所述固定化導(dǎo)致的酶的穩(wěn)定性改進(jìn)的優(yōu)點(diǎn)。因此，可在典型地變性或以其它方式干擾酶活性的pH范圍下進(jìn)行從ddA產(chǎn)生ddI的反應(yīng)。此外，固定ADA給ADA賦予了方便的特性，即，經(jīng)簡單過濾方法從反應(yīng)產(chǎn)物分離酶的能力。
制備腺苷脫氨酶(ADA)本發(fā)明特別感興趣的ADA是人類ADA或其保守變體，其具有氨基酸序列SEQ ID NO1(Genebank編號gi114043373)。選擇此人類形式的ADA是由于它比微生物來源的ADA有更優(yōu)越的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。特定言的，與微生物的ADA相比，人類ADA在相對寬的pH范圍內(nèi)維持顯著的活性。此外，與微生物的ADA相比，人類ADA在升高的溫度下對降解更具抗性。人類ADA的DNA序列公布為源自人類mRNA的cDNA序列，它是1,533個堿基的序列。參閱Gwendolyn，S.et al.，Mol.andCellular Biology，4(9)1712-1717(1984)。
公布的序列，或其某些保守變體，可用以編碼和獲得所需要的ADA。SEQ ID NO2(Genebank編號giI14043372)是公布的人類cDNA序列。理想地，尤其是當(dāng)利用大腸桿菌作宿主時，使用SEQ ID NO3(Genebank編號gi1140433732)。SEQ ID NO3為公布的人類cDNA的保守變體，其中對精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸以及脯氨酸進(jìn)行了密碼子優(yōu)先取代。由于遺傳密碼是簡并的，這些密碼子取代不會導(dǎo)致序列編碼的氨基酸改變。這些取代反而可改進(jìn)大腸桿菌對密碼子的識別。可使用下列的密碼子優(yōu)先取代
表1-密碼子優(yōu)先取代

本發(fā)明進(jìn)一步包括使用包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列的其它小的修飾以及所有天然等位基因的序列，所述序列產(chǎn)生基本上具有等同活性的酶。修飾可以是特意的，例如經(jīng)定點(diǎn)誘變，或可以是自發(fā)突變。等位基因可來自任何物種。優(yōu)選的等位基因是人類來源。本發(fā)明包括利用所有這些多肽，只要仍保持酶使ddA脫氨基的活性。
例如，本發(fā)明亦包括SEQ ID NO1的保守變體或等同變體。此處用到的術(shù)語″保守變體″以及″等同變體″代表用具有相似的化學(xué)和生物的性質(zhì)或一般而言考慮為等同的其它氨基酸取代氨基酸。
例如，本領(lǐng)域已知以等同的氨基酸取代序列內(nèi)的氨基酸，即保守變體。通?？紤]為等同的氨基酸的基團(tuán)是Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G)；Asn(N)、AsD(D)、Glu(E)、Gln(Q)；
His(H)、Arg(R)、Lys(K)；Met(M)、Leu(L)、He(I)、Val(V)；和Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)。
可在酶序列內(nèi)進(jìn)行取代、添加、及/或缺失，只要保持本發(fā)明方法中所用ADA的功能。等同的酶通常具有與天然酶基本上相同的氨基酸序列?；旧吓c另一序列相同，但經(jīng)一個或多個取代、添加及/或缺失而與其它序列不同的氨基酸序列，被認(rèn)為是等同的序列、等同變體或保守變體。本發(fā)明蛋白質(zhì)序列內(nèi)氨基酸殘基數(shù)目的優(yōu)選少于25％，更優(yōu)選少于10％經(jīng)取代、添加、或缺失。
人類ADA可經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法制備。所述方法包括生物合成和化學(xué)合成。在生物合成中，酶可直接分離自細(xì)胞。此外，已知可以通過提供編碼酶的DNA，擴(kuò)增或克隆DNA，在適當(dāng)?shù)乃拗鞯膬?nèi)表達(dá)此DNA，以及收獲酶而制備酶。例如，此酶可直接或間接翻譯自編碼酶氨基酸序列的cDNA。在化學(xué)合成時，用四種堿基作原料來組裝已知的氨基酸序列。
A.獲得編碼ADA的核酸序列編碼ADA的DNA可通過本領(lǐng)域已知的方法源自適當(dāng)?shù)腸DNA文庫。參閱例如Gwendolyn，S.et al.，Molecular and Cellular Biology，4(9)1712-1717(1984)，全文在此引入作為參考。此序列已指定為Genebank編號GI14043372。
一般而言，完整的DNA鏈或DNA的其它片段可經(jīng)利用公知的DNA或其片段作為探針而加以分離。為此，來自基因組或cDNA文庫的限制片段可利用標(biāo)記的寡核苷酸探針經(jīng)Southern雜交而鑒定。例如，可通過利用已知序列的片段從人類勻漿的組織分離編碼酶的DNA，從而制備一個或多個寡核苷酸探針。探針是標(biāo)記的，并且用于篩選在適當(dāng)載體例如噬菌體λ內(nèi)的基因組或cDNA文庫。cDNA文庫可經(jīng)已知的方法，例如描述于Gubler and Hoffman，Gene，25263-270(1983)中的方法，從mRNA制備。寡核苷酸探針可用于從不同組織篩選cDNA文庫。這些寡核苷酸探針應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，從而可在雜交至篩選的文庫中的DNA時被檢測。這些方法是本領(lǐng)域公知的。對分離的DNA進(jìn)行測序，并且用此序列制備額外的寡核苷酸探針?？芍貜?fù)此步驟以獲得重疊片段直到制備出完全的可讀框。
擴(kuò)增以及克隆DNA的方法是本領(lǐng)域公知的。參閱例如Sambrook andRussel，Molecular Cloning A Laboratory Manual，3rd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(2001)，全文在此引入作為參考。利用λ-gt10或λ-gt11-特異性寡聚體作擴(kuò)增引物(可購自Clontech，Palo Alto，CA)，擴(kuò)增λ-gt10或λ-gt11載體內(nèi)的克隆是方便的。其它擴(kuò)增程序是本領(lǐng)域公知的，例如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、修復(fù)鏈反應(yīng)(RCR)、以及PCR寡核苷酸連接分析(PCR-OLA)亦可用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。
作為上述的基因生物合成的替代方案，基于報道DNA序列，利用本領(lǐng)域已知的方法可化學(xué)地合成此基因。該方法包含描述于″Modernmachine-aided methods of oligonuc leotide synthesis″，Brown TandDorcas，J.S.，In Oligonucleotide and Analogues a PracticalApproach，Ed.F.Eckstern，IRL Press，Oxford UK(1995)中的方法，全文在此引入作為參考。也可以通過制備重疊的雙鏈寡核苷酸、填充空位和將末端連接在一起而合成DNA。一般而言參閱Sambrook etal.，and Glover，D.M.and Hames，B.D.，eds.Cloning，2nd Ed.，Vols.1-4，IRL Press，Oxford，UK(1995)。
如果關(guān)注與人類來源的DNA相關(guān)的潛在病毒污染的風(fēng)險，例如為了符合管理的要求，那么獲得DNA的化學(xué)合成方法是優(yōu)選的。
B.表達(dá)ADA按上文描述得到的重組DNA分子，含有編碼人類ADA的多核苷酸序列。此重組DNA可克隆于適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞并且經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法表達(dá)。一般而言，給克隆的基因提供表達(dá)載體，它指導(dǎo)酶在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)。然后可自宿主細(xì)胞中回收此酶。參閱Sambrook etal.(2001)關(guān)于制備和操作核酸的方法。
擴(kuò)增的或克隆的DNA可經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法在適當(dāng)?shù)妮d體中表達(dá)，優(yōu)選在表達(dá)載體中表達(dá)。一般而言參閱Sambrook et al.(2001)。表達(dá)載體能指導(dǎo)與其可操作性連接的基因的表達(dá)。用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒的形式。然而，本發(fā)明可以包括其它形式的表達(dá)載體，例如具有等同功能的病毒載體(例如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等)。優(yōu)選地，此表達(dá)載體是質(zhì)粒，如公開于美國專利No.6,068,991中的那些，全文在此引入作為參考。
載體DNA，優(yōu)選地為包括調(diào)控序列的表達(dá)載體形式，可經(jīng)由常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入原核的或真核的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”及“轉(zhuǎn)染”意指多種本領(lǐng)域公知的可將外來的核酸引入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(脂轉(zhuǎn)染)或電穿孔。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法可參見Sambrook，et al.(supra)，以及其它實(shí)驗(yàn)室手冊。
表達(dá)載體優(yōu)選含有至少一種表達(dá)控制序列，它可操作性連接至DNA序列或要表達(dá)的片段。此控制序列是基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞加以選擇，并且插入載體內(nèi)以控制和調(diào)節(jié)克隆的DNA序列的表達(dá)。
在重組表達(dá)載體中，“可操作性連接”是指將目的核苷酸序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式(例如在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)內(nèi)，或當(dāng)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，在宿主細(xì)胞內(nèi))連接于調(diào)控序列。
術(shù)語″調(diào)控序列″包括啟動子、增強(qiáng)子以及其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。所述調(diào)控序列描述于例如Goeddel，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology，185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)。調(diào)控序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的那些，以及僅在某些宿主細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些(例如組織特異的調(diào)控序列)。
適用的表達(dá)控制序列的實(shí)例是lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、tac系統(tǒng)、trc系統(tǒng)、噬菌體λ的主操縱子以及啟動子區(qū)、fd外被蛋白的控制區(qū)、酵母的糖酵解啟動子，例如3-磷酸甘油激酶的啟動子、酵母酸性磷酯酶的啟動子(例如Pho5)、酵母α-交配因子的啟動子、以及源自多瘤、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、以及猿猴病毒的啟動子，例如早和晚期啟動子或SV40，以及其它已知的控制原核或真核細(xì)胞及其病毒的基因表達(dá)的序列或其組合。
適當(dāng)?shù)目烧T導(dǎo)的非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括調(diào)控序列，例如pTrc(Amann et al.，(1988)Gene 69301-315)以及pET11d(Studier et al.，Gene Expression TechnologyMethods toEnzvmolov 185，Academic Press，San Diego，California(1990))。由pTrc載體表達(dá)目標(biāo)基因，是依賴于由雜交體trp-lac融合啟動子轉(zhuǎn)錄宿主RNA聚合酶。由pET 11d載體表達(dá)目標(biāo)基因，是依賴于共同表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7 gnl)介導(dǎo)的T7 gn10-lac融合啟動子進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶可由宿主株BL21(DE3)或HMS 174(DE3)提供，它們來自于具有在lacUV 5啟動子控制轉(zhuǎn)錄下的T7 gnl基因的停留的λ原噬菌體。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞可為任何原核(例如大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如昆蟲細(xì)胞、酵母或者哺乳動物的細(xì)胞)。一些適當(dāng)?shù)脑怂拗靼ǎ绱竽c桿菌，例如大腸桿菌SG-936、大腸桿菌HB 101、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌X2282、大腸桿菌DHI、以及大腸桿菌MRC1、大腸桿菌BL21、假單胞菌物種、芽孢桿菌物種，例如枯草芽孢桿菌、以及鏈霉菌物種。適當(dāng)?shù)恼婧思?xì)胞包括酵母以及其它真菌、昆蟲、動物細(xì)胞，例如COS細(xì)胞以及CHO細(xì)胞、組織培養(yǎng)中的人類細(xì)胞以及植物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于以下因素，如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生由在此描述的核酸編碼的ADA，包括融合蛋白或肽。
融合表達(dá)載體中經(jīng)常在融合部份與重組蛋白質(zhì)的接合處引入蛋白水解切割位點(diǎn)，以便在純化融合蛋白質(zhì)后可從融合部份分離重組蛋白質(zhì)。所述酶，及其相關(guān)識別序列包括因子Xa、凝血酶以及腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白質(zhì)、或蛋白質(zhì)A與目標(biāo)重組蛋白質(zhì)融合的pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith and Johnson(1988)Gene 6731-40)、pMAL(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)以及pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
在大腸桿菌中使重組蛋白質(zhì)表達(dá)最大化的策略之一是在通過蛋白水解而切割重組蛋白質(zhì)的能力受損的宿主細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)(Gottesman，Gene Expression TechnologyTechnologyMethods inEnzvmology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)pp.119-128)。另一策略是改變要插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，從而使各氨基酸的各個密碼子是大腸桿菌優(yōu)先利用的密碼子(Wads etal.，Nucleic Acids Res(1992)202111-2118)。本發(fā)明的核酸序列的所述改變可用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)或定點(diǎn)誘變進(jìn)行。
細(xì)胞是在本領(lǐng)域公知的條件下生長。誘導(dǎo)克隆基因的表達(dá)，以表達(dá)大量的酶。優(yōu)選地，利用的大腸桿菌表達(dá)載體包括lac系統(tǒng)啟動子系統(tǒng)。ADA的表達(dá)優(yōu)選利用IPTG誘導(dǎo)。
C.分離以及純化ADA一般而言，可從溶解的細(xì)胞級分經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法分離酶。一些適當(dāng)?shù)姆椒òǔ恋硪约耙合嗌V方案，例如離子交換、疏水相互作用、以及凝膠過濾。參閱例如，Methods Enzymol.-Guide to ProteinChemistry，Deutscher，Ed.，Section VII pp.182-309(1990)；以及Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，New York(1987)，全文在此引入作為參考。
此外，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在制備性SDS-PAGE凝膠上分離酶，切出目的條帶并且從聚丙烯酰胺基質(zhì)上電泳洗脫蛋白質(zhì)，可得到純化的材料。經(jīng)已知的方法從蛋白質(zhì)移除洗滌劑SDS，例如經(jīng)透析或利用適當(dāng)?shù)闹?，例如Pierce的Extracti-Gel柱。酶的混合物可依據(jù)Laemmli，Nature 227680-685(1970)的方法，經(jīng)例如SDS-PAGE分離。此類方法是本領(lǐng)域公知的。
只要可有效地移除不需要的污染，純化蛋白質(zhì)的方法無特定的限制。一個經(jīng)濟(jì)的方法是將發(fā)酵液通過微型流化床而破碎細(xì)胞，以從細(xì)胞釋放出酶。添加助濾器以及植絨劑(例如PEI，可購自VWRInternational，South Plainfield，NJ)到攪拌的培養(yǎng)液中，使污染物例如蛋白質(zhì)以及其它細(xì)胞碎片不溶。適當(dāng)?shù)闹鸀V器是CELITE(可購自World Minerals，Inc.，Santa Barbara，CA)。然后可從培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)大小的過濾器過濾而移除可溶的酶。理想地，過濾器將允許可溶的活性酶通過，而細(xì)胞蛋白質(zhì)以及其它污染物的不溶級分被過濾器保留。然后可利用超濾器在溶液內(nèi)濃縮酶。為此目的，使用30,000分子量截止(MWCO)的濾器。
ADA活性分析如此得到的酶應(yīng)測定活性。本文中酶活性單位(U)是37℃下每分鐘使1μmol ddA脫氨基的酶量。理想地，最終酶效價是約650-750U/毫升?？山?jīng)添加酶至2.4％ddA溶液中在37℃下進(jìn)行分析。使反應(yīng)在輕柔攪拌下進(jìn)行15分鐘。加入四氫呋喃停止反應(yīng)。取樣并進(jìn)行HPLC，以測定ddI的形成量。
固定ADA一旦純化酶，需要用合適的緩沖液處理酶溶液至pH約7.3至約7.6。雖然磷酸鹽緩沖液是優(yōu)選的，但使用的緩沖液的類型無特定的限制。理想地，溶液是用緩沖液稀釋至活性約250至約350U/mI。
純化的酶先固定于支持物上，支持物在和ddA反應(yīng)前不溶于反應(yīng)溶液。只要酶可固定在其上，支持物的類型無特定的限制。一般而言，將上述緩沖酶的稀釋溶液加入含不溶支持物的溶液中，某些支持物需要經(jīng)活化劑例如交聯(lián)劑活化。交聯(lián)劑經(jīng)由ADA上的胺基團(tuán)將ADA共價鍵合至支持物。
反應(yīng)期間支持物保持不溶，并且在反應(yīng)溶液內(nèi)保持酶不溶。理想地，支持物是固態(tài)樹脂材料，其直徑約250-600微米。適當(dāng)?shù)闹С治锇ǎ鏘PS-400(可購自U.O.P.，Des Plaines，IA)或EUPERGIT(可購自Rohm America Inc，Piscataway，NJ)。
交聯(lián)劑無特定的限制，只要它能將酶共價連接至支持物。交聯(lián)劑的選擇將取決于選擇的支持物，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易明確的。樹脂支持物以及交聯(lián)劑適當(dāng)?shù)慕M合是硅藻土和戊二醛、IPS-400和戊二醛、瓊脂糖和CNBr、以及伯胺或羧基官能化的樹脂支持物和碳二亞胺。固態(tài)支持物和交聯(lián)劑其它適當(dāng)?shù)慕M合，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易明確的。
可以分批或連續(xù)方法固定酶到支持物上。例如，通過將緩沖的酶溶液與活化的支持物混合數(shù)小時而進(jìn)行分批法。然后利用簡單過濾技術(shù)收集固定化的酶。通過固態(tài)支持物的大小測定顆粒保留尺寸。對于IPS-400，使用具有約20微米至約30微米的顆粒保留尺寸的過濾器。高速回收可施加真空，然而支持物不應(yīng)被干燥。
此外，可在顆粒保留尺寸足以保持固態(tài)支持物的過濾器上收集活化的支持物。然后使緩沖的酶溶液通過支持物。將過濾的酶母液重復(fù)地通過過濾器以使酶的固定最大化。在連續(xù)法中，可使固態(tài)支持物成為漿，并且倒入層析柱?；厥蘸?，用水沖洗固定化的酶以去除任何雜質(zhì)或未結(jié)合的酶。優(yōu)選地，固定化的酶的效價為至少約40U。
使ddA與ADA反應(yīng)然后將固定化的ADA與ddA溶液混合以獲得ddI。ddA至ddI的反應(yīng)期間產(chǎn)生氨。由于ddA是在比現(xiàn)有技術(shù)更濃的濃縮溶液中加入酶中，混合物中的氨副產(chǎn)物可導(dǎo)致pH升高，范圍是約9.2升至約9.5。不預(yù)期在這些條件下使用微生物的ADA或未結(jié)合的ADA可完成反應(yīng)，因?yàn)槊笇⒃谶@些升高的pH下失活。然而，使用固定于固態(tài)支持物的人類形式的ADA可減少該降解。結(jié)果，ADA保留活性，并且以比以前更快、產(chǎn)量更高的進(jìn)度進(jìn)行反應(yīng)。
進(jìn)行反應(yīng)的溫度為約20℃至約50℃。理想地，反應(yīng)是維持在約25-30℃的溫度。反應(yīng)可在更低的溫度下進(jìn)行，然而這將導(dǎo)致更長的反應(yīng)時間。在超過約50℃的溫度下進(jìn)行反應(yīng)可導(dǎo)致酶的活性受損及/或變性。
以分批或連續(xù)法添加市售的ddA(可購自Ajinomoto，Tokyo，Japan)至固定化的ADA的水溶液。可利用比ADA未經(jīng)固定化的方法中使用的濃度高得多的ddA濃度進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)溶液中ddA可接受的濃度范圍為約1％至約15％。理想地，向固定化ADA中添加約4％至10％的ddA水溶液，更優(yōu)選約5-6％ddA的水溶液。在允許反應(yīng)進(jìn)行的條件下進(jìn)行反應(yīng)，并且持續(xù)一段時間直到保留約1％或更少的ddA。
在分批法中，將ddA添加入固定化ADA在水中的懸浮液并使得反應(yīng)進(jìn)行。完全反應(yīng)應(yīng)該進(jìn)行約5至8小時。一旦完成反應(yīng)，可過濾回收固定化的ADA以便再利用，接著用水洗滌。此外，去除ddI產(chǎn)物后，母液可再利用以使產(chǎn)率最大化。
在連續(xù)法中，可將ddA溶液加入固定化ADA裝填的柱。理想地，高度與直徑比為大約6，但該比例并不重要。以一定的速率和時間加入ddA溶液，以便保留約1％或更少的ddA。完全反應(yīng)應(yīng)該進(jìn)行約120小時。流速取決于柱的尺寸、ddA的濃度、以及反應(yīng)的溫度。此外，可使用連續(xù)法，其中經(jīng)由裝填的柱使ddA溶液再循環(huán)。以一定的速率和時間再循環(huán)ddA溶液，以便保留約1％或更少的ddA。流速取決于柱的尺寸、ddA的濃度、以及反應(yīng)的溫度。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，引入ddA溶液的速率的選擇是容易明確的。
回收ddIddA反應(yīng)至ddI后，ddI在高pH值(＞8)下是以銨鹽的形式存在于溶液。在回收步驟中，從溶液移除ddI。這是通過將ddI從溶液結(jié)晶出來而完成的?？衫煤唵握麴s方法去除反應(yīng)的副產(chǎn)品氨，并且產(chǎn)生游離酸形式的ddI。蒸餾可依序地進(jìn)行，第一次蒸餾使溶液的濃度為約10-12％(基于起始ddA)，接著添加水并且進(jìn)一步蒸餾直到濃度再一次到達(dá)約10-12％并且ddI漿的pH低于大約8。然后可冷卻懸浮液至約0-5℃并且保持至少一個小時。
此ddI可過濾并且用丙酮洗滌濾餅。然后可在例如真空、約45-50℃下干燥固體至恒重。理想地，保留反應(yīng)母液以便再利用于分批或連續(xù)法中，將ddA反應(yīng)至ddI。此外，亦可再利用水洗滌。
無任何再循環(huán)可以獲得約82％的產(chǎn)率。然而，當(dāng)再循環(huán)反應(yīng)母液時，產(chǎn)率可增加至約96-99％。產(chǎn)生的ddI純度大于99％。
下列實(shí)施例旨在顯示本發(fā)明的實(shí)施，并不旨在限制本發(fā)明的范圍。除非特別說明，所有百分比是重量/體積。
在此引入在發(fā)明背景、詳細(xì)描述、附圖
簡述、以及實(shí)施例內(nèi)引用的各文件(包括專利、專利申請案、期刊、摘要、實(shí)驗(yàn)手冊、書籍、Genebank編號、SWISS-PROT編號、或其它公開內(nèi)容)的完整公開內(nèi)容作為參考。進(jìn)一步，在此引入提交的序列表紙件和它的對應(yīng)的計(jì)算機(jī)可讀形式的全文作為參考。
實(shí)施例1制備人類腺苷脫氨酶(ADA)基因轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌用限制酶BspHI和BamHI消化大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pBMS2000，并且在0.7％瓊脂糖凝膠上分級分離。從凝膠中切出相當(dāng)于4.5Kb的片段、洗脫、經(jīng)乙醇沉淀濃縮。用限制酶Nco I和BamHI從含有編碼人類ADA基因的質(zhì)粒切出合成的人類ADA DNA。將含有合成的人類ADA基因的Ncol-Bam HI片段與經(jīng)限制酶BspHI和BamHI消化獲得的pBMS2000的4.5Kb片段連接。將連接的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主BL21中。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到補(bǔ)充了30微克硫酸新霉素的Lauria培養(yǎng)液瓊脂平板。在某些菌落上進(jìn)行限制酶分析與SDS-PAGE分析。選擇一個具有正確的限制分析以及酶活性的菌落進(jìn)行分析。
實(shí)施例2含有合成的人類腺苷脫氨酶基因的重組大腸桿菌的發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配方接種培養(yǎng)基(每100毫升)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(每升)

補(bǔ)料培養(yǎng)基(每升)

PH對照-堿

PH對照-酸

A.制備接種母液將0.2毫升解凍的重組大腸桿菌接種到含有100毫升上述接種培養(yǎng)基的500毫升Erlenmeyer燒瓶中。在旋轉(zhuǎn)式孵育箱中300rpm、28℃下振蕩燒瓶24小時，以制備接種物。
B.發(fā)酵將50毫升的接種物接種到具有1升工作體積的5升發(fā)酵器。操作條件是溫度28℃，1000rpm攪拌；1vvm的通氣；記錄溶解氧(DO)設(shè)置并且確定為100％；pH用NH4OH以及磷酸控制為pH6.8-7.22升的補(bǔ)料培養(yǎng)基如下制備。6小時后起始Ramp補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為5毫升/小時，以1.2ml/小時/小時增加。細(xì)胞在監(jiān)測下生長24小時。根據(jù)需要調(diào)整空氣流動、補(bǔ)料速率、以及溫度，以控制DO大于或等于起始設(shè)置的20％。然后將培養(yǎng)溫度減低至16℃。接種后16-18小時，用異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)細(xì)胞至80微克/毫升的終濃度。在600納米的光密度是20-30。監(jiān)測以及補(bǔ)料總共持續(xù)40-48小時或直到補(bǔ)料用盡。培養(yǎng)液含有84單位/毫升的溶液。(1單位(U)＝37℃下，1微摩爾脫氨的ddA/分鐘)。
實(shí)施例3從重組大腸桿菌發(fā)酵物中分離并固定人類ADA將10升的發(fā)酵培養(yǎng)液通過微型流化床(M-110Y型，可購自Microfluidics，Newton，MA)。操作壓力是12,000-20,000psi直到至少90％的活性自細(xì)胞釋放出來。通過取出部分微流化的培養(yǎng)液、離心樣品、并且測量上清液部分的活性而測量活性。上清液活性量代表釋放出的活性量。通常須要通過微流化床一次。
于10L充分?jǐn)嚢璧奈⒘骰呐囵B(yǎng)液中添加1.5千克的CELITE(最終濃度15％w/v)。然后加入0.30L的10％水溶性聚乙烯亞胺(PEI)(最終濃度0.3％v/v)。攪拌至少30分鐘然后過濾去除不溶物。濾餅用3.0-4.0L的水洗滌。
澄清的濾液經(jīng)由30,000 MWCO過濾盒(Pellicon 2單位，聚醚砜低蛋白質(zhì)結(jié)合盒，0.5m2過濾區(qū)，可購自Millipore，Bedford，MA)超濾至最終酶效價為650-750U/毫升。樣品經(jīng)1.25L的50mM磷酸鹽緩沖液pH7.3-7.6稀釋(至酶活性為250-350U/毫升)。
于550克IPS-400蛋白質(zhì)固定支持物中加入2.75升的2.5％戊二醛。在室溫下輕柔攪拌2小時并且傾析或過濾到尺寸60目的濾器上。活化的支持物用4升水洗滌10次。
于稀釋的酶溶液(約0.95L)中加入1.10千克活化的IPS-400固定支持物，在20-25℃下輕柔地攪拌2小時。在具有有效的孔徑足以保留固定支持物的濾器收集固定化的酶，并且用5倍體積的水洗滌。
此外，在自來水中使IPS-400成為漿，并且在裝有具有20至30微米粒度保留(等級604或415)的快速流動濾紙的Buchner漏斗上收集。施加真空以去除過量的水，但不干燥支持物。將稀釋的酶加入樹脂中，施加真空(20″Hg)并且收集母液。停止真空，對母液取樣(通過#1)測量活性，然后添加回支持物中，再度施加真空。在重復(fù)四次，總共通過IPS-400五次。通過第5次后，在樹脂中加入1.5L水并且施加真空以洗滌固定化的酶。
作為另一種替代，在自來水中使IPS-400成為漿，并且倒入層析柱。靜置流化床，然后使水通過柱(向上流動)以沖洗支持物。稀釋的酶溶液經(jīng)由泵通過柱(1至25mI/分鐘)。添加酶后，向柱上泵入1.5L的水以洗滌固定化的酶。
固定化的酶分析顯示酶活性約為100U/克。(1單位＝37℃下，1微摩爾脫氨的ddA/分鐘)。
實(shí)施例4利用重組的人類ADA固定的酶從ddA制備ddI(分批)在30℃下于1900毫升的水中加入100.0克ddA(亦可使用來自前面的步驟的母液)。加入ddA后(不需要完全的溶解)，加入4000U固定化的重組人類腺苷脫氨酶。攪拌下將反應(yīng)維持在30℃。當(dāng)殘留ddA的水平少于或等于1％的最初添加的ddA量時反應(yīng)完成(大約5-8小時)。經(jīng)過濾(20-30微米介質(zhì))移除酶固體并且用100毫升水洗滌酶濾餅。在0-5℃下維持使用的酶為濕濾餅(多至72小時)并且可再循環(huán)至另一批。經(jīng)由CUNO過濾墊(0.4至1微米)，然后經(jīng)由0.2微米過濾介質(zhì)過濾ddI溶液。
實(shí)施例5利用重組的人類ADA固定的酶從ddA制備ddI(連續(xù)柱)以380U固定化的重組人類腺苷脫氨酶，用水對柱子(h/d比＝6)進(jìn)行漿裝填。用30mM的NH4OH洗滌柱至pH9.5，然后用水洗滌至pH6.5-7.5。維持溫度于20℃下，使4％的ddA水溶液通過柱，速率為7.2毫升/分鐘，進(jìn)行120小時。柱流出物的pH是9.2-9.5并且含有＞99％ddI，殘留＜1％的ddA。在最終分離前，產(chǎn)生的ddI溶液經(jīng)由CUNO墊和0.2微米濾器過濾。
實(shí)施例6利用重組的人類ADA固定的酶從ddA制備ddI(再循環(huán)柱)以1000U固定化的重組人類腺苷脫氨酶，用水對柱子(h/d比＝2.7)進(jìn)行漿裝填。在30℃下于裝有機(jī)械攪拌器的3-頸圓底燒瓶中將25.0克的ddA溶于475毫升的水(或來自前面批次的母液，用水稀釋至475毫升)。在30℃下將ddA溶液以約50毫升/分鐘通過酶柱而循環(huán)(根據(jù)需要，循環(huán)速度可變化)。
當(dāng)通過HPLC分析出殘留ddA少于或等于1％的最初添加的ddA量時，反應(yīng)是完全的(大約3-9.5小時)。然后用25毫升的水洗滌柱并且可以維持在0-5℃(多至72小時)，以便再利用。在最終分離前，產(chǎn)生的ddI溶液經(jīng)由CUNO墊和0.2微米濾器過濾。
實(shí)施例7分離ddI在真空、內(nèi)部批次溫度20-40℃下蒸餾ddI溶液。當(dāng)ddI的濃度到達(dá)起始ddA的10-12％w/v時停止蒸餾。此時的pH一般是8.1-8.3。加入額外的水，然后繼續(xù)蒸餾直到濃度再一次到達(dá)10-12％，并且ddI漿的pH小于8(典型地7.8-7.9)。將ddI懸浮液冷卻至0-5℃并且維持至少1小時。過濾此冷漿并且用0-5℃的水洗滌濾餅?？杀３帜敢阂约八礈?，以便在另一批中再循環(huán)。
濾餅用0-5℃丙酮洗滌。在真空、45-50℃下干燥固體至恒重。在母液再循環(huán)情況下，預(yù)期第一輪的產(chǎn)率為約82％，隨后的四輪以后的產(chǎn)率為96-99％(總體＞96％)。產(chǎn)生的ddI純度大于99％。
比較實(shí)施例1比較大腸桿菌ADA和重組的人類固定化ADA的活性將來自重組大腸桿菌的微生物ADA部分純化及分離為硫酸銨懸浮液。離心大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液(42U ADA/毫升，2升)，收集細(xì)胞沉淀物并且用1升100mM的磷酸鹽緩沖液pH7.5洗滌。再一次離心細(xì)胞并且重新懸浮于2升的補(bǔ)充20％甘油的上述緩沖液。細(xì)胞通過微型流化床一次。經(jīng)離心移除細(xì)胞碎片，將產(chǎn)生的上清液經(jīng)30,000 MWCO盒超濾濃縮。酶濃縮至最終效價390U/毫升。加入硫酸銨至50％飽和，產(chǎn)生的沉淀經(jīng)離心收集并且重新懸浮于100毫升去離子水。漿的最終效價是740U/毫升；漿的蛋白質(zhì)含量是約75毫克/毫升。
下表描述利用上述的微生物腺苷脫氨酶與利用按照實(shí)施例4的一般程序獲得的重組的人類ADA固定化的酶，導(dǎo)致52-60克/升的ddA水溶液轉(zhuǎn)化至ddI。從表2的結(jié)果可以看出，重組的人類固定化酶比微生物的酶顯著更穩(wěn)定，并且允許在較少單位的酶和短時間內(nèi)完成反應(yīng)。
表2-比較大腸桿菌與重組的人類ADA的ddA產(chǎn)量

因此，盡管描述的是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其它和進(jìn)一步的實(shí)施方案、修改和改進(jìn)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且權(quán)利要求的范圍中包括所述進(jìn)一步的實(shí)施方案、修改和改進(jìn)。
序列表<110>Skonezny，Paul M.
Politino，MichaelLiu，Suo-WinAlfred，BoyleChen，JasonStein，GregoryFranceschini，ThomasAnderson，Wendy<120>利用腺苷脫氨酶制備雙脫氧肌苷的方法<130>GYolll pCT<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>363<212>pRT<213>人<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(363)<223>gi 14043373<400>1Met Ala Gln Thr Pro Ala phe Asp Lys Pro Lys Val Glu Leu His Val1 5 10 15His Leu Asp Gly Ser Ile Lys Pro Glu Thr Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg20 25 30Arg Arg Gly Ile Ala Leu Pro Ala Asn Thr Ala Glu Gly Leu Leu Asn35 40 45Val Ile Gly Met Asp Lys Pro Leu Thr Leu Pro Asp Phe Leu Ala Lys50 55 60Phe Asp Tyr Tyr Met Pro Ala Ile Ala Gly Cys Arg Glu Ala Ile Lys65 70 75 80Arg Ile Ala Tyr Glu Phe Val Glu Met Lys Ala Lys Glu Gly Val Val85 90 95Tyr Val Glu Val Arg Tyr Ser Pro His Leu Leu Ala Asn Ser Lys Val
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<221>misc_feature<223>gi 14043372<400>2ggcacgaggc gtggccggcc gcggccaccg ctggccccag ggaaagccga gcggccaccg60agccggcaga gacccaccga gcggcggcgg agggagcagc gccggggcgc acgagggcac 120catggcccag acgcccgcct tcgacaagcc caaagtagaa ctgcatgtcc acctagacgg 180atccatcaag cctgaaacca tcttatacta tggcaggagg agagggatcg ccctcccagc 240taacacagca gaggggctgc tgaacgtcat tggcatggac aagccgctca cccttccaga 300cttcctggcc aagtttgact actacatgcc tgctatcgcg ggctgccggg aggctatcaa 360aaggatcgcc tatgagtttg tagagatgaa ggccaaagag ggcgtggtgt atgtggaggt 420gcggtacagt ccgcacctgc tggccaactc caaagtggag ccaatcccct ggaaccaggc 480tgaaggggac ctcaccccag acgaggtggt ggccctagtg ggccagggcc tgcaggaggg 540ggagcgagac ttcggggtca aggcccggtc catcctgtgc tgcatgcgcc accagcccaa 600ctggtccccc aaggtggtgg agctgtgtaa gaagtaccag cagcagaccg tggtagccat 660tgacctggct ggagatgaga ccatcccagg aagcagcctc ttgcctggac atgtccaggc 720ctaccaggag gctgtgaaga gcggcattca ccgtactgtc cacgccgggg aggtgggctc 780ggccgaagta gtaaaagagg ctgtggacat actcaagaca gagcggctgg gacacggcta 840ccacaccctg gaagaccagg ccctttataa caggctgcgg caggaaaaca tgcacttcga 900gatctgcccc tggtccagct acctcactgg tgcctggaag ccggacacgg agcatgcagt 960cattcggctc aaaaatgacc aggctaacta ctcgctcaac acagatgacc cgctcatctt 1020caagtccacc ctggacactg attaccagat gaccaaacgg gacatgggct ttactgaaga 1080
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<223>gi 14043372的序列變體<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>NCO I 限制位點(diǎn)<220>
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1.一種制備2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)的方法，其包含以下步驟(a)獲得表達(dá)ddA脫氨酶活性的酶；(b)將此酶固定至不溶的支持物上；(c)于產(chǎn)生ddI溶液的時間內(nèi)和條件下使酶與雙脫氧腺苷(ddA)溶液接觸，所述雙脫氧腺苷溶液的濃度至少為在水中的約1％重量體積；及(d)從ddI溶液分離ddI。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中接觸步驟中的ddA溶液為約2％至約10％重量體積的ddA水溶液。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中接觸步驟中pH是約8.0至約9.5。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中在接觸步驟中基本上所有的ddI抵抗從ddI溶液中沉淀出來。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中不溶的支持物經(jīng)官能化以允許酶與其附著。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中使用活化劑使酶附著在該不溶的支持物上。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中該酶是人類腺苷脫氨酶(ADA)。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中ADA的氨基酸序列是SEQ ID NO1或其保守變體。
9.如權(quán)利要求7的方法，其中ADA由具有SEQ ID NO2、3或其保守變體的核苷酸編碼。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中獲得步驟包括在轉(zhuǎn)化的生物體內(nèi)表達(dá)人類腺苷脫氨酶(ADA)或其保守變體，并從該生物體分離ADA。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中轉(zhuǎn)化的生物體是大腸桿菌。
12.如權(quán)利要求10的方法，其中不溶的支持物經(jīng)官能化以允許酶與其附著。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中使用活化劑使酶附著在該不溶的支持物上。
14.如權(quán)利要求10的方法，其中固定于該不溶的支持物上的酶的活性為至少約40U/克。
15.如權(quán)利要求10的方法，其中接觸步驟中pH為約7.5至約9.5。
16.如權(quán)利要求10的方法，其中該接觸步驟是利用裝填的柱進(jìn)行的連續(xù)方法。
17.如權(quán)利要求10的方法，其中接觸步驟中ddA溶液是約4％至約15％重量體積的ddA水溶液。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中該ddA溶液是約5％至約8％重量體積的ddA水溶液。
19.如權(quán)利要求10的方法，其中分離步驟包括依序地蒸餾ddI溶液并且添加水直到獲得水性母液中的ddI漿且pH低于大約8。
20.如權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包含以下步驟(a)分離步驟后保留反應(yīng)母液；及(b)使用此反應(yīng)母液重復(fù)接觸步驟至少一次以制備ddA溶液；及(c)重復(fù)此分離步驟至少一次。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中此分離步驟的產(chǎn)率為至少約96％ddI，ddI純度為至少約99％。
全文摘要
一種制備雙脫氧肌苷(ddI)的方法，包括以下的步驟(a)獲得表達(dá)ddA脫氨酶活性的酶；(b)將酶固定到不溶的支持物上；(c)于產(chǎn)生ddI溶液的時間內(nèi)和條件下使酶與雙脫氧腺苷(ddA)溶液接觸，所述雙脫氧腺苷溶液的濃度至少為在水中的約4％重量體積；以及(d)從ddI溶液中分離ddI。任選地，將產(chǎn)生的ddI母液再利用于后續(xù)的程序中以改良產(chǎn)率。
文檔編號C07H19/167GK1954080SQ200480005868
公開日2007年4月25日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者P·M·斯科內(nèi)茲尼, M·波利蒂諾, S·W·劉, A·W·博伊爾, J·G·陳, G·L·斯泰因, T·弗蘭西施尼, W·L·安德遜 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司