專利名稱：一種多肽——人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶－21.34和含有這個多肽成分的藥學化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物領域，描述了一種純的具有生物活性的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34，和具有這個人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶的藥學化合物。
肌苷三磷酸(ITP)與脫氧肌苷三磷酸(dITP)廣泛的存在生物體的各種細胞中。肌苷三磷酸及脫氧肌苷三磷酸通常由嘌呤生物合成代謝的化合物肌苷酸經(jīng)焦磷酸化或分步磷酸化形成。肌苷酸是嘌呤類化合物合成的重要代謝物質(zhì)，亦是生物體內(nèi)重要能量代謝物質(zhì)AMP和GMP合成的重要前體。由此可知，肌苷三磷酸在體內(nèi)的合成及代謝異常將導致體內(nèi)相關能量代謝途徑的異常，進而引發(fā)各種相關的能量代謝及物質(zhì)代謝紊亂性疾病。
肌苷三磷酸焦磷酸水解酶亦是生物體內(nèi)一種常見的水解酶，其在體內(nèi)催化肌苷三磷酸及脫氧肌苷三磷酸的水解反應，使之分解為肌苷二磷酸及肌苷酸。該酶的突變或表達異常同樣將導致體內(nèi)相關能量及物質(zhì)代謝途徑的異常，進而引發(fā)各種相關的疾病。
本發(fā)明的多肽是一種新的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶，通過酶活性分析實驗證實該酶在體內(nèi)催化肌苷三磷酸及脫氧肌苷三磷酸水解為肌苷酸及磷酸，且其作用活性強弱與鎂離子的存在與否及PH值的大小直接相關，而對其他的嘌呤核苷酸三磷酸底物催化活性很低。由此可知，其是一種新的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。其突變或表達異常將導致體內(nèi)相關能量及物質(zhì)代謝途徑的異常，進而引發(fā)各種相關的疾病。
由于如上所述人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34蛋白在調(diào)節(jié)細胞分裂和胚胎發(fā)育等機體重要功能中起重要作用，這種蛋白可能構成開發(fā)疾病診斷和/或治療藥的基礎。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供純化人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供了針對本發(fā)明多肽——人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供診斷治療與人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34異常相關的疾病的方法。
本發(fā)明也涉及一種藥物組合物，它含有本發(fā)明多肽或其模擬物、激活劑、拮抗劑或抑制劑以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸在制備用于治療發(fā)育紊亂，畸胎，腫瘤，感染及神經(jīng)系統(tǒng)障礙或其它由于人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34表達異常所引起疾病的藥物的用途。
本發(fā)明涉及懸浮液的濃縮物，按照本發(fā)明在給藥前不久將該濃縮物轉(zhuǎn)變成浮懸制劑。
這些濃縮物可以具有各種組成。本發(fā)明也包括濃縮液和/或懸浮劑與稀釋所需要的溶劑或溶液之間的進一步的組合，由此得到了本發(fā)明的懸浮劑。
本發(fā)明也涉及另外的表現(xiàn)形式或各種表現(xiàn)形式的結(jié)合，所有這些最終都導致了本發(fā)明的注射液。
本說明書和權利要求書中使用的下列術語除非特別說明具有如下的含義“生物活性”是指具有天然分子的結(jié)構、調(diào)控或生物化學功能的蛋白質(zhì)。類似地，術語“免疫學活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動物或細胞中誘導特定免疫反應以及與特異性抗體結(jié)合的能力。
“拮抗劑”或“抑制物”是指當與人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34結(jié)合時，一種可封閉或調(diào)節(jié)人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的生物學活性或免疫學活性的分子。拮抗劑和抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的分子。
“激動劑”是指當與人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34結(jié)合時，一種可引起該蛋白質(zhì)改變從而調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)活性的分子。激動劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的分子。
本發(fā)明純化步驟的順序是陽離子交換，親和層析，超濾，凝膠滲透(加上回收組分的超濾)和陰離子交換。
在此純化方法后，用的都是傳統(tǒng)技術。為了儲藏或處理的目的，產(chǎn)物就應該被凍干。其它對于影響產(chǎn)物濃縮、穩(wěn)定或其它過程的合適的步驟已經(jīng)成熟。
可以將本發(fā)明的酶及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34可以以水和/或油注射劑加應用，或作為與某種酸或堿形成的鹽來使用。以前藥的形式，例如酯，加以應用也是可能的。
作為注射用時，除了水外，肌肉注射的水懸浮液也可以含有液體賦形劑，例如，乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、三甘醇。各種物質(zhì)的緩沖溶液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、抗壞血酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸和乳酸鹽的緩沖液均可用于調(diào)節(jié)PH值使之盡量在生理范圍之內(nèi)(大約PH7.4)或作為緩沖之用。本發(fā)明水溶液制劑的PH為4.5-8.5，最好是6.5-7.5。水懸浮液的同滲重摩(osmolality)是200-900mosmol/kg，最好是260-390mosmol/kg，而且可通過加入氯化鈉、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、甘露糖醇、蔗糖、木糖醇或這些物質(zhì)的混合物，來調(diào)節(jié)到一個適當?shù)牡葷B條件。
此外，還可以應用一些其他的配方試劑，例如增調(diào)劑(如甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、明膠等)，吸附劑，光的遮蔽劑，吸附抑制劑，結(jié)晶阻滯劑，絡合劑(如，NaEDTA、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽以及其他鹽)抗氧化劑(抗壞血酸、亞硫酸鹽化合物、L-半胱氨酸、亞硫基二丙酸、硫羥乳酸、單疏代甘油、酸丙酯(propyl gall-ate)等)，防腐劑(PHB酯、酚及其衍生物、有機汞化合物、氯丁醇、苯甲醇、乙醇、1，3-丁二醇、benzalkonium chlorideChlorhexidline salts、苯甲酸及其鹽、山梨酸及其他)。如果合適的話，局部麻醉劑，比如像普魯卡因鹽酸鹽、利多卡因鹽酸鹽諸如此類，可以加進水懸浮液中。
在制備水懸浮液時，必須保顆粒的大小在0.5-150μm。特別為4-40μm?？梢酝ㄟ^控制混合活性物質(zhì)的不同大小顆粒來實現(xiàn)活性物質(zhì)自肌內(nèi)懸浮庫的控制釋放。
對于水懸浮液的情形，90％顆粒的大小最好在10-20μm。水懸浮液的粘勵5-500mPa·s，最好是10-130mPa·s。
人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的水懸浮液可以采用不同的方法制備。一種方法是將某種促旋酶抑制劑活性化合物以微粒形式加進水賦形介質(zhì)中，當然包括已經(jīng)提及的輔助劑；采用這種工藝時，應該嚴格保證不能使結(jié)晶的生長超出上述界限。在某些情況下，活性化合物必須先制作成它的一種穩(wěn)定的水合物的形式，然后再進一步加工成一種懸浮液。如果最后滅菌不宜用加熱法的話，那么好必須在無菌條件下進行，使用的活性化合物和輔料要經(jīng)過預處理。最后，采用輻射滅菌方式是可行的。
人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的水懸浮液還可以通過控制從溶液中沉淀的方法加以制備。例如，將活性化合物溶解某種生理上可耐受的酸中是可行的。這些酸包括鹽酸、甲磺酸、丙酸、琥珀酸、戊二酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、谷氨酸、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、抗壞血酸、磷酸、己二酸、羥乙酸、硫酸、硝酸、乙酸、蘋果酸、L-天冬氨酸、乳酸、羥乙磺酸、乳糖酸和草酸或者各種氨基酸，如L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨、L-谷氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸和L-絲氨酸，如果需要可以緩慢溫熱至20-80℃通常使用的酸是過量的，例如，根據(jù)歐洲專利申請86114131.5和84110474.8的規(guī)定。然后，加人一種生理上可以耐受的堿溶液來調(diào)節(jié)PH至7(生理PH)，堿溶液有如氫氧化鈉、氫氧化鉀或麥格魯明(meglumine)，最后活性化合物從溶液中沉淀出來。另一方面，也可以將人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34活性化合物溶解在前述一種堿的堿性介質(zhì)，然后前述的一種酸將其沉淀出來。
然而，酸和堿溶液可以在不加壓情況合并，也可以加壓，壓力范圍為2到100巴。通過限定條件來控制懸浮液中形成顆粒大小是可能的。實際的沉淀操作也可以使用高速攪拌器，旋轉(zhuǎn)—固定均化器，高壓均化器(100-1000巴)和其他類似方法以助于均化作用。如果因為可能使顆粒長大而不能在最后滅菌，可以在無菌條件下制備懸浮液，即將預先滅菌并在另一種嚴格滅菌條件下進行無菌過濾的酸和堿的組分在無菌條件下混合。有時可以應用前述的防腐劑或其結(jié)合物，加入一適當?shù)膭┝恳员o菌制作。最后的滅菌也可以應用了γ-射線滅菌的方式。
另外，還有一種形式可以提供，即這種制劑含有的活性化合物是干的，沒有液體賦形劑。分裝的液體賦形劑只是在給藥前臨時與處方中的固體組分相混合，在這種情況下必須充分振搖以保證固體顆粒在液相中的均勻分布。
在上述和下面討論的各種肌肉汪射制劑中，油性基質(zhì)含有水溶性、結(jié)晶或無定形的活性化合物，例如以鹽酸鹽乳酸鹽、菜酸鹽、對一甲苯磺酸鹽或其他與生理耐受性好的酸所形成的鹽，基于油性基質(zhì)的肌肉注射液還可含有表面活性物質(zhì)，例如呈大豆卵磷脂、雞蛋卵磷脂、腦卵磷脂或油菜卵磷脂形式的各種卵磷脂或其他生理耐受性好的表面活性劑，其濃度為0.1-30％，特別是0.2-10％，尤其是5.5-5.5％W/V，油性基質(zhì)的肌內(nèi)注射劑除了含有活性化合物的水溶性鹽以外，還含有過量的生理上可耐受的酸，如乳酸或檸檬酸，其范圍為1-300mmol/L，特別是5-50mmol/L，最好是10-30mmol/L。這種油性基質(zhì)的肌內(nèi)注射劑是本發(fā)明最特別的目的。
人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的油質(zhì)懸浮液所含活性化合物是以內(nèi)鹽的形式或水溶性鹽的形式存在。
油質(zhì)懸浮液可以含有非水賦形劑，諸如杏仁油、花生油、橄欖油、罌粟子油、芝麻油、棉子油、豆油、玉米油、蓖麻油、油酸乙酯、油酸油酯、十四烷酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、中等鏈長的三甘油酯等。
可以與所提及的物質(zhì)合并使用的其它賦形劑還有乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、1，3-丁二醇、苯甲醇、各種來源的二乙二醇和三乙二醇、Pluronic類型的聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚體、聚氧脫水山梨醇脂肪酸酯、脫水山梨醇脂肪酸酯、甘油-油酸酯、Cremophor EL、imwitor742以及不同種類的卵磷脂諸如大豆卵磷脂、雞蛋卵磷脂、腦卵磷脂和油菜卵磷脂等。
用來作為抗氧劑的有a-、p-、Y-和6-維生素E、棕櫚酸抗壞血酸脂、硬脂酸抗壞血酸酯、L-半胱氨酸、亞硫基二丙酸、硫羥乳酸、巰基乙酸、甲硫代甘油、酸丙酯、丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯及其他。
有時，某種要求粘度可以加人像乙醇或苯甲醇稀釋劑和象硬脂酸鋁增稠劑來獲得。由于吸附的增加，所以可以加入某些酸。油懸浮劑的粘度值為5-500mPa·S，最好是10-15Pa·s油懸浮劑的制備是通過將油性賦性劑同其中所包含的輔料和活性化合物相混合來進行，活性化合物已事先用適當?shù)膬x器粉碎成所希望順粒大小(參見前面)并將混合物勻化。90％的顆粒大小為0.5-150μm。最好時4-12μm。如果因為活性化合物的顆粒大小可能發(fā)生變化而不能在釋放容器中進行最后滅菌的話，那么懸浮劑必須在無菌條件下制作。同時也指明了含有適當?shù)娜芙獾妮o料的油相的無菌過濾方法，例如通過加熱處理對活性化合物進行滅菌預處理。最后的滅菌也可以應用Y-射線滅菌 除了作好的懸浮劑以外，還可以提供一種在給藥前不久進行制作的新鮮的制劑。在這種情況下，活性化合物必須在一個短時間內(nèi)在振搖裝有制劑的容器時，能夠均勻的懸浮在液體賦性劑中。
用于裝載懸浮液、活性化合物、溶劑和其他的表現(xiàn)形式如懸浮液濃縮物的容器可以用玻璃或塑料制作。此處容器的材質(zhì)可以含有某些物質(zhì)，這些物質(zhì)對于內(nèi)容物可以起著特殊的保護作用，比如避光或與氧隔絕。對小體積容器，其中的懸浮液在給藥之前必須被抽進注射器之中，在此，也可以把這些容器做成注射系統(tǒng)。
本發(fā)明的各種注射劑均被應用于人體或動物體的治療。
下面給出一些疾病的例子，能夠用本發(fā)明的化合物預防、緩解或治愈的各種疾病(包括但不限于)發(fā)育紊亂癥如脊柱裂、顱腦裂、無腦畸形、腦膨出、孔腦畸形、先天性腦積水、導水管畸形、軟骨發(fā)育不全性侏儒病、脊柱骨骺發(fā)育不良癥、生殖腺發(fā)育不全、尿道上裂、隱睪、先天性青光眼或白內(nèi)障、先天性小瞼裂、視網(wǎng)膜發(fā)育異常、先天性視神經(jīng)萎縮、裂手裂腳癥、畸胎、Williams綜合癥、Alagille綜合癥、貝魏二氏綜合癥等；腫瘤如基底上皮腫瘤、鱗形上皮腫瘤、粘液性腫瘤、纖維瘤、脂肪瘤、軟骨瘤、血管瘤、淋巴瘤、造血組織腫瘤、神經(jīng)瘤、腺瘤等；感染如癤，癰，傷口化膿，肺炎，腦膜炎，心內(nèi)膜炎，假膜性腸炎，敗血癥，燙傷樣皮膚綜合癥，毒性休克綜合癥，流感，麻疹，麻疹性支氣管炎，肺炎，中耳炎，亞急性硬化姓全腦炎，流行性腮腺炎，腦膜炎，胰腺炎，小兒喘息性細支氣管炎，風疹等；神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂如感覺障礙包括抑制性感覺障礙(感覺缺失、感覺減退)，刺激性感覺障礙(感覺過敏、感覺異常、疼痛)等，運動障礙包括中樞性癱瘓(單癱、偏癱、截癱)，周圍性癱瘓等，植物神經(jīng)(交感和副交感)功能紊亂如心律失常、腸麻痹、膽絞痛、雷諾病、肺水腫等下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1為分離的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。21kDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α，細菌形成cDNA文庫。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆ITPA的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結(jié)果表明，ITPA克隆所含的全長cDNA為1085bp(如Seq ID NO1所示)，從第105bp至689bp有一個585bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如Seq IDNO2所示)。我們將此克隆命名為pBS-ITPA，編碼的蛋白質(zhì)命名為人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。實施例2用RT-PCR方法克隆編碼人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的基因用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增Primer15’-CCTGGCCGGAAACTGAGCCGTTCA-3’ (SEQ ID NO3)Primer25’-TTTTTTTTTTTTTCGGAACAGATA-3’ (SEQ ID NO4)Primer1為位于SEQ ID NO1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為SEQ ID NO1的中的3’端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時同時設β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO1所示的1-1085bp完全相同。實施例3重組人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的體外表達、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer35’-CCCCATATGATGGCGGCCTCATTGGTGGGGAAG-3’(Seq ID No5)Primer45’-CATGGATCCTCAAGCTGCCAAACTGCCAAAGTA-3’(Seq ID No6)此兩段引物的5’端分別含有NdeI和BamHI酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NdeI和BamHI酶切位點相應于表達載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-ITPA質(zhì)粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-ITPA質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 2min，共25個循環(huán)。用NdeI和BamHI分別對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-ITPA)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(NoVagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-ITPA)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進行層析，得到了純化的目的蛋白人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在21kDa處得到一單一的條帶(圖1)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實施例4根據(jù)本發(fā)明純化人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34準備或調(diào)整發(fā)酵物的濃縮液(centrat)，或其它任何來源(如血清)的不純的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34溶液以便用陽離子交換基質(zhì)進行層析，同時防止人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的多聚化(通過加入正率酸)和蛋白酶活性(通過加熱或選擇不含損害水平的蛋白酶的酵母)。優(yōu)選地是加入辛酸鈉(色譜溶液13(CS13)-表2)至終濃度1-10mM，例如約5mM以穩(wěn)定人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。用乙酸(CS09)調(diào)pH至4.3-4.8，優(yōu)選地為4.5±0.1最優(yōu)選地為±0.05)，電導率檢測應小于5.5smScm-1。
來源于某些宿主菌株或種的培養(yǎng)物上清含有在后續(xù)過程中能降解重組人人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的蛋白酶。這種情況下；這種蛋白酶的活性可通過對含有重組人人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的培養(yǎng)物上清加熱處理以破壞。通常1-10mM辛酸鈉足以防止重組人的蛋白的熱變性，在60-80℃的溫度下30秒至10分鐘足以使蛋白酶失活。隨后；上清可進一步如前所述地調(diào)節(jié)。如果不存在蛋白酶的降解作用，優(yōu)選地省略熱處理。
層析所有的操作均可在室溫下(20±0℃)進行。層析柱中人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的上樣量(g人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34/L基質(zhì))取決于用SDS-PAGE(在SP-FF柱的情況下)或GP-HPLC(對所有其它柱)確定的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34滴度(g/L)。每一步驟的過程可用連機的紫外吸收，如在254或280nm測定來監(jiān)測。
第一步純化步驟中陽離子基質(zhì)的使用使大部分從酵母發(fā)酵中得到低分子量有色物質(zhì)直接通過柱子，而那些與基質(zhì)結(jié)合的也是弱的結(jié)合且能用諸如1M氯化鈉的高離子強度的鹽洗滌液去除。因此；不象陰離子基質(zhì)，其不可逆地吸附那類物質(zhì)；陽離子基質(zhì)可再生并用于純化中第一步的層析的多次循環(huán)。因而，這一步驟形成了耐用的商品化的層析方法的基礎。
在本實施例中應用Cibacron藍型柱作為第一步純化對于特異地用于去除一種由于其物理化學特征；如大小和等電點而難以從人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34中去除的45KDa的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34片段是新穎的。該片段令人吃驚地比全長的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34能更強地與染料結(jié)合，因而可將它們分離。
人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34純化中所用的層析液詳細列于表1中。因為在人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34純化中大量使用，并且相對廉價，這種緩沖鹽溶液因其工業(yè)上可提供高純度的形式和與其它通常用于緩沖液的如TriS、HEPES或MOPS相比廉價而最適于本方法。其它的緩沖液可代替表2中所列，如相近pKa值的緩沖液(如蘋果酸對乙酸)，但在大多數(shù)情況下，價錢如在大范圍的適用性排除了他們的應用。其它的鹽形式的使用取決于其可溶性，可工業(yè)上提供及低價格。然而，在CS06和CS10柱中包含四硼酸鹽離子有特殊的益處因為其在與大分子的碳水化合物部分復合和使其與基質(zhì)中的陰離子基團緊密結(jié)合起特別的作用。這一結(jié)果可以增加洗脫液中人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的純度。
層析可使用軸流式柱(axial flow columns)，如由Pharmacia提供的那種，或輻流式柱(radial flow columns)，如由Sepragen提供的那種。在本實施例中，所用的柱子都是軸流式。
緩沖溶液可按下述濃度扼配制；或者配制濃縮的貯存液，使用時即時混和或稀釋。
表1 用于純化實施例中的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的層析溶液
陽離子交換層析人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34是用陽離子交換層析，從至少是酵母蛋白(如果人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34是來源于酵母發(fā)酵的重組人人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34)和其它抗原，低分子量雜質(zhì)和色素化合物中純化和濃縮。本方法采用的是商品化的陽離子交換基質(zhì)，如SP-瓊脂糖FF，SP-多孔微球硅膠(Spenerosil)，CM-瓊脂糖FF，CM-纖維素，SE-纖維素或S-葡聚糖凝膠。優(yōu)選的基質(zhì)是SP-瓊脂糖FF(Pharmacia)床高5-25cm，優(yōu)選地為10-15cm，本實施例為12.scm，柱的上樣量為10至50g人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34/L基質(zhì)；優(yōu)選地為40±10g人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34/L基質(zhì)?；|(zhì)以緩沖液平衡以去除堿性貯存液，緩沖液優(yōu)選地應具足夠的緩沖能力以降低ph至約pH6.0、如CS01的緩沖液用于去除柱中的CS07貯存液；然而，任何PH小10于6.0的緩沖液都可使用。當柱流出液的PH值約6對時，即可判斷為平衡完成。
調(diào)整的濃縮液(centrate)以一定的流率加入層析柱，例如以1.0-8.0cm/min；優(yōu)選地為4.0-7.0cm/min，本實施例為6.36cm/min，然后以一種溶液洗滌柱子以去除殘留的雜質(zhì)。這種洗滌溶液應為PH＜6.0并且電導率15低于5mScm-1’；優(yōu)選地低于3mScm-1以防人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34被洗脫。合適的溶液是CS01。前面的步驟都以6.36cm/min的流率進行；對于洗脫和所有隨后的步驟流率降至0.5-5cm/min，優(yōu)選地為2.0-4.0c./min。本實施例為3.18cm/min，以減少洗脫的體積、增加離子強度將有效地洗脫人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34；使用電導率范圍在5-10mscm-1的溶液，優(yōu)選地為6-8mscm-1，本實施例使用CS02。當紫外吸收信號上升至1.0A280/cm以上時開始收集人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34，直至紫外吸收信號降至0.6A280/Cm或收集的最大體積達65倍柱體積時為止。層析柱然后用CS03和04清洗，貯藏于CS07。
親和層析這一步進一步純化人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34，以去除45KDa人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34N-末端片段，酵母抗原(如果人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34是來源于酵母發(fā)酵的重組人人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34)和色素。親和基質(zhì)可包括任何型的結(jié)合人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34CibacronO藍染料，如活性藍2，Procion藍HB，藍瓊脂糖，藍丙烯?；推渌祯突衔?。該基質(zhì)優(yōu)選地是下述的“Delta藍瓊脂糖”基質(zhì)。這可降低基質(zhì)產(chǎn)生藍浸出液的程度和增強基質(zhì)的堿穩(wěn)定性以有助于洗滌和去熱原。和商品化的基質(zhì)相比，進一步改進的基質(zhì)是在染料(活性藍2)和基質(zhì)之間引入一間隔基團，1，4-二氨基丁烷。這對于人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34純品的洗脫而言；間隔基團的長度是合適的。
活性藍結(jié)構中鄰位，間位或?qū)ξ划悩嬻w或任何其混合物都可使用。優(yōu)選的異構體是鄰位SO3型，但難以制備理想的純度，故使用間位異構體。氨丁酞一活性藍2的制備達到用分析型高效液相色譜測定至少整個峰區(qū)占98％的純度。還可通過使用粗的商品化的染料，其必須純化氨丁酰衍生的染料，或使用純的合成的染料。在后一種方法中，開始用的染料物質(zhì)應在分析型高效液相色譜280nm測定純度至少為98％。這種材料由ACL，Isle ofMan提供。通過加熱混和物至60℃，使活性藍2與1，4-二氨基丁烷在水中反應，然后以混合物中純化修飾的染料，如通過沉淀。然后氨丁酰一活性藍2與基質(zhì)偶合，例如與3-氯-1-2-環(huán)氧丙烷活化的瓊脂糖CL-6B(Pharmacia，瑞典)偶合。見Porath等(1971)色譜雜志(J.Chromatog)60，167-177。這種Delta藍瓊脂糖(DBA)基質(zhì)的染料的含量優(yōu)選地是50±5mmol/g干重。
藍基質(zhì)的使用。本方法使用DBA；床高10-30cm，優(yōu)選地為20-30cm(本實施例為25Cm，柱的上樣量為7.14g重組人人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34/L基質(zhì)；優(yōu)選地為8-12g/L(本實施例為10±1g人肌苷三磷酸焦當2-9％細層析柱體積，優(yōu)選地為5-8％，本實施例為柱體積的7.5％。人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34組分分三部分收集棄去最初小量的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34二聚體直至A280/Cm上升至指針滿偏(FSD)的10％；這時開始連續(xù)收集回收的組分直至達滿偏的90％；然后所收集的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34作為初級產(chǎn)品組分。這一連續(xù)收集直至A280降至5％滿偏值之下，之后的流出液再直接棄去。回收初級產(chǎn)品組分分開收集。重復這一步驟直至所有原料上樣至層析柱。
S-200HR回收超濾一種標稱截流分子量等于或小于30,000，或如本實施例所用的10,000的纖維素型濾膜置于超濾裝置中，用以濃縮匯集的回收組分至保留濃度為20-120g/L人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34；優(yōu)選地為80-110g/L。使用后的濾膜按中間體超濾中所述方法處理。
另一種選擇是，在本方法的任何超濾步驟中，標稱截流分子量30.000的聚醚楓或PVDF膜可代替纖維素型的濾膜。這種膜由Amicon和Millipore提供。最好選用適宜NaOH貯存和清洗的濾膜。
S-200HR回收超濾保留物的純化從回收超濾所得的保留物上樣至和初級S-200純化同樣的層析柱，從每個峰收集產(chǎn)物組分；然后與前面收集的大量的初級產(chǎn)物組分混和。重復這一步驟直至所有的原料上樣至層析柱。
陰離子交換層析這一步的目的是純化人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34以去除至少酵母抗原(如果人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34是來源自酵母發(fā)酵的重組人人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34)和含色素的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。本方法使用的陰離子交換基質(zhì)，如QMA-多孔微球硅膠(SPherosil)，DEAE-SPherodex，Q-Hvper D，DEAE-纖維素，QAE-纖維素或W-DMAE或DEAE分級凝膠(Fractogel優(yōu)選地?；|(zhì)用商品化的陰離子交換基質(zhì)二乙氨基乙基瓊脂糖凝膠-FF(DEAESepharose-FF)(Phannacia)，床高在5-25cm范圍內(nèi)根據(jù)方便選擇，優(yōu)磷酸水解酶-21.34/L基質(zhì))。所有步驟以0.3-2.cm/min的流率進行，優(yōu)選地為1.-2.0Cm/min。本實施例中為153cm/min。DBA在來源自CS07的CS01中平衡；當柱中流出液的ph約為9.5時，平衡完成。層析之前；SP-FF的洗脫液用氨調(diào)節(jié)…約為8.5-9.5，優(yōu)選地PH9.0，然后上樣至層析柱。上樣完畢后；層析柱以1-5倍體積的電導率10-30mScm-1；優(yōu)選地是15-25mSm-1的緩沖液洗滌以去除雜質(zhì)，例如用CS12，優(yōu)選地以5倍體積。人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34用電導率大于100mScm-1，優(yōu)選地為125-165mScm-1的高離子強度的緩沖液洗脫，例如用CS03。當紫外信號(A280/cm)升至高于0.4對時開始收集洗脫液，在信號再次低于0.4時停止。層析柱再用CS04洗滌并貯存于CS07。
中間體超濾這一步為進行凝膠滲透層析而濃縮人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。超濾裝置中的纖維素型濾膜(最小分子量截留低于或相當于30,000，例如10,000)用于濃縮DBA洗脫液以保持人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34濃度20-120g/L，優(yōu)選地為80-100g/L。使用后，濾膜以水或表3中的CS03或CS05沖洗去殘留的蛋白質(zhì)，并以0.1M的氫氧化鈉清洗。濾膜可貯存于20mM的氫氧化鈉中。凝膠滲透層析。這一步純化人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34是針對酵母蛋白(如果人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34是來源于酵母發(fā)醇的重組人人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34)，色素和二聚化的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34并進行緩沖液交換的步驟。本方法使用商品化的凝膠滲透基質(zhì)，如交聯(lián)葡聚糖凝膠G100；G150，G250，Sephacryl S-100，S-200或S-300，Toyopearl HW50S或瓊脂糖凝膠6或12。優(yōu)選地，基質(zhì)為SePhacryl-200HR(Pharmacia)凝膠床高度大于60cm，最好在90cm(3×30cm)。層折柱在CS05中平衡并以0.1-1.5cm/min，優(yōu)選地為0.5-1.0cm/min的流率進行層析，在本實施倒流率為0.75cm/min；然后當層析柱的ph達到9.5時，將中間體超濾所得的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34上樣至層析柱。上樣體積約相選地為10-15cm，如12.scm，柱的上樣量為每升基質(zhì)10-60g，優(yōu)選地為35±15g/L基質(zhì)。層析柱首先以強的緩沖液平衡將pH迅速降至工作范圍，如pH4.5-6.0，優(yōu)選地為約出5.5的乙酸鈉，以CS11為例。使用濃的緩沖液之后，在加S200洗脫液于柱子之前，用一種低電導率，即范圍在1-4mSm-1。優(yōu)選地為2.5-3.5mSm-1。例如CS08的溶液平衡層析柱。所用的線性流率為1.0-8.0cm/min，優(yōu)選地為3.0-7.0cm/min，本實施例為4.4cm/min。上樣完畢后，層析柱以5-30mM范圍，優(yōu)選地是15-25mM的四硼酸鈉溶液洗滌，例如用CS10。這導致洗脫人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34組分之前，任何含碳水化合物的雜質(zhì)更強地粘附在層折柱上。用任何范圍在10-20mScm-1的高離子強度的溶液可有效地洗脫，優(yōu)選地用CS06。當A280/cm達到0.4時開始連續(xù)收集洗脫液直至吸收峰降至0.8以下。
因此，在本實施例中；純化步驟的順序是陽離子交換，親和層析，超濾，凝膠滲透(加上回收組分的超濾)和陰離子交換。
實施例6 藥劑的配制本發(fā)明獲得含有人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的制劑后。既然該物質(zhì)在凍干后仍具有活性，可適合制成注射劑。
用生理鹽水和/或其他合適的稀釋液配制含有人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34凍干粉的注射液。
一些賦形劑可作為藥物的組成部分，諸如甘露醇、乳糖、糖膠、葡萄糖、蔗糖及其他混合物。其他的一些載體、填充物及諸如此類可以使用。混合物亦可。
根據(jù)本發(fā)明，實驗中乳糖被作為注射藥的賦形劑。
在制備注射劑中，PH值通過常規(guī)酸或堿調(diào)定。酸包括醋酸等。堿包括氫氧化鈉等?；旌衔镆嗫?。
還需要一種或多種穩(wěn)定劑比如白蛋白等。
制備每20000安瓿含75國際單位人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34，制法如下適量的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34凍干粉末溶于700ml冷水中，如必須，可用醋酸或氫氧化鈉(視情況而定)，將PH值調(diào)至6.2-6.8。然后通過0.2微米的小孔過濾器過濾消毒。200克乳糖溶于2立升冷水中，注射用，如上法過濾消毒后加入人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34溶液中。將冷水加至15立升，然后將溶液等分至0.75ml/安瓿，并在消毒凍干器凍干。這樣所得的安瓿含有75國際單位人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34和10ml乳糖。
每安瓿含有150國際單位人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34是首選劑量。
根據(jù)進一步的配制實例，每安瓿還需含有1mg人白蛋白作為賦形劑乳糖的穩(wěn)定劑。
這些特例對本發(fā)明進行了描述，但可以理解此外在本發(fā)明的所及范圍內(nèi)還有許多可變性。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34-21.34名及其編碼序列，以及含有其成分的藥學化合物(iii)序列數(shù)目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1085bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11 CCTGGCCGGAAACTGAGCCGTTCACTTCCGCCACCAGCCGGAAGTTTTCTGTCACTGGAC61 GCCAAGGAGTTTTCGGTGGCTCAGCTGGGTAACCGGGGATCACCATGGCGGCCTCATTGG121 TGGGGAAGAAGATCGTGTTTGTAACGGGGAACGCCAAGAAGCTGGAGGAGGTCGTTCAGA181 TTCTAGGAGATAAGTTTCCACGCACTTTGGTGGCACAGAAAATTGACCTGCCGGAGTACC241 AGGGGGAGCCGGATGAGATTTCCATACAGAAATGTCAGGAGGCAGTTCGCCAGGTACAGG301 GGCCCGTGCTGGTTGAGGACACTTGTCTGTGCTTCAATGCCCTTGGAGGGCTCCCCGGCC361 CCTACATAAAGTGGTTTCTGGAGAAGTTAAAGCCTGAAGGTCTCCACCAGCTCCTGGCCG421 GGTTCGAGGACAAGTCAGCCTATGCGCTCTGCACGTTTGCACTCAGCACCGGGGACCCAA481 GCCAGCCCGTGCGCCTGTTCAGGGGCCGGACCTCGGGCCGGATCGTGGCACCCAGAGGCT541 GCCAGGACTTTGGCTGGGACCCCTGCTTTCAGCCTGATGGATATGAGCAGACGTACGCAG601 AGATGCCTAAGGCGGAGAAGAACGCTGTCTCCCATCGCTTCCGGGCCCTGCTGGAGCTGC661 AGGAGTACTTTGGCAGTTTGGCAGCTTGACTTCTGCAGCTGGAGGAGGCCCCTCAGGCCG721 GGGATCTGGGGAGGGCTAGCCCAAAACCTCCCGCATCGGGCAGGCACCCCCTGAAGTACT781 TCCTTCAGGGTTTCCCCTTTGTGAGGGTGTCAAGTAGCCTCACCGGCCTGTCTGGAGGAG841 CAGCTGGCTCTGCTCTGAGAAACTCTGGCAAGTGGACGCCATTCTCTTGCCCTTAGGATT901 CACTGCTCTCTCCTACAGCCGCCAGGCCTGGGGTCCTGAAAGGACCTTGGGTGGTAAAGC961 TGTACTTGGTGGGAGTGAGGGCGTGGGGAGGAACCATGCAAATCGCCTTCCATGGTTTTT1021 AAATGCAGTAAATAACATTTCTGGATGAGACTTGTTTCCAAAATAAACCAGCTATATCTG1081 TTCCGAAAAAAAAAAAAA(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度194個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO21 Met Ala Ala Ser Leu Val Gly Lys Lys Ile Val Phe Val Thr Gly16 Asn Ala Lys Lys Leu Glu Glu Val Val Gln Ile Leu Gly Asp Lys31 Phe Pro Arg Thr Leu Val Ala Gln Lys Ile Asp Leu Pro Glu Tyr46 Gln Gly Glu Pro Asp Glu Ile Ser Ile Gln Lys Cys Gln Glu Ala61 Val Arg Gln Val Gln Gly Pro Val Leu Val Glu Asp Thr Cys Leu76 Cys Phe Asn Ala Leu Gly Gly Leu Pro Gly Pro Tyr Ile Lys Trp91 Phe Leu Glu Lys Leu Lys Pro Glu Gly Leu His Gln Leu Leu Ala106 Gly Phe Glu Asp Lys Ser Ala Tyr Ala Leu Cys Thr Phe Ala Leu121 Ser Thr Gly Asp Pro Ser Gln Pro Val Arg Leu Phe Arg Gly Arg136 Thr Ser Gly Arg Ile Val Ala Pro Arg Gly Cys Gln Asp Phe Gly151 Trp Asp Pro Cys Phe Gln Pro Asp Gly Tyr Glu Gln Thr Tyr Ala166 Glu Met Pro Lys Ala Glu Lys Asn Ala Val Ser His Arg Phe Arg181 Ala Leu Leu Glu Leu Gln Glu Tyr Phe Gly Ser Leu Ala Ala(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CCTGGCCGGAAACTGAGCCGTTCA(5)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4TTTTTTTTTTTTTCGGAACAGATA(6)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CCCCATATGATGGCGGCCTCATTGGTGGGGAAG(7)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CATGGATCCTCAAGCTGCCAAACTGCCAAAGTA
權利要求
1.一種分離的多肽-人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34，其特征在于它包含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如權利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
4.如權利要求1所述的多肽，在每毫克凍干粉末中含有大概6200國際單位人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的這樣規(guī)格下，具有特有的活性。
5.與權利要求1所述的多肽相關的能夠進行治療的藥學化合物，和藥學上的賦形體。
6.如權利要求5所述的藥學化合物，它的賦形體是乳糖。
7.如權利要求5所述的藥學化合物，它的一個計量單位中含有75個國際單位的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。
8.如權利要求1所述的多肽，在每毫克凍干粉末中含有6200國際單位人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的這樣規(guī)格下，具有特有的活性。
9.人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34的肌內(nèi)注射劑，其中含有0.05-70％的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34，適當時，可作為與酸和堿形成的鹽或作為前藥，制劑形式為水性或油性懸浮液。
10.根據(jù)權利要求9的肌內(nèi)注射劑在于人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34顆粒的大小為0.5-150μm，最好為4-40μm。
11.根據(jù)權利要求9的肌內(nèi)注射劑的其特征在于它們的同滲重摩(osmolality)是200-900 m osmol/kg，最好是260-390 m osmol/kg。
12.根據(jù)權利要求9、10、11的肌內(nèi)注射劑，其特征是它們含有2.5-50％(重量)的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶-21.34。
13.根據(jù)權利要求9的肌內(nèi)注射劑在治療人體和動物體方法的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多肽－人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶－21.34以及含有這個多肽成分的藥學化合物。本發(fā)明還公開了此多肽用于治療多種疾病的方法,如發(fā)育紊亂,畸胎,腫瘤,感染及神經(jīng)系統(tǒng)障礙等。本發(fā)明還公開了編碼這種新的人肌苷三磷酸焦磷酸水解酶－21.34的多核苷酸的用途。
文檔編號A61K38/43GK1382796SQ0111277
公開日2002年12月4日 申請日期2001年4月26日 優(yōu)先權日2001年4月26日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博德基因開發(fā)有限公司