一種一步均相d-二聚體檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種一步均相D?二聚體檢測(cè)試劑盒及其在檢測(cè)D?二聚體含量中的應(yīng)用，所述試劑盒包括：(1)抗D?二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液；(2)抗D?二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試液；以及能夠接收和發(fā)射光的反應(yīng)孔。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有操作方便、檢測(cè)快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，并且特異性強(qiáng)。將其應(yīng)用于高凝狀態(tài)和血栓性疾病的監(jiān)測(cè)，可以提高高凝狀態(tài)和血栓性疾病的準(zhǔn)確率。
【專利說(shuō)明】
一種一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維蛋白溶解系統(tǒng)是人體最重要的抗凝系統(tǒng)。在纖溶過(guò)程中，凝血酶在水解纖維 蛋白原后，即相繼釋放出纖維蛋白肽(A和B)，剩余的可溶性纖維蛋白單體，在因子Ma作用 下，形成穩(wěn)定的交聯(lián)纖維蛋白，交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶的降解過(guò)程中，釋放的碎片進(jìn)一步降 解為最小片段D-二聚體。在病理狀態(tài)下，凝血與纖溶的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，凝血傾向增強(qiáng)， 從而纖維蛋白降解產(chǎn)物增加，導(dǎo)致D-二聚體含量增加。D-二聚體水平的增高，表明體內(nèi)有纖 維蛋白血栓形成和纖溶發(fā)生，所以臨床上可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子指標(biāo)。
[0003] D-二聚體來(lái)源于纖溶酶溶解的交聯(lián)纖維蛋白凝塊。凝血系統(tǒng)激活使凝血酶作用于 纖維蛋白原，將其轉(zhuǎn)變成纖維蛋白單體(α、β、γ )2即D-E-D結(jié)構(gòu)，并有規(guī)則連接為可溶性纖 維蛋白單體聚合體(SFMC)。后者進(jìn)一步在Ca2+與Xma作用下，單體間發(fā)生α鏈與γ鏈交聯(lián) (D-D交聯(lián))形成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白聚合體。交聯(lián)纖維蛋白的生成又激活纖溶酶溶解系 統(tǒng)。纖維蛋白溶解系統(tǒng)由纖溶酶原、纖溶酶原激活劑、纖溶酶溶解酶、纖溶酶溶解酶抑制物4 個(gè)主要部分組成。當(dāng)纖維蛋白凝結(jié)塊形成時(shí)，在組織型纖溶酶溶解酶原激活物存在的條件 下，纖溶酶溶解酶原激活轉(zhuǎn)化為纖溶酶溶解酶，纖維蛋白溶解過(guò)程開始，纖溶酶溶解酶降解 纖維蛋白凝結(jié)塊形成各種可溶片段(X'、Y'、D、E等碎片）』-二聚體是通過(guò)γ鏈相連的2個(gè)D 碎片連接起來(lái)的片段(00、0乂0、00/^、￥乂0等復(fù)合物），是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物。
[0004] D-二聚體在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用的十分廣泛。有研究表明，心血管疾病由于血管壁的 損傷、血小板的激活、凝血機(jī)制的亢進(jìn)及血液狀態(tài)的變化，使循環(huán)血液中的有形成分在心臟 或血管內(nèi)形成異常凝塊，堵塞部分或全部血管腔導(dǎo)致急性心肌梗死或腦梗死，引起D-二聚 體含量升高。腦梗死D-二聚體檢測(cè)結(jié)果及陽(yáng)性率最高。有資料顯示其含量與梗死面灶的體 積及病情輕重呈明顯正相關(guān)。動(dòng)態(tài)測(cè)定血漿D-二聚體含量可作為急性腦梗死病程判斷及療 效觀察的有用指標(biāo)。對(duì)妊娠高血壓綜合征患者血漿D-二聚體的測(cè)定結(jié)果表明，妊娠高血壓 綜合征患者血漿D-二聚體高于正常晚孕婦女，而且隨病情的發(fā)展而明顯升高，故認(rèn)為D-二 聚體升高是妊娠高血壓綜合征導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)時(shí)最早出現(xiàn)的陽(yáng)性指標(biāo)。大量 臨床資料證明，惡性腫瘤存在纖溶活性亢進(jìn)，這與惡性腫瘤細(xì)胞具有高水平的纖維蛋白溶 解酶激酶有關(guān)，并可分泌大量纖維蛋白原激活物，其主要類型是尿激酶型，能導(dǎo)致局部纖維 蛋白溶解，使D-二聚體水平升高。D-二聚體含量與惡性腫瘤病情進(jìn)展有相關(guān)性。D-二聚體作 為交聯(lián)纖維蛋白的特異降解產(chǎn)物，其水平的增高反映著繼發(fā)性纖溶的增強(qiáng)，在臨床上已被 視為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。動(dòng)態(tài)觀察患者體內(nèi)的D-二聚體水平變 化，對(duì)高凝狀態(tài)和血栓性疾病的診斷及預(yù)后判斷有一定實(shí)用價(jià)值。
[0005] 目前用于檢測(cè)D-二聚體的方法主要有放射性免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)(ELISA)，膠體金免疫層析法(GICA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA) ΑΙΑ有很高的檢測(cè)靈 敏度，但由于標(biāo)記物具有放射性危害，標(biāo)記物穩(wěn)定性差，廢棄物難以處理等缺點(diǎn)，已逐漸退 出臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域;ELISA法采用辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或堿性磷 酸酶標(biāo)記抗體，并催化底物產(chǎn)生顏色變化，具有操作簡(jiǎn)單，試劑穩(wěn)定期長(zhǎng)的特點(diǎn)，但ELISA法 的檢測(cè)靈敏度較低，目前主要應(yīng)用于傳染性疾病篩查等對(duì)檢測(cè)靈敏度要求較低的項(xiàng)目； GICA具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，但也存在靈敏度低，試劑不穩(wěn)定，重復(fù)性較差，難以 進(jìn)行定量的缺點(diǎn)。CLIA具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快、高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但也存在非均相反 應(yīng)、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)際穩(wěn)定性差、批內(nèi)批間變異大的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：為解決上述問題，本發(fā)明利用D-二聚體的抗體，以氧通道化學(xué)發(fā)光技術(shù) 為平臺(tái)，研發(fā)出一種針對(duì)高凝狀態(tài)和血栓性疾病診斷的D-二聚體快速檢測(cè)試劑。使其與現(xiàn) 有檢測(cè)試劑相比，具有操作方便、檢測(cè)快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn);將其應(yīng)用于高凝狀 態(tài)和血栓性疾病的監(jiān)測(cè)，可以提高高凝狀態(tài)和血栓性疾病的準(zhǔn)確率。
[0007] 技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，包括：
[0008] (1)抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液；
[0009] (2)抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試液；
[0010] (3)分析緩沖液；
[0011]以及能夠接收和發(fā)射光的反應(yīng)孔。
[0012] 作為優(yōu)選，所述抗D-二聚體抗體為針對(duì)D-二聚體不同表位的單克隆抗體或多克隆 抗體，其可通過(guò)常規(guī)免疫學(xué)方法獲得。
[0013] 所述發(fā)光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基、氨基等，發(fā)光微球帶有發(fā)光化合物和鑭 系元素化合物的高分子。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己稀)或Thioxene(二甲基噻 吩）的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen等，發(fā)光微球大小 為100-300nm，該微球可由市場(chǎng)購(gòu)得，如鉑金埃爾默公司。
[0014] 所述感光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基、氨基等，感光微球帶有光激發(fā)產(chǎn)生單線 態(tài)氧的染料，如酞箐染料、葉綠素等，感光微球大小為100_300nm，該微球可由市場(chǎng)購(gòu)得，如 鉑金埃爾默公司。
[0015]所述抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球，其中發(fā)光微球與抗D-二聚體抗體的質(zhì)量比 為(1-100): 1;所述抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液的濃度為10-200μg/ml。
[0016]所述抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球，其中感光微球與抗D-二聚體抗體的質(zhì)量比 為(1-100): 1;所述抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試液的濃度為10-200μg/ml。
[0017]所述反應(yīng)孔為微孔板、微流控試劑盤、反應(yīng)杯或反應(yīng)管等。
[0018] 所述分析緩沖液的制備，包括如下步驟：將HETOS 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml加入蒸餾水溶解后，制成分析緩沖液。
[0019]所述抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液或抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試 液主要由以下步驟制成：
[0020] ⑴將抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌，抗體稀釋到 lmg/ml備用；取發(fā)光微球或者感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除 上清；
[0021 ] (2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球或感光微球中，重懸；
[0022] (3)加入 10%Tween20;
[0023] (4)加入400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足；
[0024] (5)37 Γ震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)；
[0025] (6)封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液，加到反應(yīng)體系中；
[0026] (7)37°C 震蕩反應(yīng)；
[0027] (8)離心，去除上清；
[0028] (9)加入Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0029] (10)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0030] 本發(fā)明還提供了所述一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)D-二聚體含量中的應(yīng) 用。
[0031] 其中，檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0032] (1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液和抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試液，混合反應(yīng)5-60分鐘；
[0033] (2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值；
[0034] (3)繪制D-二聚體濃度與光信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用步驟(2)測(cè)得的光信號(hào)值，通 過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算D-二聚體含量。
[0035] 技術(shù)效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有操作方便、檢測(cè)快速、靈敏度高、準(zhǔn) 確性好等優(yōu)點(diǎn)，并且特異性強(qiáng)。將其應(yīng)用于高凝狀態(tài)和血栓性疾病的監(jiān)測(cè)，可以提高高凝狀 態(tài)和血栓性疾病的準(zhǔn)確率。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是本發(fā)明D-二聚體氧通道化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒原理示意圖；
[0037] 圖2是本發(fā)明D-二聚體氧通道化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線性范圍圖；
[0038] 圖3是本發(fā)明試劑盒與羅氏D-二聚體試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0039]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0040]實(shí)施例1試劑盒
[0041 ]實(shí)驗(yàn)中原料來(lái)源及試劑配方：
[0042]
[0043]
[0044] -、抗D_二聚體抗體偶聯(lián)發(fā)光微球，以醛基發(fā)光微球?yàn)槔?br>[0045] 1)將0 . lmg抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6 次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。取lmg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離 心，去除上清。
[0046] 2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球(購(gòu)自鉑金埃爾默公司）中，重懸。
[0047] 3)加入 1·25μ1 10%Tween20〇
[0048] 4)加入10μ1 400mMNaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μ1。
[0049] 5)37°C震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)。
[0050] 6)封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液。加10μ1 CM0溶液到反應(yīng)體系中。
[0051] 7) 37 Γ震蕩反應(yīng)1小時(shí)。
[0052] 8)離心，去除上清。
[0053] 9)加入200ylTris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清。重復(fù)一次。
[0054] 10)最后一次離心后用200μ1 PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微 球，終濃度0.5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0055]二、抗D-二聚體抗體偶聯(lián)感光微球，以醛基感光微球?yàn)槔?br>[0056] 1)將0 . lmg抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6 次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。取lmg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離 心，去除上清。
[0057] 2)將抗體溶液加入到感光微球(購(gòu)自鉑金埃爾默公司）中，重懸。
[0058] 3)加入 2·5μ1 10%Tween20〇
[0059] 4)加入10μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μ1。
[0060] 5 )37 °C震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)。
[0061 ] 6)封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液。加10μ1 CM0溶液到反應(yīng)體系中。
[0062] 7)37Γ震蕩反應(yīng)1小時(shí)。
[0063] 8)離心，去除上清。
[0064] 9)加入200ylTris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清。重復(fù)一次。
[0065] 10)最后一次離心后用200μ1 PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微 球，終濃度0.5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0066]三、試劑盒的制備：
[0067]按所述用量量取各個(gè)組分：
[0068]
[0069] 加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4,水補(bǔ)足到100ml，制成分析緩沖液。
[0070] 1)使用分析緩沖液稀釋偶聯(lián)D-二聚體抗體的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml;
[0071 ] 2)使用分析緩沖液稀釋偶聯(lián)D-二聚體抗體的感光微球濃度為10-200μg/ml。
[0072]實(shí)施例2試劑盒的應(yīng)用 [0073]試劑盒使用方法，包括如下步驟：
[0074] 1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球和抗D-二聚體 抗體偶聯(lián)的感光微球，混合反應(yīng)5-60分鐘；
[0075] 2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。
[0076]此試劑盒的反應(yīng)孔可以是微孔板、微流控試劑盤、反應(yīng)杯、反應(yīng)管等。
[0077]本發(fā)明試劑盒方法學(xué)評(píng)價(jià)：
[0078] 1.線性
[0079] 配制濃度為Ong/ml，100ng/ml，500ng/ml，2500ng/ml，10000ng/ml，50000ng/ml， lOOOOOng/ml的D-二聚體標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在反應(yīng)孔中分別加入5μ1標(biāo)準(zhǔn)品、加入20μ1偶聯(lián)抗D-二聚體抗體的發(fā)光微球(終濃度l〇μg/ml)，加入20μ1偶聯(lián)抗D-二聚體抗體的感光微球(終濃 度lOμg/ml)，室溫暗處溫育15分鐘。溫育后，激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲 得光信號(hào)值。
[0080] 如上用本發(fā)明所制備的D-二聚體含量檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，繪制各檢測(cè)試劑 盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見附圖2)。從附圖2可以看出本發(fā)明所制備的檢測(cè)試劑盒能保持良好的線 性，D-二聚體濃度為100000ng/mL時(shí)方法無(wú) Hook效應(yīng)。
[0081 ] 2.準(zhǔn)確度
[0082] 準(zhǔn)確性測(cè)量是指用已知量D-二聚體標(biāo)準(zhǔn)品加入到正常人的血清標(biāo)本中，測(cè)量加入 后濃度值與加入的理論值進(jìn)行比較，計(jì)算D-二聚體的回收率。檢測(cè)結(jié)果如下：
[0083]
[0084] 3.精密度
[0085] 選取3份不同濃度的標(biāo)本，分別按照本發(fā)明所述的方法重復(fù)測(cè)量20次。根據(jù)20次的 測(cè)量結(jié)果，計(jì)算平均偏差C.V. %值。
[0086]
[0087] 4.分析靈敏度
[0088] 分析靈敏度的定義為:是指在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上能與零劑量區(qū)別的量。重復(fù)20次測(cè)量 零劑量點(diǎn)，計(jì)算其平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以X+2SD的計(jì)算的濃度值即為該試劑盒的分析 靈敏度。本發(fā)明試劑盒的分析靈敏度為1 〇ng/m 1。
[0089] 5.特異性
[0090] 檢測(cè)本發(fā)明的氧通道化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑在干擾性物質(zhì)(溶血、高血脂、高膽紅 素)存在的情況下檢測(cè)標(biāo)本的準(zhǔn)確性。將血紅蛋白溶液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的D-二聚體陽(yáng)性血清標(biāo)本中，使血清中血紅蛋白的含量分別為lmg/ml、0.5mg/ml。將甘油三酯溶 液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的D-二聚體陽(yáng)性血清標(biāo)本中，使血清中甘油三酯的含量 分別為lmg/mL、0.5mg/ml。將膽紅素溶液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的D-二聚體陽(yáng)性血 清標(biāo)本中，使血清中膽紅素的含量分別為50ng/ml、25ng/ml。對(duì)加入了血紅蛋白、甘油三酯 和膽紅素的D-二聚體陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，在反應(yīng)孔中每孔分別加入5μ1含加入了血紅蛋白、 甘油三酯和膽紅素的D-二聚體陽(yáng)性標(biāo)本，加入20μ1偶聯(lián)抗D-二聚體抗體的發(fā)光微球(終濃 度l〇μg/ml)，加入20μ1偶聯(lián)抗D-二聚體抗體的感光微球(終濃度10μg/ml)，室溫暗處溫育15 分鐘。溫育后，激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。將理論濃度與實(shí) 測(cè)濃度的比值作為回收率，回收率在97.05%-105.23%之間。表明D-二聚體氧通道化學(xué)發(fā) 光試劑在檢測(cè)血清樣本時(shí)不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。
[0091]
[0092] 6.相關(guān)性
[0093] 如圖3所示，與Roche(羅氏）D-二聚體化學(xué)發(fā)光試劑盒的相關(guān)性為：y = 0.9994x+ 151.5，R2 = 0.9986
[0094] 本發(fā)明與現(xiàn)有方法和產(chǎn)品相比，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好、成本較低，對(duì)檢測(cè) 儀器要求低的優(yōu)點(diǎn)。
[0095] 本發(fā)明的原理(見附圖1)是通過(guò)在均相條件下將偶聯(lián)了抗D-二聚體抗體的帶有酞 菁染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且?guī)в袖B螯合物、偶聯(lián)了抗D-二聚 體抗體的發(fā)光微球2混合。此時(shí)偶聯(lián)了抗D-二聚體抗體感光微球1和偶聯(lián)了抗D-二聚體抗體 的發(fā)光微球2迅速有效地識(shí)別檢測(cè)樣本3的目標(biāo)分子而形成免疫夾心復(fù)合物。在激光(波長(zhǎng) 為680nm)的照射下，感光微球上的光敏劑將周圍環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單線態(tài) 氧。單線態(tài)氧擴(kuò)散至發(fā)光微球，與其上的化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，進(jìn)一步激活了同樣在發(fā)光微球上 的熒光基團(tuán)，使之發(fā)出熒光，波長(zhǎng)為615nm。單線態(tài)氧的半衰期為4ys，在溶液中的擴(kuò)散距離 為200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，單線態(tài)氧無(wú)法擴(kuò)散到發(fā)光微球，則不會(huì)有熒 光信號(hào)產(chǎn)生。
[0096] 實(shí)施例3
[0097] 與實(shí)施例1基本相同，不同之處僅在于所用發(fā)光微球?yàn)轸然l(fā)光微球，所用感光微 球?yàn)轸然泄馕⑶颍?br>[0098]經(jīng)過(guò)實(shí)施例2方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，其線性、準(zhǔn)確度、精密度、分析靈敏度、特異性和相 關(guān)性與實(shí)施例1結(jié)果基本相同。
[0099] 實(shí)施例4
[0100] 與實(shí)施例1基本相同，不同之處僅在于所用發(fā)光微球?yàn)榘被l(fā)光微球，所用感光微 球?yàn)榘被泄馕⑶颍?br>[0101] 經(jīng)過(guò)實(shí)施例2方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，其線性、準(zhǔn)確度、精密度、分析靈敏度、特異性和相 關(guān)性與實(shí)施例1結(jié)果基本相同。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括： (1) 抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液； (2) 抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試液； (3) 分析緩沖液； 以及能夠接收和發(fā)射光的反應(yīng)孔。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗D-二聚體 抗體為針對(duì)D-二聚體不同表位的單克隆抗體或多克隆抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光微球表 面活性基團(tuán)為醛基、羧基或氨基，發(fā)光微球帶有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子，發(fā) 光微球大小為100-300nm;所述感光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基或氨基，感光微球帶有 光激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧的染料，感光微球大小為100-300nm。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光化合物 為二氧雜環(huán)己烯或二甲基噻吩的衍生物，鑭系元素化合物為Eu(TTA) 3/TOPO或Eu(TTA)3/ Phen;所述染料為酞箐染料或葉綠素。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗D-二聚體 抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球，其中發(fā)光微球與抗D-二聚體抗體的質(zhì)量比為（1-100) :1;所述抗D-二 聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液的濃度為10-200μg/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗D-二聚體 抗體偶聯(lián)的感光微球，其中感光微球與抗D-二聚體抗體的質(zhì)量比為（1-100): 1;所述抗D-二 聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試液的濃度為10-200μg/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)孔為微 孔板、微流控試劑盤、反應(yīng)杯或反應(yīng)管；所述分析緩沖液的制備，包括如下步驟:將HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml加入蒸餾水溶 解后，制成分析緩沖液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗D-二聚體 抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液或抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的感光微球試液主要由以下步驟制成： (1) 將抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌，抗體稀釋到lmg/ ml備用;取發(fā)光微球或者感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清； (2) 將抗體溶液加入到發(fā)光微球或感光微球中，重懸； (3) 加入 10%Tween20; (4) 加入400mM NaCNBH3，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足； (5) 37°C震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)； (6) 封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CMO溶液，加到反應(yīng)體系中； (7) 37°C震蕩反應(yīng)； (8) 尚心，去除上清； (9) 加入Tr i s-HCl (pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次； (10) 最后一次離心后用roS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使 用前稀釋至所需濃度。9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述一步均相D-二聚體檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)D-二聚體含量中的應(yīng) 用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測(cè)方法包括以下步驟： (1) 在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗D-二聚體抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液和抗D-二聚 體抗體偶聯(lián)的感光微球試液，混合反應(yīng)5-60分鐘； (2) 激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值； (3) 繪制D-二聚體濃度與光信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用步驟(2)測(cè)得的光信號(hào)值，通過(guò)標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算D-二聚體含量。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105974118SQ201610422173
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】李明明, 張春東, 黃寶福, 淳林
【申請(qǐng)人】南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司