專利名稱：二聚體化肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥疫苗治療，更具體地涉及肽二聚體，其可以產(chǎn)生具有誘導細胞毒 性T細胞活性的腫瘤抗原肽，還涉及含有該肽二聚體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
細胞介導的免疫，尤其細胞毒性T細胞(下文中稱作“CTL”)在腫瘤細胞或者病毒 感染的細胞的體內(nèi)排斥中起重要作用。CTLs識別來源于腫瘤抗原蛋白的抗原肽(“腫瘤抗 原肽”)和癌細胞上MHC (主要組織相容性復合體)I類抗原(人的MHC I類抗原稱為“HLA 抗原”)，并攻擊和殺死細胞。腫瘤抗原蛋白的典型實例包括Immunity，卷10 :281，1999的表中列出的那些。特 定實例包括黑素體抗原如黑素細胞組織特異性蛋白gpl00(J. Exp. Med.，179 :1005，1994)、 MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91 :3515，1994)和酪氨酸激酶(J. Exp. Med.，178 :489， 1993)，和腫瘤標記，如不同于黑素瘤的腫瘤抗原，如HER2/neu(J. Exp. Med.，181 2019， 1995)、CEA (J. Natl. Cancer. Inst. ,87 :982，1995)禾口 PSA (J. Natl. Cancer. Inst. ,89 -.293, 1997)。腫瘤抗原肽是約8到11個氨基酸的肽，其可以由細胞中蛋白酶對腫瘤抗原蛋白 的細胞內(nèi)加工產(chǎn)生(Cur. Op in.，Immunol.，5 :709，1993 ； Cur. Opi, Immunol.，5 :719，1993 ； Cell,82 :13，1995 ；Immunol. Rev.，146 :167，1995)。如上文描述的，如此產(chǎn)生的腫瘤抗原肽 作為與MHC I類抗原(HLA抗原)的復合體呈遞在細胞表面并被CTLs識別。因此，為了開 發(fā)利用CTLs破壞腫瘤細胞的癌癥免疫治療劑(癌癥疫苗)，非常重要的是鑒定腫瘤抗原蛋 白中的腫瘤抗原肽，所述肽能夠有效誘導CTLs。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供可以體內(nèi)使用的來源于腫瘤抗原肽的新的腫瘤抗原。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)證明為腫瘤抗原肽的某些肽含有半胱氨酸殘基并且由這 些肽組成的二聚體當施用時令人驚奇地表現(xiàn)出相當于單體的誘導CTLs的活性(“CTL-誘 導活性”)，從而建立了本發(fā)明。從而，本發(fā)明包括下面的內(nèi)容。(1)肽二聚體，其中由包括至少一個半胱氨酸殘基的7-30個氨基酸組成并且能夠 產(chǎn)生具有CTL-誘導活性的腫瘤抗原肽的兩種肽單體每一種相互通過二硫鍵結(jié)合。(2)根據(jù)上面(1)的肽二聚體，其可以產(chǎn)生具有CTL-誘導活性的腫瘤抗原肽。(3)根據(jù)上面(1)或(2)的肽二聚體，其中兩種肽單體通過一個或兩個二硫鍵結(jié)
1=1 o
3
(4)根據(jù)上面(1)到(3)任一項的肽二聚體，其中肽單體來源于腫瘤抑制基因的表 達產(chǎn)物WT1。(5)根據(jù)上面⑴到⑷任一項的肽二聚體，其中肽單體如下Cys Xaa Thr Trp Asn Gin Met Asn Xaa (SEQ ID NO 72)其中2位的Xaa為選自Tyr、Phe、Met和Trp的氨基酸殘基；9位Xaa為選自Phe、Leu、lie、Trp和Met的氨基酸殘基。(6)根據(jù)上面(1)到⑷任一項的肽二聚體，其中肽單體選自下面的肽。
Cys Met ThrTrpAsn GinMet AsnLeu(SEQIDNO=11)
Asp Phe LysAspCys GluArg ArgPhe(SEQIDNO18)
Ala Tyr ProGlyCys AsnLys ArgTyr(SEQIDNO19)
Asn Ala ProTyrLeu ProSer CysLeu(SEQIDNO20)
Gly Cys AsnLysArg TyrPhe LysLeu(SEQIDNO21)
Arg Trp ProSerCys GinLys LysPhe(SEQIDNO22)
Asp Ser CysThrGly SerGin AlaLeu(SEQIDNO23)
Cys Tyr ThrTrpAsn GinMet AsnLeu(SEQIDNO44)
(7)含有根據(jù)上面(1)到(6)任一項的肽二二聚體與藥學上可接受的載體的藥物組合物。(8)根據(jù)上面(7)的藥物組合物，其用作癌癥疫苗。(9)根據(jù)上面(1)到(6)任一項的肽二聚體在生產(chǎn)癌癥疫苗中的應用。(10)治療或者預防癌癥的方法，其包括對需要該治療或預防的WT-1陽性患者施 用治療有效量的根據(jù)上面(1)到(6)任一項的肽二聚體。


圖1是顯示肽二聚體(SEQ ID NO 44)誘導轉(zhuǎn)基因小鼠中CTLs的圖。
具體實施例方式在本發(fā)明的肽二聚體中，兩個肽單體通過該肽單體中存在的至少一對半胱氨酸殘 基的SH基團之間的二硫鍵二聚體化。本發(fā)明的肽二聚體具有CTL誘導活性并且所誘導的CTL可以通過細胞毒性作用 或者產(chǎn)生淋巴因子發(fā)揮抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明的肽二聚體可以用作治療或者預防癌癥 (腫瘤)的癌癥疫苗。構(gòu)成本發(fā)明的肽二聚體的肽單體由含有至少一個半胱氨酸殘基的7-30個氨基酸 殘基組成，并且產(chǎn)生具有CTL誘導活性的腫瘤抗原肽。短語“產(chǎn)生腫瘤抗原肽”指肽單體具 有使腫瘤抗原肽能夠結(jié)合HLA抗原并被細胞毒性T細胞(CTL)識別的特征。任何肽單體只 要其具有CTL誘導活性都可以無限制地用于本發(fā)明；然而，優(yōu)選來源于人維耳姆斯氏瘤的 腫瘤抑制基因WT1并且含有至少一個半胱氨酸殘基的肽單體。腫瘤抑制基因WT1在多種腫 瘤中表達(Cell, 60 =509,1990 ；NCBI數(shù)據(jù)庫存取號XP_034418，SEQ ID N0:1)?；趯Σl(fā) 維耳姆斯氏瘤、無虹膜、尿生殖異常、智力障礙等的WAGR綜合征的分析，從染色體llpl3分 離出WT1基因，其作為維耳姆斯氏瘤的致病基因之一。(Nature, 343 :774，1990)。WT1的基因組DNA為約50kb，由10個外顯子組成，并且其cDNA為約3kb。從cDNA推導的氨基酸序列在 SEQID NO 1中顯示(Cell. ,60 :509，1990)。根據(jù)WT1基因在人白血病中高水平表達和通過 WT1反義寡聚體治療抑制白血病細胞的細胞生長這一事實提出WT1基因促進白血病細胞的 生長(JP-A-1-4627/1997)。然后，已經(jīng)闡明WT1基因是白血病和實體癌的新的腫瘤抗原蛋 白(J. Immunol.，164 1873-80，2000 和 J. Clin. Immunol.，20，195-202，2000)，這是根據(jù)如 下事實:WT1基因在實體癌如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺 癌、子宮癌、宮頸癌，和卵巢癌中也高水平表達(JP-A-104627/1977，W0 00/06602)。因為癌 癥免疫治療(癌癥疫苗)優(yōu)選可應用于盡可能多的癌癥患者，因此重要的是從許多類型的 癌癥中高度表達的WT1鑒定腫瘤抗原肽，和使用所得腫瘤抗原肽開發(fā)癌癥疫苗。在這點上， 由WT1蛋白質(zhì)的部分片段組成的幾種天然類型的腫瘤抗原肽在W0 00/06602和W000/18795 中描述；然而，關(guān)于它們的體內(nèi)效果還不知道?？捎糜诒景l(fā)明的其他肽單體包括來源于Immunity，卷10 :281，1999的表中列出的 腫瘤抗原蛋白的含有至少一個半胱氨酸殘基的腫瘤抗原肽。通過HLA四聚體方法(Int. J. Cancer 100，565-570 (2002))或者有限稀釋方法 (Nat. Med 4, 321-327 (1998))測量CTLs數(shù)可以證實CTL-誘導活性。備選地，例如，對于 HLA-A24-限制的 CTL-誘導，根據(jù) W0 02/47474 或者 Int. J. Cancer 100，565-570 (2002)中 描述的方法使用HLA-A24模型小鼠可以確定活性。肽單體由7-30個，優(yōu)選8-12個，更優(yōu)選9_11個氨基酸殘基組成?？紤]與HLA結(jié) 合的基序和肽長度，肽單體優(yōu)選含有1或2個半胱氨酸殘基。根據(jù)肽化學領(lǐng)域中的常用方法可以合成肽單體。這種方法可以在文獻中發(fā) 現(xiàn)，所述文獻包括 Peptide Systhesis，Interscience，NewYork，1966 ；The Proteins， 卷 2，Academic Press Inc.，New York，1976 ；Peptide Syhthesis，Maruzen，Inc.，1975 ； Peptide-Goseino Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.，1985 ；禾口 Lyakuhin nokainatsu (Zoku)， 卷 14，Peptide Systhesis, Hirokawa-syoten，19910根據(jù)肽化學領(lǐng)域中的常用方法可以允許形成所得肽單體。形成二硫鍵的方法可以 在包括 Peptide Systhesis, Interscience，NewYork，1966 ；The Proteins，卷 2，Academic Press Inc.，New York，1976 ；Peptide Syhthesis, Maruzen, Inc.，1975 ；Peptide-Goseino Kiso to Jikken，Maruzen, Inc.，1985 ；禾口 Lyakuhin nokainatsu(Zoku)，卷 14，Peptide Systhesis, Hirokawa-syoten, 1991 的文獻中發(fā)現(xiàn)。具體地，可以通過例如，除去包括半胱氨酸側(cè)鏈上保護基的所有保護基，然后將所 得單體溶液在堿性條件下空氣氧化，或者通過在堿性或酸性條件下加入氧化劑形成二硫鍵 合成含有一個半胱氨酸殘基的肽單體。氧化劑的實例包括碘、二甲亞砜(DMS0)、鐵氰化鉀，寸寸。根據(jù)上面描述的方法也可以合成含有兩個或多個半胱氨酸殘基的單體肽。在該 情況中，可以得到不同結(jié)合方式的二硫鍵導致的異構(gòu)體。通過選擇半胱氨酸側(cè)鏈的保護基 的特定組合可以制備其中在目的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵的肽二聚體。保護基組合 的實例包括MeBzl (甲基芐基)和Acm(乙酰胺甲基)基團、Trt (三苯甲基)和Acm基團、 Npys (3-硝基-2-吡啶基硫代)和Acm基團、S_Bu_t (S-叔丁基)和Acm基團，等等。例如， 對于MeBzl和Acm基團的組合的情況，通過一種方法可以實施制備，該方法包括除去不同于MeBzl基團的保護基和半胱氨酸側(cè)鏈上的保護基，和將所得單體溶液進行空氣氧化以在去 保護的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，然后去保護并用碘氧化以在之前受Acm保護的半胱 氨酸殘基之間形成二硫鍵。根據(jù)肽化學中常用方法可以純化所得肽二聚體。這種純化方法可以在包括 Peptide Systhesis, Interscience, New York, 1966 ；TheProteins,卷 2, Academic Press Inc. , New York,1976 ；PeptideSyhthesis, Maruzen, Inc. , 1975 ；Peptide-Gosei no Kiso tojikken, Maruzen, Inc. , 1985 ；禾口 Lyakuhin no kainatsu (Zoku),卷 14, Peptide Systhesis, Hirokawa-syoten，1991的文獻中發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選使用HPLC的方法。本發(fā)明的所得肽二聚體顯示出針對溶液中的氧化劑等的優(yōu)良的穩(wěn)定性并且由于 半胱氨酸殘基之間的二硫鍵而具有給定的質(zhì)量和CTL-誘導活性?？捎糜诒景l(fā)明的優(yōu)選的肽單體在下面闡明，以WT1為例。如本文中所用的，用單 字母或者三字母縮寫簡寫各自氨基酸殘基。Ala(A):丙氨酸殘基，Arg(R):精氨酸殘基， Asn(N)天冬酰胺殘基；Asp (D)天冬氨酸殘基，Cys (C)半胱氨酸殘基，Gln(Q)谷氨酰胺 殘基，Glu(E)谷氨酸殘基，Gly(G)甘氨酸殘基，His (H):組氨酸殘基，lie (I)異亮氨酸殘 基，Leu (L)亮氨酸殘基，Lys(K)賴氨酸殘基，Met (M)甲硫氨酸殘基，Phe (F)苯丙氨酸殘 基，Pro(P)脯氨酸殘基，Ser(S)絲氨酸殘基，Thr(T)蘇氨酸殘基，Trp (W)色氨酸殘基， Tyr(Y)酪氨酸殘基，Val (V):纈氨酸殘基。表中，術(shù)語“位置”指人WT1中肽的位置。表 1HLA-A1-限制的肽單體 表2HLA-A0201-限制的肽單體
表3HLA-A0205-限制的肽單體 表 4HLA-A24-限制的肽單體 :SEQ ID NO 11 中 236 位 M 改變成 Y。表 5HLA-A3-限制的肽單體 表6HLA-A68. 1_限制的肽單體 表7HLA-A1101-限制的肽單體 表8HLA-A3101-限制的肽單體 表 9HLA-A3302-限制的肽單體 表 10HLA-B14-限制的肽單體 表11HLA-B40-限制的肽單體 表 13HLA-B61 表 14HLA-B62-限制的肽單體 表 15HLA-B7-限制的肽單體 表 16HLA-B8-限制的肽單體 表 17HLA-B2702-限制的肽單體 表 18HLA-B2705-限制的肽單體 表 19HLA-B3501-限制的肽單體 表 20
HLA-B3701-限制的肽單體 表23HLA-B3902-限制的肽單體 表24HLA-B4403-限制的肽單體 表 25HLA-B5101-限制的肽單體 表26HLA-B5102-限制的肽單體 表27HLA-B5201-限制的肽單體 表28HLA-B5801-限制的肽單體 表 29HLA-CW0301-限制的肽單體 表 30HLA-CW0401-限制的肽單體 表 31HLA-CW0602-限制的肽單體 表 32HLA-CW0702-限制的肽單體 已經(jīng)知道有許多HLA分子的亞型并且結(jié)合每種亞型的腫瘤抗原肽的氨基酸序列 遵循某種規(guī)則(結(jié)合基序)。HLA-A24的結(jié)合基序是公知的，在由8到11個氨基酸殘基組 成的肽中，2位氨基酸為酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或者色氨酸(Trp)， C-末端氨基酸為苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(lie)、色氨酸(Trp)或者甲硫氨 酸(Met) (J. Immunol.，152，3913 頁，1994)，Immunogenetics, 41, pl78，1995，J. Immunol., 155，4307，1994)。因此，除了表4中的肽單體，下式中的肽單體也可優(yōu)選用作HLA-24-限制 的肽單體。Cys Xaa Thr Trp Asn Gin Met Asn Xaa (SEQ ID NO 72)其中2位Xaa為選自Tyr、Phe、Met和Trp的氨基酸殘基；9位Xaa為選自Phe、 Leu、lie、Trp和Met的氨基酸殘基。HLA-A0201的結(jié)合基序是公知的，在由8到11個氨基酸殘基組成的肽中，2位氨基 酸為亮氨酸(Leu)或者甲硫氨酸(Met)，C_末端氨基酸為纈氨酸(Val)或者亮氨酸(Leu)。 HLA-A0205的結(jié)合基序是公知的，在由8到11個氨基酸殘基組成的肽中，2位氨基酸為纈氨 酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(lie)或者甲硫氨酸(Met)，C末端氨基酸為亮氨酸(Leu) (Immunogenetics, 41,178 頁，1995 J. Immunol.，155 4749 頁，1995)。因此，其中表 2 或 3 中所示的肽單體的2位或C末端氨基酸被上述任何一種氨基酸基序取代的肽也可以優(yōu)選用 作HLA-A0201-或者HLA-A0205-限制肽單體。上面表4中所示肽單體特別優(yōu)選用于本發(fā)明中。在表4中的肽中，SEQ ID NO 44 為非天然變體肽，其中SEQ ID N0 :11的236位甲硫氨酸(235位-243位)改變成酪氨酸。 因此，本發(fā)明的肽單體包括這樣的序列，該序列中不同于半胱氨酸殘基的一個或多個氨基 酸殘基在天然型肽的序列中被改變并且顯示出CTL誘導活性。作為另一實施方案，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有本發(fā)明的肽二聚體與治療 上可接受的載體。盡管作為藥物組合物中活性成分的本發(fā)明的肽二聚體的量可以根據(jù)治 療目的、患者的年齡、體重等等而變，所述量通常為0. 000lmg到lOOOrng，優(yōu)選0. OOlmg到lOOOmg,更優(yōu)選 0. lmg 到 20mg。本發(fā)明的藥物組合物可以含有作為活性成分的本發(fā)明的肽單體以及肽二聚體。對 于本發(fā)明的藥物組合物中“肽二聚體”的含量沒有限制，條件是能發(fā)揮CTL誘導活性；然而， 所述含量可以為總肽的50 %或以上，優(yōu)選70-100 %，更優(yōu)選80-100 %?？梢酝ㄟ^高效液相 層析(HPLC)確定肽二聚體的含量。藥學上可接受的載體為能夠增強細胞免疫力的那些載體。這些載體包括佐劑?？?應用于本發(fā)明的佐劑的實例包括文獻中描述的那些(Clin. Microbiol. Rev.，7 =277-289, 1994)，具體地，來源于微生物的組分、細胞因子、來源于植物的組分、礦物凝膠如氫氧化鋁、 溶血卵磷脂、表面活性劑如Pluronic 多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑(乳劑制劑)等等。 而且，載體包括制備脂質(zhì)體制劑所需的組分，尤其其中成分結(jié)合到具有幾微米直徑的珠子 的制劑、其中成分結(jié)合到脂質(zhì)等的制劑。例如，可以皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)地實現(xiàn)施用。優(yōu)選途徑為有效誘導CTLs的皮 內(nèi)或皮下施用。施用的頻率或間隔可以根據(jù)所治療或預防的疾病、個體差異等等適當?shù)卣{(diào) 節(jié)；然而，優(yōu)選以幾天到數(shù)月一次的間隔施用一次以上。例如，當含有由來源于WT1的肽單體組成的肽二聚體的本發(fā)明的藥物組合物施用 于WT1-陽性患者時，該肽呈遞給抗原呈遞細胞的HLA抗原以形成復合體。然后所呈遞的 HLA抗原復合體特異的CLTs增殖并破壞癌細胞，從而可以治療或者預防癌癥。本發(fā)明的藥 物組合物可用于治療或者預防與WT1基因的上升的表達水平有關(guān)的癌中包括血癌，如白血 病、脊髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤，和實體癌，如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳 腺癌、胚胎癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌。在進一步實施方案中，本發(fā)明提供了通過對WT1-陽性患者施用本發(fā)明的藥物組 合物治療或者預防癌癥的方法。
實施例通過下面的實施例進一步闡明本發(fā)明，但是本發(fā)明不在任何方面受到這些實施例 的限制。制備11.合成受保護的肽樹脂(H-Cys (Trt) -Tyr (Trt) -Thr (tBu) -Trp (Boc) -Asn (Trt)-Gin (Trt) -Met-Asn (Trt) -Leu-Alko-樹脂)將Fmoc-Leu-Alko-樹脂(其中 Alko 為對 _ 烷氧基芐基醇)(12g) (0. 81mmol/ g, ffatanabe Chemical Industries，Ltd.)裝入反應容器(500ml，ACT90 型固相合成儀) 并用DMF等洗滌一次(步驟1)。然后用25% Pip (哌啶)處理樹脂(3分鐘XI，15分 鐘XI)以切除Fmoc基團(步驟2)，并用DMF等再次洗滌(步驟1)以除去Pip。向反應 容器加入 Fmoc-Asn (Trt) -OH (29. 36g)和 H0BT (1-羥基苯并三唑)(7. 5g)在 NMP (N-甲 基吡咯烷酮)(150ml)中的溶液。加入DIPCI(N，N，- 二異丙基碳二亞胺)后(7.6ml) 后，將混合物在室溫攪拌30分鐘(步驟3)。30分鐘后，用NMP洗滌樹脂(步驟4)，并 將樹脂用Fmoc-Asn (Trt) -OH (29. 36g)和H0BT (7. 5g)再次進行偶聯(lián)反應(步驟5)以 合成Fmoc-Asn (Trt)-Leu-Alko樹脂。然后通過重復步驟2的去保護將所得樹脂轉(zhuǎn)化 成 H-Asn (Trt) -Leu-Alko-樹脂。洗滌(步驟 1)后，連續(xù)加 A Fmoc-Met_0H(18. 27g)、Fmoc-Gln(Trt)-0H(30. 04g)、Fmoc-Asn (Trt)-0H(29. 36g)、Fmoc-Trp (Boc)-0H(25. 91g)、 Fmoc-Thr (tBu) -OH (19. 56g)、Fmoc-Tyr (tBu) -OH (22. 60g)禾口 Fmoc—Cys (Trt) -OH (28. 82g) 以實施偶聯(lián)反應(步驟3)，其中用Fmoc-Thr (tBu) _0H重復偶聯(lián)3次。所得樹脂用DMF洗滌并 用25%AC20(乙酸酐)處理(15分鐘X2)以帽化未反應的氨基。N-末端FmOC-Cys(Trt)-0H 縮合后，進行去保護(步驟2)和洗滌(步驟6)得到H-CyS(Trt)-Tyr(Trt)-Thr(tBU)-Trp (Boc) -Asn (Trt) -Gin (Trt) -Met-Asn (Trt) -Leu-Alko-樹脂。上面的合成步驟在表 33 中概 述。表 33〈 2.受保護肽樹脂的去保護 向根據(jù)上面的方法得到的受保護的肽樹脂(H-Cys (Trt) -Tyr (Trt) -Thr (tBu) -Tr p (Boc) -Asn (Trt) -Gin (Trt) -Met -Asn (Trt) -Leu-Alko-樹脂)(14. 06g)加入試劑 K (5 % 苯酚苯硫基甲烷H20/2. 5%乙二醇/TFA溶液，100ml)和三異丙基硅烷(TIPS， 15ml)，并將混合物在室溫攪拌2. 5小時。加入二乙醚(約500ml)后，混合物通過玻璃濾 器過濾除去作為濾液的試劑K和二乙醚。然后通過加入TFA(約100mlX3)用二乙醚(約 100ml, X3)洗滌殘渣得到含有目標產(chǎn)物的濾液(300ml)。濃縮濾液除去TFA并加入乙腈 (約50ml)和20%水性乙酸溶液(約250ml)后凍干得到粉末狀粗制肽(H-Cys-Tyr-Thr-T rp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH, SEQ IDN0 44)(6. 12g)。3.純化粗制肽所得粗制肽(749mg)溶于TFA(lOml)中并加到 HPLC (Shimadzu ；LC8AD 型)的 0DS C18 柱(5cm① X 50cm L，YMC，Co.，Ltd.)，該柱子用溶液 1 ( = H20/0. 1 % TFA)平衡，使用 HPLC泵。使柱子按照原狀保持約30分鐘，然后溶液2 ( = CH3CN/0. 1 % TFA)的濃度在30分 鐘內(nèi)從0%增加到15%。之后，溶液2的濃度在330分鐘內(nèi)增加到28%，而通過220nm處UV吸收監(jiān)視含有目標肽的洗脫物以得到含有目標產(chǎn)物的級分。合并級分并注射到連接至 HPLC(Hitachi, L-4000 型)的 ODS C18 柱(4. 6mmO X25cmL, YMC, Co.，Ltd)并用處于溶液 1 ( = H20/0. 1 % TFA)和溶液2 (CH3CN/0. 1 % TFA)的混合物中的17%溶液2平衡，然后將溶 液2的濃度在30分鐘內(nèi)提高到47%以獲得所純化的目標肽單體(227. 5mg)，其存留時間為 14. 79分鐘。氨基酸分析水解1 %苯酚/6N水性鹽酸溶液110°C，10 小時分析方法茚三酮方法Asx 1. 71(2)Thr 0. 75(l)Glx 1. 07(l)Met 0. 91(l)*Leu (1)Tyr 0. 82(1)*)Leu=參考氨基酸括號()中的值理論值質(zhì)譜法:LC/MSM+1 = 1173. 0(理論值=1172. 36)肽測序從N-末端的第二個殘基(Tyr)連續(xù)到C-末端Leu證實序列。實施例1下式二聚體的合成C-Y-T-W-N-Q-M-N-L-0HC-Y-T-W-N-Q-M-N-L-0H通過將制備1中制備的肽單體(227. 5mg)、N_甲基葡糖胺(NMG) (227. 5mg)和水 (23ml)在室溫下攪拌約2天實施空氣氧化。向反應溶液加入乙酸鈉(2g)在水(5ml)中的 水性溶液，并將混合物在室溫攪拌約20分鐘。加入水(200ml)和乙腈(約200ml)后，混合 物通過Kiriyama Roht(濾紙?zhí)?C)過濾，并用水(約50ml X 3)洗滌濾器上的殘渣。收集 濾器上的殘渣并在加入水后凍干(約200ml)以得到目標肽二聚體的粗產(chǎn)物(158mg)。粗制肽二聚體的純化粗制肽二聚體(158mg)溶于DMS0(9ml)中并加到 HPLC(Shimadzu ；LC8AD 型)的 ODS C18 柱(5cm① X 50cm L，YMC，Co.，Ltd.)，該柱子用溶液 1 ( = H20/0. 1 % AcOH)平衡，使 用HPLC泵。使柱子按照原狀保持約30分鐘，然后溶液2 ( = CH3CN/0. 1 % AcOH)的濃度在 360分鐘內(nèi)從0%增加到40%。之后，通過自動部分收集器收集含有目標產(chǎn)物的級分，而通 過220nm的UV吸收監(jiān)視含有目標肽的洗脫物。合并級分并注射到連接到HPLC (Hitachi， L-4000 型)并且用溶液 1 ( = H20/0. 1% TFA)和溶液 2 ( = CH3CN/0. 1% TFA)中的 17% 溶 液 2 ( = CH3CN/0. 1 % TFA)平衡的 ODS C18 柱(4. 6mmO X 25cm L, YMC, Co.，Ltd.)。然后溶 液2的濃度在30分鐘內(nèi)從0%增加到47%并通過220nm處UV吸收監(jiān)視洗脫物以得到純化 的目標肽二聚體(46. 6mg)，其存留時間為20. 51分鐘。FAB. MS 2365. 0 (理論值2342. 70) Na+F = 0.25%。試驗實施例1用肽二聚體誘導CTLs用HLA-A24轉(zhuǎn)基因小鼠(Int. J. Cancer 100，565，2002)評估實施例1中制備的肽二聚體的CTL-誘導活性。將肽二聚體溶于二甲基亞砜(DMS0)以得到40mg/ml肽溶液。然 后將肽溶液(35 u 1)加入10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 5) (581 u 1)得到肽懸浮液。用連接的 玻璃注射器混合所得肽懸浮液(550 ill)和MontanideISA51(S印pic) (700 u 1)以制備乳液 作為施用溶液。將施用溶液(200 u 1)皮下注射到HLA-A24轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴基部。使用三只小 鼠。注射后7天，除去脾臟并制備脾細胞。將一部分脾細胞用肽二聚體(100 u g/ml)脈沖1 小時。未用肽脈沖的脾細胞以7X106個細胞/孔接種在24孔板中并向孔中加入上述用所 述肽脈沖的脾細胞(IX 106個細胞/孔)，并孵育平板。在補加10% FCS，10mMHEPES,20mM L_谷氨酰胺，ImM丙酮酸鈉，ImM MEM非必需氨基酸，MEM維生素和55 y M 2-巰基乙醇的 RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育5天。通過51Cr釋放測定法(J. Immunol. :159，4753，1997)檢查所培養(yǎng)的脾細胞對用 于施用的肽特異的細胞毒性活性。將通過以如此方式轉(zhuǎn)化EL-4細胞(ATCC號TIB-39)使 得HLA-A24和H2Kb (Int. J. Cancer 100，565，2002)的嵌合體MHC I類分子穩(wěn)定表達所得的 EL4-A2402/Kb細胞用作靶細胞。將靶細胞用51Cr(3. 7MBq/106個細胞)標記并以100 y g/ml 所述肽脈沖1小時。對于對照，未用肽脈沖的靶細胞用51Cr標記2小時。那些標記的靶細 胞和以前制備的脾細胞以1 120的比例混合，培養(yǎng)4小時并基于受損的靶細胞的百分數(shù) 評估CTL活性。結(jié)果在圖1中顯示。從用所述肽注射的小鼠制備的脾細胞強烈傷害用所述 肽脈沖的靶細胞。然而，它們對不用所述肽脈沖的靶細胞僅顯示出弱細胞毒性。這些結(jié)果 清楚地表明誘導了對該肽特異的CLTs。工業(yè)應用性根據(jù)本發(fā)明，提供了具有體內(nèi)CTL誘導活性的肽二聚體，和含有所述肽二聚體作 為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明可用于改善許多腫瘤患者的病癥。
2權(quán)利要求
由下述序列組成的肽二聚體Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu|Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu。
2.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1的肽二聚體與藥學上可接受的載體，并且 被用作癌癥疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的腫瘤抗原肽和其癌癥疫苗，具體地，肽二聚體，其中由包括至少一個半胱氨酸殘基的7-30個氨基酸組成并且能夠產(chǎn)生腫瘤抗原肽的兩種肽單體相互通過二硫鍵結(jié)合。
文檔編號A61K39/00GK101851275SQ201010156098
公開日2010年10月6日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月15日
發(fā)明者三溝文雄, 杉山治夫, 高須秀夫 申請人:株式會社國際癌癥免疫研究所;中外制藥株式會社;大日本住友制藥株式會社