專利名稱：用海藻制備脫鎂葉綠素甲酯一酸a和脫鎂葉綠素c的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用海藻制備脫鎂葉綠素甲酯一酸A和脫鎂葉綠素C的方法。
葉綠素A(Chlorophyll A，Chla)是天然無(wú)毒的綠色食用色素，脫鎂葉綠素甲酯一酸A(Pheophorbide A，Pha)是一種新的激光化學(xué)方法治療惡性腫瘤的高效光敏化藥劑，將Pha靜脈注射入患者體內(nèi)，24小時(shí)后主要潴留在腫瘤組織，用激光照射腫瘤部位時(shí)，由于Pha的敏化，腫瘤組織中的氧被激發(fā)成為單態(tài)1O2，單態(tài)1O2具有很強(qiáng)的氧化能力，可以定向殺死腫瘤細(xì)胞達(dá)到不損傷正常細(xì)胞而治愈腫瘤的目的。葉綠素C(Chlorophyll C，Chlc)是天然無(wú)毒的黃色食用色素，脫鎂葉綠素C(Pheophytine C，Phc)不僅是黃色食用色素，而且亦是一種新的激光化學(xué)方法治療惡性腫瘤的高效光敏化藥劑，其藥理同Pha。目前國(guó)際上采用層析技術(shù)從高等綠色植物和蕨類(lèi)植物中提取Chla，然后用酸或酶脫去Chla的葉綠醇尾制得Pha。但這些植物中均含有葉綠素B(Chlb)，用CHO取代Chla噗啉環(huán)上第17位的CH3就是Chlb。由于Chla與Chlb的化學(xué)結(jié)構(gòu)很相似，因此將其分離開(kāi)比較困難，要得到高純度的Chla，需要大量的試劑進(jìn)行層析，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)資金、效益低。
本發(fā)明的目的是提供一種用海藻制備葉綠素A、葉綠素C、脫鎂葉綠素甲酯一酸A和脫鎂葉綠素C的方法，它能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種用海藻制備脫鎂葉綠素甲酯一酸A和脫鎂葉綠素C的方法，包括將原料磨漿，用有機(jī)溶劑水溶液提取，然后將葉綠素A、C分離，用酸處理，得到脫鎂綠素A溶液和脫鎂葉綠素C溶液，再用液相酸度梯度法處理脫鎂葉綠A溶液，得到脫鎂葉綠素甲酯一酸A，其特征是所述的原料為海藻，提取后用油水分離的方法將葉綠素c分出。
本發(fā)明由于選取的原料不含葉綠素B而含有chlc，而且Chla是酯溶性的，Chlc是水溶性的，因此很容易將Chla、Chlc分離，能夠得到高純度的Pha、Phc。本方法簡(jiǎn)便、節(jié)省試劑，經(jīng)濟(jì)效益是常規(guī)法的十倍以上。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。


圖1是本方法得到的Pha的電子光譜圖。
圖2是本方法得到的Phc的電子光譜圖。
實(shí)施例1稱取摘洗干凈的海帶1kg剪短磨碎后加入2L濃度為80％的丙酮水溶液，浸泡12小時(shí)過(guò)濾，收取濾液。濾渣可以反復(fù)提取2次。取500ml濾液注人分液漏斗中，再加入500ml正辛烷搖勻。30分鐘后分層，下層黃色的是Chlc，Chla、類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素均被萃取進(jìn)上層正辛烷溶液中。如此反復(fù)萃取2次，分別回收Chlc溶液和萃取液。蒸餾干燥Chlc溶液得固體粉末。Chlc溶液和Chlc固體粉均可作為食用色素使用。往Chlc溶液中滴入數(shù)滴1摩爾濃度的鹽酸，溶液變深黃色，說(shuō)明Chlc反應(yīng)成脫鎂葉綠素C，進(jìn)行濃度和電解質(zhì)調(diào)節(jié)后可做為注射針劑進(jìn)行臨床使用。采用聚乙烯粉作為吸附劑并將其填充進(jìn)層析柱中。然后慢慢滴入萃取液，待到達(dá)柱高的一半時(shí)就，停止滴入，改用60％的丙酮水溶液繼續(xù)慢慢滴入，注意觀察柱內(nèi)已明顯分為藍(lán)、黃、淺黃色帶，繼續(xù)慢慢滴入洗脫液，分別接取藍(lán)色、黃色、淺黃色溶液。藍(lán)色是Chla、黃色是類(lèi)胡蘿卜素、淺黃色是葉黃素。類(lèi)胡蘿卜素不僅可以作為實(shí)用色素而且是很好的營(yíng)養(yǎng)品。
往Chla溶液中滴入數(shù)滴1摩爾濃度的鹽酸，溶液變深棕色，說(shuō)明Chla反應(yīng)成脫鎂葉綠素A。然后采用液相酸度梯度法制備pha，即將脫鎂葉綠素A溶液置于分液漏斗中并加入10ml去離子水后慢慢滴入濃硫酸，Chla脫掉醇尾成為棕黑色的Pha，進(jìn)入下層的水溶液中。往分離出的Pha溶液中加入去離子水，使PH值達(dá)到4為止，再加入硅藻土，充分?jǐn)嚢杈筮^(guò)濾，再用去離子水淋洗，洗脫過(guò)剩的酸至PH中性為止。將吸附了Pha的硅藻土浸入90％的丙酮水溶液洗脫出Pha。餾出Pha溶液中的提取劑，得到Pha水溶液，進(jìn)行濃度和電解質(zhì)調(diào)節(jié)后可做為注射針劑進(jìn)行臨床使用。將Pha水溶液蒸干后，可得黑色固體Pha便于保存。以上各個(gè)蒸餾過(guò)程中均可回收提取劑，不僅能減少成本而且可避免環(huán)境污染。Pha及其溶液均需避光保存。
實(shí)施例2稱取摘洗干凈的裙帶菜1kg剪短磨碎后加入2L濃度為80％的乙醚水溶液，浸泡12小時(shí)過(guò)濾，收取濾液，濾渣反復(fù)提取2次。取500ml濾液注入分液漏斗中，再加入500ml苯搖勻。30分鐘后分層，下層黃色的是Chlc，Chla、類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素均被萃取進(jìn)，上層苯溶液中。如此反復(fù)萃取2次，分別回收Chlc溶液和萃取液。
脫鎂葉綠素C的制備和Chla、類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素的分離及Pha的制備同實(shí)施例1。
往分離出的Pha溶液中加入去離子水使PH值達(dá)到4為止，再加入化石粉充分?jǐn)嚢杈筮^(guò)濾，再用去離子水淋洗，洗脫過(guò)剩的酸至PH中性為止。將吸附了Pha的化石粉浸入90％的乙醚水溶液洗脫出Pha。蒸餾出Pha溶液中的提取劑，得到Pha水溶液，進(jìn)行濃度和電解質(zhì)調(diào)節(jié)后，可做為注射針劑進(jìn)行臨床使用。將Pha水溶液蒸干后可得黑色固體。
實(shí)施例3稱取摘洗干凈的鹿角菜1kg，磨碎后加入2L濃度為98％的乙醇，浸泡24小時(shí)后過(guò)濾，收取濾液，濾渣反復(fù)提取2次。取500ml濾液注入分液漏斗中，再加入500ml石油醚搖勻。30分鐘后分層，下層黃色的是Chlc，Chla、類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素均被萃取進(jìn)入上層石油醚溶液中。如此反復(fù)萃取2次，分別回收Chlc溶液和萃取液。
脫鎂葉綠素C的制備和Chla、類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素的分離及Pha的制備同實(shí)施例1。
往分離出的Pha溶液中加入去離子水，使PH值達(dá)到5。把脫脂棉填充層析柱中，將Pha溶液滴入柱中待溶液到達(dá)柱高的一半停止滴入，改用去離子水淋洗，洗脫過(guò)剩的酸至PH中性為止。將吸附了Pha的脫脂棉浸入90％的乙醚溶液洗脫出Pha。蒸餾出Pha溶液中的提取劑，得到Pha水溶液，進(jìn)行濃度和電解質(zhì)調(diào)節(jié)后可做為注射針劑進(jìn)行臨床使用。將Pha水溶液蒸干后可得黑色固體Pha。
實(shí)施例4用一定網(wǎng)目的網(wǎng)撈取硅藻，用清水漂洗干凈，稱取1kg，磨碎后加入2L濃度為90％的正辛烷，浸泡12小時(shí)后過(guò)濾，收取濾液，濾渣反復(fù)提取2次。取500ml濾液注入分液漏斗中，加入500ml去離子水搖勻。30分鐘后分層，下層黃色的是Chlc，Chla、類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素均被萃取進(jìn)，上層溶液中。分離出Chlc溶液，再如此反復(fù)淋洗多次至洗脫液無(wú)黃色為止，分別回收Chlc溶液和萃取液。
往分離出的Pha溶液中加入去離子水是使PH值達(dá)到5。采用超濾膜進(jìn)行過(guò)慮，因硫酸的分子半徑小而Pha的分子半徑大，可以將其開(kāi)來(lái)。其它同實(shí)施例1。
實(shí)施例5以硅藻為原料，有機(jī)提取劑用石油醚，其它同實(shí)施例4。
實(shí)施例6以雙鞭甲藻為原料，有機(jī)提取劑用80％的丙酮，其它同實(shí)施例4。
附圖中實(shí)線為激發(fā)光譜，虛線為熒光光譜。由激發(fā)光譜可以看到用本發(fā)明的方法得到的Pha，在418nm、669nm有兩個(gè)特征峰，這與生化標(biāo)準(zhǔn)品是一致的，說(shuō)明采用本方法得到的Pha純度很高。
下面對(duì)本發(fā)明的一些細(xì)節(jié)作出說(shuō)明。
1、本發(fā)明選取海帶、裙帶菜、鹿角菜、硅藻等褐藻、硅藻或雙鞭甲藻等為原料，新采集的材料要摘除藻根，洗去泥沙等污物，然后用清水沖洗干凈，空凈水分。中、大型藻體要剪短磨碎；單細(xì)胞藻類(lèi)選用適當(dāng)網(wǎng)目的篩子過(guò)篩后用清水沖洗；干品要水發(fā)后用清水沖洗。
2、色素的提取。將磨碎的原料浸泡到提取劑濃度在10-80％的水溶液中，12-24小時(shí)后過(guò)濾，分別收取濾液和濾渣。提取劑使用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、正辛烷、苯等醇、酮、醚、芳烴、烷烴等溶劑中的一種或多種，濾渣再反復(fù)提取數(shù)次后丟棄。
3、Chlc的提取分離。將濾液裝入分液漏斗，并加入去離子水使提取劑的濃度降低到2-10％，再加入萃取劑進(jìn)行萃取，酯溶性色素進(jìn)入上層，下面的水層溶有Chlc。對(duì)下層水溶液進(jìn)行反復(fù)萃取后，可得純的Chlc溶液。通過(guò)減壓蒸餾Chlc溶液，可得黃色的Chlc固體粉末。Chlc溶液和Chlc固體粉末均可作為食用色素使用。
4、脫鎂葉綠素C的制備。往Chlc溶液中滴入數(shù)滴1摩爾濃度的鹽酸，溶液變深黃色，說(shuō)明Chlc反應(yīng)生成脫鎂葉綠素C，進(jìn)行濃度和電解質(zhì)調(diào)節(jié)后可做為注射針劑進(jìn)行臨床使用。
5、分離出葉綠素C后還要將Chla與類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素的分離。將上述含有酯溶性色素的萃取液采用層析進(jìn)行分離，首先將吸附劑裝入層析柱，然后慢慢滴入萃取液，待到達(dá)柱高的一半時(shí)，就停止滴入萃取液，改用洗脫劑的重量占40-80％(其余為水)的洗脫液繼續(xù)慢慢滴入，注意觀察柱內(nèi)已明顯分為藍(lán)、黃、淺黃色帶，繼續(xù)慢慢滴入洗脫液，分別收取藍(lán)色、黃色、淺黃色溶液。藍(lán)色是Chla、黃色是類(lèi)胡蘿卜素、淺黃色是葉黃素。類(lèi)胡蘿卜素不僅可以作為實(shí)用色素而且是很好的營(yíng)養(yǎng)品。吸附劑采用蔗糖、有機(jī)樹(shù)脂、化石粉、硅藻土、脫脂棉、纖維素等。洗脫劑采用醇、酮、醚及其混合溶劑。
6、Pha的制備。往Chla溶液中滴入數(shù)滴1摩爾濃度的鹽酸，溶液變深棕色，說(shuō)明Chla反應(yīng)生成脫鎂葉綠素A。將脫鎂葉綠素A溶液置于分液漏斗中并加入10ml去離子水后慢慢滴入濃硫酸，Chla脫掉醇尾成為棕黑色的Pha，進(jìn)入下層的水溶液中。往分離出的Pha溶液中加入去離子水使PH值達(dá)到4為止，再加入吸附劑充分?jǐn)嚢杈筮^(guò)濾，再用去離子水淋洗，洗脫過(guò)剩的酸至PH中性為止。將吸附了Pha的吸附劑浸入70-99％的提取液洗脫出Pha。蒸餾出Pha溶液中的提取劑，得到Pha水溶液，進(jìn)行濃度和電解質(zhì)調(diào)節(jié)后可做為注射針劑進(jìn)行臨床使用。將Pha水溶液蒸干后可得黑色固體Pha便于保存。Pha及其溶液均需避光保存。以上各個(gè)蒸餾過(guò)程中均可回收提取劑，不僅能減少成本而且可避免環(huán)境污染。
權(quán)利要求
1.一種用海藻制備葉綠素A、葉綠素C、脫鎂葉綠素甲酯一酸A和脫鎂葉綠素C的方法，包括將原料磨漿，用有機(jī)溶劑水溶液提取，然后將葉綠素A、C分離，用酸處理，得到脫鎂綠素A溶液和脫鎂葉綠素C溶液，再用液相酸度梯度法處理脫鎂葉綠A溶液，得到脫鎂葉綠素甲酯一酸A，其特征是所述的原料為海藻，提取后用油水分離的方法將葉綠素C分出。
2.如權(quán)利要求1所述的的方法，其特征是分離出葉綠素C后還要將葉綠素A與類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素的分離。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的海藻為褐藻、硅藻、雙鞭甲藻。
全文摘要
一種用海藻制備脫鎂葉綠素甲酯一酸A和脫鎂葉綠素C的方法，包括。將原料磨漿，用有機(jī)溶劑水溶液提取，然后將葉綠素A、C分離，用酸處理，得到脫鎂綠素A溶液和脫鎂葉綠素C溶液，再用液相酸度梯度法處理脫鎂葉綠A溶液，得到脫鎂葉綠素甲酯一酸A，其特征是所述的原料為海藻，提取后用油水分離的方法將葉綠素C分出。本發(fā)明 能夠得到高純度的Pha、Phc，方法簡(jiǎn)便、節(jié)省試劑，經(jīng)濟(jì)效益是常規(guī)法的十倍以上。
文檔編號(hào)C07D487/00GK1428342SQ0114281
公開(kāi)日2003年7月9日 申請(qǐng)日期2001年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月22日
發(fā)明者孟繼武, 鄭榮兒, 孟廣昱 申請(qǐng)人:青島海洋大學(xué)