gbFGF/ml溶液。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述組合物包含大約33ng VEGF和大約 167ngbFGF/ml溶液。
[0095] 含有上述濃度bFGF的溶液可以導(dǎo)入基質(zhì)或支架中或者與其組合。
[0096]bFGF可商購(gòu)。
[0097]NGF
[0098] 本文所述再生牙髓或牙本質(zhì)的組合物可包含神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)。這種組合物可 包含NGF組合其它生物活性劑，如Wnt3a、VEGF、bFGF或BMP-7。
[0099]NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約1，OOOmgNGF/ml溶液的濃度 存在。例如，NGF在本文所述組合物可以以大約0.lng至大約lOOmgNGF/ml溶液的濃度存 在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約10mgNGF/ml溶液的濃度存 在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約lmgNGF/ml溶液的濃度存 在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約0.lmgNGF/ml溶液的濃度 存在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約100ygNGF/ml溶液的濃 度存在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約10ygNGF/ml溶液的 濃度存在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約1ygNGF/ml溶液的 濃度存在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約500ngNGF/ml溶液 的濃度存在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約200ngNGF/ml溶 液的濃度存在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約lOOngNGF/ml 溶液的濃度存在。再例如，NGF在本文所述組合物中可以以大約0.lng至大約10ngNGF/ml 溶液的濃度存在。
[0100] NGF在本文描述的組合物中可以以大約0. 2ng至大約500ngNGF/ml溶液的濃度存 在。例如，NGF在本文描述的組合物中可以以大約0. 5ng至大約lOOngNGF/ml溶液的濃度 存在。再例如，NGF在本文描述的組合物中可以以大約lng至大約10ngNGF/ml溶液的濃 度存在。
[0101] 在一些實(shí)施方案中，其中組合物包含BMP-7和NGF，所述組合物包含大約0. 2ng至 10,000ngBMP-7及大約0. 2ng至500ngNGF/ml溶液。在其它實(shí)施方案中，所述組合物包含 大約lng至1000ngBMP-7及大約0. 5ng至lOOngNGF/ml溶液。在另外的實(shí)施方案中，所 述生物活性成分組合物包含大約5ng至50ngBMP-7及大約lng至10ngNGF/ml溶液。
[0102] 含有上述濃度NGF的溶液可以導(dǎo)入基質(zhì)或支架中或者與其組合。
[0103]NGF是可商購(gòu)的。
[0104] 基質(zhì)或支架
[0105] 本發(fā)明一方面提供了適于插入牙髓腔中的基質(zhì)或支架，其中包含本文所述一或多 種生物活性劑的組合物包含在所述基質(zhì)或支架之中或之上。包含生物活性劑的組合物的基 質(zhì)或支架當(dāng)插入牙髓腔中時(shí)可促進(jìn)所述基質(zhì)或支架中血管組織形成或者神經(jīng)形成。在一些 實(shí)施方案中，所述基質(zhì)或支架不包含活細(xì)胞。這種材料可用于牙齒、牙髓或根管處理方法 中。
[0106] 如本文所用，"基質(zhì)"是無(wú)定形結(jié)構(gòu)，例如凝膠，其中可以懸浮一或多種生物活性成 分。"支架"應(yīng)理解為具有二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)（例如柱形結(jié)構(gòu)或多孔結(jié)構(gòu)，如在典型的膠原蛋 白海綿中，例如具有在大約250-400yM之間的完全一致的孔，其中一或多種生物活性成分 可以滲透）。本發(fā)明不限于任何特定的基質(zhì)或支架。優(yōu)選所述基質(zhì)或支架是可生物降解的。
[0107] 在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架包含水凝膠。水凝膠應(yīng)理解為具有聚合物鏈網(wǎng)絡(luò)， 其是親水性的，有時(shí)是膠狀凝膠，其中水是分散介質(zhì)。水凝膠可以是高度可吸收的（例如大 約80%、85%、90%、95%、99%或99.9%的以上的水）天然或合成的聚合物。水凝膠由于 其顯著的水含量而也可以具有與天然組織相似程度的柔性。水凝膠可包括例如聚乙烯醇、 聚丙烯酸鈉、丙烯酸鹽聚合物或者具有親水性基團(tuán)的共聚物。天然水凝膠可包括瓊脂糖、甲 基纖維素、透明質(zhì)酸或者其它天然衍生的聚合物。
[0108] 包含一或多種生物活性劑的組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式與所述基質(zhì) 或支架組合。例如，包含一或多種生物活性劑的組合物可以注射進(jìn)基質(zhì)或支架中。再例如， 包含一或多種生物活性劑的組合物可與基質(zhì)或支架混合。再例如，包含一或多種生物活性 劑的組合物通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以包囊于基質(zhì)或支架中，或者化學(xué)束縛于或吸附于基 質(zhì)或支架中。
[0109] 基質(zhì)或支架可以置于手術(shù)制備的牙腔上或者置入除去病變組織，包括腐爛的牙釉 質(zhì)和牙本質(zhì)之后的髓腔中。對(duì)于置入制備的牙腔中的基質(zhì)或支架材料如藻酸鹽水凝膠，血 液、組織液或水可以被吸收進(jìn)生物材料中。在基質(zhì)或支架保留在原位或者在除去材料后，髓 腔可以封閉或者患病的牙齒可以恢復(fù)。
[0110] 在一些實(shí)施方案中，生物材料裝置可以在大約24小時(shí)后除去。例如，生物材料裝 置可以在大約24至大約48小時(shí)后除去。再例如，生物材料裝置可以在大約48小時(shí)后除去。
[0111] 基質(zhì)或支架可以提供細(xì)胞生長(zhǎng)或組織形成的底物?；|(zhì)或支架的有益性質(zhì)是多孔 性、生物相容性和可生物降解性、支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，或者其用作可控的基因和蛋白質(zhì)輸 送載體的能力（Murphy1999)。由支架提供的三維大分子結(jié)構(gòu)可以指導(dǎo)生物工程化組織的 最終形狀（Murphy1999)。
[0112] 本文描述的支架可具有任何哺乳動(dòng)物牙齒或其中的洞或腔室的形狀。例如，支架 可具有人切牙、人尖牙、人雙尖牙或人磨牙或者其中的洞或腔室的形狀。本文所述基質(zhì)可適 合任何哺乳動(dòng)物的天然或人工的洞或腔室。
[0113] 許多研究已經(jīng)調(diào)查外源性生長(zhǎng)因子在載體中以輸送生長(zhǎng)因子至植入部位的地位 和作用。盡管載體也許不提供為組織形成必需的任何另外的因子，但是其仍可以是生長(zhǎng)過(guò) 程的重要成分（Wozney1990)。載體的功能之一是保持所述因子在植入部位及因此增加其 局部濃度。載體也可以作為環(huán)境，在其中組織可以形成，并因此有助于限定新組織可以形 成的區(qū)域（Whang1998)。膠原性或合成載體已經(jīng)用作輸送運(yùn)載體，其物理化學(xué)性質(zhì)以及其 產(chǎn)生的微環(huán)境在歸納結(jié)果（inductiveoutcome)中起作用。載體可以是固體異種的（例如 輕磷灰石）（Kuboki1995,Murata1998)、固體異質(zhì)成形的（聚乙稀聚合物）材料（Saito 1998, Isobe1999)或者自生凝膠（Sweeney1995，Schwartz1998)，同種異體的（Bax 1999,Viljanen1997)或者異質(zhì)成形的來(lái)源（Santos1998)，及上述材料的組合（Alpaslan1996)〇
[0114] 基質(zhì)或支架可進(jìn)一步包含任何其它生物活性分子，例如抗生素或趨化性生長(zhǎng)因 子。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架是加強(qiáng)的，通過(guò)加入例如人血清白蛋白（HSA)、羥乙基淀 粉、葡聚糖或者其組合。用于本發(fā)明組合物中的這些化合物的合適濃度為本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知，或者可以不用過(guò)度實(shí)驗(yàn)而易于確定。
[0115] 基質(zhì)或支架中化合物的濃度可以根據(jù)化合物的性質(zhì)、其生理學(xué)作用及希望的治療 或診斷效果而變化。治療有效量通常是治療劑展示希望的作用而無(wú)過(guò)度毒性的的足夠濃 度。
[0116] 化合物可以通過(guò)任何已知方法摻入基質(zhì)或支架中。在一些實(shí)施方案中，化合物是 包埋在凝膠中，例如膠原蛋白凝膠中，摻入基質(zhì)或支架的孔中，如實(shí)施例中所述。
[0117] 或者，化學(xué)修飾方法可用于將化合物共價(jià)連接在基質(zhì)或支架表面上?；|(zhì)或支架 的表面官能團(tuán)可以與化合物的反應(yīng)性官能團(tuán)偶聯(lián)以形成共價(jià)鍵，使用本領(lǐng)域熟知的偶聯(lián)劑 如乙醛化合物、碳二亞胺等。此外，間隔分子可用于使表面反應(yīng)基團(tuán)和生物分子的反應(yīng)基團(tuán) 形成缺口，以使得基質(zhì)表面上這種分子更靈活。使生物分子與基質(zhì)內(nèi)部或外部附著的其它 相似方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
[0118] 化合物或者可以通過(guò)基于載體（carrier)的系統(tǒng)如包囊載體（vehicle)導(dǎo)入基質(zhì) 中或其上。這種載體可用作緩釋組合物。例如，化合物可以是微囊化的以提供增強(qiáng)的穩(wěn)定 性或延長(zhǎng)的輸送時(shí)間。包囊化載體包括但不限于微粒、脂質(zhì)體、微球等，或者任何上述載體 的組合，以提供各種比例的希望的釋放模式?？刂漆尫泡斔椭苿┑钠渌椒楸绢I(lǐng)域技術(shù) 人員已知。此外，這些及其它系統(tǒng)可以組合或者調(diào)整以優(yōu)化基質(zhì)內(nèi)制劑的整合/釋放。
[0119] 聚合物微球可以使用天然發(fā)生的或者合成的聚合物產(chǎn)生，其是大小在0. 1-500ym 范圍的微粒系統(tǒng)。聚合物微團(tuán)和聚合物囊泡（polymeromes)是具有與微球相似特性的 聚合物輸送載體，也可以促進(jìn)本文所述化合物的包囊化及基質(zhì)整合。各種有效載荷的微 球的制造、包囊和穩(wěn)定在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)（見(jiàn)例如Varde&Pack(2004)ExpertOpin. Biol. 4(1)35-51)。微球的釋放速度可以通過(guò)聚合物的類型、聚合物分子量、共聚物成分、 加入微球劑型中的賦形劑以及微球的大小而調(diào)整。用于形成微球的聚合物材料包括PLA、 PLGA、用DPPC包被的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明膠、白蛋白、殼聚糖、葡聚糖、DL-PLG、SDLMs、 PEG(例如ProMaxx)、透明質(zhì)酸鈉、二酮哌嗪衍生物（例如Technosphere)、磷酸|丐-PEG 微粒和/或寡糖衍生的DPPG(例如Solidose)。包囊化可以例如使用水/油單一乳化方 法、水-油-水雙重乳化方法或者凍干法實(shí)現(xiàn)。一些商業(yè)包囊化技術(shù)是可獲得的（例如 ProLease?,.Alkerme) 〇
[0120] 脂質(zhì)體也可以用于整合化合物與基質(zhì)或支架。脂質(zhì)體的制劑攜帶能力和釋放速 度可依賴于脂質(zhì)成分、大小、電荷、藥物/脂質(zhì)比率及輸送方法。常規(guī)的脂質(zhì)體由中性或 陰離子脂質(zhì)（天然或合成的）組成。常用的脂質(zhì)是卵磷脂制劑，如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙 醇胺、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油及磷脂酰肌醇。脂質(zhì)體包囊方法為本領(lǐng)域已知 (Galovicetal. (2002)Eur.J.Pharm.Sci. 15, 441-448；ffagneretal. (2002)J.Liposome Res. 12,259-270)。靶向脂質(zhì)體和反應(yīng)性脂質(zhì)體也可以用于組合所述制劑和基質(zhì)。靶向脂 質(zhì)體具有靶向配體如單克隆抗體或凝集素附著于其表面，使得與特異性受體和/或細(xì)胞類 型相互作用。反應(yīng)性或多態(tài)性脂質(zhì)體包括各種脂質(zhì)體，其共有性質(zhì)是其基于特定的相互作 用改變其相和結(jié)構(gòu)的傾向（例如pH-敏感性脂質(zhì)體）。見(jiàn)例如Lasic(1997)Liposomesin GeneDelivery,CRCPress,FL)〇
[0121] 基質(zhì)或支架可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的任何材料制造。合適的基質(zhì)或支架材 料在例如MaandElisseeff，ed. (2005)ScaffoldinginTissueEngineering,CRC,ISBN 1574445219 ；Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesforthe DesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X中論述。對(duì)于所 有或部分基質(zhì)或支架潛在可用的材料的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇、聚交酯、聚乙醇酸、聚 (交酯-共-乙交酯）、聚（己內(nèi)酯）、聚酐、polyglactin、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、 聚正酯、聚縮醛、聚腈基丙烯酸酯）、聚磷腈、可降解的聚氨酯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯 酯聚合物及其它?；〈睦w維素醋酸酯及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟 乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚（乙烯咪唑）、氯磺化聚烯烴、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、特氟龍?、 尼龍、瓊脂糖、藻酸鹽（例如藻酸鈣凝膠）、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白、膠原蛋白（例 如膠原蛋白凝膠）、明膠、透明質(zhì)酸、殼多糖，及其它合適的聚合物和生物聚合物，或者類似 物、混合物、組合，以及上述材料的衍生物。
[0122] 在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架包含天然聚合物。舉例的天然聚合物是膠原蛋白、 殼聚糖和多糖。在其它實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架包含合成聚合物。舉例的合成聚合物是聚 (a-羥基酸）的脂肪族聚酯及聚乙二醇。另外的合成的聚合物是聚乳酸（PLA)、聚乙醇酸 (PGA)以及PLA和PGA的混合物（PLGA)。在一些實(shí)施方案中，合成聚合物是包含大約50% PLA和50%PGA的PLGA。在其它實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架包含膠原蛋白海綿或PLGA。
[0123]在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架由包含骨引導(dǎo)材料的組合物制造。骨引導(dǎo)材料的 非限制性實(shí)例是羥磷灰石（HA)。HA多年來(lái)由于其良好的生物相容性和高生物活性而用作 骨替代物（Liao2006,Nebahat2006,Lijun2006,Wei2003)。
[0124] 盡管HA具有良好的生物活性和骨引導(dǎo)性，但是其非常易碎及具有不佳的固有的 可拉伸性質(zhì)。因此，在一些實(shí)施方案中，HA與e-聚已酸內(nèi)酯（PCL)組合。PCL是良好的 骨基質(zhì)或支架材料，因?yàn)槠湓趲啄陜?nèi)在體內(nèi)降解且是生物相容的、相對(duì)廉價(jià)的及可以大數(shù) 量獲得（Rich2002,Kim2004)。PCL與HA組合（PCL-HA)提供了生物活性、可生物降解性 及強(qiáng)度的希望的組合（Patcharaporn2005,Rezwan2006,Landis1995,Ziv1994)。復(fù)合 的PCL-HA材料被認(rèn)為具有最佳的基質(zhì)或支架的生物相容性、細(xì)胞粘附、增殖和分化性質(zhì) (Zhao2008)。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架包含大約80wt%聚已酸內(nèi)酯和大約20wt% 羥磷灰石的混合物。在其它實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架包含大約60wt%聚已酸內(nèi)酯和大約 40wt%輕磷灰石至大約95wt%聚已酸內(nèi)酯和大約5wt%輕磷灰石。例如，基質(zhì)或支架可包 含大約70wt%聚已酸內(nèi)酯和大約30wt%輕磷灰石。再例如，基質(zhì)或支架可包含大約90wt% 聚已酸內(nèi)酯和大約l〇wt%輕磷灰石。
[0125]在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)或支架具有較高多孔性。這種多孔結(jié)構(gòu)提供了細(xì)胞迀移、 粘附和新骨組織向內(nèi)生長(zhǎng)的空間（Gazdag1995,Rezwan2006,Mano2004,Shin2003,Kim 2001,Leong2003)〇
[0126]支架的孔和通道可以工程化為各種直徑。例如，支架的孔的直徑可以是微米至毫 米范圍。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)材料的孔包括微通道。微通道的平均直徑為大約0.1yrn 至大約1，〇〇〇ym，例如大約50ym至大約500ym(例如大約100ym、150ym、大約200ym、 大約250ym、大約300ym、大約350ym、大約400ym、大約450ym、大約500ym或者大約 550ym)。技術(shù)人員了解微通道直徑的分布可具有任何分布方式，包括正常分布或非正常分 布。在一些實(shí)施方案中，微通道是基質(zhì)材料的天然存在的特征。在其它實(shí)施方案中，微通道 工程化為在基質(zhì)材料中存在。
[0127]本發(fā)明還提供了置換哺乳動(dòng)物口腔中牙齒的方法。在這些實(shí)施方案中，牙齒缺失， 并且口腔中在缺失的牙齒部位有牙槽。所述方法包括在牙槽中植入具有缺失的牙齒形狀的 非細(xì)胞支架。
[0128] 一些方法用于制造多孔支架，包括粒子瀝濾法、氣體發(fā)泡法、靜電紡絲、冷凍干燥、 從衆(zhòng)材料中釉質(zhì)發(fā)泡（foamingofceramicfromslurry)，以及有機(jī)泡沫形成（Mikos1994，Mooney1996,Qing2002,Sylvain2006)。然而，通過(guò)使用這些方法制備的支架具 有限制孔的結(jié)構(gòu)和互相連接性的缺點(diǎn)，這樣會(huì)限制其應(yīng)用于組織工程中的細(xì)胞滲透方面 (Yeong2004,Tan2003)〇
[0129] 在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（CAD)制作缺失牙 的模型及用生物繪圖儀合成支架。這種方法可提供具有較高多孔性和良好互相連接性的支 架。已經(jīng)提出了快速原型設(shè)計(jì)（RP)方法如熔融沉積造型術(shù)、選擇性激光燒結(jié)術(shù)、3D打印、多 相噴射固化及3D繪圖方法（Hutmacher2001，Moroni2006)。
[0130] 快速原型設(shè)計(jì)的關(guān)鍵特征是自由實(shí)體成型（SFF)方法：將3D計(jì)算機(jī)模型切成系列 薄層，其用于構(gòu)建復(fù)合層疊物體。薄層通過(guò)熔融固化、層光聚合作用或者微粒粘合而產(chǎn)生， 使用激光束誘導(dǎo)的燒結(jié)（選擇性激光燒結(jié)）或者特殊的粘合劑進(jìn)行（Landers2002)。近年 來(lái)，已經(jīng)引進(jìn)特化快速原型系統(tǒng)（Bioplotter?,EnvisionTec,Germany)，使得可以設(shè)計(jì)和制 造具有不同內(nèi)部結(jié)構(gòu)的解剖學(xué)形狀的支架，從而使得可以精確控制孔大小、多孔性、滲透性 和硬度（Landers2002;Landers2005)。使用Bioplotter?以制造組織特異性PCL-HA支 架的原型設(shè)計(jì)方法需要靶組織或組織缺陷的3D形態(tài)學(xué)信息，這可以通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層檢查 (CT)或者磁共振成像（MRI)獲得。當(dāng)缺失的牙齒在口腔另一側(cè)具有對(duì)應(yīng)物時(shí)，該對(duì)應(yīng)物可 用作模型以設(shè)計(jì)缺失牙的支架。
[0131] 然后將上述獲得的信息用于通過(guò)CAD設(shè)計(jì)功能性支架，并移至Bioplotter?系 統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，Bioplotter?機(jī)械熔融并以層疊形式在收集板上分配支架材料（例如 PCL-HA)?？?，例如微通道，可以作為設(shè)計(jì)的一部分而產(chǎn)生。通過(guò)RP系統(tǒng)制造的3D支架產(chǎn) 生明顯的細(xì)胞滲透，及因此具有理想的支架性質(zhì)（Heo2007)。這些3D支架可具有臨床應(yīng)用 潛力，通過(guò)提供患者用于營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和血管化的組織特異性解剖學(xué)形狀以及優(yōu)化的內(nèi)部微 結(jié)構(gòu)。關(guān)于這些方法的更詳細(xì)的論述在PCT公開W02009/006558中提供，其并入作為參考。
[0132] 本發(fā)明另外提供了制作牙齒支架的方法。所述方法包括合成哺乳動(dòng)物牙齒形狀的 無(wú)細(xì)胞支架并加入本文所述的化合物。在這些方法的一些實(shí)施方案中，牙齒被制成與哺乳 動(dòng)物中缺失的牙齒一樣的形狀，所述方法進(jìn)一步包括通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)制作缺失的牙齒 模型，及用生物繪圖儀合成支架。當(dāng)缺失的牙齒在口腔中有對(duì)應(yīng)牙時(shí)，例如磨牙，所述方法 進(jìn)一步包括進(jìn)行例如在口腔另一側(cè)的相似磨牙的CT掃描，其中CAD利用第二個(gè)磨牙的CT 掃描數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)支架。
[0133] 在這些方法的一些實(shí)施方案中，本文描述的生物活性劑或者編碼其的核酸包含在 支架中。
[0134] 在這些方法的一些實(shí)施方案中，支架中包含的化合物可以是Wnt3a多肽、血小板 衍生生長(zhǎng)因子（PDGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1 (TGF-P1)、表皮生長(zhǎng) 因子（EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-l(SDFl)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)、 TGF-P、生長(zhǎng)和分化因子（⑶F)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGFl)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白、牙本質(zhì)涎蛋白、骨涎蛋白