(分度值:0? 0001g),儀器編號:BKY-TJ-002, 德國Sartorius股份有限公司生產(chǎn)。
[0245] ZT-14V2生物組織自動脫水機(jī),儀器編號:BKY-BL-016,孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù) 有限公司出品。
[0246] 常州中威BMJ-III型包埋機(jī),儀器編號:BKY-BL-002,江蘇省常州市中威電子儀器 廠出品。
[0247] 常州中威PHY- III病理組織漂烘儀,儀器編號:BKY-BL-003,江蘇省常州市中威電 子儀器廠出品。
[0248] 徠卡RM2126輪轉(zhuǎn)式切片機(jī),儀器編號:BKY-BL-004,上海徠卡儀器有限公司出品。
[0249] 日本奧林巴斯BX41-32P01顯微鏡,儀器編號:BKY-BL-013,日本奧林巴斯株式會 社出品。
[0250] YR-21生物組織自動染色機(jī),儀器編號:BKY-BL-015,孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有 限公司出品。
[0251] 北京永光明202-0型臺式干燥箱,儀器編號:BKY-BL-005,北京市永光明醫(yī)療儀器 廠出品。
[0252] 試劑:
[0253] (1)供試品配液所需試劑
[0254] 羧丙甲纖維素(由委托方提供)。
[0255] 乳糖,規(guī)格:100g/瓶,批號:2015041701,失效期:2018.06,成都市科龍化工試劑 廠。甘露醇,規(guī)格:500g/瓶,批號:201402201,失效期:2017. 06,成都市科龍化工試劑廠。
[0256] (2)凝血功能及凝血因子活性測定試劑
[0257] 凝血質(zhì)控品,規(guī)格:lmlX10 瓶 / 盒,批號:528167B,失效期:2017. 4. 27,SIEMENS。
[0258] PT 試劑,規(guī)格:2mlX10 瓶 / 盒,批號:R5003,R5005,失效期:2017. 1. 1,2017. 3. 1, 希森美康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
[0259] aPIT 試劑,規(guī)格:2mlX 10 瓶 / 盒,批號:R5001,R5006,失效期:2016. 9. 1, 2016. 12. 1,希森美康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
[0260] 抗血凝因子(Xa)測定試劑盒(發(fā)色底物法),規(guī)格:10X71nkat,批號:N1243555, 生產(chǎn)企業(yè):意大利Chromogenix 〇
[0261] 發(fā)色底物S,規(guī)格:25mg,批號:N1143454,生產(chǎn)企業(yè):意大利Chromogenix。
[0262] 聚乙二醇(?£6)6000,規(guī)格:5(^,批號:1^50?76,生產(chǎn)企業(yè) :北京百靈威科技有限 公司。
[0263] 肝素鈉,規(guī)格:lg/瓶,批號:9041-08_1,生產(chǎn)企業(yè):Bomei。
[0264] ⑶PAF含量測定試劑
[0265] 科研兔血小板活化因子(PAF)試劑盒,規(guī)格:96T/盒X 5盒,48T/盒X 1盒,批號: 201509, 201508,失效期:2016. 02,上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)。
[0266] (4)麻醉劑
[0267] 戊巴比妥鈉,用于家兔麻醉。使用時用純化水將戊巴比妥鈉配制成3 %濃度。配制 成3%戊巴比妥鈉溶液(g/v)。用于造模時家兔麻醉。
[0268] (5)病理檢查劑
[0269] 組織標(biāo)本固定液(FAA液):95 %乙醇(AR級),批號:2015052301,有效期至: 2020. 4,規(guī)格:20kg/桶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);冰乙酸(AR級),批號:2015040201, 有效期至:2020. 03,規(guī)格:500ml/瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);甲醛(AR級),批號: 2014120801,有效期至:2016. 11,規(guī)格:500ml/瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。配制方法: 分別量取95%乙醇4200ml、甲醛500ml、冰乙酸300ml和純化水900ml倒入塑料桶中,充分 混勻即可。
[0270] 脫水試劑:無水乙醇(AR級),批號:2015052501,有效期至:2020. 04,規(guī)格:20kg/ 桶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。配制方法:取無水乙醇用純化水稀釋配成70%、80%和 90%乙醇溶液。
[0271] 透明試劑:二甲苯(AR級),批號:2014071001,有效期至:2019.06,規(guī)格:500ml/ 瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。
[0272] 蘇木素染液:蘇木素(AR級),批號:2014010701,有效期至:2017. 04,規(guī)格:5g/ 瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);硫酸鋁鉀(AR級),批號:2014091601,有效期至:2017. 1, 規(guī)格:500g/瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);碘酸鈉(AR級),批號:20140711,有效期 至:2017. 1,規(guī)格:100g/瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);甘油(丙三醇,AR級),批號: 2014122401,有效期至:2017. 12,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);冰乙酸(AR級),批號: 2015040201,有效期至:2020. 3,規(guī)格:500ml/瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。配制方法: 稱取蘇木素1. 5002g,加入250ml純化水?dāng)嚢璐渫耆芙猓偌尤?12. 5ml純化水,稱取碘 酸鈉0. 3003g加入燒杯中,攪拌5分鐘,再加入硫酸鋁鉀37. 5004g,待其完全溶解加入甘油 187. 5ml,混勻,最后加入冰乙酸7. 5ml,充分?jǐn)嚢杌靹蚣吹谩?br>[0273] 伊紅染液:伊紅(水溶),批號:2013110501,有效期至:2016. 05,規(guī)格:25g/瓶, 成都市科龍化工試劑廠;無水乙醇(AR級),批號:2015052501,有效期至:2020. 4,規(guī)格: 20kg/桶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。配制方法:量取無水乙醇600ml和純化水150ml倒 入燒杯中,混勻,加入伊紅3. 7505g,攪勻使溶解,即得。
[0274] 鹽酸一乙醇分化液:鹽酸(AR級),批號:2014072301,有效期至:2019. 7. 22,規(guī) 格:500ml/瓶,成都市科龍化工試劑廠;無水乙醇(AR級),批號:2015052501,有效期至: 2020. 4,規(guī)格:20kg/桶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。配制方法:取無水乙醇520ml和純化 水222. 5ml倒入燒杯中,混勻,再緩慢加入濃鹽酸7. 5ml,攪拌混勻,即得。
[0275] 封片試劑:中性樹膠,規(guī)格:100g/瓶,批號:20140106,有效期至:2018. 12,中國上 海懿洋儀器有限公司。
[0276] 蓋玻片清洗液:重鉻酸鉀:(AR級),批號:20120822,有效期至:2016. 07,規(guī)格: 500g/瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);濃硫酸:(AR級),批號:2014072301、20130607,有 效期至:2019. 7. 22、2018. 06. 06,規(guī)格:500ml/瓶,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。配制方 法:取純化水500ml,加入重鉻酸鉀50. 0003g,攪拌、溶解、混勻,再向其中緩慢加入濃硫酸 50ml,攪拌混勻即可。
[0277] 2. 4 造模
[0278] 取檢疫及適應(yīng)性觀察合格的日本大耳白家兔392只,體重2. 070-2. 560kg,全雄 性,先取8只作為正常組,其余均采用擊打裝置,擊打接觸圓面直徑為1. 5cm,創(chuàng)傷能量按Ep =mgh計(jì)算,鐵棒每打擊一次能量為7. 5J。具體方法:兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉lml/ kg麻醉,右側(cè)俯臥位,左大腿根部置打擊平臺上,觸清兔左股骨大轉(zhuǎn)子,將擊打頭平面緊貼 股骨大轉(zhuǎn)子至大轉(zhuǎn)子下1. 5cm范圍內(nèi),使用自制擊打裝置,擊打兔大腿近端外側(cè),石膏固定 左下肢于屈髖屈膝位,上石膏繃帶時檢查右髖活動自如后,俯臥位待石膏定型,造模后動 物自由飲水,顆粒飼料飼養(yǎng),不用抗凝劑及抗生素。
[0279] 2. 5分組與給藥方式
[0280] 2. 5. 1藥物配制方法
[0281] 藥物(mg):羧丙甲纖維素(mg):乳糖(mg):甘露醇(mg) = 1:2:10:20研磨均勾 后,再加水入純化水lml,攪拌均勻,即得。舉例:50mg藥物+100mg羧丙甲纖維素+500mg乳 糖+1000mg甘露醇,研磨均勾,加水50ml,攪拌均勾,即得lmg/ml的藥液。
[0282] 2.5.2給藥方案
[0283] 各組動物于造模后分組,按下表4給藥方案灌胃給藥,連續(xù)給藥7天,每天給藥1 次。表4給藥方案
[0284]
[0286] 2.6指標(biāo)檢測
[0287] 2. 6. 1凝血功能及凝血因子活性測定
[0288] 首次給藥后0. 5、1. 0、2. 0、3. 0和4. 0h,耳中央動脈取血,分離血漿,在全自動血凝 儀上測定aPPT、PT及Xa活性。
[0289] 2. 6. 2 PAF 含量變化
[0290] 首次給藥后0. 5、1. 0、2. 0、3. 0和4. 0h,耳中央動脈取血,分離血清,采用ELISA法 測定PAF含量變化。
[0291] 2. 6. 3深靜脈血栓形成測定
[0292] 末次給藥30min后放血處死動物,切取股動、靜脈,HE染色,光鏡鏡檢檢查血管內(nèi) 皮損傷、血栓形成和血管破裂等情況,并對以上病變程度進(jìn)行分級評分,具體評分標(biāo)準(zhǔn)詳見 表5〇
[0293] 表5深靜脈血栓形成病理組織學(xué)檢查病變程度評分標(biāo)準(zhǔn)
[0296] 2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0297] 凝血功能及凝血因子和PAF含量數(shù)據(jù)為計(jì)量資料,采用Excel軟件計(jì)算平均數(shù)、標(biāo) 準(zhǔn)差,判斷數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布,正態(tài)分布則采用excel中F檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),然后 選擇t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若呈非正態(tài)分布,則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。
[0298] 病理檢測數(shù)據(jù)為等級資料數(shù)據(jù),采用軟件SPSS13. 0 "非參數(shù)檢驗(yàn)"的"多個獨(dú)立樣 本"進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0299] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0300] 3. 1凝血功能及抗凝血因子活性測定 [0301] 表6凝血功能aPPT檢查結(jié)果G±SD,秒)
[0304] 注:①模型組與正常對照組比較p > 0.05,②模型組與各給藥組比較邙 < 0? 05**p < 0? 01
[0305] 由表6顯示:①給藥后0. 5h~4h,模型組與正常對照組比較aPTT (活化部分凝 血活酶時間)均未見明顯延長(P>〇. 05)。說明造模成功。②與模型組比較,各給藥組給藥 后0. 5h~4h aPTT大部分未見明顯延長(p>0.05)。說明銀杏內(nèi)酯B、沙班類及各組合物 組無出血不良反應(yīng)。③給藥后lh與模型組比較,銀杏內(nèi)酯B和利伐沙班組aPTT出現(xiàn)明顯 延長(p < 0.05),阿哌沙班組、依度沙班組、雷扎沙班組、奧米沙班組aPPT均未見明顯延長 (P>0. 05);銀杏內(nèi)酯B+沙班類組aPPT出現(xiàn)顯著延長(p < 0. 01)和明顯延長(p < 0. 05), 表明本發(fā)明藥物組合物可以有效延長aPPT,同時該比例下銀杏內(nèi)酯B與沙班對aPPT的延長 具有協(xié)同增效的作用。
[0306] 表7凝血功能PT檢查結(jié)果G±SD,秒)
[0309] 注:①模型組與正常對照組比較p > 0. 05,②模型組與各給藥組比較*p