，Higgins等， 公開于2012年3月8日；美國專利申請(qǐng)?zhí)?012/0172836，Higgins等，公開于2012年7月5日。
[0080] 凝塊提取物與固相提取材料的接觸，可使用影響接觸的合適的容器或其它裝置來 執(zhí)行。接觸可W在連續(xù)過程中進(jìn)行，其中源源不斷的凝塊提取物或繞過，或通過固相提取材 料，或凝塊提取物和固相提取材料可W被放置于一個(gè)容器中。如上討論，該容器可包含固相 提取材料，或者可W僅僅作為容器容納珠或其它形式的材料。在本技術(shù)有用的容器包括那 些本領(lǐng)域中已知的，如PLASMAX?Plus Plasma Concentrator,購自Biomet Biologies,LLC (Warsaw，Indiana，USA)，W及可包括如美國專利No. 7，553，413，Dorian等人，公開于2009年 6月30日；美國專利號(hào)No. 7，694，828，Swif t等人，公開于2010年4月13日的所述那些設(shè)備和 使用方法。
[0081] 運(yùn)樣的裝置如圖2A和2B所示，為示范性用途，用聚丙締酷胺凝膠珠固相提取材料。 裝置200具有上腔室205和下腔室210。上腔室205具有端壁215,凝膠珠攬拌器225的攬拌器 閥桿220延伸穿過端壁215。裝置200還有入口 230,其延伸穿過端壁215并進(jìn)入上腔室205。裝 置200也包括出口 235,其與血漿濃縮液導(dǎo)管240連通。上腔室205的基底包括過濾器245,它 的上表面支持干燥的濃縮聚丙締酷胺珠250。
[0082] 在使用過程中，將含有凝塊提取物的液體255經(jīng)由入口230注射入上腔室205,與聚 丙締酷胺珠250混合。流體255和聚丙締酷胺珠250可通過旋轉(zhuǎn)攬拌器閥桿220和凝膠珠攬拌 器225被混合，W幫助流體255和聚丙締酷胺珠250混合。然后，混合的流體255和聚丙締酷胺 珠250在所需的溫度溫育所需的時(shí)間。然后離屯、裝置200W使液體被傳到下腔室210,而聚丙 締酷胺珠250由過濾器245保留，由此可從所得的IL-Ira和其他蛋白質(zhì)的溶液260分離聚丙 締酷胺珠250,所述溶液260在下腔室210中收集。溶液260可W經(jīng)由出口 235從該設(shè)備移除。
[0083] 從組織培養(yǎng)物中獲得組分
[0084] 用于制備無細(xì)胞蛋白質(zhì)溶液的方法可包括W細(xì)胞培養(yǎng)物的形式培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì) 胞天然產(chǎn)抗炎性細(xì)胞因子，如IL-Ira,或者細(xì)胞經(jīng)工程化W產(chǎn)生運(yùn)樣的細(xì)胞因子。非限制性 的自然產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子的細(xì)胞的實(shí)例包括脂肪組織的細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、脂肪來源的干 細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和血細(xì)胞。
[0085] 在各種實(shí)施方案中，細(xì)胞系可經(jīng)工程化W過量產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子。抗炎性細(xì)胞 因子的非限制性實(shí)例包括VEGF、TNF-a、Iklra、sTNF-RI、sTNF-RII、PGDF-AB、PDGF-BB、IGF-1、66。^6。-01、3化-1311和服。。通過用含有編碼抗炎性細(xì)胞因子和選擇標(biāo)記基因的重組 DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，生成穩(wěn)定的真核細(xì)胞系，W過量表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子。 可替代地，用含有編碼抗炎性細(xì)胞因子和選擇標(biāo)記基因的重組DNA轉(zhuǎn)化原核生物和酵母，W 過量表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染用包含編碼抗炎性細(xì)胞因子，如IL-Ira,和選擇性標(biāo) 記的DNA序列的重組DNA分子進(jìn)行。真核和原核細(xì)胞可經(jīng)工程化W組成型或誘導(dǎo)型過表達(dá)抗 炎性細(xì)胞因子。在真核和原核細(xì)胞中表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子，如比-lra、sTNF-RI、sTNF-RlKP SlLl-RII的方法描述于，美國專利No. 6337072，F(xiàn)ord等人，公開于2002年1月8日；美國申請(qǐng)[0086] 當(dāng)IL-Ira在人體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，mRNA被剪接成四種變體，導(dǎo)致翻譯的化-Ira的四種同種 型。SEQ ID N0:l、3、5、7分別是比-Ira同種型1-4的cDNA，SEQ ID N0:2,4,6,8分別是比-Ira 同種型1-4的氨基酸序列?？偟膩碚f，IL-Ira的同種型統(tǒng)稱"比-Ira" dSEQ ID N0:9是STNF-尺1的。0臟序列，569 10^:10是31^-31的氨基酸序列。沈9 10^:11是31^-1?11的。0魁序 列，SEQ ID NO: 12是sTNF-RII的氨基酸序列。沈Q ID NO: 13是S比-IRI的cDNA序列，SEQ ID 顯：14是3化-131的氨基酸序列。569 10肋：15和17分別是3化-11?11￥1和3化-11?11￥3的 cDNA，SEQ ID ^:16和18分別是1311￥巧日3比-11?11￥3的氨基酸序列。比-11?11￥2的。0魁是非 編碼序列；因此，未包括在內(nèi)。
[0087] 為在原核培養(yǎng)物中，例如在特定細(xì)菌中，表達(dá)比-lra、sTNF-RI或sTNF-RiK統(tǒng)稱為 目的蛋白），將CDNA序列（SEQ ID ^:1、3、5、7、9、11、13、15、17)克隆到適于細(xì)菌的表達(dá)載體 里。該表達(dá)載體應(yīng)包含強(qiáng)啟動(dòng)子和可選擇標(biāo)記，如抗生素抗性。能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞的抗生素 的非限制性實(shí)例包括氨節(jié)西林、四環(huán)素、卡那霉素和氯霉素。表達(dá)載體應(yīng)進(jìn)一步包含導(dǎo)致組 成型或誘導(dǎo)型表達(dá)目的蛋白的元件。任選地，考慮到鑒定和純化該蛋白質(zhì)，載體上與目的蛋 白質(zhì)的基因相鄰的位置可存在對(duì)應(yīng)于與目的蛋白質(zhì)功能性偶聯(lián)的標(biāo)簽的DNA序列。例如，N 端或C端化S標(biāo)簽可用于用抗化S抗體檢測蛋白質(zhì)，并且它們可在儀柱上純化。當(dāng)制備了包含 表達(dá)目的蛋白基因的表達(dá)載體，細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌化.COli),可用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。可 選擇的標(biāo)記確保只有用該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在補(bǔ)充有與選擇標(biāo)記相應(yīng)的抗生素的LB培養(yǎng)基 中存活。然后細(xì)菌可在補(bǔ)充有用于表達(dá)和純化的抗生素的LB培養(yǎng)基中成長。表達(dá)載體，用于 克隆目的蛋白到表達(dá)載體的方法，用于轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞的方法，用于從轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞中表 達(dá)蛋白的方法，W及蛋白純化的方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常識(shí)。
[0088] 為在真核培養(yǎng)物中，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，表達(dá)目的蛋白，將CDNA序列（SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15,或17)克隆到適合特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體上。表達(dá)載體包 含強(qiáng)啟動(dòng)子和可選擇標(biāo)記，例如抗生素抗性。能夠殺死哺乳細(xì)胞的抗生素的非限制性實(shí)例 包括遺傳霉素和慶大霉素。表達(dá)載體應(yīng)進(jìn)一步包含導(dǎo)致組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)目的蛋白的元 件。任選地，，考慮到鑒定和純化該蛋白質(zhì)，載體上與目的蛋白質(zhì)的基因相鄰的位置可存在 對(duì)應(yīng)于與目的蛋白功能性偶聯(lián)的標(biāo)簽的DNA序列。當(dāng)制備了包含表達(dá)目的蛋白基因的表達(dá) 載體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人體細(xì)胞，可用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可在補(bǔ)充有與選擇標(biāo) 記相應(yīng)的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中成長?？股氐拇嬖谠试S穩(wěn)定細(xì)胞系的分離。然后穩(wěn)定細(xì) 胞系可在補(bǔ)充有用于表達(dá)和純化的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中成長。表達(dá)載體，用于克隆目的 蛋白到表達(dá)載體的方法，用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞和發(fā)展穩(wěn)定細(xì)胞系的方法，用于從轉(zhuǎn)染的真核 細(xì)胞中表達(dá)蛋白的方法，W及蛋白純化的方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常識(shí)。
[0089] 可替代地，沒有被DNA轉(zhuǎn)染而遺傳改變的真核細(xì)胞可被培養(yǎng)。真核細(xì)胞可是原代培 養(yǎng)物，即所培養(yǎng)的細(xì)胞直接來自真核供體，如人，或者真核細(xì)胞也可W是已建立的細(xì)胞系。 許多已建立的細(xì)胞系可購自American Type Culture Collection,Inc. (Manassas,VA, USA)?？蒞用或外源信號(hào)，如重組蛋白，培養(yǎng)細(xì)胞。真核細(xì)胞常培養(yǎng)于含細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng) 瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)基可從瓶中回收，并離屯、W除去任何非貼壁細(xì)胞。
[0090] 細(xì)胞培養(yǎng)可是單層培養(yǎng)、非貼壁培養(yǎng)或生物反應(yīng)器。單層培養(yǎng)包含貼壁細(xì)胞，在合 適的基底上培養(yǎng)，如細(xì)胞培養(yǎng)瓶和細(xì)胞培養(yǎng)皿，使得細(xì)胞粘附和擴(kuò)散。非貼壁培養(yǎng)包含懸浮 細(xì)胞。適合的細(xì)胞要么是不貼壁細(xì)胞，要么是適于在懸浮液中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞。許多細(xì)胞 系，如許多昆蟲細(xì)胞，可單層培養(yǎng)或懸浮液中生長。生物反應(yīng)器是能支持生物學(xué)活性環(huán)境的 裝置，其中進(jìn)行化學(xué)過程和/或獲得生化活性物質(zhì)。生物反應(yīng)器可包括懸浮或固定化的細(xì) 胞。單層培養(yǎng)、非貼壁培養(yǎng)或生物反應(yīng)器可通過本領(lǐng)域中常用方法來保持。
[0091 ]在一些實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物施加電磁場，W便刺激一種或多種蛋白質(zhì)產(chǎn)生。 用電磁場刺激培養(yǎng)物可設(shè)及多種形式的電磁刺激，如脈沖電場或電容禪合電磁場。在一些 實(shí)施方案中，用與電源偶聯(lián)的刺激線圈刺激所述培養(yǎng)物。電流通過線圈產(chǎn)生脈沖磁場，能在 液體中誘導(dǎo)脈沖電場。當(dāng)它放在容器內(nèi)，線圈可部分纏繞細(xì)胞培養(yǎng)物。線圈可整合入包含細(xì) 胞培養(yǎng)物的容器，或是可拆卸的。例如，塑料管可與集成的線圈一起形成，或線圈可暫時(shí)與 容器偶聯(lián)，或放在容器內(nèi)；例如，該管可被構(gòu)造成使得線圈可卡裝在容器上。電源可W根據(jù) 需要偶聯(lián)到線圈進(jìn)行刺激。
[0092] 用電磁場刺激培養(yǎng)物也包括跨越液體放置至少兩個(gè)電極。然后可將電能施加到電 極，W便電容禪合電極W及在此間產(chǎn)生電磁場。因此電磁場能通過所述培養(yǎng)物，W增加細(xì)胞 因子的生成速率和/或量。在其他實(shí)施方案中，電極可用來產(chǎn)生直流電或者一個(gè)或多個(gè)線圈 可用來產(chǎn)生脈沖電磁場。
[0093] 電磁場的強(qiáng)度在刺激過程中可W為至少約0.5微伏/厘米，無論是由直流電、電容 禪合的電流、或脈沖電磁場產(chǎn)生。在直流電電極的情況下，電流振幅可W是約1-200微安，并 且在一些實(shí)施方案中，振幅可為約20-100微安。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，電流可W是約 20、約60或約100微安。然而，應(yīng)該理解的是，電流振幅也可W是其它合適的幅度。
[0094] 刺激所施加的電磁場可W恒定或隨時(shí)間變化。例如，正弦時(shí)變電磁場可使用跨越 液體放置的電極而施加。運(yùn)種正弦時(shí)變電磁場的跨電極的峰值電壓可W為約1-10伏，在一 些實(shí)施方案中，峰值電壓大約為5伏。所產(chǎn)生的相應(yīng)的電場振幅可W是約0.1-100毫伏/厘米 (mV/cm)，在一些實(shí)施方案中，為約20mV/cm。正弦時(shí)變電磁場的頻率范圍約1，000-200,000 赫茲，在一些實(shí)施方案中，頻率可為約60，000赫茲。
[0095] 施加到培養(yǎng)物的電磁場也可是脈沖電磁場。脈沖電磁場可W使用外部線圈和脈沖 發(fā)生器來引起。在運(yùn)方面，脈沖電磁場的脈沖持續(xù)時(shí)間可W為10-2000微秒/脈沖。在一個(gè)實(shí) 施方案中，脈沖持續(xù)時(shí)間大約為225微秒。脈沖可包括電磁脈沖，其中一個(gè)脈沖串可含約1-200個(gè)脈沖?？商娲?，電磁場可產(chǎn)生含約10-30個(gè)脈沖的脈沖串。在運(yùn)方面，一個(gè)實(shí)施方案 中每個(gè)脈沖串可包含約20個(gè)脈沖。
[0096] 施加的脈沖電磁場中的脈沖串頻率可變。在運(yùn)方面，一些實(shí)施方案中，脈沖串可W 1-100赫茲的頻率重復(fù)，在其他實(shí)施方案中，可W10-20赫茲的頻率重復(fù)。此外，脈沖串W約 1.5赫茲、約15赫茲或約76赫茲的頻率重復(fù)。脈沖串的持續(xù)時(shí)間可為10-40，000微秒。在運(yùn)方 面，脈沖串持續(xù)時(shí)間約4.5毫秒。
[0097] 用于產(chǎn)生電容禪合電磁場的合適裝置包括SpinalPak?脊髓刺激儀化Bl，L.P.， Parsi郵any ,New Jersey)或DC刺激裝置如SpF"化IIb脊髓融合刺激儀化BI, L.P.， Parsippany,化W Jersey)。脈沖電磁場可用各種已知方法和設(shè)備產(chǎn)生，如采用單線圈或一 對(duì)Helmholtz線圈。例如，合適的設(shè)備包括EBI Bone 胎alingSystexa⑥Model 200UEBI, L.P. ,Parsippany,化W Jersey)和BTBS刺激線圈。關(guān)于直流電，電場可用任何已知用于產(chǎn)生 直流電場的裝置來生成，如Osteogen?可植入的骨生長刺激儀化BI ,L.P.,化rsippany ,New Jersey)。也可使用其他合適的裝置產(chǎn)生電磁場。
[0098] 細(xì)胞培養(yǎng)物可W自然釋放抗炎性細(xì)胞因子至培養(yǎng)基中，或培養(yǎng)物可被誘導(dǎo)釋放抗 炎性細(xì)胞因子至培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基可W通過抽吸、離屯、或過濾分離，用于形成